CN117844782A - 靶向范围广的基因编辑核酸酶及其在核酸检测中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了靶标识别范围广的基因编辑核酸酶及其应用，具体地，本发明提供了一种利用宏基因组学结合实验鉴定出的CRISPR系统基因编辑核酸酶Gs12‑9（PAM=NYYN，Y=C/T），其优点在于比已知识别PAM为“TTTV”的LbCas12a靶标覆盖范围更广。本发明还建立了基于CRISPR/Gs12‑9系统介导的核酸可视化检测技术，在核酸检测领域具有广阔的应用前景。

Description

靶向范围广的基因编辑核酸酶及其在核酸检测中的应用

技术领域

本发明属于基因组编辑技术领域，具体地涉及新鉴定的基因编辑核酸酶Gs12-9及其应用。

背景技术

CRISPR是继ZFN和TALEN之后的第三代基因编辑技术，是原核生物的天然免疫系统。根据Cas蛋白的类型，CRISPR-Cas系统分为两大类，第一大类由多个Cas蛋白复合而成，包括I型、III型和IV型；第二大类由相对单一的Cas蛋白组成，如II型的Cas9系统和V型的Cas12系统，以及VI型的Cas13系统。

最常用的CRISPR-SpCas9系统的PAM识别序列为3'端NGG；Cas12a在5'端识别TTTV的PAM序列，与CRISPR-Cas9互补，但还不足以覆盖所有靶位点。长期以来，研究人员一直致力于优化和升级Cas9蛋白，以扩大其与不同PAM序列的兼容性，并通过改造获得了SpCas9-VRQR、SpCas9-VRER、xCas9 3.7和SpCas9-NG等变体，2020年又开发出了SPRY，其识别的PAM序列同时覆盖了NRN和NYN（R代表A/G，Y代表C/T）。然而，目前还没有发现PAMless或无 PAM的Cas12a。此外，当CRISPR/Cas12蛋白在sgRNA 引导下识别并切割靶标DNA时，其“反式裂解活性”活性被激活，可高效切割体系中非特异单链DNA(ssDNA)，其在核酸检测方面的应用前景广阔，目前已开发出HOLMES、DETECTR和RAVI-CRISPR等检测平台，但sgRNA识别的PAM依然是经典的“TTTV”或“TTV”，因此迫切需要找到一种可识别靶标范围更广的基因编辑核酸酶。

目前，对基因编辑动物的鉴定主要是基于基因编辑的DNA序列，包括聚合酶链反应(PCR)、定量PCR (qPCR)、环介导等温扩增、重组酶聚合酶链扩增、Southern印迹杂交。但是PCR、qPCR、多重PCR等方法需要昂贵复杂的设备和训练有素的技术人员，而其它方法的特异性较低，容易造成假阳性结果，这在一定程度上限制了缺少仪器的贫穷地区的准确检测。相比之下，CRISPR/Cas系统与等温扩增反应相结合，不仅灵敏度高，而且特异性强，可以实现对样品的现场快速检测。但是基因编辑动物的编辑靶点相对固定，PAM序列可选范围小，因此，亟需找到一种靶标识别范围更广的基因编辑核酸酶。

发明内容

本发明公开了靶标识别范围更广的CRISPR/Cas基因编辑核酸酶及其应用，具体地，本发明提供了一种利用宏基因组学结合实验鉴定的基因编辑核酸酶Gs12-9（PAM=NYYN，Y = C/T），还建立了基于CRISPR/Gs12-9介导的核酸可视化检测技术。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

CRISPR/Cas系统中的基因编辑核酸酶，与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相比，具有80%以上的序列同一性的蛋白，并且基本保留了其源自序列的生物学功能。优选，具有90%以上的序列同一性的蛋白。更优选，具有95%以上的序列同一性的蛋白。更优选，具有98%以上的序列同一性的蛋白。

CRISPR/Cas系统中的基因编辑核酸酶，与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相比，具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加的蛋白，并且基本保留了其源自序列的生物学功能。优选，具有1-100个氨基酸的置换、缺失或添加的蛋白。更优选，具有1-80个氨基酸的置换、缺失或添加的蛋白。更优选，具有1-50个氨基酸的置换、缺失或添加的蛋白。更优选，具有1-30个氨基酸的置换、缺失或添加的蛋白。更优选，具有1-10个氨基酸的置换、缺失或添加的蛋白。

CRISPR/Cas系统中的基因编辑核酸酶，SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的Gs12-9蛋白。

融合蛋白，包含本发明前述蛋白和其他修饰部分。

多核苷酸，所述多核苷酸为编码本发明前述基因编辑核酸酶的多核苷酸，或编码前述融合蛋白的多核苷酸。

载体，所述载体包含本发明前述的多核苷酸。

宿主细胞，所述宿主细胞包含本发明前述的多核苷酸或载体。

一种可视化核酸检测试剂盒，包括本发明前述的基因编辑核酸酶，单链DNA荧光-淬灭报告基因，与靶标核酸配对的向导RNA。

一种用于检测MSTN基因编辑猪的试剂盒，包括RPA引物对，上述基因编辑核酸酶，单链DNA荧光-淬灭报告基因，与靶标核酸配对的向导RNA，所述的RPA引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和4所示，或如SEQ ID NO.5和6所示，向导RNA的序列如SEQ ID NO.7所示。

本发明所述的基因编辑核酸酶、融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞在核酸检测中的应用。

本发明的技术方案具有如下主要的有益效果：

1.本发明首次提供了结合宏基因组学与实验手段挖掘到的新型CRISPR/Cas12a系统家族新成员Gs12-9。

2.本发明发现PAM可用范围广的基因编辑核酸酶Gs12-9，其优点在于可以在基因组中识别PAM为“NYYN”（Y = C/T）的靶标DNA位点，极大拓展了基因编辑靶标覆盖范围。

3.本发明首次提供了CRISPR/Gs12-9系统介导的核酸可视化检测技术。

术语说明

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

Genie scissor（灵剪）基因编辑核酸酶家族，其中Genie是精灵的意思，代表为细菌来源，scissor代表基因剪刀，表明其可能发挥的基因编辑功能。Genie scissor对应的中文名称为“灵剪”基因编辑核酸酶，Genie scissor基因编辑系统代表“灵剪”基因编辑核酸酶介导的基因编辑系统，简称为“灵剪基因编辑”。

前间隔序列邻近基序（protospacer adjacent motif，简称PAM）是一个短的DNA序列（通常为2-6碱基对长度）。传统观点认为，PAM是Cas核酸酶切割所必需的，通常在切割位点下游3-4个核苷酸。有许多不同Cas核酸酶可以从不同的细菌中纯化，并且每种酶可能识别不同的PAM序列。

附图说明

图1.利用生物信息学手段发掘新型基因编辑核酸酶Gs12-9

A. Gs12-9与已知Cas12a的氨基酸序列相似性分析；B. Gs12-9的进化树分析；C.Gs12-9的基因座示意图；D. Gs12-9的结构域分析；E. Gs12-9的向导RNA的DR序列二级结构折叠与多序列比对；F. Gs12-9和LbCas12a的三维空间结构预测。

图2.Gs12-9蛋白氨基酸序列与已知LbCas12a、FnCas12a、AsCas12a蛋白的氨基酸序列保守性分析。

图3. CRISPR/Gs12-9介导的基因编辑系统特性鉴定

A.在细菌中利用PAM文库消减实验鉴定Gs12-9识别PAM的特征；B. Gs12-9可识别的PAM；C.凝胶电泳检测Gs12-9和LbCas12a体外切割不同PAM位点双链DNA靶标活性，靶标为非洲猪瘟p72基因扩增片段；D.Gs12-9和LbCas12a的顺式切割效率热图；E.检测Gs12-9与LbCas12a不同PAM位点的反式切割活性，双链靶标为非洲猪瘟病毒p72基因扩增片段；F.测定D图中酶标荧光数据。

图4.评估Gs12-9反应温度和反应时间

A.相同时间（10 min）不同温度时Gs12-9核酸酶的反式切割活性蓝光结果图；B.相同时间（15 min）不同温度时Gs12-9核酸酶的顺式切割活性；C.相同温度（37℃）不同时间时Gs12-9核酸酶的反式切割活性蓝光结果图；D.相同温度（37℃）不同时间时Gs12-9核酸酶的顺式切割活性。

图5.基于CRISPR/Gs12-9系统介导的MSTN基因编辑猪检测技术

A.MSTN基因敲除猪与野生型猪的基因差异及设计的sgRNA序列示意图；B.不同基因编辑核酸酶检测MSTN基因敲除猪和野生型猪效果；D.筛选RPA扩增MSTN基因编辑猪的引物对；E. CRISPR-LbCas12a/Gs12-9检测D图中的RPA扩增产物；G.RPA扩增MSTN基因的效果；H.评估CRISPR-LbCas12a/Gs12-9检测G图中的RPA扩增产物；C、F、I. 测定B、E、H图中的酶标荧光数据。

图6.利用RPA-CRISPR/Gs12-9技术现场鉴定MSTN基因编辑猪

A.利用RPA-CRISPR/Gs12-9技术现场鉴定MSTN基因编辑猪的流程图；B、C.分别利用ZFX和MSTN的RPA引物扩增组织样品；D、E.分别利用RPA-CRISPR-LbCas12a/Gs12-9检测B、C中扩增产物；F、G. 测定D、E图中的酶标荧光数据。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件，例如《分子克隆：实验室手册》(New York: Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1 利用生物信息学手段发掘新型基因编辑核酸酶Gs12-9

基于发明人搭建的新型向导RNA依赖型基因编辑核酸酶的生物信息学鉴定流程，对NCBI nr (Non-Redundant Protein Sequence Database)非冗余蛋白库、全球微生物基因目录数据库（GMGC）等公共数据库中的海量宏基因组测序数据进行了细菌编码蛋白深度挖掘。大致分析流程为：针对目标数据库中所有的contig序列，使用minced软件搜寻与定位CRISPR array，接着使用prodigal软件预测CRISPR array邻近表达的蛋白质，通过CD-hit软件对预测到的所有蛋白去冗余、并利用mega软件进行蛋白质聚类分析、利用hmmer软件进行CRISPR-Cas相似性蛋白鉴定与分类，最终获得一种新的未知细菌蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

通过系统发育进化树分析，发现这种新的细菌蛋白位于不同CRISPR-Cas12a系统进化分支上（图1中的B），推测它可能为新的RNA引导型基因编辑核酸酶。本发明对这类来自不同细菌中新发现的蛋白命名为Genie scissor（灵剪，Gs）基因编辑核酸酶。为了方便后续研究，进一步基于细菌种属来源，发明人将这种新的未知细菌蛋白命名为Gs12-9，其命名规则为：“基因编辑核酸酶+数字编号”。

接着，发明人利用本地化blast程序，对这种新发现的细菌蛋白与NCBI nr数据库进行序列相似性比对。结果发现，新的Gs12-9蛋白与已知基因编辑核酸酶LbCas12a、FnCas12a和AsCas12a的氨基酸序列相似性分别为46.57%、40.51%、34.75%（图1中的A）。

进一步，发明人通过对这种蛋白的基因座用CRISPRCasFinder软件进行分析。结果发现，Gs12-9具有CRISPR array序列，包含多个重复和间隔序列，以及Cas4、Cas1和Cas2蛋白（图1中的C）。通过使用hmmer软件与Pfam数据库中的结构域序列进行隐马尔可夫模型比对分析，分析得到了REC结构域、RuvC核酸酶结构域和NUC结构域，推测这个新的细菌蛋白可能具有核酸切割活性（图1中的D）；接着发明人对Gs12-9的DR序列二级结构通过RNAfoldweb server (http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi)在线网站进行预测与多序列比对，结果发现这个新预测的细菌蛋白与已知Cas12a蛋白的DR二级结构类似，仅存在一个碱基差异（图1中的E）。

发明人为了比较Gs12-9与已知的LbCas12a在三维空间结构上的相似性，使用AlphaFold2软件对这种新型基因编辑核酸酶的三维空间结构进行预测，结果显示Gs12-9空间结构与已知的LbCas12a相似（图1中的F）。

最后发明人对Gs12-9的RuvC和Nuc结构域分别与已知的LbCas12a、FnCas12a和AsCas12a蛋白进行氨基酸多序列比对。如图2所示，发现Gs12-9蛋白结构域与已知Cas12a蛋白的氨基酸序列相似性存在较大差别，因此亟需通过进一步实验确定它是否具有核酸定向切割活性。

实施例2 CRISPR/Gs12-9介导的基因编辑系统特性鉴定

2.1通过细菌PAM文库消减实验鉴定Gs12-9蛋白所识别的PAM序列

通过细菌PAM文库消减实验，对同源性低且具有体外目标核酸切割活性的Gs12-9蛋白所识别的PAM序列进行了鉴定。其中随机混合PAM载体库构建流程为：合成DNA oligo序列GGCCAGTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGNNNNNNNGAGAAGTCATTTAATAAGGCCACTGTTAAAAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTT，其中N为随机脱氧核苷酸。以Oligo-F：GGCCAGTGAATTCGAGCTCGG和Oligo-R：AAACAGCTATGACCATGATTACGCCAA为上下游引物经PCR扩增后，以同源重组的方式连入pUC19载体，转化大肠杆菌后提取质粒即可形成随机混合PAM载体库。采用的向导RNA序列为：AAUUUCUACUAUUGUAGAUGAGAAGUCAUUUAAUAAGGCCACU(下划线区域为靶向识别序列)。

细菌PAM文库消减实验流程（图3中的A）：将构建好的Gs12-9蛋白与crRNA共表达的载体pACYC-Duet-1-Gs12-9-crRNA转化至DE3 (BL21)感受态中，制备稳定表达的细菌株。不含Gs12-9蛋白表达载体pACYC-Duet-1构建的稳转细菌株作为阴性对照。将100 ng的PAM文库质粒分别电转至稳定表达的细菌株中，通过氨苄霉素和氯霉素双抗性的培养板进行筛选，16 h后将板子上的菌落刮下进行质粒提取。分别以100 ng提取的质粒为模板，用文库测序引物Seq-F：GGCCAGTGAATTCGAGCTCGG和PAM-Seq-R：CAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACC进行PCR扩增，产物回收后分别将实验组和对照组进行二代高通量测序，对测序结果通过Weblogo3.0分析展示。

鉴定的Gs12-9蛋白识别的PAM序列特征：对起始载体库中含有的16384种不同类型的PAM序列，分别统计它们在高通量测序中实验组和对照组中出现的次数高低，并用各自组所有PAM序列总数进行标准化。针对每条PAM消耗变化的计算方式为 log₂(对照组标准化值/实验组标准化值)，当该值大于3.5时，认为这条PAM被显著消耗。然后使用Weblogo3.0对显著消耗的PAM序列各位置碱基出现频率进行可视化展示。结果如图3中的B所示，发现这种松散型PAM序列的CRISPR/Cas基因编辑系统的Gs12-9，在基因组中的PAM为“NYYN”(Y = C/T)的序列中切割靶标DNA，比已知的LbCas12a、FnCas12a等基因编辑核酸酶识别的“TTTV”PAM序列覆盖范围更广。

2.2体外顺式切割实验测试Gs12-9蛋白对不同PAM的切割活性

本实施例通过体外实验测试Gs12-9蛋白对双链DNA靶标的切割活性。

首先，针对p72基因随机设计了16条识别PAM位点为“NYYN”(Y = C/T)的crRNA，随后进行PCR扩增制备出体外转录模板，接着进行体外转录，转录出相应的crRNA。

通过体外测试Gs12-9蛋白对双链 DNA的切割活性，并与已知的LbCas12a 的切割活性进行比较。利用与靶标核酸互补配对的crRNA引导核酸酶识别并结合在靶标核酸上，从而激发Gs12-9和LbCas12a蛋白对靶标核酸的切割活性，切割体系里的双链靶标核酸。通过琼脂糖凝胶电泳检测观察目标条带是否被切割来鉴定它的酶切活性，对照组不加crRNA。

本实施例中选择靶标双链DNA(dsDNA)为非洲猪瘟病毒p72基因，其序列：CTGTAACGCAGCACAGCTGAACCGTTCTGAAGAAGAAGAAAGTTAATAGCAGATGCCGATACCACAAGATCAGCCGTAGTGATAGACCCCACGTAATCCGTGTCCCAACTAATATAAAATTCTCTTGCTCTGGATACGTTAATATGACCACTGGGTTGGTATTCCTCCCGTGGCTTCAAAGCAAAGGTAATCATCATCGCACCCGGATCATCGGGGGTTTTAATCGCATTGCCTCCGTAGTGGAAGGGTATGTAAGAGCTGCAGAACTTTGATGGAAATTTATCGATAAGATTGATACCATGAGCAGTTACGGAAATGTTTTTAATAATAGGTAATGTGATCGGATACGTAACGGGGCTAATATCAGATATAGATGAACATGCGTCTGGAAGAGCTGTATCTCTATCCTGAAAGCTTATCTCTGCGTGGTGAGTGGGCTGCATAATGGCGTTAACAACATGTCCGAACTTGTGCCAATCTCGGTGTTGATGAGGATTTTGATCGGAGATGTTCCAGGTAGGTTTTAATCCTATAAACATATATTCAATGGGCCATTTAAGAGCAGACATTAGTTTTTCATCGTGGTGGTTATTGTTGGTGTGGGTCACCTGCGTTTTATGGACACGTATCAGCGAAAAGCGAACGCGTTTTACAAAAAGGTTGTGTATTTCAGGGGTTACAAACAGGTTATTGATGTAAAGTTCATTATTCGTGAGCGAGATTTCATTAATGACTCCTGGGATAAACCATGG，设计16条不同PAM的向导RNA，其引物及PAM见表1，crRNA向导RNA序列分别为：

crRNA1-TTTA：AAUUUCUACUGUUGUAGAUAGAGCAGACAUUAGUUUUUCA；

crRNA2-CTTT：AAUUUCUACUGUUGUAGAUGATGGAAAUUUAUCGAUAAG；

crRNA3-ATTG：AAUUUCUACUGUUGUAGAUAUACCAUGAGCAGUUACGGA；

crRNA4-GTTA：AAUUUCUACUGUUGUAGAUCGGAAAUGUUUUUAAUAAUA；

crRNA5-TTCA：AAUUUCUACUGUUGUAGAUGGAUAGAGAUACAGCUCUUC；

crRNA6-CTCT：AAUUUCUACUGUUGUAGAUUCCAGACGCAUGUUCAUCUA；

crRNA7-ATCA：AAUUUCUACUGUUGUAGAUUCGCACCCGGAUCAUCGGGG；

crRNA8-GTCA：AAUUUCUACUGUUGUAGAUUCGCACCCGGAUCAUCGGGG；

crRNA9-TCTG：AAUUUCUACUGUUGUAGAUCGUGGUGAGUGGGCUGCAUA；

crRNA10-CCTG：AAUUUCUACUGUUGUAGAUAAAGCUUAUCUCUGCGUGGU；

crRNA11-ACTG：AAUUUCUACUGUUGUAGAUCUCAUGGUAUCAAUCUUAUC；

crRNA12-GCTG：AAUUUCUACUGUUGUAGAUAACCGUUCUGAAGAAGAAGA；

crRNA13-TCCG：AAUUUCUACUGUUGUAGAUGGUGCGAUGAUGAUUACCUU；

crRNA14-CCCC：AAUUUCUACUGUUGUAGAUACGUAAUCCGUGUCCCAACU；

crRNA15-ACCT：AAUUUCUACUGUUGUAGAUAUUAUUAAAAACAUUUCCGU；

crRNA16-GCCT：AAUUUCUACUGUUGUAGAUUACAUACCCUUCCACUACGG；下划线为靶向序列。

用PCR-p72-F：CTGTAACGCAGCACAGCTGA，PCR-p72-R：CCATGGTTTATCCCAGGAGT为引物进行PCR扩增得到p72双链DNA。体外切割反应采用如下体系：10×rCutSmart Buffer 2μL，预测的Gs12-9蛋白或LbCas12a为500ng，crRNA为500 ng，p72靶标扩增产物2μL。37℃孵育60min。反应完成后分别加入0.5 μL蛋白酶K，55℃孵育10 min终止反应。实验组添加向导RNA和靶标核酸，对照组不添加向导RNA。反应后通过2%琼脂糖凝胶电泳检测，在UV照胶仪下进行成像观察相同反应时间LbCas12a蛋白和预测的新型蛋白酶Gs12-9实验组和对照组的目标条带区别，并通过Image J软件分析切割效率。

结果如图3中的C所示，用 ImageJ软件自动读的灰度值，通过公式计算切割效率，并将效率数值制作成热图（图3中的D）。与对照组相比，实验组中的 Gs12-9蛋白在60 min时就能够切割14种不同PAM的双链DNA，仅有“CCCC”、“GCTG”不能被有效切割，由此可见，通过细菌PAM文库消减实验发现的Gs12-9蛋白的PAM是“NYYN”是相对可靠的。而LbCas12a蛋白仅能切割8种不同PAM的双链DNA，靶标识别范围远低于Gs12-9（图 3中的C、D）。

其中用 ImageJ软件自动读的灰度值，计算切割效率公式为：

a代表未被基因编辑核酸酶切割的双链DNA野生型条带；b，c代表被基因编辑核酸酶剪切后的条带。

表1测试PAM的crRNA引物序列

2.3体外反式切割实验测试Gs12-9蛋白对不同PAM的切割活性

为了进一步评估Gs12-9蛋白是否具有反式切割 (trans cleavage) 活性。利用可以与靶核酸配对的向导RNA引导基因编辑核酸酶Gs12-9识别并结合在靶核酸上；随之激发其对任意单链核酸的“反式切割”活性，从而切割反应体系里的单链DNA荧光-淬灭报告基因（5’ ROX/GTATCCAGTGCG/3’BHQ2）；进一步可以通过激发的荧光强度、背景噪音和肉眼颜色变化来判断候选细菌蛋白的反式切割功能。

为了验证不同靶标对应的向导RNA的活性影响，本实施例中选择靶标双链DNA(dsDNA)依旧为非洲猪瘟病毒p72基因，所用sgRNA为测试顺式切割的crRNA。接着采用以下反应体系：Gs12-9或LbCas12a蛋白500 ng，向导RNA 500 ng，2 μL 10×rCutSmart Buffer，1 μM单链DNA荧光-淬灭报告基因和2 μL的PCR扩增靶标产物，DEPC水补足到20 μL。阴性对照为不加靶标。37℃反应10 min，98℃反应2 min灭活。通过在酶标仪定量和蓝光下观察荧光强度和背景噪音，来判断体外Gs12-9和LbCas12a的反式切割活性。

结果发现，LbCas12a核酸酶仅对9种PAM序列下的双链靶标产生反式切割活性，而Gs12-9核酸酶仅在“GTTA”、“GCTG”的PAM靶标双链不能产生反式切割活性，其余14条均有反式切割活性，PAM范围明显优于LbCas12a（图3中的E、F）。

2.4评估Gs12-9蛋白靶标切割时间和反应温度特性

为了评估Gs12-9靶标切割时间和反应温度。选定测试靶标为p72双链DNA，sgRNA选用sgRNA1-TTTA。首先测试不同温度条件（16℃、25℃、37℃、42℃、50℃、55℃、60℃）切割10min时核酸酶的反式切割活性，结果发现Gs12-9的反式切割温度范围为16-50℃，其中最适温度在37-42℃（图4中的A）。接着测试不同温度条件切割15min时核酸酶的顺式切割活性，结果发现 Gs12-9的顺式切割温度范围为16-60℃，其中顺式切割活较高的范围依旧是37-42℃（图4中的B）。再接着测试在37℃温度下，随着时间延长引起的反式切割效果，发现在5min时，Gs12-9 核酸酶即表现出非特异切割活性（图4中的C），非常适用于建立新型CRISPR的核酸检测系统——CRISPR/Gs12-9。最后测试在37℃温度下，随着时间延长引起的顺式切割活性变化，发现在0.5 min时，Gs12-9 核酸酶即表现出切割效率，到30 min 时达到较高水平（图4中的D）。

实施例3 建立基于CRISPR/Gs12-9系统介导的MSTN基因编辑猪检测技术

进一步评估CRISPR/Gs12-9核酸检测系统可行性。利用向导RNA引导基因编辑核酸酶Gs12-9识别并结合在靶核酸上，随之激发其对任意单链核酸的“反式切割”活性，从而可以切割反应体系中的单链DNA荧光-淬灭报告基因（ssDNA-FQ）；进一步可以通过激发的荧光强度、背景噪音和肉眼颜色变化来判断候选细菌蛋白的反式切割功能。基于此，基因敲除猪基因组扩增片段无法与sgRNA完全互补配对，Cas蛋白无法与双链DNA（dsDNA）结合，因此无法发挥特有的非特异性的反式切割活性，导致单链DNA不可以被切割，因此MSTN基因编辑猪的样品是没有荧光产生，而野生型猪的样品则有荧光产生。基于CRISPR/Gs12-9系统介导的MSTN基因编辑可以用于基因编辑猪的检测，结果可靠。

本实施例评估Gs12-9核酸检测效果采用的双链DNA（dsDNA）靶标为MSTN基因敲除猪和野生型猪的MSTN基因片段，扩增引物为：PCR-MSTN-F：GTCAAGGTAACAGACACACC；PCR-MSTN-R：ACCCACAGCGATCTACTACC，扩增片段为：GTCAAGGTAACAGACACACCAAAAAGATCCAGGAGAGATTTTGGACTCGACTGTGATGAGCACTCAACAGAATCTCGATGCTGTCGTTACCCTCTAACTGTGGATTTTGAAGCTTTTGGATGGGACTGGATTATTGCACCCAAAAGATATAAGGCCAATTACTGCTCTGGAGAGTGTGAATTTGTATTTTTACAAAAATACCCTCACACTCATCTTGTGCACCAAGCAAACCCCAGAGGTTCAGCAGGCCCCTGCTGTACTCCCACAAAGATGTCTCCAATCAATATGCTATATTTTAATGGCAAAGAACAAATAATATATGGGAAAATTCCAGCCATGGTAGTAGATCGCTGTGGGT（下划线为MSTN基因敲除猪缺失的基因片段）。并将野生型猪的基因组扩增片段构建到PMD19-T载体上，并命名为PMD19-T-MSTN。

检测基因编辑猪有助于养殖生产商、供应商、肉类加工者和消费者在食品生产的不同阶段识别和监测猪的基因特征。根据MSTN敲除猪基因型和野生型猪基因型之间的碱基差异设计了一条sgRNA：AAUUUCUACUGUUGUAGAUCUGCUCUGGAGAGUGUGAAU（下划线为靶向序列），并选用LbCas12a、Gs12-1、Gs12-4、Gs12-9、Gs12-14进行CRISPR核酸检测，检测体系为五种不同的CRISPR系统蛋白500 ng，向导RNA 500 ng，2 μL 10×rCutSmart Buffer，1 μM单链DNA荧光-淬灭报告基因（5’ ROX/GTATCCAGTGCG/3’BHQ2）和2 μL的对应组织样品的PCR扩增靶标产物。在37℃金属浴上孵育10 min，然后98℃ 2 min终止反应。在蓝光仪下进行拍照，以及通过多功能酶标仪测定荧光数值。通过比较发现LbCas12a、Gs12-1、Gs12-9介导的CRISPR核酸检测可以有效区分MSTN基因编辑猪与野生型猪，并且Gs12-9效果更优，而Gs12-4、Gs12-14则不能有效区分基因编辑猪与野生型猪（图5中的B、C）。为了结合RPA技术建立高灵敏性可视化检测MSTN基因编辑猪的方法，使用Primer5软件在线设计了两组RPA引物：

MSTN-RPA-F1：GATCCAGGAGAGATTTTGGACTCGACTGTG

MSTN-RPA-R1：TATAGCATATTGATTGGAGACATCTTTGTGG

MSTN-RPA-F2：CAACAGAATCTCGATGCTGTCGTTACCCTCTAAC

MSTN-RPA-R2：ACCCACAGCGATCTACTACCATGGCTGGAATT，进行初步筛选，用各自的组织样品的基因组为模板来比较两组引物的扩增情况，扩增体系为：将29.5 µL RPA缓冲液，MSTN基因的RPA上游和下游引物各25 pmol，以及11 µL无核酸酶水，2.5 µL 280 mM的醋酸镁（MgOAc）加入到TwistAmp RPA试剂盒的冻干粉中，分别加入2 µL不同组织样品的基因组DNA模板。通过琼脂糖凝胶电泳发现都可以扩增得到对应大小的条带（图5中的D），进一步评估是否可以区分开MSTN基因敲除和野生型猪，使用上述同样的体系，用新型Gs12-9核酸酶和LbCas12a核酸酶检测扩增产物。结果发现，与理论上MSTN基因编辑猪的样品是没有荧光产生，而野生型猪的样品则有荧光产生保持一致，因此Gs12-9蛋白可以有效区分MSTN基因敲除和野生型猪的RPA扩增产物（图 5中的E、F），后续选用MSTN-RPA-F1/R1作为扩增引物。

为了评估CRISPR/Gs12-9系统检测 MSTN基因编辑猪的最低检测限，使用4× 10⁵到4×10^-1copies/μL的MSTN野生型基因质粒为模板进行RPA扩增，利用CRISPR/Gs12-9系统检测扩增产物，结果发现最低检测限均为4×10¹copies/μL（图5中的G、H、I），检测最低限度远远低于PCR的4×10³copies/μL检测限度，因此成功建立了一种基于CRISPR/Gs12-9技术高灵敏性可视化检测MSTN基因编辑猪的方法。

实施例4 利用RPA-CRISPR/Gs12-9技术现场鉴定MSTN基因编辑猪

为评价CRISPR/Gs12-9技术鉴定MSTN基因编辑猪的准确性（图 6中的A），选取4头MSTN基因编辑敲除猪、4头野生型猪和构建的PMD19-T-MSTN作为阳性对照进行检验。为防止粗提DNA失败而造成的假阴性，以ZFX基因作为检测的内参基因模板，其RPA扩增引物为：ZFX-RPA-F：GGTTCTCTGGGAATCTCAGTAACAATTTCCCTT，ZFX-RPA-R：GACACAGATTGCTGGATCCCACACCCAGTTTCCTA，对ZFX基因进行RPA扩增反应后进行琼脂糖凝胶电泳，泳道出现条带可证明猪的基因组DNA提取成功，除阴性对照外所有泳道均有扩增条带，证明8头猪的DNA均提取成功（图6中的B）。同时对MSTN 基因也进行RPA扩增（图6中的C）。通过对应的MSTN基因或者ZFX基因的sgRNA（GAAUUUCUACUGUUGUAGAUAAAGUGUGCCUUGGCAGCGGUGAC）进行CRISPR核酸检测，检测体系为Gs12-9或LbCas12a蛋白500 ng，MSTN或ZFX基因的sgRNA 500 ng，2 μL 10×rCutSmart Buffer，1 μM单链DNA荧光-淬灭报告基因（5’ ROX/GTATCCAGTGCG/3’BHQ2）和2μL的对应组织样品的PCR扩增靶标产物。在37℃金属浴上孵育10 min，然后98℃ 2 min终止反应。在蓝光仪下进行拍照，结果显示4头MSTN基因敲除猪的MSTN扩增产物没有荧光产生，野生型猪的MSTN扩增产物有荧光产生，与理论结果是一致的（图6中的D、E），并通过多功能酶标仪测定荧光数值（图6中的F、G）。表明利用CRISPR/Gs12-9技术区分MSTN基因敲除猪以及野生型猪的准确率可达100%。

Claims (17)

1.CRISPR/Cas系统中的基因编辑核酸酶，其特征在于，与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相比，具有80%以上的序列同一性的蛋白，并且基本保留了其源自序列的生物学功能。

2.如权利要求1所述的基因编辑核酸酶，与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相比，具有90%以上的序列同一性的蛋白。

3.如权利要求2所述的基因编辑核酸酶，与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相比，具有95%以上的序列同一性的蛋白。

4.CRISPR/Cas系统中的基因编辑核酸酶，其特征在于，与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相比，具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加的蛋白，并且基本保留了其源自序列的生物学功能。

5.CRISPR/Cas系统中的基因编辑核酸酶，其特征在于，SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的Gs12-9蛋白。

6.融合蛋白，其特征在于，包含权利要求1-5任一权利要求所述蛋白和其他修饰部分。

7.多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸为编码权利要求1-5任一权利要求所述基因编辑核酸酶的多核苷酸，或编码权利要求6所述融合蛋白的多核苷酸。

8.载体，其特征在于，所述载体包含权利要求7所述的多核苷酸。

9.宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求7所述的多核苷酸。

10.宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求8所述的载体。

11.一种可视化核酸检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-5任一权利要求所述的基因编辑核酸酶，单链DNA荧光-淬灭报告基因，与靶标核酸配对的向导RNA。

12.一种用于检测MSTN基因编辑猪的试剂盒，其特征在于，包括RPA引物对，权利要求1-5任一权利要求所述的基因编辑核酸酶，单链DNA荧光-淬灭报告基因，与靶标核酸配对的向导RNA，所述的RPA引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和4所示，或如SEQ ID NO.5和6所示，向导RNA的序列如SEQ ID NO.7所示。

13.权利要求1-5任一权利要求所述的基因编辑核酸酶在核酸检测中的应用。

14.权利要求6所述的融合蛋白在核酸检测中的应用。

15.权利要求7所述的多核苷酸在核酸检测中的应用。

16.权利要求8所述的载体在核酸检测中的应用。

17.权利要求9-10任一所述的宿主细胞在核酸检测中的应用。