CN118064648A - 一种禽细小病毒的可视化核酸检测方法及其试剂盒 - Google Patents

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王丽霞
童新红
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Abstract

本发明属于基因工程检测技术领域，具体涉及一种禽细小病毒的可视化核酸检测方法及其试剂盒。本发明通过提取病死鸭的病料DNA，鉴别出了一种禽细小病毒AAV‑2020，并提供了该毒株的检测方法，以LAMP结合CRISPR/LbCas12a系统对AAV‑2020这一禽细小病毒进行检测，操作简单，灵敏度高，特异性强，且结果可视化。据实施例记载，本发明以LAMP‑CRISPR/LbCas12a检测体系检测该禽细小病毒，且经过LbCas12a酶切反应结果显示，LAMP‑CRISPR/LbCas12a检测体系仅能特异性检测到该新型禽细小病毒基因的重组质粒，检测灵敏性为2copies/μL。

Description

一种禽细小病毒的可视化核酸检测方法及其试剂盒
技术领域
本发明属于基因工程检测技术领域，具体涉及一种禽细小病毒的可视化核酸检测方法及其试剂盒。
背景技术
细小病毒科是一个单链DNA病毒家族，包含感染脊椎动物的细小病毒亚科和感染无脊椎动物的浓核病毒亚科；现在广泛认为的禽类易受感染的细小病毒为腺相关病毒(Adeno-associatedvirus，AAV)、鸡细小病毒(Chickenparvovirus，ChPV)、鹅细小病毒(Gooseparvovirus，GPV)、新型鹅细小病毒(NewGooseparvovirus，NGPV)以及番鸭细小病毒(Muscovyduckparvovirus，MDPV)。这些病毒会感染鸡、鸭、鹅等禽类，使禽类生物发病，严重危害禽类的健康和发育，为禽类的养殖带来了严重影响。
目前，禽细小病毒的检测方法主要包括组织病理学切片、中和试验、间接ELISA、普通PCR检测、实时荧光定量PCR和核酸探针方法等。其中，组织病理学切片、中和试验和间接ELISA这类方法耗时繁琐，且准确度、灵敏度不高，很难达到普及；普通PCR检测和实时荧光定量PCR的检测灵敏度较低，通常只能用于实验室检测；核酸探针方法虽然灵敏度高，但以探针而言，同位素标记探针具有放射性，且半衰期短，对人体危害大，使用不安全，光敏生物素探针容易非特异性结合核酸片段，其结果特异性不高。
为此，亟需一种操作简单、反应快速、结果直观可视，同时亦需高度敏感的禽细小病毒检测方法。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种禽细小病毒的可视化核酸检测方法及其试剂盒，本发明提供的方法以LAMP结合CRISPR/LbCas12a系统对禽细小病毒进行检测，灵敏度高，特异性强，结果可视化。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了上述方案所述禽细小病毒AAV-2020的基因组，所述基因组的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了一种sgRNA，所述sgRNA依据上述技术方案所述基因组中的Cap基因AAV-4片段序列为模板设计得到。
优选的，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示。
本发明还提供了一种CRISPR/LbCas12a检测体系，所述CRISPR/LbCas12a检测体系包括LbCas12a蛋白和上述技术方案所述的sgRNA。
本发明还提供了一种检测上述方案所述禽细小病毒AAV-2020的核酸的LAMP-CRISPR/LbCas12a体系，所述LAMP-CRISPR/LbCas12a体系包括LAMP扩增引物和上述方案所述的CRISPR/LbCas12a检测体系；
所述LAMP扩增引物根据上述方案所述禽细小病毒AAV-2020的基因组的Cap基因设计得到。
优选的，所述LAMP扩增引物包括如下引物：
上游外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.42所示；
下游外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.43所示；
上游内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.44所示；
下游内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.45所示；
上游环引物LF的核苷酸序列如SEQ ID NO.46所示；
下游环引物LB的核苷酸序列如SEQ ID NO.47所示。
本发明还提供了一种用于检测上述技术方案所述禽细小病毒AAV-2020的核酸的试剂盒，所述试剂盒包括上述方案所述的sgRNA、CRISPR/LbCas12a检测体系或上述方案所述的LAMP-CRISPR/LbCas12a体系。
本发明还提供了一种可视化检测上述技术方案所述禽细小病毒AAV-2020的核酸的方法，包括以下步骤：
利用LAMP扩增引物扩增所述禽细小病毒的核酸，得到LAMP扩增产物；
将所述LAMP扩增产物经过LbCas12a蛋白切割，得到切割产物；
将所述切割产物经过蓝光或紫外光照射观察结果；
当采用蓝光或紫外光照射时，发生荧光反应的则为所述禽细小病毒AAV-2020的核酸；
所述LAMP扩增引物根据上述方案所述禽细小病毒AAV-2020的基因组的Cap基因设计得到。
优选的，所述LAMP的扩增体系包括：1μLBst3.0DNA聚合酶、2.5μL 10×等温缓冲液、6mMMgSO4、14mM dNTP Mix、引物混合物2.5μL、模板2μL，DEPC灭菌双蒸水补齐到25μL；所述LAMP的扩增体系中，所述引物混合物包括1.6μM的上游内引物FIP和1.6μM的下游内引物BIP、0.2μM的上游外引物F3和0.2μM的下游外引物B3、0.4μM的上游环引物LF和0.4μM的下游环引物LB；所述LAMP的扩增条件包括：65℃扩增40min后，80℃扩增10min；
所述LbCas12a蛋白切割的体系包括：2μL模板、0.5mM LbCas12a蛋白、1μM sgRNA和2.5μM ssDNA-FQ报告基因，2μL 10×反应缓冲液；所述LbCas12a蛋白切割的条件包括：37℃切割15～60min。
有益效果：
本发明在病死鸭中鉴定了一株命名为AAV-2020的禽细小病毒毒株的基因组核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了上述禽细小病毒AAV-2020的核酸的LAMP-CRISPR/LbCas12a检测体系，包括LbCas12a蛋白、sgRNA和LAMP扩增引物；所述sgRNA依据所述AAV-2020的基因组中的Cap基因AAV-4序列为模板设计得到，所述LAMP扩增引物根据所述禽细小病毒的基因组的Cap基因设计得到。本发明提供的检测体系，以LAMP结合CRISPR/LbCas12a系统对AAV-2020这一禽细小病毒进行检测，灵敏度高，特异性强，且结果可视化。根据本发明实施例的记载可知，本发明以禽类的病料DNA为模板进行PCR扩增，鉴别出了一种禽细小病毒，并以LAMP-CRISPR/LbCas12a检测体系去检测来了该禽细小病毒，且经过LbCas12a酶切反应结果显示，LAMP-CRISPR/LbCas12a检测体系仅能特异性检测到该新型禽细小病毒基因的重组质粒，酶标仪定量检测酶切产物产生的荧光强度得到检测灵敏性为2copies/μL。
另外，本发明还提供了基于上述LAMP-CRISPR/LbCas12a检测体系检测禽细小病毒核酸的方法，该方法操作简单、反应迅速，结果可视化。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实施例1利用PCR技术检测不同种属来源的禽细小病毒，MDRV：番鸭呼肠孤病毒，NDRV：鸭呼肠孤病毒，MDPV：番鸭细小病毒，DHV：鸭肝炎病毒，1-6号对应6个病死鸭样品中采集的DNA，M表示DNA标记；
图2为实施例1利用BLAST程序对AAV-2020、AAV-MHH、MDPV序列进行比对图；
图3为AAV-2020与其他腺相关病毒的基因序列进化树；
图4为使用琼脂糖凝胶电泳检测基因片段AAV-4的PCR扩增效率，M，DNA标记，分子量标准，泳道1:AAV-4序列PCR扩增产物；
图5为设计与筛选靶向AAV-2020的高活性sgRNA，其中，图5(A)为利用CRISPR/LbCas12a鉴定sgRNA的原理，dsDNA为双链DNA，ssDNA为单链DNA，F为荧光基团，Q为淬灭基团；图5(B)为AAV-2020的基因组示意图，Cap基因(蓝色)与设计的sgRNA位点(绿色)；图5(C)为高活性sgRNA的筛选与鉴定；
图6为靶向AAV-2020Cap基因的sgRNA2、sgRNA3在不同AAV毒株中的序列特异性分析；
图7为用于扩增Cap基因的高灵敏LAMP引物对的筛选；
图8为使用LAMP-CRISPR/LbCas12a技术检测AAV-2020的灵敏性评估；
图9为使用LAMP-CRISPR/LbCas12a技术检测AAV-2020的特异性评估。
具体实施方式
本发明提供了一种禽细小病毒AAV-2020的基因组，所述禽细小病毒AAV-2020的基因组核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了一种sgRNA，所述sgRNA依据上述方案所述禽细小病毒AAV-2020基因组中的Cap基因AAV-4片段序列为模板设计得到。本发明所述sgRNA的序列如SEQ IDNO.22所示，具体为：5’-GCUGGACAA UCUCGUCAUCA-3’。
本发明还提供了一种CRISPR/LbCas12a检测体系，所述CRISPR/LbCas12a检测体系包括LbCas12a蛋白和上述方案所述的sgRNA。本发明对所述LbCas12a蛋白的来源没有任何限定，采用本领域常规市售产品即可。
本发明还提供了一种检测上述方案所述禽细小病毒核酸的LAMP-CRISPR/LbCas12a体系，所述LAMP-CRISPR/LbCas12a体系包括LAMP扩增引物和上述方案所述的CRISPR/LbCas12a检测体系，所述LAMP扩增引物根据上述方案所述禽细小病毒的基因组的Cap基因设计得到。本发明所述LAMP扩增引物优选包括如下引物：
上游外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.42所示，具体为：5’-TGATTTCAACCGCTTCCA-3’；
下游外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.43所示，具体为：5’-TTTCCGATTACATAGGGTAGT-3’；
上游内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.44所示，具体为：5’-GAACTTGAGGGCCTTGGGTCCTGTCACTTCTCTCCACGT-3’；
下游内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.45所示，具体为：5’-GCAGCAAGACTCGACCAAGACTAGTCCGAGTCCGCAAAG-3’
上游环引物LF的核苷酸序列如SEQ ID NO.46所示，具体为：5’-TGATGAGTCGCTGCCAGTC-3’；
下游环引物LB的核苷酸序列如SEQ ID NO.47所示，具体为：5’-ATCGCCAATAACCTCACCAGTACAG-3’。
本发明还提供了一种用于检测上述方案所述禽细小病毒核酸的试剂盒，所述试剂盒包括上述方案所述sgRNA、CRISPR/LbCas12a检测体系或LAMP-CRISPR/LbCas12a体系。
本发明还提供了一种可视化检测上述方案所述禽细小病毒核酸的方法，包括以下步骤：
利用LAMP扩增引物扩增所述禽细小病毒的核酸，得到LAMP扩增产物；
将所述LAMP扩增产物经过LbCas12a蛋白切割，得到切割产物；
将所述切割产物经过蓝光或紫外光照射观察结果；
当采用蓝光或紫外光照射时，发生荧光反应的则为所述禽细小病毒的核酸。
本发明利用LAMP扩增引物扩增所述禽细小病毒的核酸，得到LAMP扩增产物。本发明所述LAMP的扩增体系优选包括：1μL Bst 3.0DNA聚合酶、2.5μL 10×等温缓冲液、6mMMgSO4、14mM dNTP Mix、引物混合物2.5μL、模板2μL，DEPC灭菌双蒸水补齐到25μL，所述引物混合物优选包括1.6μM FIP/BIP、0.2μM F3/B3、0.4μMLF/LB。本发明所述LAMP的扩增条件优选包括：65℃扩增40min后，80℃扩增10min。
得到所述LAMP扩增产物后，本发明将所述LAMP扩增产物经过LbCas12a蛋白切割，得到切割产物。本发明所述LbCas12a蛋白切割的体系优选包括：2μL模板、0.5mM LbCas12a蛋白、1μM sgRNA和2.5μM ssDNA-FQ报告基因，2μL 10×反应缓冲液。在本发明的实施例中，所述LbCas12a蛋白切割的体系的品牌优选为NEB。本发明所述LbCas12a蛋白切割的条件优选包括：37℃切割15～60min。本发明所述ssDNA-FQ报告基因中的ssDNA为sgRNA在靶标基因上对应的序列，F为荧光基团，Q为淬灭基团，所述荧光基团优选为ROX，淬灭基团优选为BHQ2，所述ssDNA-FQ报告基因的序列优选为5’-ROX-GTATCCAGTGCG-BHQ2-3’(SEQ IDNO.3)。
得到所述切割产物后，本发明将所述切割产物经过蓝光或紫外光照射观察结果。本发明所述结果的判定为：当采用所述蓝光或紫外光照射时，发生荧光反应的则为所述禽细小病毒的核酸。本发明所述蓝光的波长优选为470nm，紫外波长优选为302nm。
本发明提供的可视化检测上述方案所述禽细小病毒核酸的方法，以LAMP结合CRISPR/LbCas12a系统检测所述禽细小病毒AAV-2020的核酸，该方法操作简便，灵敏度高，特异性强，且结果可视化。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的禽细小病毒AAV-2020及其LAMP-CRISPR/LbCas12a检测体系和检测方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
禽细小病毒AAV-2020的鉴别
(1)禽细小病毒AAV-2020核酸的提取
在无菌环境中取病死鸭的肝脏组织病样置于1.5mL的EP管中，加入3颗无菌钢珠和800μL生理盐水，置于快速研磨仪中65Hz研磨1min，8000rpm离心2min后取上清液100μL于1.5mL灭菌离心管中；参照Takara Mini BEST Viral RNA/DNAExtraction Kit的方法抽提病毒核酸，具体步骤为：按照AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量提取试剂盒说明书进行操作：在1.5mL离心管中加入200μL病毒液和200μL BufferV-L，震荡混匀，室温放置5min；再加入75μL BufferV-N，震荡混匀，12000g离心10min；取上清，加入300μL异丙醇混匀；将混匀液加入放置在2mL离心管上的制备管中，6000g离心1min；弃去滤液，在制备管中加入500μLBufferW1A，12000g离心1min；弃去滤液，在制备管中加入700μLBufferW2，12000g离心1min；弃滤液，12000g离心2min；将制备管置于1.5mL的离心管上，在制备管中加入40μLElution Buffer并静置1min，12000g离心1min，将提取的DNA置于-20℃保存备用。
(2)疑似病原的确定和鉴定
根据病死鸭的临床剖检症状，怀疑其病原可能是番鸭细小病毒(Muscovyduckparvovirus，MDPV)，根据GenBank上番鸭细小病毒基因序列(NC_006147.2)，用PrimerPremier 5软件设计一对引物，具体引物序列如下表1：
表1用于确定病毒种属的PCR检测引物信息
PCR扩增的体系为0.5μL MDPVF，0.5μL MDPVR，10μLPremix Ex-Taq，2μL cDNA，12μL ddH2O；扩增程序为95℃5min；95℃30s，52℃30s，72℃30s(35循环)；72℃10min；4℃1min。
结果检测及分析
对得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1。
由图1可知，琼脂糖凝胶电泳结果呈番鸭细小病毒(MDPV)阳性，所以实施例1病死鸭中提取出的病毒核酸疑似番鸭细小病毒(MDPV)。
回收PCR产物，送至擎科生物有限公司进行测序，测序结果为PCR产物的序列共521nt，与MDPV目的产物539nt的预期基因序列不一致；将测序结果用NCBI-BLAST、DNAman进行序列对比，比对结果见图2。
由图2可知，与上述PCR产物测序结果序列相似度最高的基因序列为AAV-MHH-2015的部分序列，序列相似度为85％；使用DNAman对PCR产物序列与MDPV、AAV-MHH的全基因组序列进行对比，结果显示用于检测MDPV的PCR引物对序列不仅存在于MDPV基因序列上，也存在于PCR产物序列上；该基因序列与AAV-MHH的基因序列存在差异。由于AAV-MHH、MDPV都属于细小病毒科、细小病毒亚科下的依赖病毒属，因此推测从病死鸭中提取出的病毒可能是一种与AAV-MHH、MDPV同源性较高的依赖病毒。
(3)分段克隆
将步骤(2)得到的禽细小病毒的基因序列与GenBank上已发表的禽细小病毒的核酸序列进行比较，结果显示序列相似度最高的基因序列为Adeno-associatedvirusisolate MHH-05-2015(NC_040671)，序列相似度为86％。将步骤(2)得到的禽细小病毒的基因序列与同源性较高的基因Adeno-associatedvirus isolate MHH-05-2015(NC_040671)、Adeno-associatedvirus isolate Anc84 capsidprotein(VP1)gene(KT235808)等进行比对，得到基因保守序列，根据该基因保守序列设计出6对引物，引物序列具体如下表2：
表2用于扩增禽细小病毒全基因组的PCR扩增引物对
以步骤(2)得到的禽细小病毒的基因序列为模板进行分段PCR扩增，每段PCR扩增的体系和条件分别如表3和表4。
表3用于从病毒全基因组中分段扩增的PCR反应体系
组分 体积(μL)
2×KAPA酶Mix 25
AAVDNA模板 2
上游引物 1
下游引物 1
ddH20 21
总计 50
表4用于从病毒全基因组中分段扩增的PCR反应条件
程序步骤 反应温度(℃) 反应时间
1 95 2-5min
2 98 20s
3 Tm* 15s
4 72 30s/kb
5 72 4min
6 4 2min
注：Tm*为退火温度，以AAV-1～3为引物进行PCR扩增时的Tm*为57.5℃，以AAV-4～6为引物进行PCR扩增时的Tm*为55℃。
(4)PCR扩增产物的回收与纯化
用1％琼脂糖凝胶电泳检测步骤(3)得到的PCR扩增产物，步骤(3)得到的PCR扩增产物经电泳鉴定正确后进行割胶回收，用OMEGA琼脂糖凝胶回收试剂盒进行纯化回收，并用NanoDrop2000测定基因片段的浓度，其中，琼脂糖凝胶回收DNA的步骤如下：
1)在紫外灯下使用刀片或手术刀将含有目的片段的条带从琼脂糖凝胶上切除，并移入1.5mL离心管中，称量凝胶质量；
2)按凝胶质量(克)与XP2溶液(OMEGA琼脂糖凝胶回收试剂盒中含有)体积(毫升)1：1的比例向管中加入3倍XP2溶液，并在37-60℃水浴锅中加热直至完全融化；
3)将700μL溶解液加入过滤柱中，套上收集管，12000r/min离心1min，弃去滤出液，如果溶解液体积大于700μL，则再离心一次，直至所有溶解液都加入过滤柱中被滤出；
4)向过滤柱中加入300μL XP2，套上收集管，12000r/min离心1min，弃去滤出液；
5)向过滤柱中加入700μL加入了无水乙醇的SPWBuffer，套上收集管，12000r/min离心1min，弃去滤出液；
6)将过滤柱套上收集管，12000r/min额外离心2min，尽量去除SPWBuffer，避免残余乙醇抑制下游反应；
7)向柱基质中加入40μL Elution Buffer，套上1.5mL无RNA酶的干净离心管，12000r/min离心1min，洗脱DNA。
8)用NanoDrop 2000测定回收的DNA浓度后，将纯化的DNA存放在-20℃，用于后续试验。
(5)重组表达载体的构建
将步骤(4)回收的产物与pUC57 CloningVector进行连接，连接步骤如下：
1)取1μL的pUC57 CloningVector加入4μL回收产物中，轻轻混匀；
2)室温(20-37℃)反应10～15min；
(6)重组表达载体的转化
连接产物转化感受态细胞；DE3感受态细胞用于转化，转化过程为：
1)先将DE3感受态细胞在冰浴中融化10min；
2)将50μL DE3感受态细胞加入到连接产物中，轻轻混合，在冰浴中放置30min；
3)42℃水浴热激1min后迅速转移到冰浴中3min；
4)加入平衡至室温的LB培养液250μL，200rpm、37℃恒温震荡仪上培养1h；
5)取100μL菌液均匀涂布于含100μg/mL氨苄抗生素的LB琼脂平板上，将平板正放在37℃恒温箱20-30min后将平板倒置放于37℃恒温箱过夜培养12h。
(7)阳性菌株的筛选和鉴定
1)挑选平板中的白色菌落于100μL含有Amp+的LB液体培养基中，200rpm、37℃恒温震荡仪上培养1h，得到单克隆菌液；
2)取2μL步骤1)得到的单克隆菌液于25μL的PCR体系，用特异性引物鉴定阳性克隆，引物序列为M13F：5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3'(SEQ ID NO.18)，M13R：5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'(SEQ ID NO.19)，PCR扩增体系为0.5μL M13F，0.5μL M13R，10μLPCR mix，1μL菌液，13μL ddH2O；扩增程序为95℃5min；95℃30s，56℃30s，72℃30s(35循环)；72℃10min；4℃1min。挑选阳性菌液送擎科生物技术有限公司进行序列测定。
(8)序列拼接
将步骤(7)的测序结果用NCBI在线工具BLAST进行比对分析，应用DNAStar生物软件中的SeqMan软件对测序结果进行处理和拼接，得到禽细小病毒AAV-2020的基因组序列(3984nt)(SEQ ID NO.1所示)。
(9)基因进化分析
将步骤(8)得到的禽细小病毒AAV-2020的基因组序列与Genbank数据库上已知基因组序列比对，可以得知基因序列相似度最高的毒株为DAAV-G003-20，相似度达93.12％，推测该毒株可能为一种新型腺相关病毒；为了阐明AAV-2020毒株与其它AAV的遗传进化关系，将其与GenBank中收录的31株AAV、2株番鸭细小病毒毒株(MDPV和MDPV-SAAS-SHNH)及鹅细小病毒B株(GPV—B)进行构建遗传发育树，系统发育树构建结果见图3。
由图3可知，禽细小病毒AAV-2020毒株属于细小病毒科、细小病毒亚科、依赖病毒属中的腺相关病毒。
实施例2
一种基于LAMP-CRISPR/LbCas12a可视化检测实施例1鉴别出的禽细小病毒AAV-2020核酸的方法
(1)制备检测实施例1鉴定出的禽细小病毒AAV-2020的质粒标准品
为了使基于CRISPR/Cas12a系统结合LAMP现场可视化检测AAV-2020技术的建立更加标准和方便，以实施例1中病死鸭肝脏组织病样基因组DNA(AAVDNA)为模板，针对AAV-2020的Cap基因进行片段AAV-4的PCR扩增，PCR扩增体系为1μLAAV-4F，1μLAAV-4R，25μL2×KAPA酶Mix，2μLAAVDNA，21μL ddH2O；扩增程序为95℃5min；98℃20s，55℃15s，72℃30s(35循环)；72℃5min；4℃1min。将得到的PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图4。
由图4可知，琼脂糖凝胶电泳检测发现，该条带大小与预期相符，且条带单一。
将基因片段产物纯化回收后，克隆至pMD18T载体中，然后后转染至大肠杆菌DE3感受态细胞，使用液体LB培养基进行扩增培养，对菌液中的质粒进行纯化回收，测序结果确认正确即成功建立pMD18T-AAV4重组质粒，可作为质粒模板标准品用于后续实验。
(2)用于检测实施例1鉴定出的禽细小病毒AAV-2020核酸的sgRNA设计及筛选
1)设计靶向AAV-2020Cap基因的sgRNA
以实施例1得到的禽细小病毒AAV-2020基因组中的Cap基因的AAV-4序列设计5条序列和识别位点不同的sgRNA，sgRNA序列见表5。
表5靶向禽细小病毒基因的sgRNA及其在靶标基因上对应的ssDNA序列
2)筛选靶向AAV-2020Cap基因的sgRNA
以步骤(1)得到的pMD18T-AAV4重组质粒座位转录模板进行体外转录，电泳检测结果显示转录得到目的sgRNA产物，使用得到的sgRNA产物进行LbCas12a蛋白切割实验，置于蓝光仪下观察。结果见图5，图中出现的sgRNA-1、sgRNA-2、sgRNA-3、sgRNA-4、sgRNA-5分别和sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3、sgRNA4、sgRNA5进行对应(其他附图与之相同)。
由图5可见，sgRNA-1和sgRNA-5可检测出单链DNA模板，但不能检测出双链DNA模板质粒；sgRNA-2、sgRNA-3、sgRNA-4不仅可检测单链DNA模板，也可以检测双链DNA模板，表明这三条sgRNA的检测活性相对较高，sgRNA-2、sgRNA-3检测阴性模板的背景亮度较低。
为了确定sgRNA-2、sgRNA-3能否特异性识别AAV-2020，从NCBI数据库中获取了不同的AAV毒株的序列信息，其中包括AAV-1(NC_002077.1)、AAV-2(NC_001401.2)、AAV-3(NC_001729.1)、AAV-4(NC_001829.1)、AAV-SAAS(KC171936.1)、AAV-Anc84(KT235808.1)、Bat-AAV(NC_014468.1)、AAV-G003-20(MW380871.1)、AAV-G003-19(MW380869.1)、MDPV(KR029616.1)、MHH(NC_040671.1)。使用Jalview软件对上述基因序列进行多序列比对分析，结果见图6。
由图6可见，sgRNA-2的保守性较高，可识别出多种AAV毒株，表明sgRNA-2序列相对保守；而sgRNA-3的特异性较高，仅可识别出AAV-2020序列，因此可用于特异性鉴别AAV-2020毒株。因此选择sgRNA-3作为检测禽细小病毒AAV-2020核酸的sgRNA。
(3)用于检测实施例1鉴定出的禽细小病毒AAV-2020核酸的LAMP引物设计及筛选
1)LAMP引物的设计
通过LAMP引物设计网站Primer Explorer V5针对高灵敏、高特异的Cap基因设计三组LAMP引物对，具体序列如下表6。
表6检测禽细小病毒AAV-2020基因的LAMP引物对
2)LAMP引物的筛选
将实施例2已制备好的pMD18T-AAV4重组质粒标准品设置为2×101、2×103、2×109copies/μL，用作扩增模板，以步骤1)设计的三组LAMP引物作为扩增引物进行等温扩增，等温扩增的反应体系为1μLBst 3.0DNA聚合酶、2.5μL 10×等温缓冲液、6mM MgSO4、14mMdNTP Mix、引物混合物2.5μL、模板2μL，DEPC灭菌双蒸水补齐到25μL；所述引物混合物包括1.6μM FIP/BIP、0.2μM F3/B3、0.4μM LF/LB，反应条件为65℃扩增40min后，80℃扩增10min。将得到的反应产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测，同时用LbCas12a蛋白分别切割三组LAMP扩增产物，切割的体系为：2μL模板、0.5mM LbCas12a蛋白、1μM sgRNA和2.5μM ssDNA-FQ报告基因，2μL 10×反应缓冲液，切割的条件为：37℃切割30min，将切割后的LAMP扩增产物在蓝光条件下进行观察。结果见图7，其中图7中NTC为空白对照，即DNA模板以纯水替换。
由图7可见，第三组引物对扩增效率高于其他两组引物对，能够高效扩增2×101copies/μL。切割结果显示，第三组引物检测灵敏性可达到2×101copies/μL，且无非特异性扩增，因此，选用第三组LAMP引物对作为检测实施例1鉴定出的禽细小病毒AAV-2020核酸的LAMP引物。
实施例3
基于LAMP-CRISPR/LbCas12a技术检测禽细小病毒AAV-2020核酸的灵敏性评估
利用上述第三组LAMP引物结合CRISPR/LbCas12a评估AAV-2020的检测灵敏性。将pMD18T-AAV4重组质粒的浓度梯度稀释为2×10-1-2×105copies/μL。65℃下进行LAMP扩增，将LAMP产物进行LbCas12a切割检测，使用酶标仪定量检测酶切产物产生的荧光强度。结果见图8，其中“****”表示P<0.0001，“***”表示P<0.001。。
由图8可见，第三组LAMP引物结合CRISPR/LbCas12a的检测灵敏性为2copies/μL。
实施例4
基于LAMP-CRISPR/LbCas12a技术检测禽细小病毒AAV-2020核酸的特异性评估
为评估LAMP-CRISPR/LbCas12a体系检测AAV-2020的特异性，设计与构建了与AAV-4基因序列相似度最高的AAV MHH-05-2015(NC_040671.1)对应序列的基因重组质粒，与AAV基因组序列相似度较高的DAAV-G003-20(MW380871.1)、PBDAAV-12.16-AU(MT247729.1)对应序列的基因重组质粒，由公司进行合成。
AAV-2020样品由病鸭个体采集；将pMD18T-AAV-MHH重组质粒、pMD18T-DAAV-G003-20重组质粒、pMD18T-PBDAAV-12.16-AU重组质粒分别混入健康鸭血清中，提取核酸。进行LAMP-CRISPR/LbCas12a体系的AAV-2020的特异性检测，sgRNA采用高活性sgRNA-3，LAMP引物选择第三组LAMP引物，琼脂糖凝胶电泳检测结果见图9。
由图9可知，第三组LAMP引物仅能扩增AAV-2020病毒粒子基因，LbCas12a酶切反应结果显示，仅能特异性检测到AAV-2020的基因重组质粒。以上结果说明，上述LAMP-CRISPR/LbCas12a体系能够特异性检测AAV-2020。
由以上实施例可知，本发明通过提取病死鸭的病料DNA，鉴别出了一种禽细小病毒AAV-2020，并提供了该毒株的检测方法，以LAMP结合CRISPR/LbCas12a系统对AAV-2020这一禽细小病毒进行检测，操作简单，灵敏度高，特异性强，且结果可视化。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (9)

1.一种禽细小病毒AAV-2020的基因组，其特征在于，所述基因组的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。
2.一种sgRNA，其特征在于，所述sgRNA依据权利要求1所述基因组中的Cap基因AAV-4序列为模板设计得到。
3.根据权利要求2所述的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示。
4.一种CRISPR/LbCas12a检测体系，其特征在于，所述CRISPR/LbCas12a检测体系包括LbCas12a蛋白和权利要求2或3所述的sgRNA。
5.一种检测权利要求1所述禽细小病毒AAV-2020的核酸的LAMP-CRISPR/LbCas12a体系，其特征在于，所述LAMP-CRISPR/LbCas12a体系包括LAMP扩增引物和权利要求4所述的CRISPR/LbCas12a检测体系；
所述LAMP扩增引物根据权利要求1所述禽细小病毒的基因组的Cap基因设计得到。
6.根据权利要求5所述的检测体系，其特征在于，所述LAMP扩增引物包括如下引物：
上游外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.42所示；
下游外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.43所示；
上游内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.44所示；
下游内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.45所示；
上游环引物LF的核苷酸序列如SEQ ID NO.46所示；
下游环引物LB的核苷酸序列如SEQ ID NO.47所示。
7.一种用于检测权利要求1所述禽细小病毒AAV-2020的核酸的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2或3所述sgRNA、权利要求4所述的CRISPR/LbCas12a检测体系或权利要求5或6所述的LAMP-CRISPR/LbCas12a体系。
8.一种可视化检测权利要求1所述禽细小病毒AAV-2020的核酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
利用LAMP扩增引物扩增所述禽细小病毒的核酸，得到LAMP扩增产物；
将所述LAMP扩增产物经过LbCas12a蛋白切割，得到切割产物；
将所述切割产物经过蓝光或紫外光照射观察结果；
当采用所述蓝光或紫外光照射时，发生荧光反应的则为所述禽细小病毒的核酸；
所述LAMP扩增引物根据权利要求1所述禽细小病毒AAV-2020的基因组的Cap基因设计得到。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述LAMP的扩增体系包括：1μLBst3.0DNA聚合酶、2.5μL10×等温缓冲液、6mMMgSO4、14mMdNTPMix、引物混合物2.5μL、模板2μL，DEPC灭菌双蒸水补齐到25μL；所述引物混合物包括1.6μM的上游内引物FIP和1.6μM的下游内引物BIP、0.2μM的上游外引物F3和0.2μM的下游外引物B3、0.4μM的上游环引物LF和0.4μM的下游环引物LB；所述LAMP的扩增条件包括：65℃扩增40min后，80℃扩增10min；
所述LbCas12a蛋白切割的体系包括：2μL模板、0.5mMLbCas12a蛋白、1μMsgRNA和2.5μMssDNA-FQ报告基因，2μL10×反应缓冲液；所述LbCas12a蛋白切割的条件包括：37℃切割15～60min。
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