CN111051522A - 用于重组酶介导的选择性切割核酸的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本文提供的方法和组合物的实施方式涉及靶核酸的选择性切割。一些实施方式包括用单链核酸探针和重组酶进行重组酶介导的靶核酸的选择性切割。一些实施方式还包括通过选择性切割样品中的靶核酸和从所述样品除去所切割的靶核酸而富集样品中的非靶核酸。

Description

用于重组酶介导的选择性切割核酸的方法和组合物

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年3月19日提交的题为“METHODS AND COMPOSITIONS FORRECOMBINASE-MEDIATED SELECTIVE CLEAVAGE OF NUCLEIC ACIDS”的美国临时申请号62/644727的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

序列表引用

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技术领域

本文提供的方法和组合物的实施方式涉及靶核酸的选择性切割。一些实施方式包括用单链核酸探针和重组酶进行重组酶介导的靶核酸的选择性切割。一些实施方式还包括样品中的通过选择性切割样品中的靶核酸和从所述样品除去所切割的靶核酸而富集样品中的非靶核酸。

发明背景

病原体的检测通常是通过基于抗体的方法，聚合酶链反应(PCR)，或靶向核酸捕获然后测序来完成。这些方法各自需要靶向试剂，例如抗体或DNA寡核苷酸，因此需要在之前了解病原体。结果，这些方法可能无法检测以前未被发现或被忽略的病原体。在识别感兴趣的病原体后，可以开发靶向方法。然而，任何包含新检测试剂的临床检测或诊断测试都需要获得监管机构的批准，从而增加了将测试投放市场的成本和时间。

发明内容

本文提供的方法和组合物的一些实施方式是一种在样品中非靶核酸存在下选择性切割靶核酸的方法，其包括：(a)获得包含靶核酸的样品，其中所述靶核酸是双链的；(b)使所述靶核酸与单链核酸探针和重组酶接触，使得形成所述靶核酸中的D环；和(c)使所述D环与核酸酶接触，从而切割所述靶核酸。在一些实施方式中，样品包含非靶核酸。一些实施方式还包括(d)从所述非靶核酸除去所切割的靶核酸。

在一些实施方式中，步骤(b)是在稳定所述D环的条件下进行。在一些实施方式中，步骤(b)包括使所述D环与聚合酶接触。在一些实施方式中，步骤(b)还包括使所述D环与单链结合蛋白接触。

一些实施方式还包括延伸所述单链核酸探针。一些实施方式还包括降解从所述核酸探针延伸的核酸。一些实施方式还包括将dUTP核苷酸掺入所述延伸的核酸中，并使所述延伸的核酸与选自尿嘧啶DNA糖基化酶，无嘌呤/无嘧啶内切核酸酶，和DNA糖基化酶内切核酸酶VII的核酸酶接触。

一些实施方式还包括(e)制备包含所述非靶核酸的核酸文库。在一些实施方式中，是在步骤(d)之后进行(e)。在一些实施方式中，是在步骤(b)之前进行(e)。

本文提供的方法和组合物的一些实施方式是一种用于使包含靶核酸和非靶核酸的样品去宿主化的试剂盒，所述试剂盒包括：单链核酸探针；重组酶；和第一核酸酶。一些实施方式还包括选自以下的组分：聚合酶、单链结合蛋白、终止子核苷酸、dUTP核苷酸、和第二核酸酶，所述第二核酸酶选自尿嘧啶DNA糖基化酶、无嘌呤/无嘧啶内切核酸酶、和DNA糖基化酶核酸内切酶VII。在一些实施方式中，所述重组酶选自RecA、UvsX、RAD51及其衍生物。在一些实施方式中，所述第一核酸酶选自S1核酸酶、绿豆核酸酶、和包含具有核酸酶活性的结构域和单链核酸结合结构域的重组蛋白。一些实施方式还包括多个单链核酸探针。在一些实施方式中，所述多个单链核酸探针包含不同的单链核酸探针。

本文提供的方法和组合物的一些实施方式是一种从样品中的非靶RNA除去靶RNA的方法中，包括：(a)获得包含靶RNA和非靶RNA的样品；(b)使单链DNA探针与所述靶RNA杂交；(c)用核酸酶选择性切割与所述单链DNA探针杂交的所述靶RNA；(d)从所述非靶RNA除去所切割的靶RNA。在一些实施方式中，所述核酸酶对RNA/DNA杂交体具有特异性，例如RNA酶H。

本文提供的方法和组合物的一些实施方式是一种用于使包含靶RNA和非靶RNA的样品去宿主化的试剂盒中，所述试剂盒包括：单链DNA探针；和RNA酶H。一些实施方式还包括选自DNA酶、逆转录酶的组分。

本文提供的方法和组合物的一些实施方式是一种从包含含有病原体核酸的蛋白质衣壳的样品富集所述病原体核酸的方法中，所述方法包括：获得包含含有病原体核酸和宿主核酸的蛋白质衣壳的样品；通过使所述样品与选自DNA酶和RNA酶的核酸酶在其中所述核酸酶不接触所述病原体核酸的条件下接触，选择性切割所述宿主核酸。

附图说明

图1描绘了实例实施方式，其中靶DNA与重组酶和单链DNA探针接触以形成DNA三链体。

图2描绘了实例实施方式，其中通过重组酶介导的切割来选择性切割宿主核酸。

图3描绘了实例实施方式，其中包含核酸酶结构域和单链结合结构域的重组蛋白与D环结合，其中聚合酶延伸探针，并通过重组蛋白切割靶核酸。

图4描绘了实例实施方式，其中通过重组酶介导的切割选择性切割宿主核酸，其中DNA聚合酶延长了D环。

图5描绘了实例实施方式，用于在包含人宿主RNA和病原体RNA的样品中选择性富集病原体RNA。

图6描绘了实例实施方式，其中蛋白质衣壳中的病毒核酸被保护免于受到DNA酶和RNA酶降解，而裸露的核酸和外泌体(exosome)或凋亡小体中的核酸可以被DNA酶和RNA酶降解。

具体实施方式

所述方法和组合物的实施方式涉及靶核酸的选择性切割。一些实施方式包括用单链核酸探针和重组酶进行重组酶介导的靶核酸的选择性切割。一些实施方式还包括通过选择性切割样品中的靶核酸，和从样品除去切割的靶核酸而富集非靶核酸。在一些这样的实施方式中，靶核酸例如宿主DNA可以从含有靶核酸和非靶核酸例如病原体核酸的样品中切割并除去，从而从样品极大地富集了非靶病原体核酸。这可以显著增加灵敏度，并降低病原体检测成本。此外，本文提供的方法和组合物可用于指导在靶核酸中任何位置的靶核酸切割。

一些实施方式包括通过无偏测序检测病原体核酸。为了提高检测灵敏度并降低无偏测序方法的测序成本，人们可以从样品有效地除去宿主DNA。对于病原体，例如可以低浓度存在的病毒，如果可以通过除去99％的宿主DNA来“去宿主化(dehost)”，则可以提高灵敏度，并将试剂成本降低多达100倍。而且，无偏核酸测序方法可以在未事先了解病原体的情况下检测病原体。使用无偏测序方法，核酸可能无法仅基于病原体的基因组序列来富集。由于任何病原体是根据病原体的独特序列来检测，因此不需要新的试剂。因此，很少或没有新的管理批准是必要的，从而大大降低了临床产品的成本和上市时间。本文提供的方法和组合物的一些实施方式包括选择性切割样品中宿主DNA，从样品除去切割的宿主DNA，从而从样品富集非宿主核酸，例如病原体核酸。将这样的实施方式与样品制备程序结合在一起可以富集病原体DNA，从而可以通过无偏测序来实现病原体检测。

在一些实施方式中，重组酶可用于将单链探针引导至双链靶核酸中的互补序列。图1描绘了实例实施方式，其中重组酶和与靶DNA序列中的序列互补的单链DNA探针与靶DNA序列接触以形成DNA三链体或DNA置换环(D环)。这样的D环可由探针引发，然后由核酸酶(例如核酸酶S1(也称为S1核酸酶))切割。如图1所示，提供了与双链靶标20互补的单链DNA 10。将单链DNA 10与重组酶30混合，并与双链靶分子20接触。然后，重组酶30从单链DNA 10和双链靶DNA 20形成三螺旋或D环40。

重组酶可通过链入侵将单链DNA寡核苷酸递送至双链靶标。这样的寡核苷酸可具有与靶DNA链之一相同的碱基序列。凭借与相反链的碱基互补性，重组酶可将寡核苷酸插入双链DNA中，以生成DNA三链体，即稳定的三链DNA结构。能够进行这样的链入侵的重组酶可包括大肠杆菌RecA和T4 UvsX。在图2中描绘了实例实施方式。如图2所示，图1的三螺旋或D环40与核酸酶S1 50接触，其与D环结合以形成复合物60。核酸酶S1在D环处切割双链靶标的每条链，从而将双链DNA切割为片段80和90。

可用于本文提供的实施方式的核酸酶包括靶向单链DNA的核酸酶。合适的核酸酶包括核酸酶S1和绿豆核酸酶。核酸酶S1也可以是有用的，因为它能够切割双链结构中的不规则性，包括靠近链入侵位点的那些或由干扰双螺旋结构的聚合酶活性产生的那些。在一些实施方式中，包含核酸酶结构域和单链DNA结合结构域的重组融合蛋白可以用于切割D环DNA和/或与D环相邻的DNA。例如，来自Flavobacterium okeanokoites的FokI的核酸酶结构域，和衍生自Sulfolobus solfataricus的Sso7d的单链结合结构域。如图3所示，重组蛋白100包含单链DNA结合结构域120和核酸酶结构域110。单链DNA结合结构域结合由单链探针DNA和重组酶复合物130产生的D环。通过延伸单链探针DNA的聚合酶140使D环稳定。核酸酶结构域与邻近D环的双链DNA结合，并将双链DNA切割成片段150和160。

D环是在DNA合成过程中暂时存在的瞬时结构。为了提高D环切割的效率，可以采用各种策略来延长D环的存在。这些策略包括聚合酶反应条件的变化，核苷酸浓度的变化以及使用减慢或终止合成的修饰核苷酸。也可以添加单链结合蛋白来稳定D环和/或新合成的DNA。在一些实施方式中，可以通过用聚合酶从插入的寡核苷酸探针启动DNA合成来增加D环的稳定性。聚合酶可用于产生和/或延长D环，其包含在合成过程中暴露的单链寡核苷酸探针(有时称为“有义”或“阅读”链的链)。D环或接近D环的DNA可通过添加核酸酶来切割。如图4所示，使图1的三螺旋或D环40与DNA聚合酶170接触，其结合D环以形成复合物180。该聚合酶可以在延伸单链探针DNA的条件下稳定D环。核酸酶S1 50可以接触通过聚合酶稳定的D环，并切割双链宿主DNA的链以形成片段200、210、220。

在一些实施方式中，可以限制新合成的DNA的产生。可以通过改变聚合酶反应条件，核苷酸的浓度，或使用减慢或终止合成的修饰核苷酸，限制新合成的DNA。新合成的DNA的破坏防止DNA干扰下游过程或以后被测序。这种破坏还使单链DNA(以前与新合成的DNA杂交)暴露于核酸酶的消化。新合成的链的降解可以通过在合成过程中掺入dUTP核苷酸来完成。然后可以通过加入尿嘧啶DNA糖基化酶和无嘌呤/无嘧啶内切核酸酶或DNA糖基化酶内切核酸酶VII来切割含尿嘧啶的链。

在实例实施方式中，为了使包含双链宿主DNA和非宿主病原体核酸的多核苷酸样品去宿主化，将重组酶和寡核苷酸探针与样品结合。重组酶激活的寡核苷酸探针在宿主DNA中形成D环。可以将聚合酶和其他试剂添加到样品中，以在宿主DNA中产生暂停或延长的D环。如果需要，还可以使用条件和试剂以使从探针合成长链DNA最小化。加入核酸酶以在D环处切割宿主DNA，从而从样品富集病原体核酸。在一些实施方式中，可以从样品除去切割的宿主DNA。在一些实施方式中，使用例如接头连接(例如Illumina TruSeq)或转座子添加(例如Illumina Nextera)的方法，可以使用病原体核酸制备核酸文库，例如测序文库。在另一个实例实施方式中，可以从含有双链宿主DNA和非宿主病原体核酸的多核苷酸样品制备测序文库，并且可以使用重组酶、聚合酶、靶向寡核苷酸、和其他试剂从该文库中选择性切割宿主DNA。

在去宿主化应用的一些实施方式中，单链探针池可以靶向所有或大部分的靶基因组，例如宿主基因组。单链探针可以通过化学合成产生。单链探针也可以从不包含非靶核酸(例如病原体核酸)的细胞系或宿主组织中生物化学地产生。在一些这样的实施方式中，从细胞系提取基因组DNA。从基因组DNA产生范围为30-60个碱基的单链探针。可以使用各种分子生物学方法来产生探针。例如，可以使用DNA酶、核酸外切酶和DNA大小选择来产生它们。单链探针也可以通过随机引物和聚合酶延伸来产生。然后通过标准方法纯化通过延伸产生的探针。为了控制探针的长度，可以将终止核苷酸掺入聚合反应混合物中。另外，可以通过物理或生物化学片段化方法从较长的单链DNA产生较短的探针。

可用于选择性切割靶核酸如宿主DNA的其他方法可包括使用限制酶；然而，靶核酸的切割限于特定限制酶的特异性识别序列和限制位点。其他方法可包括使用锌指和转录激活因子样效应物(TALE)核酸酶。然而，靶核酸的切割仅限于核酸酶的特异性识别序列。其他方法也可包括使用CRISPR/Cas9核酸酶；然而，靶向是由RNA指导指定的，用于宿主耗竭的这样的指导的化学合成将具有挑战性，并非所有宿主序列都可被靶向，并且靶序列大多包含原型间隔子邻近基序(PAM)。

靶核酸的选择性切割

一些实施方式包括用一个或多个核酸探针、重组酶和核酸酶选择性切割一个或多个靶核酸。在一些实施方式中，靶核酸是双链核酸，并且核酸探针是单链核酸。在一些实施方式中，靶核酸可包括重组酶和核酸探针可以与之形成D环的任何双链多核苷酸。靶核酸的实例包括真核核酸、原核核酸、病毒核酸、合成核酸和cDNA。在一些实施方式中，靶核酸可包括哺乳动物核酸，例如人核酸。在一些实施方式中，靶核酸可包括基因组DNA。在一些实施方式中，非靶核酸可包括任何多核苷酸。在一些实施方式中，非靶核酸不被在D环或在D环附近的位点切割核酸的核酸酶切割。在一些实施方式中，非靶核酸包含双链多核苷酸。靶核酸的实例包括真核核酸、原核核酸、病毒核酸、合成核酸和cDNA。在一些实施方式中，非靶核酸包含病原体的多核苷酸。

核酸探针可包含与靶核酸中的序列互补的序列。在一些实施方式中，核酸探针可包含与靶核酸，例如线粒体DNA，重复元件如散在重复、串联重复和长末端重复互补的序列。一些实施方式包括多个核酸探针。在一些实施方式中，多个核酸探针可以与整个基因组中的位点互补。在一些实施方式中，多个核酸探针可以与基因组的一部分中的位点互补。例如，可以制备与基因组的某些部分，例如一个或多个染色体中的位点互补的核酸探针。

在一些实施方式中，核酸探针的长度可以为至少5个核苷酸、10个核苷酸、20个核苷酸、30个核苷酸、40个核苷酸、50个核苷酸、60个核苷酸、70个核苷酸、80个核苷酸、90个核苷酸、100个核苷酸、或上述长度中任意两个之间的范围内的长度。在一些实施方式中，核酸探针可以通过多种方法获得，例如从头化学合成。在一些实施方式中，核酸探针可以获自基因组DNA。例如，基因组DNA可以从例如生物体或细胞系的来源获得。在一些实施方式中，细胞系可以是包含一个或多个外源染色体的体细胞杂交体。在一些实施方式中，双链DNA可以用例如DNA酶I的酶形成切口(nick)，并且切口可以被延伸以在DNA中用例如核酸外切酶III的酶产生单链缺口(gap)。通过使有缺口的DNA变性并除去双链多核苷酸，可以从有缺口的DNA获得单链核酸探针的文库。在一些实施方式中，基因组DNA可以用作模板以获得单链核酸探针或单链核酸探针的文库。例如，具有纯化标签的简并引物可用于扩增基因组DNA。产物可以被纯化、变性和片段化以提供单链核酸探针的文库。在一些实施方式中，纯化标签可包括生物素，其可与链霉亲和素珠一起使用，以从基因组DNA纯化扩增的多核苷酸。在一些实施方式中，纯化标签可包括在扩增产物的纯化过程中可用例如尿嘧啶DNA糖基化酶的酶切割的poly-U序列。

重组酶包括可以催化核酸探针与与核酸探针互补的靶核酸链的杂交的重组酶。在一些这样的实施方式中，重组酶可以催化置换环(D环)的形成。D环可包括靶核酸的两条链分开一定长度的核苷酸并且被核酸探针保持分开的结构。在该实施方式中，核酸探针具有与靶核酸链中的一条互补并与之配对的序列，从而置换靶核酸的另一条链。可用于本文提供的实施方式的重组酶的实例包括RecA，UvsX，RAD51及其活性衍生物。UvsX重组酶的实例在US2017/0275601中提供，其全部内容通过引用并入本文。可用于本文提供的实施方式的更多重组酶包括噬菌体重组酶，例如衍生自肌病毒科噬菌体的UvsX或UvsX样重组酶，例如，T4，T6，Rb69，Aeh1，KVP40，不动杆菌属噬菌体133，气单胞菌属噬菌体65，噬蓝藻体P-SSM2，噬蓝藻体PSSM4，噬蓝藻体S-PM2，Rb32，弧菌噬菌体nt-1，Rb16，Rb43和Rb49。在某些实施方式中，重组酶是衍生自肌病毒科噬菌体的UvsX或UvsX样重组酶，如例如T2，Rb14，气单胞菌属噬菌体25，phi-1，噬菌体31，噬菌体44RR2.8t，噬菌体Rb3和噬菌体LZ2。

在一些实施方式中，核酸酶可用于在D环或在D环附近的一个或多个位点切割靶核酸的至少一条链或两条链。这样的核酸酶可包括核酸内切酶，其缺乏任何实质序列特异性；具有切割单链核酸的活性；和/或具有切割接近D环的核酸的一条或多条链的活性。这样的核酸酶的实例包括核酸酶S1和绿豆核酸酶。在一些实施方式中，核酸酶可包括重组蛋白，其具有选择性结合单链核酸(例如与D环相关的单链结构)的结合结构域，和具有切割单链核酸的活性和/或切割接近D环的核酸的一条或多条链的活性的核酸酶结构域。在一些实施方式中，结合结构域可以衍生自硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)的DNA结合蛋白7d(Sso7d蛋白)。在一些实施方式中，核酸酶结构域可衍生自FokI蛋白，其包含N端DNA结合结构域和C端非特异性DNA切割结构域。或衍生自TevI蛋白。在一些实施方式中，FokⅠ或其片段包含Sharkey或Sharkey′突变，其中Sharkey：S418P，K441E；和Sharkey′：S418P，F432L，K441E，Q481H，H523Y，N527D，K559Q。在一些实施方式中，Sharkey或Sharkey′突变增强了重组蛋白的核酸酶活性。在一些实施方式中，核酸酶结构域具有使其冷或热敏感的突变。在一些实施方式中，FokI或其片段具有以下突变中的一个或多个：EL，KK，D，R，EA，KV，A，V，DA，RV，REL，DKK，RELV，DKKA，ELD，KKR，KKK，ELE，DAD，RVK，DD，或RR，其中EL:Q486E，I499L；KK:E490K，I538K；D:R487D；R:D483R；EA:Q486E，I499A；KV:E490K，I538V；A:I499A；V:I538V；ELD:Q486E，I499L，N496D；KKR:E490K，I538K，H537R；ELE:Q486E，I499L，N496E；KKK:E490K，I538K，H537K；KKR:E490K，I538K，H537R；DD:R487D，N496D；DAD:R487D，I499A，N496D；RR:D483R，H537R；RVR:D483R，I538V，H537R；REL:D483R，Q486E，I499L；DKK:R478D，E490K，I538K；RELV:D483R，Q486E，I499L，I538V；和DKKA:R478D，E490K，I538K，I499A。

表1列出了实例FokI变体及其多肽序列。在一些实施方式中，核酸酶结构域衍生自FokI蛋白或其功能片段，其包含具有与选自SEQ ID NO:01，SEQ ID NO:02，SEQ ID NO:03，SEQ ID NO:04，SEQ ID NO:05，SEQ ID NO:06，SEQ ID NO:07，SEQ ID NO:08，SEQ ID NO:09，SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11的多肽至少70％，80％，90％，95％或100％，或前述百分比中的任何两个的范围内的百分比的同一性的多肽，或前述多肽中的任一种的保守变化。

表1

在一些实施方式中，核酸酶结构域包含具有与选自SEQ ID NO:01-11的多肽至少70％，80％，90％，95％或100％同一性的多肽，或其功能性片段，或前述多肽中任一种的保守变化。在一些实施方式中，保守氨基酸变化可包括替代功能等价氨基酸的氨基酸置换。保守氨基酸变化导致所得肽的氨基酸序列的沉默变化。例如，具有相似极性的一个或多个氨基酸充当功能等同物，并导致肽的氨基酸序列内的沉默变化。电荷中性且用较小残基代替残基的置换也可被视为“保守置换”，即使残基在不同的组中，例如，用较小的异亮氨酸置换苯丙氨酸。具有相似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中定义。表2显示了多个保守氨基酸置换家族。

表2

家族	氨基酸
		非极性	Trp，Phe，Met，Leu，Ile，Val，Ala，Pro
不带电极性	Gly，Ser，Thr，Asn，Gln，Tyr，Cys
		酸性/带负电	Asp，Glu
碱性/正电荷	Arg，Lys，His
		β支化	Thr，Val，Ile
影响链取向的残基	Gly，Pro
		芳香族	Trp，Tyr，Phe，His

在一些实施方式中，可以通过增加D环的稳定性来增加切割靶核酸的效率。在一些实施方式中，可以通过使D环与聚合酶接触来增加D环的稳定性。在一些实施方式中，聚合酶可以延伸核酸探针。可用于延伸核酸探针的反应的实例包括等温扩增反应或聚合酶链反应。聚合酶可以是DNA聚合酶。在一些实施方式中，延伸的条件可以是使得核酸探针的延伸速率可以被降低、实质性抑制、或抑制。降低核酸探针的延伸速率的条件的实例包括在至少一种类型的终止子核苷酸的存在下进行延伸，以及在至少一种核苷酸的有限浓度的存在下进行延伸。在一些实施方式中，可以通过使D环与单链结合蛋白接触来增加D环的稳定性。

在聚合酶延伸核酸探针的一些实施方式中，延伸的多核苷酸可以被降解。延伸的多核苷酸的降解可用于防止延伸的多核苷酸干扰下游过程。在一些实施方式中，可以在dUTP存在下延伸核酸探针，使得延伸的多核苷酸包含UTP残基。可以使用例如尿嘧啶DNA糖基化酶，无嘌呤/无嘧啶内切核酸酶或DNA糖基化酶核酸内切酶VII的酶降解含有UTP残基的延伸的多核苷酸。

一些实施方式包括从多核苷酸样品富集非靶核酸。在一些实施方式中，样品可包含靶核酸和非靶核酸，可以用本文提供的方法选择性切割靶核酸，并且可以从非靶核酸除去切割的靶核酸。在一些实施方式中，可以通过根据大小分级多核苷酸的方法除去切割的靶核酸。在一些实施方式中，可用于从非靶核酸除去切割的靶核酸的方法包括使非靶核酸与基质结合，使非靶核酸与捕获探针杂交，和/或凝胶过滤。在一些实施方式中，基质包含固相可逆固定化(SPRI)珠。

在本文提供的一些实施方式中，多核苷酸样品中靶核酸的选择性切割和切割的靶核酸的除去可导致样品或测序文库包含例如至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的非宿主核酸，或其值的任何范围。在一些实施方式中，方法产生样品或测序文库，其中非宿主核酸占样品或测序文库中的核酸的例如50％-100％，60％-100％，70％-100％，80％-100％，90％-100％或95％-100％。在一些实施方式中，方法产生富集非宿主核酸的样品或测序文库。在一些实施方式中，与起始样品相比，样品或测序文库富集2×，3×，4×，5×，10×，20×，50×，100×，200×，500×，1000×，10,000×，100,000×或1,000,000×的非宿主核酸。

在一些实施方式中，样品可以获自来自生物体或细胞培养物的细胞，流体，组织或器官，例如血液、血清、血浆、眼泪、唾液、粘液、尿液、乳液、精液、肌肉、心脏、肝脏、皮肤、肝脏、肾脏或脂肪组织。在一些实施方式中，样品可以来自细胞培养物。在一些实施方式中，样品是环境样品，例如土壤、水或空气样品。在一些实施方式中，样品是生物样品。在一些实施方式中，样品来自人。在一些实施方式中，样品来自非人真核生物。在一些实施方式中，样品来自动物。在一些实施方式中，样品来自植物。在一些实施方式中，样品来自真菌。在一些实施方式中，样品来自原生动物。在一些实施方式中，样品包含来自至少两种不同原核生物的核酸。在一些实施方式中，样品包含来自人和细菌生物的核酸。在一些实施方式中，样品包含来自真核和原核生物的核酸。在一些实施方式中，样品包含来自至少两种不同的真核生物的核酸。在一些实施方式中，样品包含来自未知生物的核酸。

RNA的选择性富集

一些实施方式包括从含有靶RNA和非靶RNA的样品中选择性除去靶RNA。在一些实施方式中，单链DNA探针与靶RNA杂交。在一些实施方式中，单链DNA探针包含与选自核糖体RNA，tRNA和mRNA的序列互补的序列。在一些实施方式中，可以将多个单链DNA探针与样品中的一个或多个靶RNA杂交。单链DNA探针与靶RNA杂交。可以使双链RNA/DNA杂合体与选择性降解双链RNA/DNA杂合体的RNA的RNA酶，例如RNA酶H接触。可以用DNA酶降解单链DNA。在一些实施方式中，可以用可包括使非靶RNA与基质结合，使非靶RNA与捕获探针杂交，或进行凝胶过滤的方法捕获非靶RNA。在一些实施方式中，基质包括固相可逆固定化(SPRI)珠。在一些实施方式中，非靶RNA可以被逆转录。一些实施方式还包括从逆转录的非靶RNA制备核酸文库。一些实施方式还包括对核酸文库测序。在图5中描绘了实例实施方式，其中RNA样品包含病原体RNA 250和人宿主RNA 260。可以将靶向宿主RNA的单链DNA 270与RNA样品杂交以与宿主RNA形成RNA/DNA杂交体280。可以用RNA酶H消化RNA/DNA杂合体的RNA链，并且可以用DNA酶消化剩余的单链DNA链300以留下非靶向病原体RNA。RNA可以被逆转录并用于产生核酸文库。

本文提供的方法和组合物的一些实施方式包括从样品富集蛋白质衣壳中含有的病毒核酸。在一些实施方式中，样品可包含含有病毒核酸的蛋白质衣壳。在一些实施方式中，样品还可包含病毒衣壳或其他类型的蛋白质衣壳中不含的靶核酸。在一些实施方式中，靶核酸可包含在囊泡如外泌体或凋亡小体中。通过用将核酸酶(例如DNA酶或RNA酶)递送至靶核酸而不递送至病毒核酸的试剂处理样品，可以在样品中选择性降解靶核酸。递送剂的实例包括阳离子聚合物，例如转染试剂。非靶核酸可用于制备核酸文库。如图6所示，可以使用可以进入囊泡的递送剂，使包含双链和单链核酸的无细胞核酸320，和含有单链核酸、双链核酸的囊泡330，或含有病毒核酸的蛋白质衣壳340，与DNA酶和RNA酶接触。蛋白质衣壳340中含有的核酸被保护免受消化。

核酸文库的制备

本文提供的一些实施方式涉及制备核酸文库。在一些实施方式中，可以对核酸文库测序。在一些这样的实施方式中，可以使用本文提供的方法和组合物选择性切割多核苷酸样品中的靶核酸。可以从样品除去切割的靶核酸，并且剩余的非靶核酸可以用于制备核酸文库。文库制备试剂的实例包括转座子，连接酶和测序引物。在另一个实施方式中，可以从多核苷酸样品制备核酸文库，并且可以使用本文提供的方法和组合物从文库中选择性切割并除去靶核酸。

在一些实施方式中，使用基于连接的文库制备方法，如TruSeq(Illumina,Inc，SanDiego CA)。基于连接的文库制备方法通常利用接头设计，其可在初始连接步骤中引入索引序列，并且通常可用于制备用于单读取测序、成对端测序和多重测序的样品。例如，核酸，如片段化核酸或无细胞DNA，可以通过填充反应，核酸外切酶反应或其组合来进行末端修复。在一些实施方式中，然后可以将所得平末端修复核酸延伸单个核苷酸，其与接头/引物的3'端上的单个核苷酸突出端互补。任何核苷酸均可用于延伸/突出端核苷酸。在一些实施方式中，核酸文库制备包括连接接头寡核苷酸。接头寡核苷酸通常与流动池锚互补，并且有时用于将核酸文库固定在固相支持物上，例如流动池的内表面。在一些实施方式中，接头寡核苷酸包含标识符、一个或多个测序引物杂交位点，例如与引物互补的序列，所述引物包括通用测序引物、单端测序引物、成对端测序引物和多重测序引物。

在一些实施方式中，使用基于转座子的文库制备方法，例如Nextera(Epicentre，Madison，Wis.)。基于转座子的方法可以使用体外转座以在单管反应中对DNA同时进行片段化和标签化。这可以允许引入平台特异性标签和任选的条形码，和制备测序仪即用型DNA文库。

在一些实施方式中，通过PCR或其他公知方法扩增核酸文库或或其部分。在一些实施方式中，测序方法包括核酸文库扩增。核酸文库可以在固定到固体支持物(如流动池中的固体支持物)上之前或之后进行扩增。核酸扩增包括通过产生模板和/或其互补物的一个或多个拷贝来扩增或增加存在的核酸模板和/或其互补物的数量的过程。扩增可以通过任何合适方法进行。在一些实施方式中，可使用接头序列中的引物位点扩增文库，并使用接头序列中的测序引物位点进行测序。在一些实施方式中，接头序列可包括识别核酸来源的索引。通过形成引物二聚体可以降低后续扩增步骤的效率。为了提高后续扩增步骤的效率，可以从连接产物除去未连接的单链接头。

本文提供的一些实施方式可包括对核酸进行测序。测序技术的实例包括合成测序(SBS)。在SBS中，监测核酸引物沿核酸模板的延伸，以确定模板中的核苷酸的序列。作为基础的化学过程可以是聚合。在特定的基于聚合酶的SBS实施方式中，添加荧光标记的核苷酸以以模板依赖性方式延伸引物，使得可以使用对添加至引物的核苷酸的顺序和类型的检测以确定模板的序列。可以对一个或多个扩增的核酸进行SBS或其他涉及在循环中重复递送试剂的检测技术。例如，为了启动第一个SBS循环，可以使一个或多个标记核苷酸、DNA聚合酶等流入/通过容纳一个或多个扩增的核酸分子的水凝胶珠。可以检测到引物延伸导致掺入标记核苷酸的那些位点。任选地，核苷酸可以还包括可逆的终止性质，一旦将核苷酸添加至引物，该可逆的终止性质终止进一步的引物延伸。例如，可以将具有可逆终止子部分的核苷酸类似物添加至引物，使得后续延伸直到递送解封闭剂以除去该部分才发生。因此，对于使用可逆终止的实施方式，可以在检测发生之前或之后将解封闭剂递送至流通池。可以在各个递送步骤之间进行洗涤。然后可以重复该循环n次以将引物延伸n个核苷酸，从而检测长度为n的序列。

一些SBS实施方式包括检测在将核苷酸掺入延伸产物后释放的质子。例如，基于对释放的质子的检测的测序可以使用电检测器和可商购的相关技术。这样的测序系统的实例是焦磷酸测序，例如来自Roche的子公司454Life Sciences的可商购平台；使用γ-磷酸标记的核苷酸的测序，例如来自Pacific Biosciences的可商购平台；和使用质子检测的测序，例如来自Life Technologies的子公司Ion Torrent的可商购平台。

焦磷酸测序检测在特定核苷酸被掺入新生核酸链中时无机焦磷酸酯(PPi)的释放。在焦磷酸测序中，释放的PPi可以通过被ATP硫酸化酶立即转化为三磷酸腺苷(ATP)来检测，并且可以通过荧光素酶产生的质子来检测生成的ATP的水平。因此，可以通过发光检测系统监测测序反应。焦测序程序不需要用于基于荧光的检测系统的激发辐射源。

一些实施方式可以利用涉及实时监测DNA聚合酶活性的方法。例如，可以通过带有荧光团的聚合酶和γ-磷酸标记的核苷酸之间的荧光共振能量转移(FRET)相互作用，或通过零模波导(ZMW)，来检测核苷酸掺入。另一种有用的测序技术是纳米孔测序。在一些纳米孔实施方式中，靶核酸或从靶核酸除去的个体核苷酸穿过纳米孔。随着核酸或核苷酸穿过纳米孔，可以通过测量孔的电导率的波动来识别每种核苷酸类型。

在分离核酸、扩增和测序的方法中，各种试剂可用于核酸分离和制备。实例试剂包括溶菌酶；蛋白酶K；随机六聚体；聚合酶，如Φ29DNA聚合酶，Taq聚合酶，Bsu聚合酶；转座酶，如Tn5；引物，如P5和P7接头序列；连接酶；脱氧核苷酸三磷酸；缓冲液；和二价阳离子。

接头可包含测序引物位点、扩增引物位点、和索引。如本文所用，“索引”可包括核苷酸序列，其可以用作分子标识符和/或条形码以标记核酸，和/或识别核酸的来源。在一些实施方式中，索引可用于识别单个核酸或核酸亚群。在一些实施方式中，可以在流动池装置上的水凝胶内制备核酸文库。

试剂盒

本文提供的方法和组合物的一些实施方式包括试剂盒。一些实施方式包括用于通过重组酶介导的切割来选择性切割靶核酸的试剂盒。在一些实施方式中，试剂盒可包括单链核酸探针、重组酶和第一核酸酶。重组酶的实例包括RecA、UvsX、RAD51及其衍生物。第一核酸酶的实例包括核酸酶S1、绿豆核酸酶、和包含具有核酸酶活性的结构域和单链核酸结合结构域的重组蛋白。在一些实施方式中，试剂盒可包括多个不同单链核酸探针。在一些实施方式中，单链核酸探针可包含与靶核酸，例如线粒体DNA，重复元件如散在重复、串联重复和长末端重复互补的序列。在一些实施方式中，试剂盒还可包含一种或多种组分，例如聚合酶、单链结合蛋白、终止子核苷酸、dUTP核苷酸、第二核酸酶，例如尿嘧啶DNA糖基化酶、无嘌呤/无嘧啶内切核酸酶、和DNA糖基化酶核酸内切酶VII，以及从非靶核酸(例如SPRI珠)除去切割的靶核酸的试剂。

一些实施方式包括用于制备单链核酸探针库的试剂。用于制备单链核酸探针文库的实例试剂可包括在双链DNA上形成切口的酶，例如DNA酶I，在有切口的双链DNA上产生缺口的酶，例如核酸外切酶III，将双链DNA变性为单链物种的试剂，和从单链DNA除去双链DNA的试剂中的一种或多种。用于制备单链核酸探针文库的更多实例试剂可包括多个简并引物中的一个或多个，和嗜热聚合酶。在一些实施方式中，简并引物包含纯化标签，例如生物素。在一些实施方式中，简并引物包含可切割接头，例如可用于从简并引物产生的产物除去纯化标签的poly-U序列。在一些实施方式中，试剂盒可包括基质以捕获从简并引物产生的产物，例如珠，例如用链霉亲和素包被的珠。

本文提供的方法和组合物的一些实施方式包括用于对含有靶RNA和非靶RNA的样品进行选择性富集的试剂盒。在一些实施方式中，试剂盒可包括含有与靶RNA互补的序列的单链DNA探针，RNA酶H，和DNA酶。在一些实施方式中，试剂盒可包括多个不同的单链DNA探针。在一些实施方式中，单链DNA探针包含与选自核糖体RNA、tRNA和mRNA的序列互补的序列。

实施例

实施例1—制备核酸探针文库

基因组DNA获自人成纤维细胞系。使用简并引物文库扩增基因组DNA，简并引物各自包含通过poly-U接头与引物连接的5'生物素标签。扩增产物被捕获在链霉亲和素珠上，并且使用尿嘧啶DNA糖基化酶切割接头。将扩增产物变性为单链核酸，并通过超声来片段化。制备了人特异性单链核酸探针的文库。

实施例2：使含有人和非人DNA的样品去宿主化

DNA样品获自人血液。通过人DNA的重组酶介导选择性切割，从DNA样品除去人DNA。简言之，将DNA样品与实施例1的文库、UvsX重组酶、DNA聚合酶、和核酸酶S1混合。使用SPRI珠捕获非人DNA，并通过洗涤珠除去切割的人DNA。从非人DNA制备了核酸文库，并且对文库测序。

实施例3-使用RNA酶H进行的核糖体和珠蛋白RNA的耗竭

衍生自血液样品的人RNA样品与靶向核糖体RNA和珠蛋白mRNA序列的单链DNA寡核苷酸杂交。已经与单链DNA寡核苷酸杂交的RNA被RNA酶H降解，单链DNA寡核苷酸被DNA酶降解。逆转录剩余的RNA，制备了核酸文库，并对文库测序。在图5中描绘了实例工作流程。将序列与数据库中的序列比对。从已经用单链DNA寡核苷酸和RNA酶H处理的RNA获得的序列中超过85％与数据库中的序列对齐。相比之下，从已经用单链DNA寡核苷酸而未用RNA酶H处理的RNA获得的序列中少于12％与数据库中的序列对齐。因此，用单链DNA寡核苷酸和RNA酶H进行处理大大提高了比对的灵敏度。

如本文所用，术语“包含”与“包括”、“含有”或“特征在于……”同义，并且是包括性的或开放性的，不排除另外的、未记载的要素或方法步骤。

以上描述公开了本发明的多种方法和材料。本发明容许方法和材料的改变，以及制造方法和设备的改变。通过考虑本文公开的本发明的该公开内容或实践，这样的改变对于本领域技术人员将变得显而易见。因此，无意将本发明限制于本文公开的特定实施方式，而是其涵盖了落入本发明的真实范围和精神内的所有改变和替代。

本文引用的所有参考文献，包括但不限于已公布和未公布的申请、专利和文献参考，其全部内容均通过引用并入本文，并因此成为本说明书的一部分。对于通过引用并入的出版物和专利或专利申请与本说明书中包含的公开内容相矛盾的程度，本说明书旨在代替和/或优先于任何这样的相矛盾的内容。

Claims (70)

1.一种在样品中非靶核酸存在下选择性切割靶核酸的方法，其包括：

(a)获得包含靶核酸的样品，其中所述靶核酸是双链的；

(b)使所述靶核酸与单链核酸探针和重组酶接触，使得形成所述靶核酸中的D环；和

(c)使所述D环与核酸酶接触，从而切割所述靶核酸。

2.权利要求1所述的方法，其中所述样品包含非靶核酸。

3.权利要求2所述的方法，其还包括：(d)从所述非靶核酸除去所切割的靶核酸。

4.权利要求1-3中任一项所述的方法，其中步骤(b)是在稳定所述D环的条件下进行。

5.权利要求4所述的方法，其中步骤(b)包括使所述D环与聚合酶接触。

6.权利要求5所述的方法，其还包括延伸所述单链核酸探针。

7.权利要求6所述的方法，其中核酸扩增反应包括延伸所述单链核酸探针，所述核酸扩增反应选自等温扩增反应和PCR。

8.权利要求6所述的方法，其中所述单链核酸探针的延伸处于实质性抑制延伸速率的条件下。

9.权利要求6所述的方法，其中所述延伸是在终止子核苷酸的存在下进行。

10.权利要求6所述的方法，其中所述延伸是在有限量的至少一种类型的核苷酸的存在下进行。

11.权利要求6所述的方法，其中所述聚合酶是DNA聚合酶。

12.权利要求6所述的方法，其还包括降解从所述核酸探针延伸的核酸。

13.权利要求12所述的方法，其包括将dUTP核苷酸掺入所述延伸的核酸中，并使所述延伸的核酸与选自尿嘧啶DNA糖基化酶，无嘌呤/无嘧啶内切核酸酶，和DNA糖基化酶内切核酸酶VII的核酸酶接触。

14.权利要求1所述的方法，其中步骤(b)还包括使所述D环与单链结合蛋白接触。

15.权利要求1所述的方法，其中所述重组酶选自RecA、UvsX、RAD51及其衍生物。

16.权利要求15所述的方法，其中所述重组酶包括UvsX重组酶。

17.权利要求1所述的方法，其中所述核酸酶是单链特异性核酸内切酶。

18.权利要求17所述的方法，其中所述核酸酶选自S1核酸酶和绿豆核酸酶。

19.权利要求1所述的方法，其中所述核酸酶包括包含核酸酶结构域和单链核酸结合结构域的重组蛋白。

20.权利要求19所述的方法，其中所述核酸酶结构域衍生自FokⅠ蛋白或TevI蛋白，并且所述单链结合结构域衍生自Sso7d蛋白。

21.权利要求3-20中任一项所述的方法，其中步骤(d)包括选自以下的步骤：使所述非靶核酸结合至基质，使所述非靶核酸杂交至捕获探针，和进行凝胶过滤。

22.权利要求21所述的方法，其中所述基质包括固相可逆固定化(SPRI)珠。

23.权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述单链核酸探针具有范围为10个核苷酸至100个核苷酸的长度。

24.权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述单链核酸探针具有范围为30个核苷酸至60个核苷酸的长度。

25.权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述单链核酸探针与选自以下的序列互补：线粒体DNA和重复元件，所述重复元件选自散在重复、串联重复和长末端重复。

26.权利要求1所述的方法，其中所述单链核酸探针获自化学合成。

27.权利要求1所述的方法，其中所述单链核酸探针获自基因组DNA的片段。

28.权利要求1所述的方法，其中所述单链核酸探针获自cDNA。

29.权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述靶核酸是基因组DNA。

30.权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述靶核酸是哺乳动物的。

31.权利要求1-30中任一项所述的方法，其中所述靶核酸是人的。

32.权利要求2-31中任一项所述的方法，其中所述非靶核酸选自真核核酸、原核核酸、和病毒核酸。

33.权利要求2-32中任一项所述的方法，其中病原体包含所述非靶核酸。

34.权利要求2所述的方法，其还包括(e)制备包含所述非靶核酸的核酸文库。

35.权利要求34所述的方法，其包括使所述非靶核酸与选自转座子、连接酶和测序引物的文库制备试剂接触。

36.权利要求34所述的方法，其中在步骤(d)之后进行(e)。

37.权利要求34所述的方法，其中在步骤(b)之前进行(e)。

38.权利要求34所述的方法，其还包括对所述非靶核酸进行测序。

39.权利要求1所述的方法，其中所述样品包含多个靶核酸。

40.权利要求39所述的方法，其中所述多个靶核酸包含不同的靶核酸。

41.权利要求2所述的方法，其中所述样品包含多个非靶核酸。

42.权利要求41所述的方法，其中所述多个非靶核酸包含不同的非靶核酸。

43.权利要求1所述的方法，其还包括使所述靶核酸与多个单链核酸探针接触。

44.权利要求43所述的方法，其中所述多个单链核酸探针包含不同的单链核酸探针。

45.一种用于使包含靶核酸和非靶核酸的样品去宿主化的试剂盒，所述试剂盒包括：

单链核酸探针；

重组酶；和

第一核酸酶。

46.权利要求45所述的试剂盒，其还包括选自以下的组分：聚合酶、单链结合蛋白、终止子核苷酸、dUTP核苷酸、和第二核酸酶，所述第二核酸酶选自尿嘧啶DNA糖基化酶、无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶、和DNA糖基化酶核酸内切酶VII。

47.权利要求45或46所述的试剂盒，其中所述重组酶选自RecA、UvsX、RAD51及其衍生物。

48.权利要求45-47中任一项所述的试剂盒，其中所述第一核酸酶选自S1核酸酶、绿豆核酸酶、和包含具有核酸酶活性的结构域和单链核酸结合结构域的重组蛋白。

49.权利要求45-48中任一项所述的试剂盒，其包括多个单链核酸探针。

50.权利要求49所述的试剂盒，其中所述多个单链核酸探针包含不同的单链核酸探针。

51.一种从样品中的非靶RNA除去靶RNA的方法，其包括：

(a)获得包含靶RNA和非靶RNA的样品；

(b)使单链DNA探针与所述靶RNA杂交；

(c)用核酸酶选择性切割与所述单链DNA探针杂交的所述靶RNA；和

(d)从所述非靶RNA除去所切割的靶RNA。

52.权利要求51所述的方法，其中所述核酸酶对RNA/DNA杂交体具有特异性。

53.权利要求51所述的方法，其中所述核酸酶是RNA酶H。

54.权利要求51所述的方法，其中步骤(d)包括通过使所述单链DNA探针与DNA酶接触来除去所述单链DNA探针。

55.权利要求51所述的方法，其中步骤(d)包括选自以下的步骤：使所述非靶RNA结合至基质，使所述非靶RNA杂交至捕获探针，和进行凝胶过滤。

56.权利要求55所述的方法，其中所述基质包括固相可逆固定化(SPRI)珠。

57.权利要求51的方法，其还包括反转录所述非靶RNA。

58.权利要求51所述的方法，其还包括制备核酸文库。

59.权利要求58所述的方法，其还包括对所述非靶RNA进行测序。

60.权利要求51的方法，其中所述单链DNA探针与选自核糖体RNA、tRNA和mRNA的序列互补。

61.权利要求51所述的方法，其中所述样品包含多个靶RNA和/或多个非靶RNA。

62.权利要求51所述的方法，其还包括使所述靶RNA与多个单链DNA探针杂交。

63.一种用于使包含靶RNA和非靶RNA的样品去宿主化的试剂盒，所述试剂盒包括：

单链DNA探针；和

RNA酶H。

64.权利要求63所述的试剂盒，其还包括选自DNA酶、逆转录酶的组分。

65.权利要求63或64所述的试剂盒，其包括多个单链核酸探针。

66.权利要求65所述的试剂盒，其中所述多个单链核酸探针包含不同的单链核酸探针。

67.权利要求63所述的试剂盒，其中所述单链DNA探针与选自核糖体RNA、tRNA和mRNA的序列互补。

68.一种从包含含有病原体核酸的蛋白质衣壳的样品富集所述病原体核酸的方法，所述方法包括：

获得包含含有病原体核酸和宿主核酸的蛋白质衣壳的样品；

通过使所述样品与选自DNA酶和RNA酶的核酸酶在其中所述核酸酶不接触所述病原体核酸的条件下接触，选择性切割所述宿主核酸。

69.权利要求68所述的方法，其中选自外泌体和凋亡小体的囊泡包含所述宿主核酸。

70.权利要求68所述的方法，其中所述样品与核酸酶和阳离子聚合物接触。

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