CN109868270A - 低起始量的dna文库构建方法 - Google Patents
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Abstract
一种低起始量的DNA文库构建方法,该方法包括:取基因组DNA加入标记有生物素的随机引物进行退火并进行扩增反应;分离纯化全基因组扩增产物;对分离纯化的产物进行末端补平得到线性平末端DNA;在补平的线性平末端DNA中加入连接酶进行连接反应;纯化获得双链环状DNA,然后将双链环状DNA打断成线性DNA片段;使用链霉素磁珠捕获标记有生物素的线性DNA片段;对捕获的线性DNA片段进行末端修复以及加A尾碱基反应;在加A尾碱基反应后的线性DNA片段两端连接接头;对连接接头的产物进行PCR扩增得到DNA文库。本方法利用生物素标记的随机引物对少量基因组DNA进行随机扩增,同时实现基因组DNA的放大、截短和生物素标记,从而实现低起始量投入的大片段DNA文库构建。
Description
技术领域
本发明涉及文库构建技术领域,具体涉及一种低起始量的DNA文库构建方法。
背景技术
高通量测序(High-Throughput Sequencing),即下一代测序技术(Nextgeneration sequencing),是通过在高密度生物芯片上实现大规模平行测序,具有数据产量高,单位数据量成本低的特点。但其缺点在于测序读长短,一般测序长度为2X300bp或者2X150bp。获得的短读长序列在无参考基因组比对拼接,或者含有高度复杂结构序列的基因组时,序列的比对和拼接会非常困难。此时,通过大跨度的大片段文库(mate pairlibrary)可以辅助短序列的拼接组装。此外,通过link算法对大片段文库进行分析,可以检测染色体大片段的结构变异,如插入、缺失、倒位、异位等。
目前市面上的大片段文库构建商业试剂盒主要分为物理法和酶切法两种,物理法如Illumia公司提供的Mate pair Library V2试剂盒,能够构建2-10Kb插入片段的文库,起始投入DNA要求4微克以上;酶切法如VAZYME公司的用于Illumia平台的VAHTS Mate PairLibrary Prep Kit,可提供切胶法和非切胶法两种建库策略,其中切胶法可以构建5-10Kb的插入片段文库,起始投入量为4微克DNA,非切胶法只需要投入1微克DNA,但插入片段较为弥散,主要插入片段大小为1500-2000bp。
基于物理法的大片段文库构建方法主要是通过超声波将基因组DNA打断成特定大小范围的片段化DNA,再通过末端修复或者接头连接的方式在片段化DNA的两端标记上生物素,然后连接环化形成双链环状DNA,未环化的线性DNA则用内切酶消化。环状DNA再次使用超声波随机打断成200~400bp主峰的片段化DNA,此时部分片段DNA(即连接环化时的连接处片段)携带有生物素标记,而部分片段DNA没有携带。使用链霉素磁珠捕获标记有生物素的DNA片段,未标记生物素的DNA片段则被洗去。捕获下来的DNA再经过一系列末端修复、加“A”和接头连接、PCR扩增反应后即可获得大片段文库。基于物理法的大片段文库构建方法,一方面起始投入DNA要求较高,因为超声波打断会使得基因组DNA被随机降解,造成DNA的大量损耗;另一方面通过末端修复的方式在片段DNA两端标记生物素的方式效率相对较低。使得很多没有标记上的DNA白白浪费,进一步提高了初始DNA投入需求量。此外物理法还必须依赖特定的超声波打断设备,并且整个建库流程相比于酶切法来说,更为繁琐。
基于酶切法的大片段文库构建方法,则主要是通过转座酶将标记有生物素的识别序列随机插入到基因组DNA中,同时使DNA随机片段化成合适大小。补平后同样采用平末端连接环化,内切酶消化未环化的线性DNA,超声波打断成小片段DNA,链霉素磁珠捕获生物素标记的DNA片段,后续流程与物理法一致。基于酶切法的大片段文库构建方法,相比于物理法有一定优势,其在于操作简单,无需特定的超声波打断设备。但由于转座酶处理的片段DNA大小比较难以控制并且整个片段范围比较弥散。所能分离获得的特定大小片段的DNA则比较少,不足以满足双链环化的需求,反之则需要提高起始投入DNA量来弥补这一缺陷。此外酶切反应极易受到DNA完整度、纯度的影响,再实际操作过程中会极大的提高建库失败率。
从上面的描述中可以看出,大片段文库构建相比于常规的文库构建,主要需要将基因组DNA打断成合适的片段范围(如2-10Kb)并且在DNA片段的两端标记上生物素,标记产物平末端连接形成双链环状DNA,打断后链霉素磁珠捕获等环节。这些环节都会损失大量的DNA,不得不提高起始DNA投入量。
从应用上来说,大片段文库主要应用在基因组组装和染色体结构变异检测方面。在传统的基因组组装中,所能提供的DNA量往往比较充足。但随着这一技术应用在临床染色体结构变异检测中,所面临的一些样本类型可能比较难以获得或者量比较少,比如肿瘤穿刺样本、羊水细胞、石蜡切片等等。这时样本DNA可能就无法满足常规大片段建库的需求。因此开发一种低起始量的大片段建库方法则有利于解决这一问题。
发明内容
本申请提供一种低起始量的DNA文库构建方法,该方法利用生物素标记的随机引物对少量基因组DNA进行随机扩增,同时实现基因组DNA的放大、截短和生物素标记,从而实现低起始量投入的大片段DNA文库构建。
本发明通过如下技术方案实现:
一种低起始量的DNA文库构建方法,包括如下步骤:
(1)取10-50ng基因组DNA作为模板,加入标记有生物素的随机引物进行退火,并在扩增酶的作用下进行扩增反应,获得上述基因组DNA的全基因组扩增产物;
(2)分离纯化上述全基因组扩增产物;
(3)对分离纯化的上述全基因组扩增产物进行末端补平得到线性平末端DNA;
(4)在补平的线性平末端DNA中加入连接酶进行连接反应,形成双链环状DNA;
(5)纯化获得上述双链环状DNA,然后将上述双链环状DNA打断成线性DNA片段;
(6)使用链霉素磁珠捕获标记有生物素的线性DNA片段;
(7)对捕获的线性DNA片段进行末端修复以及加A尾碱基反应;
(8)在上述加A尾碱基反应后的线性DNA片段两端连接接头;和
(9)对上述连接接头的产物进行PCR扩增得到DNA文库。
在优选实施例中,上述步骤(2)中,使用琼脂糖凝胶电泳并切胶回收分离纯化上述全基因组扩增产物。
在优选实施例中,上述步骤(2)中,分离纯化的全基因组扩增产物的片段大小在3-6Kb。
在优选实施例中,上述步骤(4)中,在上述连接反应之后,加入外切酶消化未成环的上述线性平末端DNA。
在优选实施例中,上述步骤(5)中,使用超声波打断仪将上述双链环状DNA打断成线性DNA片段。
在优选实施例中,上述步骤(5)中,打断成的线性DNA片段的主峰为200-400bp。
在优选实施例中,上述步骤(1)中,标记有生物素的随机引物的序列为BIO-GAGANNNNNNNN(SEQ ID NO:1),其中BIO为生物素标记,NNNNNNNN为8碱基随机序列。
在优选实施例中,上述步骤(1)中,上述扩增酶是phi 29 DNA聚合酶。
在优选实施例中,上述步骤(8)中,上述接头的序列如下:
通用接头序列:
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’(SEQID NO:2);
DNA接头96-X:
5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’(SEQ ID NO:3),其中NNNNNNNN为用于文库拆分的标签序列。
在优选实施例中,上述步骤(9)中,上述PCR扩增使用的引物如下:
正向引物:AATGATACGGCGACCACCGA(SEQ ID NO:4);
反向引物:CAAGCAGAAGACGGCATACGA(SEQ ID NO:5)。
本发明采用全基因组恒温扩增对少量基因组DNA进行随机扩增,极大减少了大片段建库投入起始所需DNA量,使得许多样本稀少或者取样困难的样本类型也可用于大片段文库检测。采用标记了生物素的随机引物进行全基因组扩增,扩增产物直接在两端标记上了生物素,可用于后续环化及磁珠捕获,缩减了实验流程。采用全基因组恒温扩增技术,在放大DNA量的同时,随机将序列截断,后续实验可根据需求切胶分离所需片段大小,无需依赖超声波打断设备。
附图说明
图1为本发明实施例的低起始量的DNA文库构建方法流程示意图;
图2为本发明实施例的全基因组扩增后产物电泳图;
图3为本发明实施例的大片段文库插入片段大小分析结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。在以下的实施方式中,很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而,本领域技术人员可以毫不费力的认识到,其中部分特征在不同情况下是可以省略的,或者可以由其他材料、方法所替代。
另外,说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时,方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此,说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例,并不意味着是必须的顺序,除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。
本发明的主要目的是提供一种可以用于Illumina高通量测序平台的低起始量的大片段DNA文库构建方法,该方法主要解决以下问题:
(1)降低起始DNA投入量。常规的物理法或者酶切法一般需要4微克以上的基因组DNA以上,本方法采用生物素标记的随机引物对基因组DNA进行全基因组扩增,起始DNA仅需要5-50ng基因组DNA即可满足后续建库需求。
(2)减少对贵重仪器的依赖。本方法采用随机引物恒温扩增法对样本DNA进行随机扩增,扩增产物呈弥散状,经片段选择后可用于双链环化及后续实验,而不需依赖于超声波打断仪。
(3)缩短建库流程。本方法采用生物素标记的随机引物对基因组DNA进行扩增,在扩增了DNA的同时,将基因组DNA进行了随机片段化,同步完成了DNA末端的生物素标记,缩短了建库流程。
如图1所示,本发明的低起始量的大片段DNA文库构建方法,其可以用于Illumina高通量测序平台,包括以下步骤:
(1)取10-50ng基因组DNA,加入标记有生物素的随机引物进行退火。在本发明一个实施例中,随机引物的序列为BIO-GAGANNNNNNNN(SEQ ID NO:1),其中BIO为生物素标记,NNNNNNNN为8碱基随机序列。
在本发明一个实施例中,随机引物进行退火的反应体系如下表1:
表1
反应条件为95℃3min,4℃10min。
(2)在退火产物中分别加入恒温扩增酶进行反应,获得样本基因组DNA全基因组扩增产物。在本发明一个实施例中,扩增酶是phi 29 DNA聚合酶(phi29 DNA polymerase)。
在本发明一个实施例中,在步骤(2)中加入phi 29 DNA聚合酶2微升,即表1的体系中加入phi 29 DNA聚合酶2微升,反应条件为30℃4h。
图2示出了本发明一个实施例中全基因组扩增后产物电泳图,可见全基因组扩增后产物呈弥散分布。
(3)使用琼脂糖凝胶电泳并切胶分离所需特定片段大小的DNA产物(如3-6Kb),胶回收纯化。
在本发明一个实施例中,步骤(3)中使用0.8%的琼脂糖凝胶电泳进行分离和切胶回收,切胶范围为3-6Kb。
(4)对纯化的切胶产物进行末端补平。
在本发明一个实施例中,步骤(4)中反应体系如下表2:
表2
反应条件为22℃温浴30min。
(5)在补平的线性平末端DNA中加入连接酶,过夜连接形成双链环状DNA。
在本发明一个实施例中,步骤(5)反应体系如下表3:
表3
反应条件为16℃,反应12-16h。
(6)加入外切酶,消化未成环的线性DNA。
在本发明一个实施例中,步骤(6)中反应体系如下表4:
表4
反应条件为37℃,30min;65℃,20min。
(7)纯化获得双链环状DNA,使用超声波打断仪将环状DNA再次打断成主峰为200-400bp的线性DNA。
(8)使用链霉素磁珠捕获标记有生物素的线性DNA片段。
(9)对捕获的线性DNA片段进行末端修复及加“A”反应。
在本发明一个实施例中,步骤(9)中,反应体系如下表5:
表5
反应条件为20℃,30min;65℃15min。
(10)接头连接。
在本发明一个实施例中,步骤(10)中,反应体系如下表6:
表6
反应条件为20℃,20min。
其中,用于Illumina平台的接头序列如下:
通用接头序列:
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’(SEQID NO:2);
DNA接头96-X:
5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’(SEQ ID NO:3),其中NNNNNNNN为用于文库拆分的标签序列。
(11)PCR扩增、纯化及获得大片段文库。
在本发明一个实施例中,步骤(11)中,反应体系如下表7:
表7
反应条件为:95℃,3min;(95℃,10s;60℃,20s;72℃,10s)14个循环;72℃,5min。
其中,PCR扩增使用的引物如下:
正向引物:AATGATACGGCGACCACCGA(SEQ ID NO:4);
反向引物:CAAGCAGAAGACGGCATACGA(SEQ ID NO:5)。
图3示出了本发明一个实施例的大片段文库插入片段大小分析结果图。
以上应用了具体个例对本发明进行阐述,只是用于帮助理解本发明,并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员,依据本发明的思想,还可以做出若干简单推演、变形或替换。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳乐土生物科技有限公司
<120> 低起始量的DNA文库构建方法
<130> 18I27608
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(12)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 1
gagannnnnn nn 12
<210> 2
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58
<210> 3
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(41)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 3
gatcggaaga gcacacgtct gaactccagt cacnnnnnnn natctcgtat gccgtcttct 60
gcttg 65
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aatgatacgg cgaccaccga 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
caagcagaag acggcatacg a 21
Claims (10)
1.一种低起始量的DNA文库构建方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:
(1)取10-50ng基因组DNA作为模板,加入标记有生物素的随机引物进行退火,并在扩增酶的作用下进行扩增反应,获得所述基因组DNA的全基因组扩增产物;
(2)分离纯化所述全基因组扩增产物;
(3)对分离纯化的所述全基因组扩增产物进行末端补平得到线性平末端DNA;
(4)在补平的线性平末端DNA中加入连接酶进行连接反应,形成双链环状DNA;
(5)纯化获得所述双链环状DNA,然后将所述双链环状DNA打断成线性DNA片段;
(6)使用链霉素磁珠捕获标记有生物素的线性DNA片段;
(7)对捕获的线性DNA片段进行末端修复以及加A尾碱基反应;
(8)在所述加A尾碱基反应后的线性DNA片段两端连接接头;和
(9)对所述连接接头的产物进行PCR扩增得到DNA文库。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(2)中,使用琼脂糖凝胶电泳并切胶回收分离纯化所述全基因组扩增产物。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述步骤(2)中,分离纯化的全基因组扩增产物的片段大小在3-6Kb。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(4)中,在所述连接反应之后,加入外切酶消化未成环的所述线性平末端DNA。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(5)中,使用超声波打断仪将所述双链环状DNA打断成线性DNA片段。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述步骤(5)中,打断成的线性DNA片段的主峰为200-400bp。
7. 根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(1)中,标记有生物素的随机引物的序列为BIO-GAGANNNNNNNN(SEQ ID NO:1),其中BIO为生物素标记,NNNNNNNN为8碱基随机序列。
8. 根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(1)中,所述扩增酶是phi 29DNA聚合酶。
9.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(8)中,所述接头的序列如下:
通用接头序列:
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’(SEQ IDNO:2);
DNA接头96-X:
5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’(SEQ ID NO:3),其中NNNNNNNN为用于文库拆分的标签序列。
10.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(9)中,所述PCR扩增使用的引物如下:
正向引物:AATGATACGGCGACCACCGA(SEQ ID NO:4);
反向引物:CAAGCAGAAGACGGCATACGA(SEQ ID NO:5)。
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