CN108753936A

CN108753936A - 一种同步检测猪五种繁殖障碍性病毒病多重pcr体系及检测方法

Info

Publication number: CN108753936A
Application number: CN201810645013.2A
Authority: CN
Inventors: 李文刚; 刘胜利; 吕玉金; 刘玲玲; 吴凤笋; 马文涛
Original assignee: Henan University of Animal Husbandry and Economy
Current assignee: Henan University of Animal Husbandry and Economy
Priority date: 2018-06-21
Filing date: 2018-06-21
Publication date: 2018-11-06

Abstract

本发明公开了一种同步检测猪五种繁殖障碍性病毒病多重PCR体系及检测方法，该方法的建立一方面可应用于临床样品的检测，另一方面为多重PCR诊断方法的建立奠定了基础。其技术方案如下：设计CSFV、PPV、PRRSV、JEV及PCV2特异性引物，提取病毒DNA和RNA，并将RNA进行反转录。随后，对设计的引物进行PCR反应条件的优化，确立最佳多重PCR反应体系及反应程序。按照最佳多重PCR反应条件进行试验，对该方法的特异性、敏感性及稳定性进行验证，同时进行临床样品检测以验证此方法操作的可行性。本发明不仅保留了常规PCR的高度特异性、敏感性，又减少了操作步骤，实现了一次扩增可同时检测多种微生物的目的，大大节省了时间，节约了经费开支。

Description

一种同步检测猪五种繁殖障碍性病毒病多重PCR体系及检测方法

技术领域

本发明涉及农业和动物检疫领域，特别是一种同时检测猪五种繁殖障碍性病毒病多重PCR诊断方法的建立，更具体地说，它涉及一种同步检测猪五种繁殖障碍性病毒病多重PCR体系及检测方法。

背景技术

随着规模化猪场不断增加，猪的疫病也日益呈现复杂化和严重化趋势，混合感染的比例大幅度上升，目前，猪繁殖障碍类疾病、消化道类疾病、呼吸道类疾病是影响我国生猪健康养殖、制约我国生猪产业发展的三座大山。其中猪繁殖障碍病已成为大中型猪场最重要的疫病之一，并且呈全球性分布。我国当前仍以猪瘟(CSF)、猪繁殖与呼吸障碍综合征(PRRS)、猪圆环病毒病(PCVDA)、猪细小病毒病(PPI)、日本乙型脑炎(JEV)以及猪伪狂犬病(PR)造成的繁殖障碍最为普遍和严重。现有的猪繁殖障碍性疾病的检测方法有血清学方法以及分子生物学方法等。血清学方法包括中和试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)、乳胶凝集试验、血凝试验与血凝抑制试验，胶体金免疫层析，其中中和试验应用较为广泛。分子生物学方法灵敏度高、特异性好，该方法主要包括核酸探针、基因芯片、PCR检测等。而对于基因芯片来说，传统的芯片平台因依赖于荧光标记技术，需要昂贵的扫描设备进行扫描以及操作过程复杂，对技术要求较高，难以做到基层推广。

对于危害我国养猪业发展的主要疫病快速准确诊断是控制该病的重要前提。多重PCR(mμLtiplex polymerase chain reaction,mPCR)即是在同一PCR反应体系中加入两对或两对以上的引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理、反应试剂和操作过程与一般PCR相同。与普通PCR相比，多重PCR具有特异性强、灵敏度高、检测时间短、成本低等优点，而且能够同时检测多种病原，利于对疾病作出快速、准确的诊断，适合大量临床病料中病原体的快速检测。

发明内容

本发明要解决的主要技术问题在于提供一种用于检测CSFV、PPV、PRRSV、JEV和PCV2的多重PCR诊断方法。该PCR检测方法的建立克服了传统病原分离及常规血清学诊断方法费时费力、敏感性差及特异性差等缺点。该方法的建立为今后利用多重PCR检测方法开展动物疫情临床诊断和研究提供理论依据，也为控制和消灭疫情奠定了基础。为此，本发明还提供一种用于上述方法的检测引物。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

依据生物学软件设计并合成特异性引物，用TE Buffer溶解并稀释合成好的特异性引物，按设定好的PCR反应体系及PCR反应程序进行引物扩增，并用琼脂糖凝胶电泳观察结果。

在本发明的一方面，提供一种CSFV、PPV、PRRSV、JEV及PCV2的多重PCR检测方法，即一种同步检测猪五种繁殖障碍性病毒病多重PCR体系及检测方法，具体步骤包括：

(1)PPV与PCV2病毒DNA的提取；

(2)CSFV、PRRSV和JEV病毒RNA的提取以及反转录；

(3)特异性引物设计与筛选；

(4)PCR反应条件优化；

(5)多重PCR扩增特异性验证；

(6)多重PCR敏感性验证；

(7)多重PCR稳定性验证；

(8)临床样品的检测；

作为本发明的进一步改进，步骤(1)中，所述的PPV和PCV2病毒DNA的提取方法为：取适量PPV和PCV2病毒液，置于1.5mL Eppendorf管中，参照上海生物工程的DNA提取试剂盒说明书进行。将提取的基因组DNA置于-20℃保存备用。

作为本发明的进一步改进，步骤(2)中，所述的CSFV、PRRSV、JEV病毒RNA的提取及反转录方法为：取CSFV、PRRSV和JEV病毒液，参照Magen公司Hipure Viral RNA Spin Kit试剂盒说明书提取病毒RNA。将提取的病毒RNA反转录成cDNA，按照Magen公司M-MLV H-First-Stand Synthesis Kit反转录试剂盒说明书进行。将反转录的cDNA置于-20℃保存备用。

作为本发明的进一步改进，步骤(3)中，所述特异性引物设计与筛选具体为：应用DNAStar或DNAMAN软件对CSFV、PPV、PRRSV、JEV和PCV2参考基因序列进行同源性分析，依据分析结果，应用Primer Premier5.0软件针对各自保守区设计5对引物，并通过NCBI Blast对其特异性进行鉴定。筛选确定最终所用引物，确保所设计的引物能够扩增出相对应的目标产物，并且在实施多重PCR反应中，多对引物之间未出现任何交叉反应，即没有同源、互补，不形成发卡结构等。最终所确定的引物序列见表1。

表1 PCR特异性引物

作为本发明的进一步改进，步骤(4)中，所述的PCR反应条件优化具体方法为：选择25μL的PCR反应体系，体系包含10×PCR buffer(Mg²⁺Plus)2.5μL，2.5mmol/L dNTP 3μL，5U/μL Taq聚合酶0.4μL，DNA与cDNA混合模板2μL，引物反应浓度为10μmol/L，ddH₂O补足至25μL，根据多重PCR条带的明亮，适当调整3对引物加入量的比例。退火温度根据引物Tm值范围进行，根据梯度PCR仪将退火温度设定为49.5℃、50.8℃、51.7℃、54.1℃、56.6℃、57.8℃、58.7℃、59.5℃、60.0℃，同时对循环次数(20、30、35、40)等条件在单一变量的情况下进行优化，最终确定最佳多重PCR反应体系及反应程序。

作为本发明的进一步改进，步骤(5)中，所述的多重PCR扩增特异性验证具体方法为：同时用CSFV、PPV、PRRS、JEV和PCV2 5对引物，分别以PRV、大肠杆菌(E.coli)、CSFV、PPV、PRRSV、JEV、PCV2基因组为模板，同时以dd H2O为阴性对照，按照已经优化好的反应条件和体系在相同条件下进行PCR反应，以验证其特异性。

作为本发明的进一步改进，步骤(6)中，所述的多重PCR敏感性验证具体为：先将CSFV、PPV、PRRSV、JEV和PCV2病毒的标准DNA或者cDNA样品用超微量核酸蛋白测定仪测定原模板浓度，再以10倍连续稀释分别将CSFV、PPV、PRRSV、JEV和PCV2 5种病毒的模板稀释成7个浓度梯度，取每个稀释倍数的模板混匀后按照以上条件进行PCR扩增，测定多重PCR的敏感性。

作为本发明的进一步改进，步骤(7)中，所述的多重PCR稳定性试验验证具体为：以建立的多重PCR方法对CSFV、PPV、PRRSV、JEV和PCV2重复检测9次，以验证结果的可靠性。

作为本发明的进一步改进，步骤(8)中，所述临床样品检测具体方法为：采集疑似病料，并按照上述(1)和(2)步骤进行处理，提取DNA或者RNA，按照已建立好的多重PCR体系进行扩增。

综上所述，本发明与现有技术相比具有以下有益效果：

1.简单、直观：本发明设计的5对引物，GC含量相近，Tm值相近，这就保证了在相同退火温度下，CSFV、PPV、PRRSV、JEV和PCV2都能得到很好的扩增。其扩增片段分别为91bp、152bp、198bp、238bp和417bp，各扩增片段相差不大，可在同一种浓度的电泳胶下进行，可通过观察PCR产物条带的位置就能判断。

2.特异性强且反应快速，耗时短：本发明建立的检测方法显示，无论是单一PCR还是多重PCR，均能特异性扩增出CSFV、PPV、PRRSV、JEV和PCV2条带与普通PCR检测方法相比，本实验采用的多重PCR有更高的灵敏度和准确性；与单项PCR及免疫学检测方法相比，多重PCR花费小、检测时间短、实验条件要求相对也不太严格。

为更清楚地阐述本发明的结构特征和功效，下面结合附图与具体实施例来对本发明进行详细说明。

附图说明

图1为本发明的单项PCR与多重PCR扩增结果的示意图，其中M:Marker DL500；1:阴性对照；2:CSFV；3:PPV；4:PRRSV；5:JEV；6:PCV2；7:PCV2+JEV+PRRSV+PPV+CSFV。

图2为本发明的不同退火温度进行的多重PCR反应的示意图，其中M:MarkerDL500；1:阴性对照；2-10退火温度分别为:49.5℃、50.8℃、51.7℃、54.1℃、56.6℃、57.8℃、58.7℃、59.5℃、60.0℃。

图3为本发明中多重PCR的特异性试验结果的示意图，M:Marker DL500；1:ddH2O阴性对照；2:PCV2+JEV+PRRSV+PPV+CSFV；3:PCV2+PRV+JEV+PPV+CSFV；4:E.coli+JEV+CSFV；5:PCV2+E.coli+PPV；6:CSFV；7:PPV；8:PRRSV；9:JEV；10:PCV2。

图4为本发明的多重PCR敏感性试验结果的示意图，其中：M:Marker DL500；1:阴性对照；2:10⁰稀释；3:10¹稀释；4:10²稀释；5:10³稀释；6:10⁴稀释；7:10⁵稀释；8:10⁶稀释；9:10⁷稀释。

图5为本发明的多重PCR重复性试验结果的示意图，其中M:Marker DL500；1:阴性对照；2-10:同一条件下多重PCR的扩增。

图6为本发明的多重PCR临床样品检验结果的示意图，其中M:Marker DL500；1:阴性对照；2-17为16份临床样品。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。

参见图1-图6，一种同步检测猪五种繁殖障碍性病毒病多重PCR体系及检测方法，包括以下步骤：(1)病毒DNA的提取：取PPV和PCV2的病毒液150μL到离心管(1.5mL)中，分别加25μL OB Protease混合均匀后，于60℃水浴锅中水浴10min，期间进行震摇使之充分反应；水浴完成后，10000×g高速离心5min，弃去沉淀，取上清另置一新离心管中，加220μLBuffer BL混匀，水浴锅70℃水浴10min；后向离心管中加220μL无水乙醇溶液(室温)，快速混匀，然后将液体移入吸附柱并套上收集管，8000×g高速离心1min，弃去液体；更换收集管，向吸附柱中加入500μL Buffer HB，8000×g离心1min，弃液；再次更换收集管，吸附柱中加入DNA Wash Buffer(预先加入酒精至终浓度为25mg/mL)700μL，8000×g高速离心1min，弃去液体；重复加入DNA Wash Buffer对DNA进行二次洗涤并离心，倒掉收集管中的液体，14000×g高速离心2min干燥吸附柱；用无菌离心管(1.5mL)替换收集管，在吸附柱内加入150μL提前70℃预热好的Elution Buffer，室温静置3min后，10000×g高速离心1min，将DNA从吸附柱中洗脱出来；再加150μL Elution Buffer对DNA进行二次洗脱，将溶液移至无菌离心管(1.5mL)，-20℃保存备用。

(2)病毒RNA的提取及反转录：转移20μL Proteinase K至1.5mL离心管中；转移200μL样品，如血清、血浆、尿液、培养液上清、或其它无细胞体液至装有Proteinase K的离心管中，振荡混匀5s。若样品不足200μL，用BufferPBS或Nuclease Free Water补足。咽/口腔拭子，或固体组织样品先用Buffer PBS浸泡或匀浆后，离心取上清进行操作；转移200μLBuffer AL/Carrier RNA至样品中，涡旋混匀15s。使用前，按每1mL Buffer AL加入15μLCarrier RNA(1μg/μL)。该混合液室温可保存2d；56℃水浴10min；加入250μL无水乙醇至裂解液中，涡旋混匀15s。室温静置3min；把HiPure Viral Micro Column装在2mL收集管中。转移混合液至柱子中。8,000×g离心30-60s；倒弃滤液把柱子装回收集管中。加入500μLBuffer VHB(已用无水乙醇稀释)至柱子中。8,000×g离心30-60s。使用前Buffer VHB必须按瓶子标签所示用无水乙醇稀释；倒弃滤液把柱子装回收集管中，加入500μL Buffer RW2(已用无水乙醇稀释)至柱子中，8,000×g离心30-60s，使用前Buffer RW2必须按瓶子标签所示用无水乙醇稀释；倒弃滤液把柱子装回收集管，加入500μL Buffer RW2(已用无水乙醇稀释)至柱子中，8,000×g离心30-60s；倒弃滤液把柱子套回收集管，13,000×g离心空柱3min甩干柱子；将柱子转移至新的1.5mL离心管，加入15-30μL Nuclease Free Water至柱子的膜中央，13,000×g离心1min；弃去柱子，把RNA保存于-80℃备用。

利用Magen公司M-MLV H-First-Stand Synthesis Kit反转录试剂盒将提取的RNA进行反转录，反应体系为20μL，操作步骤如下：取RNA溶液6μL(RNA的量可根据其浓度进行适当调整)，Oligo(dT)20 1μL，d NTPs 1μL，Nuclease Free Water补足至13μL，将混合液置于65℃孵育5min，迅速取出置于冰上冷却1min；随后向反应液中加入5×M-MLV First StandBuffer 4μL，0.1M DTT 1μL，M-MLV RNase H-RT 1μL，RNase Inhibitor(40U/μL)1μL，轻柔吹打混匀后瞬间离心。经反应45℃30min，85℃10s后瞬间离心，将产物立即放置-20℃保存备用。

(3)特异性引物设计与筛选：根据Gene Bank中登录的CSFV、PPV、PRRSV、JEV和PCV2的参考基因序列，应用DNAStar或DNAMAN软件对CSFV、PPV、PRRSV、JEV和PCV2进行同源性分析，根据分析结果，应用Primer Premier5.0软件针对各自保守区设计5对引物，并通过NCBIBlast对其特异性进行鉴定。筛选确定最终所用引物，确保所设计的引物能够扩增出相对应的目标产物，并且在实施多重PCR反应中，多对引物之间未出现任何交叉反应，即没有同源、互补，不形成发卡结构等。

(4)PCR反应条件与体系：本发明所使用的PCR试剂为TAKARA公司生产。PCR反应条件优化具体为：选择25μL的PCR反应体系，体系包含10×PCR buffer(Mg²⁺Plus)2.5μL，2.5mmol/L dNTP 3μL，5U/μL Taq聚合酶0.4μL，DNA与cDNA混合模板1μL，引物反应浓度为10μmol/L，根据多重PCR条带的明亮，适当调整3对引物加入量的比例。退火温度根据引物Tm值范围进行，根据梯度PCR仪将退火温度设定为49.5℃、50.8℃、51.7℃、54.1℃、56.6℃、57.8℃、58.7℃、59.5℃、60.0℃，同时对循环次数(20、30、35、40)等条件在单一变量的情况下进行优化，最终确定最佳多重PCR反应体系及反应程序：25μL反应体系中10×buffer(Mg²⁺)2.5μL，dNTP 3μL(2.5mmol)，5对引物上下游混合引物2.4μL，Taq聚合酶0.4μL(5U/μL)，DNA/cDNA混合模板2μL，加灭菌双蒸水至25μL。最佳的多重PCR反应条件为：94℃5min；94℃1min，51.7℃30s，72℃30s，30个循环；72℃10min。

(5)多重PCR特异性验证：用CSFV、PPV、PRRSV、JEV和PCV2的5对引物，分别以PRV、大肠杆菌(E.coli)、CSFV、PPV、PRRSV、JEV、PCV2基因组为模板，同时以dd H2O为阴性对照，按照已经优化好的反应条件和体系在相同条件下进行PCR反应。多重PCR扩增后，产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测，可见CSFV、PPV、PRRSV、JEV和PCV2分别扩增出91bp、152bp、198bp、238bp以及417bp，与预期目的条带相符，5对引物对双蒸水、大肠杆菌(E.coli)、PRV均未出现任何扩增条带。CSFV、PPV、PRRSV、JEV和PCV2的多重PCR特异性扩增产物经测序分析后，结果显示与预期结果相一致。可见，多重PCR的特异性验证试验证实了这5对引物具有很强的特异性，可以同时检测CSF、PPI、PRRS、JE及PCVDA。

(6)多重PCR敏感性验证：首先利用超微量核酸蛋白测定仪测定CSFV、PPV、PRRSV、JEV及PCV2原始DNA/cDNA模板浓度，将DNA模板按10¹-10⁷倍连续稀释成7个浓度梯度，按以上PCR反应体系与条件进行PCR扩增。结果显示，该mPCR对CSFV、PPV、PRRSV、JEV和PCV2的最低核酸浓度检测量分别为：即最低核酸检测量分别为0.9ng、1.4ng、1.3ng、0.8ng、0.1ng。多重PCR敏感性试验验证了这5对引物对模板浓度的敏感性较高。

(7)多重PCR稳定性验证：以建立的多重PCR方法对CSFV、PPV、PRRSV、JEV和PCV2重复检测9次，扩增结果均一致，表明建立的多重PCR方法具有较好的稳定性。

(8)临床样品检测：将采集好的样品经过研磨处理，按照上述(1)和(2)步骤进行DNA、RNA的提取，使用已经建立好的多重PCR反应体系对16份病料进行临床样品检测，结果显示16份样品中有14份为阳性病料，阳性率达87.5％，混合感染率达21.4％(3/14)，其中PCV2与PRRSV的混合感染较为严重，达14.3％(2/14)。该检测结果与单项PCR鉴定结果一致，符合率达100％，临床样品的检测验证了该方法的可行性。

以上结合具体实施例描述了本发明的技术原理，仅是本发明的优选实施方式。本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。本领域的技术人员不需要付出创造性的劳动即可联想到本发明的其它具体实施方式，这些方式都将落入本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种同步检测猪五种繁殖障碍性病毒病多重PCR体系的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)PPV和PCV2病毒DNA的提取；

2)CSFV、PRRSV和JEV病毒RNA的提取以及反转录；

3)特异性引物设计与筛选；

4)对步骤3)所设计的特异性引物进行PCR反应条件优化，从而建立最佳多重PCR反应体系；

5)按照步骤4)建立的最佳多重PCR反应体系进行多重PCR扩增特异性验证；

6)按照步骤4)建立的最佳多重PCR反应体系进行多重PCR敏感性验证；

7)按照步骤4)建立的最佳多重PCR反应体系进行多重PCR稳定性验证；

8)按照建立的多重PCR方法对临床样品的检测，以验证该方法的可行性。

2.根据权利要求1所述的一种同步检测猪五种繁殖障碍性病毒病多重PCR体系的检测方法，其特征在于，步骤1)所述的PPV和PCV2病毒DNA的提取方法为：取适量PPV和PCV2病毒液，置于1.5mL Eppendorf管中，参照上海生物工程的DNA提取试剂盒说明书进行，将提取的基因组DNA置于-20℃保存备用。

3.根据权利要求1所述的一种同步检测猪五种繁殖障碍性病毒病多重PCR体系的检测方法，其特征在于，所述步骤2)中，CSFV、PRRSV、JEV病毒RNA的提取及反转录方法为：取CSFV、PRRSV和JEV病毒液，参照Magen公司Hipure Viral RNA Spin Kit试剂盒说明书提取病毒RNA，将提取的病毒RNA反转录成cDNA，按照Magen公司M-MLV H-First-StandSynthesis Kit反转录试剂盒说明书进行，将反转录的cDNA置于-20℃保存备用。

4.根据权利要求1所述的一种同步检测猪五种繁殖障碍性病毒病多重PCR体系的检测方法，其特征在于，步骤3)中所述特异性引物的设计与筛选具体为：应用生物学软件对CSFV、PPV、PRRSV、JEV和PCV2基因进行同源性分析，筛选确定引物，确保所设计引物必须为特异性引物，一对引物只能扩增出相应病毒的序列片段，并且与其它引物之间没有干扰，即没有同源、互补，不形成发卡结构；所述设计的引物序列为：

CSFV的特异性引物：

F:5′-TGCAACTGAATGACGGGAC-3′

R:5′-GCCAAATACCTCCTACTGACCAC-3′

PPV的特异性引物：

F:5′-AAAAACAATCCACCAGGACAAC-3′

R:5′-CTGGATCTCATTTTTGCTGTGA-3′

PRRSV的特异性引物：

F:5′-CGGGCGGTATGTCCTAAGTA-3′

R:5′-ACCTCAACTTTGCCCCTTTT-3′

JEV的特异性引物：

F:5′-AGCTTGTTGGACGGCAGAG-3′

R:5′-GCCACATGATTGAGCCTTCA-3′

PCV2的特异性引物：

F:5′-CTATCAAGCGAACCACAGT-3′

R:5′-GGTCTACATTTCCAGCAGT-3′。

5.根据权利要求1所述的一种同步检测猪五种繁殖障碍性病毒病多重PCR体系的检测方法，其特征在于，所述步骤4)中所述的PCR反应条件优化具体方法为：选择25μL的PCR反应体系，体系包含10×PCR buffer(Mg²⁺Plus)2.5μL，2.5mmol/L dNTP 3.0μL，5U/μL Taq聚合酶0.4μL，DNA与cDNA混合模板2.0μL，上下游引物浓度为10μmol/L，ddH2O补足至25μL，根据多重PCR条带的明暗度，适当调整3对引物加入量的比例；退火温度根据引物Tm值范围进行，根据梯度PCR仪将退火温度设定为49.5℃、50.8℃、51.7℃、54.1℃、56.6℃、57.8℃、58.7℃、59.5℃、60.0℃，同时对循环次数的条件在单一变量的情况下进行优化，最终确定最佳多重PCR反应体系及反应程序，循环次数按照为20、30、35、40设置。

6.根据权利要求1所述的一种同步检测猪五种繁殖障碍性病毒病多重PCR体系的检测方法，其特征在于，所述步骤4)中最佳多重PCR条件具体为：25μL反应体系中10×PCRbuffer(Mg2+Plus)2.5μL，2.5mmol dNTP 3μL，5对引物上下游混合引物2.4μL，Taq聚合酶0.4μL 5U/μL，DNA/cDNA混合模板2μL，加灭菌双蒸水至25μL；多重PCR反应条件为：94℃5min；94℃1min，51.7℃30s，72℃30s，30个循环；72℃10min。

7.根据权利要求1所述的一种同步检测猪五种繁殖障碍性病毒病多重PCR体系及检测方法，其特征在于，步骤5)中多重PCR扩增特异性验证具体为：同时用步骤3)中的5对特异性引物，分别以PRV、大肠杆菌(E.coli)、CSFV、PPV、PRRSV、JEV、PCV2基因组为模板，同时以ddH2O为阴性对照，按照已经优化好的反应条件和体系在相同条件下进行PCR反应，以验证其特异性。

8.根据权利要求1所述的一种同步检测猪五种繁殖障碍性病毒病多重PCR体系的检测方法，其特征在于，所述步骤6)所述的多重PCR敏感性验证具体为：先将CSFV、PPV、PRRSV、JEV和PCV2病毒的标准纯化后的DNA或者cDNA样品用超微量核酸蛋白测定仪测定原模板浓度，再以10倍连续稀释分别将CSFV、PPV、PRRSV、JEV和PCV2 5种病毒的模板稀释成7个浓度梯度，按照步骤4)中的最佳PCR反应条件进行扩增，测定多重PCR的敏感性。

9.根据权利要求1所述的一种同步检测猪五种繁殖障碍性病毒病多重PCR体系的检测方法，其特征在于，所述步骤7)所述的多重PCR稳定性验证具体为：以步骤4)中建立的多重PCR方法对CSFV、PPV、PRRSV、JEV和PCV2重复检测9次，以验证结果的可靠性。

10.根据权利要求1所述的一种同步检测猪五种繁殖障碍性病毒病多重PCR体系的检测方法，其特征在于，所述步骤8)中所述的临床样品检测以验证其可行性具体为：将采集的疑似病料按照步骤1)和步骤2)提取DNA和RNA，按照步骤4)建立的多重PCR检测方法进行扩增，以验证该方法的可行性。