BRPI0107771B1 - Vaccination against the canine herpes and vaccines virus - Google Patents

Abstract

"vacinação contra o vírus do herpes canino e vacinas". utilização de antígeno de chv para a preparação de uma vacina contra a hipervirose canina, destinada a ser administrada na cadela gestante o mais próximo possível do parto, de preferência durante a última terça parte da gestação e que produz uma taxa de anticorpo anti-chv elevada na cadela gestante na ocasião do parto, induzindo uma proteção nos filhotes por transferência de anticorpos por ocasião do aleitamento. vacina anti-chv inativada ou de subunidades, que pode ser utilizada para a vacinação das fêmeas gestantes para proteger os filhotes de cães por transferência de anticorpos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "VACINAÇÃO CONTRA O VÍRUS DO HERPES CANINO E VACINAS". A presente invenção refere-se à vacinação contra o vírus do herpes canino. Ela refere-se especialmente a um método de vacinação, a vacinas apropriadas e à utilização de vacinas no campo deste método de vacinação. O vírus do herpes canino (em inglês Canine Herpesvirus ou CHV) foi descrito pela primeira vez em 1965 (L. E. Carmichael, Am. J. Vet. Res., 1965, 26, 803-814). A infecção pelo vírus do herpes canino foi em seguida identificada em numerosos países (EUA, França, Reino Unido, Suíça, Itália, Japão, Austrália, Nova Zelândia...). O CHV é responsável por problemas de reprodução nas criações de cães e particularmente pela mortalidade dos filhotes de cães recém-nascidos o que pode ocasionar grandes perdas em certas coletividades. Ele é igualmente responsável pelos abortos e pela mortalidade. Suspeita-se aliás que a infecção pelo CHV diminui a fertilidade das cadelas. A transmissão do CHV se faz por via venérea, por via oronasal ou por via transplacentária. O CHV pertence à família dos Herpesviridae e à subfamília dos Alphaherpesvirinae. Atualmente, um único tipo de CHV foi identificado. Trata-se de um vírus com envoltório que contém uma molécula de DNA com duplo filamento. O envoltório apresenta diversas glicoproteínas de origem viral. As glicoproteínas gB, gC e gD são responsáveis pela indução de anticorpos neutralizantes no camundongo. O CHV é antigenicamente próximo do vírus do herpes felino (J. A. Limcumpao e outros, Arch. Virol., 1990, 111, 165-176) porém sem neutralização cruzada significativa (X. Xuan e outros, Arch. Virol., 1992, 122, 359365). O CHV é fortemente dependente de seu hospedeiro e se multiplica apenas em células de origem canina (Pierson e outros, recueil de Mé-decine Vétérinaire, março / abril 1998,174 n9. 3/4, 87-94).

Os filhotes de cães recém-nascidos são muito sensíveis à infecção pelo CHV por ocasião das 3 primeiras semanas de vida. A contamina- ção intervém por ocasião do nascimento ou nos primeiros dias de vida. Consequentemente, a vacinação dos filhotes não é possível. Os únicos meios de proteção disponíveis são as medidas sanitárias como o reaquecimento dos filhotes com uma lâmpada infravermelha e a soroterapia. O CHV entretanto é pouco imunogênico e é difícil preparar um bom soro (L. E. Carmichael, J. Am. Vet. Med. Assoe., 1970, 156, 1714-1721).

Nas condições naturais, o filhote de cão pode ser protegido pelos anticorpos que neutraliza o CHV presentes no colostro das cadelas soro-positivas: na ausência destes anticorpos, o filhote é muito sensível à infecção pelo CHV (D. Huxsoll e I. E. Hernelt, J. Am. Vet. Med. Assoe., 1970, 156, 1706-1713). Os animais de risco são os filhotes nascidos de cadelas não infectadas em contato com animais excretores e os filhotes nascidos de cadelas infectadas latentes porém soronegativas ou fracamente soropositivas. Os anticorpos que neutralizam o CHV persistem pouco tempo e um animal pode ser infectado e soronegativo. O CHV provoca nos filhotes de cães de menos de 3 semanas de idade uma herpesvirose neonatal freqüentemente fatal. A incubação é rápida e os filhotes de cães morrem dentro de alguns dias mais freqüentemente sem outros sintomas a não ser uma brutal hipotermia e perturbações nervosas fulminantes, na grande maioria dos casos antes da idade de 5 dias. Nas formas menos agudas, a hipotermia é seguida de sintomas tais como a anorexia, a depressão, a bradicardia, a hipoglicemia, o edema subeutâneo, o eritema e pápulas ventrais, fezes moles cinza-amareladas, dores abdominais, vômitos, queixas incessantes, pedalagem e morte em 24 a 72 horas em opistótono. O exame de necrópsia pode revelar uma esplenomegalia, uma inchação grave nas cavidades pleurais e peritoneal e petéquias viscerais (Pierson e outros, recueil de Médecine Vétérinaire, março / abril 1998, 174 n9. 3/4, 87-94). Este artigo lembra que nenhuma vacina contra a herpesvirose canina é comercializada atualmente e sugere que seria útil poder vacinar os reprodutores infectados latentes a fim de atenuar a reexcreção do vírus selvagem.

Delisle F., em seu artigo (Rec. Med. Vet., 1982, 158, 669-676), em compensação propõe vacinar as cadelas antes da gestação com uma vacina inativada ou injetar um soro nos filhotes logo ao nascerem. Ela lembra todavia que nenhuma vacina comercial está disponível. Ver também L. E. Carmichael, J. Am. Vet. Med. Assoe., 1970, 156, 1714-1721. Por seu lado Appel A., em seu artigo ("Canine Herpesvirus" em Virus Infections of Verte-brates, vol. 1, MC Horzinek, Ed. MJ Appel Elsevier Science Publisher, 1987, 5-15), propõe vacinar cadelas antes ou logo no início da gestação com uma vacina inativada. H. Poulet e P. Dubourget (Point Vét., 1993, 25, 69-75) sugeriram eles próprios em 1992 em termos gerais a vacinação da mãe com um reforço no fim da gestação. Os autores lembram também que foram efetuados ensaios partindo de variantes atenuadas (L. E. Carmichael, Infection and Immunity, 1978, 20(1), 108-114; US-A- 4.213.965: vacina viva atenuada, composta de uma variante termossensível do vírus CHV, chamado "de pequenas faixas"), porém que estes ensaios não forneceram resultados convincentes e não deram lugar à comercialização de vacinas.

Anvik J. O., em seu artigo (Vet. Med., Abril de 1991,4, 394-403), afirma que a produção de anticorpos neutralizantes na mãe e em conse-qüência a proteção da barrigada é imprevisível em virtude da baixa imuno-genicidade do vírus CHV.

Diante da dificuldade de vacinação, Pierson e outros, (recueil de Médecine Vétérinaire, março / abril 1998, 174 ne. 3/4, 87-94) chegaram mesmo a propor vacinar a mãe com uma vacina inativada contra a coriza do gato (FHV) ou administrar anticorpos anti-FHV aos filhotes já no nascimento.

Atualmente, nenhuma das hipóteses de vacinação foi confirmada, nenhuma vacina está disponível no comércio e nenhuma publicação leva em conta os resultados de vacinação convincentes anunciadores da comercialização próxima de uma tal vacina.

Além disso nas fêmeas gestantes, a infecção por CHV pode conduzir a uma reabsorção embrionária, uma mumificação fetal, um aborto ou um parto prematuro, uma mortalidade, uma mortalidade neonatal. Podem surgir lesões placentárias.

Embora existam vacinas contra diferentes vírus do herpes em outras espécies de animais, entre os quais o gato, a vacinação eficaz contra o vírus do herpes canino nunca foi proposta. A presente invenção tem por objetivo a adaptação de um método de vacinação contra o vírus do herpes canino que permita proteger os filhotes. Um outro objetivo da invenção é a elaboração de vacinas, eficazes e farmaceuticamente aceitáveis, que possam ser utilizadas no quadro deste método de vacinação. A Requerente descobriu de maneira surpreendente que é possível vacinar as cadelas gestantes e os recém-nascidos administrando-se uma vacina durante o período de gestação e em particular mais próximo possível do parto de maneira a se ter uma elevada taxa de anticorpo anti-CHV na fêmea gestante no momento do parto, esta taxa garantindo a proteção do filhote no nascimento por transmissão dos anticorpos maternais por ocasião do aleitamento. Além disso, estes anticorpos se mantêm substancialmente no filhote durante as primeira semanas de sua vida, período em que ele é sensível à doença (3 a 4 semanas). Um título de anticorpo neutralizante na cadela igual ou superior a 0,9 Iog10 é preferido e mais particularmente um título igual ou superior a 1,2 Iog10. Os títulos indicados são calculados de acordo com o método descrito no exemplo 7. A vacinação na cadela provoca por outro lado uma redução da pressão de infecção no filhote. A Requerente observou aliás nas cadelas vacinadas em meio contaminado um peso dos filhotes superior por ocasião do nascimento e uma tendência a uma taxa de gestação mais elevada. Estes fenômenos podem ser explicados por uma redução ou por uma ausência de lesões placentárias nas cadelas vacinadas (A. Hashimoto e outros, Am. J. Vet. Res., 1979, 40 (9), 1236-1240; Hashi-moto e outros, Am. J. Vet. Res., 1982, 43 (5), 844-850).

Os objetivos da invenção já mencionados, assim como outros, são obtidos com a ajuda de um método de vacinação da cadela gestante que compreende a administração de uma vacina em uma fêmea gestante mais perto possível do parto, especialmente durante a última terça parte da gestação (a duração média de gestação na cadela é de aproximadamente 63 dias), especialmente de 1 a 20 dias, em particular de 1 a 15 dias, mais particularmente de 5 a 15 dias, de preferência de 5 a 10 dias, antes da data presumida do parto, tipicamente aproximadamente 10 dias antes, de maneira a se ter uma elevada taxa de anticorpo anti-CHV na fêmea gestante por ocasião do parto, induzindo uma proteção dos filhotes por transferência dos anticorpos maternais por ocasião do aleitamento. Estes anticorpos se mantêm substancialmente durante as primeiras semanas de vida do filhote, período em que ele é sensível à doença (3 a 4 semanas).

Por definição, um antígeno, em quantidade eficaz na de acordo com a invenção, permite induzir um título elevado e protetor de anticorpo nas condições do protocolo na fêmea gestante e no recém-nascido. Pode-se tratar de antígeno que compreenda vírus CHV inativado, vírus CHV atenuado, uma ou diversas subunidades do vírus CHV, um ou diversos antígenos expressos por recombinantes.

De preferência, a vacina é destinada a produzir na fêmea gestante, no momento do parto, uma taxa de anticorpo anti-CHV (determinado conforme o exemplo 7) superior ou igual a aproximadamente 0,9 Iog10, de preferência superior ou igual a 1,2 Iog10.

Especialmente no caso de um animal que nunca foi vacinado contra o CHV, procede-se de preferência a uma (ou diversas) outra administração de vacina anti-CHV antes da administração descrita acima a fim de induzir a resposta imunológica no animal. O intervalo entre estas duas administrações deve ser suficiente para incluir um efeito de reforço, o que em geral requer pelo menos 2 a 3 semanas. A primo-administração da vacina se faz especialmente em um período que vai do cio até pelo menos duas a três semanas antes da administração descrita a seguir, em particular no período que vai do cio até a primeira terça parte da gestação inclusive, o que compreende uma administração antes da cobertura da fêmea pelo macho. De preferência esta administração é realizada aproximadamente 7 a 10 dias após a cobertura da fêmea pelo macho. De acordo com uma modalidade preferida, reproduz-se este esquema de vacinação para cada parto.

Se o animal já foi vacinado contra o CHV, pode ser suficiente uma única administração próxima do parto. A administração, ou uma pelo menos das administrações suplementares também podem ser realizadas com uma vacina que tenha uma composição diferente daquela que intervém no máximo perto do parto, a diferença podendo afetar o antígeno e/ou a formulação da vacina. A administração da vacina pode se fazer em particular pela via parenteral, de preferência pela via subcutânea ou intramuscular.

Os volumes de dose podem estar especialmente compreendidos entre 0,2 e 2 ml, de preferência da ordem de 1 ml. A invenção também tem por objetivo a utilização de antígeno CHV para a preparação de uma vacina contra a herpesvirose canina destinada a ser administrada de acordo com o protocolo descrito acima. O versado na técnica possui as competências necessárias para definir precisamente as doses de cada vacina em função do tipo de vacina.

Quando forem realizadas diversas administrações no animal, as vacinas utilizadas podem ser de tipos diferentes, escolhidos especialmente entre aqueles citados anteriormente. A invenção também tem por objetivo vacinas inativadas ou vacinas de subunidades, que podem ser utilizadas especialmente no quadro deste método de vacinação. A utilização de subunidades CHV foi descrita apenas no camun-dongo (J. A. Limcumpao e outros, J. Vet. Med. Sei., 1991, 53(3), 423-432). Os dados obtidos no camundongo não podem entretanto ser extrapolados para a espécie canina como determina este documento. Se bem que os títulos de anticorpos obtidos com as glicoproteínas gp145/112, gp80 e gp47 purificadas induzem uma resposta em anticorpo detectável, não é todavia possível determinar se este título de anticorpo pode se traduzir por uma proteção pois o camundongo não sendo sensível ao vírus CHV não é possível desenvolver um modelo de prova virulenta nesta espécie. Igualmente nenhum dado é disponível referente à imunidade celular induzida por CHV. Além disso, a relação entre o título de anticorpo obtido no camundongo e o título obtido no cão não é conhecida e estes título podem se revelar diferen- tes. Assim foi publicado que coelhos imunizados com a glicoproteína gl de herpes bovino de tipo 1 têm um título neutralizante mais elevado que os coelhos imunizados com glll, ao passo que no bovino a glicoproteína glV induz o título neutralizante mais elevado e que a glicoproteína gl é a menos imunogênica. Estes dados mostram a dificuldade de transposição dos resultados dos animais de laboratório para a espécie destinatária.

De acordo com a invenção, a utilização de uma vacina inativada ou de subunidades permite a vacinação da cadela durante a fase de gestação sem risco para a cadela e sua prole. A vacinação com reforço no final da gestação é o meio de garantir um título ótimo de anticorpos neutralizantes por ocasião do nascimento. Este título condiciona a proteção obtida por transferência dos anticorpos neutralizantes da cadela para os seus filhotes no início do aleitamento. A cultura e a propagação do vírus CHV se faz de preferência sobre células caninas primárias ou de linhagem, mais particularmente sobre células renais caninas de linhagem do tipo MDCK (em inglês Madin-Darby Canine Kidney ou MDCK disponível pela American Type Culture Collection (ATCC) sob o número CCL-34) especialmente com uma multiplicidade de infecção (m.o.i.) de 0,1 até 0,001 dose infectante 50% em cultura de células (DICC50) por célula, de preferência 0,01 DICC5o/célula. A coleta do vírus CHV ocorre a 3 a 4 dias mais tarde. Pode-se obter um título viral de aproximadamente 106 até 108 DICC5o/ml e em geral de 106,5 até 107,5 DICC5o/ml.

Para se obter uma vacina inativada, o vírus CHV é inativado, especialmente após coleta e clarificação, por um tratamento químico (por exemplo com formol ou com formaldeído, β-propiolactona, etilenoimina, eti-lenoimina binária (BEI)) e/ou térmico. De preferência, o vírus de acordo com a invenção é inativado por ação da etilenoimina. As partículas virais podem ser concentradas por técnicas clássicas de concentração, especialmente por ultrafiltração e/ou purificadas por meios clássicos de purificação, especialmente as técnicas de gel-filtração, de ultracentrifugação sobre gradiente de sacarose ou de precipitações seletivas em particular na presença de polieti-leno glicol (PEG). A vacina de subunidades é de preferência uma vacina de subu-nidades de extração, ou seja ela é preparada partindo do vírus inteiro ou de uma grande fração deste vírus (por exemplo por eliminação do capsídeo). Em particular, esta vacina pode compreender as diferentes glicoproteínas de envoltório ou uma mistura de glicoproteínas de envoltório. A preparação da vacina de subunidades é de preferência realizada partindo de uma suspensão viral inativada, especialmente inativada como descrito acima. De maneira preferida, para se obter uma vacina de subunidades, que contenha principalmente as glicoproteínas de envoltório, a suspensão de partículas virais, de preferência inativadas obtida anteriormente, é submetida à ação de um detergente apropriado, especialmente não-iônico, de preferência um álcool etoxilado que tenha vantajosamente um HLB compreendido entre 12 e 15. Os capsídeos virais são em seguida eliminados especialmente por ultracen-trifugação. Outros métodos equivalentes, que permitam eliminar os capsídeos e recolher as glicoproteínas de envoltório estão à disposição do verdade na técnica.

Para a elaboração de uma vacina inativada ou de uma vacina de subunidade, o antígeno é retomado em um veículo ou em um excipiente aceitável no plano veterinário e de preferência ao qual foi adicionado um adjuvante aceitável no plano veterinário. A quantidade de antígeno equivale especialmente a um título equivalente antes da inativação de aproximadamente 105 até aproximadamente 109,5 DICC50 por dose, especialmente desde aproximadamente 105 até aproximadamente 109 por dose. Mais particularmente, para uma vacina inativada, o título antes da inativação está compreendido entre aproximadamente 105 e aproximadamente 109 DICC50 por dose, especialmente entre aproximadamente 106 e aproximadamente 108 por dose. Mais particularmente, para uma vacina subunidades, o título antes da inativação está compreendido entre aproximadamente 106 e aproximadamente 109’5, em particular entre aproximadamente 107 e aproximadamente 109, de preferência entre aproximadamente 107,5 e 108,5 por dose. De preferência, quando se trata de uma vacina subunidades, ela apresenta um título em glicoproteína gB, medido em ELISA, de aproximadamente 0,01 pg até aproximadamente 30 pg, em particular de aproximadamente 0,1 pg até aproximadamente 10 pg e de preferência de aproximadamente 0,3 pg até aproximadamente 3 pg, por dose.

As vacinas de acordo com a invenção são conservadas e armazenadas seja sob forma formulada a 5 °C, seja sob forma liofilizada, de preferência com um estabilizador, especialmente SPGA (sacarose, fosfato, glutamato, albumina, EP-B1- 0.008.255). Estas vacinas podem ser retomadas ulteriormente em solvente (veículo ou excipiente e/ou adjuvante).

Para servir de adjuvante de acordo com a invenção, pode-se utilizar (1) hidróxido de alumínio, (2) um polímero do ácido acrílico ou metacríli-co, um polímero de anidrido maléico e de derivado de alquenila, (3) uma sequência imunoestimulante (ISS), especialmente uma seqüência oligodesoxir-ribonucleotídica tendo um ou diversos motivos CpG não-metilados (Klinman D. M. e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1996, 93, 2879-2883; WO-A1- 98 / 16247 ou (4) formular a preparação imunológica ou vacina sob a forma de uma emulsão de óleo-em-água em particular a emulsão SPT descrita na página 147 de "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" editado por M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995 e a emulsão MF59 descrita na página 183 da mesma obra. A emulsão de óleo-em-água pode especialmente ser à base de óleo de parafina líquida leve (tipo Farmacopéia Européia); de óleo de isopre-nóide tal como o esqualano, o esqualeno; de óleo que resulte da oligomeri-zação de alquenos, em particular de isobuteno ou de deceno; de ésteres de ácidos ou de álcoois com grupamento alquila linear, mais particularmente os óleos vegetais, o oleato de etila, o di(caprilato/caprato) de propileno glicol, o tri(caprilato/caprato) de glicerol, o dioleato de propileno glicol; dos ésteres de ácidos ou de álcoois graxos ramificados, em particular dos ésteres do ácido isoesteárico. O óleo é utilizado em associação com emulsificantes para formar a emulsão. Os emulsificantes são de preferência tensoativos não-iônicos em particular os ésteres de sorbitano, de manídeo (por exemplo oleato de anidromanitol), de glicerol, de poliglicerol, de propileno glicol e de ácido oléico, isoesteárico, ricinoléico, hidroxiesteárico, eventualmente etoxila- dos, os blocos de copolímeros de polioxipropileno - polioxietileno em particular os Pluronic ®, especialmente o L121.

Os polímeros do ácido acrílico ou metacrílico são reticulados especialmente por éteres polialquenílicos de açúcares ou de poliálcoois. Estes compostos são conhecidos sob o termo carbômero (Pharmeuropa vol. 8, ne. 2, junho de 1996). O versado na técnica também pode consultar a US-A-2.909.462 (aqui incorporada como referência) que descreve tais polímeros acrílicos reticulados por um composto polihidroxilado que tenha pelo menos 3 grupos hidroxila, de preferência não mais de 8, os átomos de hidrogênio de pelo menos três hidroxilas sendo substituídos por radicais alifáticos insa-turados que tenham pelo menos 2 átomos de carbono. Os radicais preferidos são aqueles que contêm de 2 a 4 átomos de carbono, por exemplo vini-las, alilas e outros grupos etilenicamente insaturados. Os radicais insatura-dos podem eles mesmos conter outros substituintes, tal como metila. Os produtos vendidos sob a denominação Carbopol ® (BF Goodrich, Ohio, EUA) são particularmente apropriados. Eles são reticulados por uma alil sa-carose ou pelo alilpentaeritritol. Entre eles, pode-se citar os Carbopol ® 974P, 934P e 971P.

Entre os copolímeros de anidrido maléico e de derivado alque-nila, preferem-se os EMA ® (Monsanto) que são copolímeros de anidrido maléico e de etileno, lineares ou reticulados, por exemplo reticulados por divinil éter. Pode-se consultar J. Fields e outros, Nature, 186, 778-780, 4 de junho de 1960 (aqui incorporado como referência). No plano de sua estrutura, os polímeros de ácido acrílico ou metacrílico e os EMA ® são formados de preferência de motivos de base de fórmula a seguir: na qual: - Rt e R2, idênticos ou diferentes, representam H ou CH3 - χ = 0 ou 1, de preferência x = 1 - y = 1 ou 2, com x+ y = 2 Para os EMA ®, x = 0 e y = 2. Para os carbômeros, x = y = 1. A concentração de polímero na composição de vacina final será de 0,01% a 1,5% P/V, mais particularmente de 0,05 até 1% P/V, de preferência de 0,1 a 0,4% P/V.

Uma forma de vacina particularmente preferida compreende uma vacina inativada ou de subunidades formulada sob forma de uma emulsão de óleo-em-água que compreende o oleato de anidromanitol, ácido oléi-co etoxilado e óleo de parafina líquida leve. Em particular, um método de imunização das cadelas gestantes de acordo com a invenção compreende a administração de uma tal vacina. Duas injeções de preferência subcutâneas são realizadas, em particular de acordo com o esquema descrito acima, por exemplo com a primeira injeção durante a primeira terça parte da gestação de preferência aproximadamente 10 dias após a data da cobertura da fêmea pelo macho e especialmente a segunda injeção durante a última terça parte de preferência aproximadamente 10 dias antes da data presumida do parto. A invenção também tem por objetivo o processo de preparação da vacina inativada ou de subunidades descrito. A invenção também tem por objetivo vacinas multivalentes que compreendem a valência do vírus do herpes canino ou de subunidades e pelo menos uma valência para pelo menos um outro agente patogênico canino, em um veículo ou excipiente aceitável no plano veterinário e de preferência com um adjuvante, especialmente um daqueles descritos anteriormente.

Os ditos agentes patogênicos caninos são especial mente escolhidos entre o grupo que compreende o vírus da doença de Carré, o parvoví-rus canino e o adenovírus canino, porém outras valências também podem ser associadas.

As vacinas CHV inativadas ou de subunidades de acordo com a invenção podem ser administradas simultaneamente na mesma preparação ou sucessivamente em preparações diferentes com a ou as outras valências caninas que podem estar sob forma de vacinas vivas atenuadas, inativadas, subunitárias, recombinadas ou polinucleotídicas. A invenção tem portanto igualmente por objetivo um kit ou conjunto de vacina multivalente que compreende, condicionadas separadamente, uma valência CHV de acordo com a invenção em um veículo ou ex-cipiente aceitável no plano veterinário e de preferência com um adjuvante, especialmente um daqueles descritos anteriormente e pelo menos uma valência de pelo menos um outro agente patogênico canino. A valência CHV de acordo com a invenção pode servir de solvente para a outra valência canina, especialmente para uma valência atenuada, recombinada ou polinu-cleotídica que se apresenta sob forma liofilizada. A invenção vai ser descrita agora com mais detalhe com a ajuda de modos de realização considerados a título de exemplos não-limitativos.

Exemplos: Exemplo 1: Cepa viral A cepa de vírus do herpes canino utilizada é a cepa F205 (L. E. Carmichael, Am. J. Vet. Res., 1965, 26, 803-814), disponível pela American Type Culture Collection (ATCC) sob o número VR-647.

Exemplo 2: Amplificação do vírus do herpes canino Células de linhagem canina (Madin-Darby Canine Kidney ou MDCK disponível pela ATCC sob o número CCL-34) são postas em cultura em frascos rolantes de 2 litros (850 cm2) com meio Dulbecco modificado de Eagle meio essencial mínimo (DMEM - Gibco BRL) suplementado com 5% de soro fetal de bezerro (Bayer Diagnostic) e de gentamicina a 50 mg/l à razão de 200.000 células por ml sob um volume de 350 ml. As células são cultivadas a +37 °C em atmosfera contendo 5% de C02.

Após 3 ou 4 dias a camada celular chega à confluência. O meio de cultura é então substituído por meio DMEM sem soro porém ao qual sempre foram adicionados 50 mg/l de gentamicina e as células são inocula-das com o vírus do herpes canino (exemplo 1) com uma multiplicidade de infecção (m.o.i.) de 0,01 DICC5o / célula. A cultura viral é mantida a 37 °C.

Quando o efeito citopático (ECP) for completo (aproximada- mente 96 horas após o início da colocação em cultura), a suspensão viral é colhida e congelada a -70 °C. Diversas passagens de amplificação celular podem ser realizadas previamente à inoculação viral em função da quantidade de vírus desejada. As passagens celulares e a cultura viral podem igualmente ser realizadas cultivando-se as células sobre microportadores em biogerador. O vírus é conservado até as etapas a seguir a 5 °C. O título do vírus CHV na colheita é 107,2 DICC50 por ml.

Exemplo 3: Titulação do vírus CHV A titulação do vírus CHV é realizada em microplacas de 96 cavidades em meio F15 ao qual foi adicionado 5% de soro fetal de bezerro e de gentamicina 50 mg/l. As diluições com uma razão da ordem de 3 da suspensão viral são misturadas a uma suspensão de células MDCK na microplaca à razão de 0,10 ml de diluição de vírus para 100.000 células sob 0,15 ml por cavidade. Após 4 a 5 dias de incubação a 37 °C com 5% de CO2, as cavidades que apresentam um ECP generalizado são contabilizadas e o título é calculado em doses infecciosas para cultura de células 50% (DICC50) pelo método de Kãrber.

Exemplo 4: Inativação do vírus O vírus CHV amplificado como foi descrito no exemplo 2 é inati-vado pela etilenoimina à concentração de aproximadamente 12 mM a 37 °C durante 6 horas. A etilenoimina é preparada extemporaneamente dissolvendo-se 28.0 g de soda em pastilha em 200 ml de água destilada e adicionando-se 68.1 g de bromoetilamina (BEA) correspondente a uma solução de etilenoimina 1,2 Μ (H. Bahnemann, Arch. Virol., 1975, 47, 47-56). A suspensão viral inativada é concentrada 100 vezes sobre cassete de ultrafiltração tipo Ultra-sette com um limite de faixa de tamanho de 300 kDa (Filtron). O vírus inati-vado concentrado pode ser congelado e armazenado a -40 °C.

Exemplo 5: Extração das glicoproteínas virais O vírus inativado (exemplo 4) é clarificado por centrifugação a 2500 g durante 30 minutos. O líquido sobrenadante é em seguida concen- trado 50 vezes sobre cassete de ultrafiltração tipo Ultrasette com um limite de faixa de tamanho de 300 kDa (Filtron). Ao concentrado é adicionado poli-etileno glicol 8000 (PEG 8000) a 8% P/V e cloreto de sódio a 4% P/V. Após um contato de 16 horas a 4°C, o vírus precipitado é sedimentado por centri-fugação a 2500 g durante 60 minutos, depois retomado em solução tampo-nadora de fosfato (PBS: NaCI 8 g/l; KCI 0,2 g/l; KH2P04 0,2 g/l; Na2HP04, 2 H20 1,44 g/l). Depois retomado em solução tamponadora de fosfato isotôni-ca à razão de um centésimo do volume inicial. O concentrado viral sofre em seguida uma ultracentrifugação zonal sobre camada de sacarose (35% e 60% P/P em PBS, durante 60 minutos, a 200.000 g) com um rotor zonal ou um rotor com ângulo fixo Ti45. O vírus é colhido na interface e é diluído aproximadamente ao quarto em PBS. Depois adicionar um álcool cetílico 10 OE (álcool etoxilado de HLB 13) à concentração de 1,5% P/V, incubar uma hora a 37°C. Os capsídeos são em seguida sedimentados por ultracentrifugação durante uma hora a 230.000 g com um rotor Ti45. O sobrenadante que contém as glicoproteínas é recolhido. A solução de glicoproteínas pode eventualmente ser concentrada por ultrafiltração. A solução de glicoproteínas purificadas é conservada a -40 °C até a formulação da vacina.

Exemplo 6: Formulação das vacinas O antígeno inativado concentrado (exemplo 4) ou a solução de subunidades (exemplo 5), após descongelamento, é diluído (a) em solução tamponadora PBS em função da quantidade necessária de antígenos por dose. A vacina adjuvante é preparada da maneira a seguir: 167 ml de fase aquosa constituída de 8 ml de antígeno viral inativado ou subunidade e de 159 ml de PBS são emulsificados em 83 ml de fase oleosa que contém 7% p/v de oleato de anidromanitol, 8% p/v de ácido oléico etoxilado a 11 OE (óxido de etileno) e 85% v/v de óleo de parafina líquida leve (tipo Farmaco-péia Européia) com a ajuda de um emulsificador de turbina Silverson a 32 °C durante 2 minutos. A vacina formulada sob forma de emulsão de óleo-em-água é em seguida armazenada a 5 °C.

Um método alternativo para preparar a vacina consiste em pôr em emulsão por três passagens através de um homogeneizador de alta pressão modelo Y110 (Microfluidics Corp.) a uma pressão de 600 bar e uma temperatura compreendida entre 30 e 40°C a mistura 5% p/v de esqualano, 2,5% p/v de Pluronic ® L121,0,2% p/v de um éster de ácido oléico e de um anidrossorbitol etoxilado a 20 OE, 92,3% v/v do antígeno viral diluído até 1/30s em solução tamponadora PBS após descongelamento. A vacina formulada sob forma de emulsão de óleo-em-água é em seguida armazenada a 5°C.

Um outro método alternativo consiste em realizar uma solução a 0,4% p/v de Carbopol ® 874P em água fisiológica (NaCI 9 g/l). O pH é ajustado a 7,3-7,4 com soda. Esta solução de Carbopol é em seguida misturada em partes iguais como o antígeno viral diluído até 1/16 após descongelamento. A vacina formulada sob uma suspensão é em seguida conservada a 5 °C. 0,5 ml de uma solução de subunidades (exemplo 5), após descongelamento diluída em solução tamponadora PBS até 1/15 é adicionada a 0,5 ml de substrato de liofilização SPGA (sacarose, fosfato, glutamato, al-bumina, EP-B1- 0.008.255). Esta mistura é dividida em frasco e liofilizada depois conservada a 5 °C. O diluente é constituído pelos adjuvantes descritos anteriormente incorporando-se unicamente solução tamponadora PBS na fase aquosa.

Exemplo 7: Titulação dos anticorpos neutralizantes anti- CHV

Os soros a serem titulados são testados para sua capacidade em neutralizar o vírus CHV. Os soros retirados dos animais são diluídos em cascata três vezes com meio DMEM ao qual foi adicionado 5% de soro fetal de bezerro nas placas com 96 cavidades para cultura de células. A 0,05 ml do soro diluído são adicionados 0,05 ml de meio de cultura contendo aproximadamente 200 DICC50 / ml de CHV. Esta mistura é incubada durante 2 horas a 37°C em estufa em atmosfera contendo 5% de CO2. 0,15 ml de uma suspensão de células MDCK contendo aproxi- madamente 100.000 células por ml é adicionado em seguida a cada mistura. O efeito citopático (ECP) é observado por microscopia com contraste de fase após 5 dias de cultura a 37 °C em atmosfera contendo 5% de C02. Os títulos neutralizantes de cada soro são calculados de acordo com o método de Kárber. Os títulos são fornecidos sob a forma da maior diluição que inibe o efeito citopático para 50% das cavidades.

Os títulos são expressos em Iog10 VN50. Cada soro é titulado pelo menos duas vezes, de preferência quatro vezes.

Exemplo 8: Eficiência 12 cadelas Beagle EOPS não vacinadas foram incluídas no estudo e distribuídas desordenadamente em 2 grupos de 6 animais. As cadelas do primeiro grupo são vacinadas com a vacina CHV de subunidades à qual foi adicionada a emulsão de óleo-em-água à base de óleo de parafina (exemplo 6), as cadelas do outro grupo com uma vacina placebo.

As cadelas foram vacinadas duas vezes por via subcutânea aproximadamente 10 dias após a cobertura da fêmea pelo macho, depois aproximadamente 10 dias antes da data presumida do parto. O liofilizado retomado por 1 ml de solvente oleoso é administrado às cadelas. Isto corresponde a um título equivalente de 107,7 DICC50 antes da inativação.

Após o parto, os filhotes recém-nascidos são testados na idade de 3 dias com 50 a 100 DICC50 de uma cepa virulenta de CHV, por exemplo F205 isolada por L. E. Carmichael (Am. J. Vet. Res., 1965, 26, 803-814) ou CHV 270 (H. Hill, Am. J. Vet. Res., 1974, 35, 669-673) ou CHV C4012SE, por via oronasal (0,5 ml por via oral e 0,25 ml em cada narina). Os filhotes são em seguida observados durante 3 semanas. São detectados os sinais clínicos e a mortalidade. Após a sua morte, todos os filhotes são autopsia-dos. As lesões macroscópicas características da herpesvirose canina são pesquisadas no nível dos rins, baço, fígado, pulmões, trato digestivo, coração e gânglios mesentéricos e são realizadas retiradas de amostras para um isolamento de CHV sobre células MDCK. O diagnóstico de herpesvirose canina é baseado na morte do filhote, na presença de lesões macroscópicas características e confirmado por um isolamento viral.

Todas as cadelas vacinadas foram soroconvertidas e têm um título elevado de anticorpos neutralizantes no momento do parto. Estes títulos são medidos pelo método descrito no exemplo 6 e são expressos em log 10 VN50._________________________________________i____________________________ Entre os filhotes nascidos de mães vacinadas, nenhum morreu de herpesvirose canina (0/27). Nenhum vírus CHV foi reisolado destes filhotes.

Entre os filhotes nascidos de mães não-vacinadas (grupo place-bo), foi observada uma taxa de mortalidade em virtude do CHV de 62% (18/29). Foi igualmente observado isolamento viral em 55% destes filhotes (16/29): as retiradas de amostras provenientes de 2 filhotes foram contaminadas por bactérias e não puderam ser testadas para o isolamento viral de CHV. A diferença da taxa de mortalidade entre os 2 grupos é altamente significativa (teste exato de Fisher; p < 0,0001).

Cadelas Yorkshire distribuídas desordenadamente em 2 grupos são mantidas em meio infectado. As 14 cadelas do primeiro grupo são vacinadas com a vacina CHV de subunidades à qual foi adicionada uma emulsão de óleo-em-água à base de óleo de parafina (exemplo 6), as 6 cadelas do outro grupo com uma vacina placebo. O protocolo de vacinação é idêntico ao que é descrito acima. O peso dos filhotes é avaliado por ocasião de seu nascimento. O peso dos 28 filhotes nascidos de mãe vacinada é sensivelmente mais elevado (peso médio de 141,8 g) do que o dos 14 filhotes nascidos de mãe não vacinada (peso médio de 85,0 g), seja um ganho ponderai de 166,8%. A diferença é significativa (Kruskal-Wallis, p < 0,01).

Os resultados mostram em meio contaminado uma tendência a aumentar a taxa de gestação em cadelas vacinadas. A taxa de gestação é de 82% nas cadelas vacinadas (50/61) e de 68% nas cadelas não vacinadas (grupo placebo) (19/28) (teste exato de Fischer, p= 0,11).

Deve ser bem-compreendido que a invenção definida pelas reivindicações anexas não está limitada aos modos de realização especiais indicados na descrição a seguir, porém engloba as variantes que não saem nem do âmbito nem do espírito da presente invenção.

REIVINDICAÇÕES

Claims (17)

1. Uso de glicoproteínas isoladas do envoltório de CHV caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de uma formulação de uma vacina destinada a cadela gestante para imunização dos filhotes contra herpes canino.

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a vacina envolve um veiculo ou um excipiente e um adjuvante veterinariamente aceitáveis.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a vacina compreende uma quantidade de antigeno correspondente a um equivalente em titulo antes da inativação de aproximadamente 105 até aproximadamente 109'5 DICC50 por dose.

4. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a vacina é formulada sob forma de uma emulsão de óleo-em-água ou sob forma de suspensão com carbômero.

5. Uso, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a vacina é formulada sob forma de uma emulsão que compreende oleato de anidromanitol, ácido oléico etoxilado e óleo de parafina liquido leve, Pluronic ®, éster de sorbitano e ácido oléico etoxilado e esqualano ou uma suspensão de Carbopol ®.

6. Vacina anti-CHV caracterizada pelo fato de ser adequada para administração a uma cadela gestante para imunização dos filhotes compreendendo glicoproteínas isoladas do envoltório de CHV, em um veículo ou um excipiente e, de preferência, um adjuvante veterinariamente aceitável.

7. Vacina anti-CHV, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que está na forma liofilizada e que pode ser reconstituída antes do uso por um adjuvante.

8. Vacina, de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizada pelo fato de que o adjuvante é um polímero de ácido acrílico ou metacrílico ou um polímero de anidrido maléico e de derivado alquenila, de preferência Carbopol ®.

9. Vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, caracterizada pelo fato de que ela é formulada sob a forma de uma emulsão de óleo-em-água.

10. Vacina, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a emulsão de óleo-em-água compreende seja oleato de anidromanitol, ácido oléico etoxilado e óleo de parafina líquida leve, Pluronic ®, éster de sorbitano e ácido oléico etoxilado e esqualano.

11. Vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 10, caracterizada pelo fato de que a vacina é uma vacina de subunidades suscetível de ser obtida submetendo-se uma suspensão de partículas virais CHV, de preferência inativadas, a ação de um detergente apropriado.

12. Vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 11, caracterizada pelo fato de que ela compreende subunidades de CHV em quantidade que equivale a um título equivalente antes da inativação de 106 até 109'5 DICCso, em particular de 107 até 109 DICC50, de preferência de IO7-5 a IO8-5 por dose.

13. Vacina, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de compreender um adjuvante escolhido entre um polímero do ácido acrílico ou metacrílico ou um polímero de anidrido maléico e de derivado alquenila, de preferência Carbopol ®, uma sequência imunoestimuladora formulada sob forma de uma emulsão de óleo-em-água.

14. Vacina, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a emulsão de óleo-em-água compreende seja oleato de anidromanitol, ácido oléico etoxilado e óleo de parafina líquida leve, seja Pluronic ®, éster de sorbitano e ácido oléico etoxilado e esqualano.

15. Vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, caracterizada pelo fato de que ela é obtida partindo de um CHV inativado por um tratamento químico e/ou térmico.

16. Vacina, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que o CHV é inativado pelo formol, pela P-propiolactona, pela etilenoimina ou pela etilenoimina binária.

17. Vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 16, caracterizada pelo fato de que ela compreende um título em glicoproteína gB, medido em ELISA, de aproximadamente 0,01 pg até aproximadamente 30 pg, em particular de aproximadamente 0,1 pg, até aproximadamente 10 pg e, de preferência, de aproximadamente 0,3 pg até aproximadamente 3 pg, por dose.