JPH11106351A - オイルアジュバントワクチンおよびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ワクチンとしての有効性と安定性だけでな
く、安全性、とくに生体に接種した際の局所反応が極め
て抑えられるという特徴を有するオイルアジュバントワ
クチンを提供すること。 【解決手段】 Ａ）常温で液状を示す油成分１０〜９０
重量％、 Ｂ）非イオン系界面活性剤から選択される乳化剤０．５
〜３０重量％、および Ｃ）０．１〜３０重量％のポリエチレングリコールと生
物学的に許容される有効量の抗原を含む水性成分とを含
有するオイルアジュバントワクチン。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はオイルアジュバント
ワクチンに関するものである。

【０００２】

【従来の技術】オイルアジュバントワクチンは、古くか
ら、効率よく免疫効果を強化するワクチンとしてよく知
られている。とくに不活化した抗原を用いる場合に非常
に有効な免疫増強効果を発揮することから、実験室レベ
ルでは古典的なオイルアジュバントであるFreundのアジ
ュバントが依然として利用されている。しかし、Freund
のアジュバントに代表される鉱物油を主成分とするオイ
ルアジュバントは、確かに高い免疫増強効果が認められ
る反面、これを用いたワクチンは接種反応（局所反応）
が著しく、接種部位周辺に無菌化膿巣や肉芽腫の形成を
引き起こし、外面的には浮腫、腫脹、硬結、壊死が観察
されることや、ワクチン注射により引き起こされたそれ
らの生体反応が長期間消失しないこと、あるいはワクチ
ン自体の残留が懸念されることなどから、ワクチンへの
応用が大きく阻まれてきた。家畜においてワクチン接種
による局所反応が消失せずに残っている場合は、その肉
が消費に適さなくなることから、可能な限り軽減するこ
とが望まれる。それゆえオイルアジュバントを用いたワ
クチンは接種部位などで制限を受ける場合がある。

【０００３】ワクチンの有効性と持続性を高いレベルで
保持させることは、疾病の予防というワクチン本来の目
的を果たす上で不可欠な要素であるが、その対象が生体
であることを考慮すると、有効性や持続性だけでなくワ
クチン自体の安全性もきわめて重要となってくる。

【０００４】これらの問題を解決することを目的として
これまで多くの検討が行われてきている。たとえば特公
平６−８１７３１号公報には、界面活性剤として無水マ
ンニトール・オレイン酸エステルを、油分として流動パ
ラフィンを用いた油中水滴型の油性アジュバントが示さ
れている。特表平４−５０６５２１号（ＷＯ９１／００
１０７号）公報には、油分として、植物油などの代謝可
能な油と鉱物油などの代謝不可能な油との混合物を用い
た低粘度の油中水型の油性アジュバントが示されてい
る。特開平６−１７２２１６号公報には、油分に植物油
を、界面活性剤としてソルビタン脂肪酸エステルとポリ
オキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル
とを用いたオイルアジュバントワクチンが示されてい
る。特公平６−３９３８６号公報には、生免疫原材料と
鉱物油を含む水中油型乳剤とを混合したオイルアジュバ
ント生ワクチンが示されている。特表平７−５０９７３
３号（ＷＯ９４／２００７１号）公報には、油分として
植物油や脂肪酸とポリオールとのエステルを、界面活性
剤としてポリグリセロールエステルを用いた油中水型の
ワクチン用液体エマルジョンが示されている。さらに、
特公平８−３２６３９号公報には、ポリオキシプロピレ
ンの疎水性部分とポリオキシエチレンの親水性部分とを
含む表面活性コポリマーを含んでなるオイルアジュバン
トが示されている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】このように数多くのオ
イルアジュバントが公報で提案されているが、いずれも
注射局所反応、もしくはワクチン自体の残留などの面で
必ずしも満足できるものはなかった。ワクチンは、生体
内の免疫機構を刺激するために生体にとっては異物であ
る種々の抗原を直接接種するものであるが、接種対象が
あくまでも生体であることから、有効でかつ可能な限り
安全なものが求められる。つまり、安全性の高いワクチ
ンを製造するために、生体異物となる抗原の含有量を抑
えると共に注射局所反応をできるだけ抑える製剤処方を
選択することが望ましい。

【０００６】しかしオイルアジュバントは、エマルジョ
ンの乳化型や安定性、使用する油分の種類や乳化剤の品
質等によって発現する免疫増強作用に大きな差を生じる
ことが知られている。とくに油中水型のオイルアジュバ
ントの場合、再現性よく、注射局所反応を抑えられるワ
クチンを調製することは困難であった。

【０００７】本発明は、従来利用が制限されていたオイ
ルアジュバントワクチンの局所反応などに関する問題点
を解決するものであり、その目的とするところは、生体
に安全なオイルアジュバントワクチンを提供することに
ある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記の目的
を達成するため鋭意検討した結果、抗原を含む水相中に
局所反応を抑えるための水溶性成分を配合すること、す
なわち常温で液状を示す油成分、乳化剤と抗原を含有す
る水性成分とで構成されるオイルアジュバントワクチン
の水性成分中に特定の水溶性物質を含有させることによ
り、優れた抗体産生力を維持しながら、生体に接種した
際の局所反応を極力抑えうるオイルアジュバントワクチ
ンが調製できることを見い出し、本発明を完成するに至
った。

【０００９】すなわち、本発明は下記の（１）〜（４）
に関する。 （１）Ａ）常温で液状を示す油成分１０〜９０重量％ Ｂ）非イオン系界面活性剤から選択される乳化剤０．５
〜３０重量％、およびＣ）０．１〜３０重量％のポリエ
チレングリコールと生物学的に許容される有効量の抗原
を含む水性成分とを含有するオイルアジュバントワクチ
ン。 （２）ポリエチレングリコールが、平均分子量３００〜
２００００のポリエチレングリコールである上記（１）
に記載のオイルアジュバントワクチン。 （３）油成分（Ａ）が、シス−Δ９−オクタデセン酸を
８５重量％以上含有しかつシス−Δ９−不飽和脂肪酸を
９０重量％以上含有する脂肪酸とアルコールとのエステ
ルである上記（１）に記載のオイルアジュバントワクチ
ン。 （４）乳化剤（Ｂ）が、３個以上の水酸基を有する多価
アルコールと、シス−Δ９−オクタデセン酸を８５重量
％以上含有しかつシス−Δ９−不飽和脂肪酸を９０重量
％以上含有する脂肪酸との部分エステルと、ヒドロキシ
脂肪酸トリグリセライドのエチレンオキサイド２０〜６
０モル付加物との混合物である上記（１）に記載のオイ
ルアジュバントワクチン。 （５）０．１〜３０重量％のポリエチレングリコールを
含む水溶液中に生物学的に許容される有効量の抗原を分
散させ、これを、得られるワクチン全量に対して１０〜
９０重量％の常温で液状を示す油成分と得られるワクチ
ン全量に対して０．５〜３０重量％の非イオン系界面活
性剤から選択される乳化剤との混合物に加え、混合する
ことを特徴とするオイルアジュバントワクチンの製造方
法。

【００１０】

【発明の実施の形態】本発明のオイルアジュバントワク
チンを構成する常温で液状を示す油成分（Ａ）は、従来
より一般的に食品、医薬品、化粧品などに用いられてい
るエステル系油性基剤および非エステル系油性基剤のう
ち、常温（１５〜２５℃）で液状を示すものの中から種
々選択、使用することができる。常温で液状を示す非エ
ステル系油性基剤としては、軽質流動パラフィン、スク
アレン、スクアラン、ポリブテンなどの炭化水素などが
挙げられる。またエステル系油性基剤としては、カプリ
ル酸やカプリン酸などの中鎖の飽和脂肪酸（炭素数：８
〜１５）や、オレイン酸やリノール酸などの長鎖の不飽
和脂肪酸（炭素数：１６〜２２）と、アルコール〔炭素
数１〜２２の１価、多価（好ましくは２〜３価）の飽
和、不飽和アルコール、たとえば、グリセロール、ジグ
リセロール、エチルアルコール、デシルアルコール、プ
ロピレングリコール、オレイルアルコールなど〕から誘
導される種々のエステル系誘導体、または天然由来の脂
肪酸エステル、たとえば、ピーナツ油、ヒマワリ油、サ
フラワー油、ホホバ油などの液状の植物油、オレンジラ
フィー油などの動物由来の油などが挙げられる。これら
は目的に応じて１種あるいは２種以上の混合物として用
いられる。

【００１１】中でも、オレイン酸のエステル誘導体や植
物油は、代謝性があり、かつ生体に対する親和性が高
く、局所刺激が低いという長所を有していることから、
油成分として好ましく使用される。その中でもとくに好
ましいものは、シス−Δ９−オクタデセン酸を８５重量
％以上含有しかつシス−Δ９−不飽和脂肪酸（炭素数：
１６〜２０）を９０重量％以上含有する脂肪酸と、たと
えば、グリセロール、ジグリセロール、エチルアルコー
ル、デシルアルコール、プロピレングリコール、シス−
Δ９−オクタデセノールを８５重量％以上含有しかつシ
ス−Δ９−不飽和脂肪族（炭素数：１６〜２０）アルコ
ールを９０重量％以上含有するオレイルアルコールなど
のアルコールとのエステル化物、該油性基剤とスクアレ
ンとの混合物などである。

【００１２】常温で液状を示す油成分の使用量は、ワク
チン全体量の１０〜９０重量％、好ましくは２０〜８０
重量％である。油成分の使用量が１０重量％未満、ある
いは９０重量％を超えると、安定なエマルジョンが得ら
れず、結果として生体に安全でかつ高い有効性を有する
オイルアジュバントワクチンを調製することができなく
なる恐れがある。

【００１３】本発明のオイルアジュバントワクチンを構
成する乳化剤（Ｂ）は、非イオン系界面活性剤から選択
される一種または二種以上の混合物である。従来より医
薬品や化粧品などに広く利用されているものの中から目
的に応じて適宜選択して使用することができる。非イオ
ン系界面活性剤であれば、親油性界面活性剤、親水性界
面活性剤のいずれも使用することができる。

【００１４】親油性界面活性剤として、３個以上の水酸
基を有する多価アルコールと脂肪酸との部分エステルが
挙げられる。多価アルコールとして、たとえば、グリセ
ロール、ジグリセロール、トリグリセロール、テトラグ
リセロール、へキサグリセロール、オクタグリセロー
ル、デカグリセロール、キシリトール、ソルビトール、
マンニトール、ソルビタンなどが挙げられる。また脂肪
酸としては、たとえば、カプリル酸、カプリン酸、ラウ
リン酸、オレイン酸、リノール酸などが挙げられる。こ
れらの脂肪酸の中でも、とくにシス−Δ９−オクタデセ
ン酸を８５重量％以上含有しかつシス−Δ９−不飽和脂
肪酸を９０重量％以上含有する脂肪酸が好ましい。上記
親油性界面活性剤として、たとえば、上記の脂肪酸から
誘導されるグリセロールモノオレート、ソルビタンモノ
オレート、ソルビタンジオレート、ジグリセロリルモノ
オレート、ジグリセロールジオレートなどがとくに好適
である。

【００１５】親水性界面活性剤として、たとえば、ヒド
ロキシ脂肪酸トリグリセライドのエチレンオキサイド２
０〜６０モル付加物などが挙げられる。

【００１６】乳化剤（Ｂ）として、ＨＬＢ７以下の親油
性界面活性剤とＨＬＢ１０以上の親水性界面活性剤との
混合物を使用することが望ましい。このような混合物を
使用すると良好な乳化状態を有するオイルアジュバント
ワクチンが得やすくなる。その中でも、とくにシス−Δ
９−オクタデセン酸を８５重量％以上含有し、かつシス
−Δ９−不飽和脂肪酸を９０重量％以上含有する脂肪酸
より誘導される親油性界面活性剤と、ヒドロキシ脂肪酸
トリグリセライドのエチレンオキサイド２０〜６０モル
付加物である親水性界面活性剤との混合物が好ましい。
この混合物を使用すると、高い安定性と安全性を有する
良好なオイルアジュバントワクチンを調製することがで
きる。親油性界面活性剤と親水性界面活性剤との混合割
合は、特に限定されないが、１０：１〜１：２（重量
比）が好ましく、さらに好ましくは５：１〜１：１であ
る。

【００１７】本発明のオイルアジュバントワクチンで使
用される、生物学的に許容される有効量の抗原を含む水
性成分（Ｃ）中には、特定量のポリエチレングリコール
が含有されている。これによって、従来のオイルアジュ
バントワクチンの短所である生体に接種した際の局所反
応性を低減することができる。

【００１８】ポリエチレングリコールの使用量は、オイ
ルアジュバントワクチンを構成する水性成分（Ｃ）中
０．１〜３０重量％、好ましくは１〜２０重量％であ
る。ポリエチレングリコールの使用量が０．１重量％未
満では、局所反応性を低減させる効果がなくなる恐れが
あり、また３０重量％を超えると、最終的に調製される
オイルアジュバントワクチンの粘度が高くなり、結果と
して接種した際の局所反応性が高くなる場合がある。

【００１９】使用されるポリエチレングリコールは、医
薬品分野で一般に広く用いられているものの中から種々
選択できるが、その中でも、好ましくは平均分子量３０
０〜２００００、とくに好ましくは平均分子量４００〜
１００００のポリエチレングリコールを用いることが望
ましい。これにより、高い安定性と安全性を有する良好
なオイルアジュバントワクチンを調製することができ
る。ポリエチレングリコールの平均分子量が３００以上
であると局所反応が抑えられ、また２００００以下であ
ると、最終的に調製されるオイルアジュバントワクチン
の粘度が適切に調整でき、結果として局所反応が抑えら
れる。

【００２０】なお、ポリエチレングリコールは、最終的
に有効量の抗原を水性成分中に分散させる際に、あらか
じめ水性成分となる緩衝生理水溶液中に添加、溶解させ
ておくことが望ましい。水性成分中に抗原を分散させた
後にポリエチレングリコールを添加、溶解させるのは操
作上困難であるだけでなく、本発明の効果が十分に得ら
れない場合がある。

【００２１】水性成分（Ｃ）に含有させる抗原として
は、一般的に用いられている不活化菌体、不活化ウィル
ス粒子、サブユニットワクチンで用いられるアタッチメ
ントプロテインやエンベローブ抗原といった病原体の感
染防御因子などが挙げられる。不活化菌体の菌として
は、たとえば、豚アクチノバシラス(Actinobacillus pl
europneumoniae）、大腸菌（Escherichia coli）などの
グラム陰性細菌、豚丹毒菌（Erysipelothrix rhusiopah
tiae）などのグラム陽性細菌などが挙げられる。不活化
ウィルス粒子のウィルスとしては、たとえば、日本脳炎
ウィルス（Japaneseencephalitis virus ）などが挙げ
られる。さらに病原体の感染防御因子として、ニューカ
ッスル病ウィルス（New castle disease virus）のＦ蛋
白などが挙げられる。本発明のオイルアジュバントワク
チンは、水性成分中に特定の水溶性物質を含有させるこ
とにより、ワクチン自体の局所反応性を低減できるた
め、抗原の形態や大きさにかかわらず、数多くの種類や
形態のものが使用される。さらに、本発明のオイルアジ
ェバントワクチンにおいては、抗原に加えて抗生物質な
どのような抗原以外の薬効成分を配合することも当然可
能である。抗生物質の例として硫酸カナマイシン、塩酸
オキシテトラサイクリンなどが挙げられる。抗原の水性
成分中の量は、目的や使用する抗原などの種類によって
生物学的に許容される有効量が適宜決められる。

【００２２】本発明のオイルアジュバントワクチンの製
造法は特に限定されず、自体既知の方法が適用できる。
たとえば、まず油成分（Ａ）に乳化剤（Ｂ）を加えて攪
拌混合し、しかるのちに、あらかじめポリエチレングリ
コールを混合、溶解した緩衝水溶液中に生物学的に許容
される有効量の抗原を分散させた水性成分（Ｃ）を、
（Ａ）と（Ｂ）の混合物に加えて攪拌、乳化させる方法
がある。乳化に際しては、ホモミキサーやホモジナイザ
ーなど、一般的に乳化が可能な手段であればどのような
装置でも使用することができる。

【００２３】油成分（Ａ）および抗原を含有する水性成
分（Ｃ）の比率は、ワクチンの用途、目的あるいは選択
する抗原種に応じて適宜選択される。好ましくは（Ａ）
成分：（Ｃ）成分が、重量比で１０：１〜１：２、さら
に好ましくは４：１〜１：１である。

【００２４】また、このワクチンの調製に際し、前記の
乳化剤（Ｂ）の添加量は、ワクチン全体量の０．５〜３
０重量％、好ましくは３〜２０重量％の割合とするのが
望ましい。０．５重量％未満では安定な乳化系を得るこ
とができず、３０重量％を超えると注射局所での反応性
が高まり、安全性の高いオイルアジュバントワクチンが
得られなくなる。

【００２５】本発明において、オイルアジュバントワク
チンを構成する油成分（Ａ）や水性成分（Ｃ）には、そ
れぞれ医薬品として当然のことながら、緩衝化剤や防腐
剤、浸透圧調整成分など、アジュバント活性には直接関
与しない種々の添加剤を含有させることができる。な
お、ワクチンの調製に際して、使用する各成分について
は、その特性に応じて、あらかじめ加熱滅菌か濾過滅菌
などの滅菌処理を行うこともできる。

【００２６】本発明のオイルアジュバントワクチンは、
その調製条件などによって、抗原が水性成分（Ｃ）のみ
に保持される場合と、その一部が油成分（Ａ）中に漏出
して、水性成分（Ｃ）と油成分（Ａ）の両成分に存在す
る場合があるが、いずれの場合にも、本発明に係るオイ
ルアジュバントワクチンの効果が損なわれるものではな
い。

【００２７】

【実施例】つぎに、本発明を実施例によりさらに具体的
に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定され
るものではない。

【００２８】実施例１ 抗原として用いた菌 グラム陰性細菌である豚アクチノバシラス(Actinobacil
lus pleuropneumoniae) の不活化菌体を用いた。すなわ
ち、Actinobacillus pleuropneumoniae ＩＷ−９０３
株（血清型１型）を液体培地に接種し、３７℃で通気攪
拌培養した菌液をホルマリンで不活化し、遠心分離によ
り集菌・洗浄したものを抗原とした。

【００２９】油成分としてエチルオレート〔日本油脂
（株）製「ＮＯＦＡＢＬＥ ＥＯ−９０」、アシル基組
成：シス−Δ９−オクタデセン酸含量：８８重量％、シ
ス−９−不飽和脂肪酸（炭素数：１６〜２０）含量：９
４重量％〕１２重量部を用い、この油成分に、乳化剤と
してソルビタンセスキオレート〔日本油脂（株）製「Ｎ
ＯＦＡＢＬＥ ＳＯ−９９２」、アシル基組成：シス−
Δ９−オクタデセン酸含量：９９重量％、シス−Δ９−
不飽和脂肪酸含量：９９重量％〕１．６重量部と５０℃
に加温したポリオキシエチレン硬化ヒマシ油〔エチレン
オキサイド平均付加モル数４０〕０．４重量部とを加え
て十分に攪拌した後、これに、あらかじめ、平均分子量
２０００のポリエチレングリコール１．２重量部を添
加、溶解したリン酸緩衝生理食塩水中に、上記の抗原
（不活化前生菌数が１０¹⁰個／ドース）を分散させた水
性成分６重量部を、攪拌しながら徐々に加え、常温に
て、クレアミクスＣＬＭ−０．８Ｓ〔エム・テクニック
（株）製〕を用いて、８，０００回転で１０分間攪拌混
合して、ワクチンａを調製した。

【００３０】実施例２ 油成分としてオレイルオレート〔日本油脂（株）製「Ｎ
ＯＦＡＢＬＥ ＯＯ−９０８０」、アシル基組成：シス
−Δ９−オクタデセン酸含量：８８重量％、シス−Δ９
−不飽和脂肪酸含量：９４重量％〕６重量部とスクアラ
ン６重量部とを用い、この油成分に、乳化剤としてソル
ビタンセスキオレート〔日本油脂（株）製「ＮＯＦＡＢ
ＬＥ ＳＯ−９０２」、アシル基組成：シス−Δ９−オ
クタデセン酸含量：８８重量％、シス−Δ９−不飽和脂
肪酸含量：９４重量％〕１．６重量部と５０℃に加温し
たポリオキシエチレン硬化ヒマシ油〔エチレンオキサイ
ド平均付加モル数４０〕０．４重量部を加えて十分に攪
拌した後、これに、あらかじめ、平均分子量４０００の
ポリエチレングリコール０．８重量部を添加、溶解した
リン酸緩衝生理食塩水中に、実施例１で使用したのと同
じ抗原（不活化前生菌数が１０¹⁰個／ドース）を分散さ
せた水性成分８重量部を、攪拌しながら徐々に加え、以
下実施例１と同様の方法により攪拌混合して、ワクチン
ｂを調製した。

【００３１】実施例３ 油成分としてオレイルオレート〔日本油脂（株）製「オ
レイン酸エチル−８０Ｒ」、アシル基組成：シス−Δ９
−オクタデセン酸含量：７２重量％、シス−Δ９−不飽
和脂肪酸（炭素数：１６〜２０）含量：８６重量％〕６
重量部とスクアレン６重量部とを用い、この油成分に、
乳化剤としてソルビタンセスキオレート〔日本油脂
（株）製「ＮＯＦＡＢＬＥ ＳＯ−８５２」、アシル基
組成：シス−Δ９−オクタデセン酸含量：８７重量％、
シス−Δ９−不飽和脂肪酸含量：９１重量％〕１．６重
量部と５０℃に加温したポリオキシエチレン硬化ヒマシ
油〔エチレンオキサイド平均付加モル数４０〕０．４重
量部を加えて十分に攪拌した後、これに、あらかじめ、
平均分子量６０００のポリエチレングリコール０．８重
量部を添加、溶解したリン酸緩衝生理食塩水中に、実施
例１で使用したのと同じ抗原（不活化前生菌数が１０¹⁰
個／ドース）を分散させた水性成分８重量部を、攪拌し
ながら徐々に加え、以下実施例１と同様の方法により攪
拌混合して、ワクチンｃを調製した。

【００３２】比較例１ 油成分としてエチルオレート〔日本油脂（株）製「オレ
イン酸エチル−８０Ｒ」、アシル基組成：シス−Δ９−
オクタデセン酸含量：７２重量％、シス−Δ９−不飽和
脂肪酸含量：８６重量％〕６重量部とスクアラン６重量
部とを用い、この油成分に、乳化剤としてソルビタンセ
スキオレート〔日本油脂（株）製「ノニオンＯＰ−８３
ＲＡＴ」、アシル基組成：シス−Δ９−オクタデセン酸
含量：５５重量％、シス−Δ９−不飽和脂肪酸含量：８
３重量％〕１．６重量部と５０℃に加温したポリオキシ
エチレン硬化ヒマシ油〔エチレンオキサイド平均付加モ
ル数４０〕０．４重量部とを加えて十分に攪拌した後、
リン酸緩衝生理食塩水中に実施例１で使用したのと同じ
抗原（不活化前生菌数が１０¹⁰個／ドース）を分散させ
た水性成分６重量部を、攪拌しながら徐々に加え、以下
実施例１と同様の方法により攪拌混合して、ワクチンｄ
を調製した。

【００３３】比較例２ 油成分として軽質流動パラフィン〔エッソ（株）製「ク
リストール５２」〕６重量部を用い、これに乳化剤とし
てソルビタンセスキオレート〔日本油脂（株）製「ノニ
オンＯＰ−８３ＲＡＴ」、アシル基組成：シス−Δ９−
オクタデセン酸含量：５５重量％、シス−Δ９−不飽和
脂肪酸含量：８３重量％）０．８重量部とポリオキシエ
チレンソルビタンモノオレート〔日本油脂（株）製「ノ
ニオンＯＴ−２２１」、アシル基組成：シス−Δ９−オ
クタデセン酸含量：５５重量％、シス−Δ９−不飽和脂
肪酸含量：７８重量％、エチレンオキサイド平均付加モ
ル数２０〕０．２重量部とを加えて十分に攪拌しなが
ら、リン酸緩衝生理食塩水中に実施例１で使用したのと
同じ抗原（不活化前生菌数が１０¹⁰個／ドース）を分散
させた水性成分３重量部を徐々に加え、以下実施例１と
同様の方法により攪拌混合して、ワクチンｅを調製し
た。

【００３４】以上の各実施例、比較例で使用したオイル
アジュバントワクチンは、いずれも加熱滅菌および濾過
滅菌のうち各々に適した方法により、滅菌処理済みの成
分を用いて、試験例中に示した処方にしたがって調製し
た。また、攪拌、乳化などの各操作は、すべてクリーン
ベンチ内で、無菌環境下にて行った。

【００３５】試験例１ 実施例１〜３および比較例１、２で得られた各オイルア
ジュバントワクチンの局所反応性および有効性を評価す
るため、モルモットを用いて試験を行った。表中のワク
チンの欄で示されている小文字のアルファベットは、そ
のワクチンが実施例１〜３および比較例１、２に示す各
々の記号に対応した処方に基づいて調製されたものであ
ることを示している。

【００３６】安全性（局所反応病変スコア） 実施例１〜３および比較例１、２で得たワクチンをモル
モットに接種した。試験群（ワクチンａ〜ｃを投与した
群）および比較群（ワクチンｄ、ｅを投与した群）共に
４週齢のクリーンモルモット(Hartlay系）各５匹に、１
匹当たりワクチンａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅをそれぞれ０．５
ml内股部筋肉内に注射した。試験期間中、経時的に注射
局所の臨床観察を行い、触診により注射局所の病変スコ
ア（無：０〜重：３）をつけ、各群５匹の平均を求め
た。結果を、表１に示す。

【００３７】

【表１】

【００３８】試験群、比較群共に臨床症状に際だった異
常はみられなかった。局所反応スコアについては、実施
例１〜３で得られたワクチンａ、ｂ、ｃの反応は、比較
例で得られたワクチンｄ、ｅと比べて明らかに低く、し
かも注射後５週目をピークに反応が低下し、注射後８週
目では反応がほとんど消失していた。比較例のワクチ
ン、とくに鉱物油系アジュバントを使用したワクチンｅ
は注射後２週目からかなり強い局所反応が認められ、そ
の後８週目においてもすべてのモルモットで明らかにス
コア３以上と判断される強い反応が認められた。

【００３９】有効性（抗体産生） また、試験期間中、経時的に血清を採取し、得られた血
清について補体結合反応（ＣＦ）抗体価を測定し、推移
を観察した。結果を表２に示す。

【００４０】

【表２】

【００４１】ワクチンａ、ｂ、ｃ注射群は注射後３週よ
りＣＦ抗体価の上昇を認め、注射後８週においては１２
８〜２５６倍の良好な抗体応答を認め、比較群のワクチ
ンｄ注射群とほぼ同等の抗体応答を示した。以上の成績
は、本発明のオイルアジュバントのアジュバントが十分
な免疫賦活効果を示すとともに、水性成分にポリエチレ
ングリコールを添加することにより局所反応性が低下
し、その結果従来用いられてきた鉱物油系アジュバント
よりはるかに優れたワクチンとなり得ることを証明する
ものである。

【００４２】実施例４ 抗原として用いた菌 Actinobacillus pleuropneumoniae ＮＧ−２２株（血清
型２型）を液体培地に接種し、３７℃で通気攪拌培養し
た菌液をホルマリンで不活化し、遠心分離により集菌・
洗浄したものを抗原とした。

【００４３】油成分としてエチルオレート〔日本油脂
（株）製「ＮＯＦＡＢＬＥ ＥＯ−９０」、アシル基組
成：シス−Δ９−オクタデセン酸含量：８８重量％、シ
ス−９−不飽和脂肪酸含量：９４重量％〕１２重量部を
用い、この油成分に、乳化剤としてソルビタンセスキオ
レート〔日本油脂（株）製「ＮＯＦＡＢＬＥ ＳＯ−９
９２」、アシル基組成：シス−Δ９−オクタデセン酸含
量：９９重量％、シス−Δ９−不飽和脂肪酸含量：９９
重量％〕１．６重量部と５０℃に加温したポリオキシエ
チレン硬化ヒマシ油〔エチレンオキサイド平均付加モル
数４０〕０．４重量部とを加えて十分に攪拌した後、こ
れに、あらかじめ、平均分子量２０００のポリエチレン
グリコール１．２重量部を添加、溶解したリン酸緩衝生
理食塩水中に、上記の抗原（不活化前生菌数：１０¹⁰個
／ドース）を分散させた水性成分６重量部を、攪拌しな
がら徐々に加え、常温にて、クレアミクスＣＬＭ−０．
８Ｓ〔エム・テクニック（株）製〕を用いて、８，００
０回転で１０分間攪拌混合して、ワクチンｆを調製し
た。

【００４４】実施例５ 油成分としてオレイルオレート〔日本油脂（株）製「Ｎ
ＯＦＡＢＬＥ ＯＯ−９０８０」、アシル基組成：シス
−Δ９−オクタデセン酸含量：８８重量％、シス−Δ９
−不飽和脂肪酸含量：９４重量％〕６重量部とスクアラ
ン６重量部とを用い、この油成分に、乳化剤としてソル
ビタンセスキオレート〔日本油脂（株）製「ＮＯＦＡＢ
ＬＥ ＳＯ−９０２」、アシル基組成：シス−Δ９−オ
クタデセン酸含量：８８重量％、シス−Δ９−不飽和脂
肪酸含量：９４重量％〕１．６重量部と５０℃に加温し
たポリオキシエチレン硬化ヒマシ油〔エチレンオキサイ
ド平均付加モル数４０〕０．４重量部を加えて十分に攪
拌した後、これに、あらかじめ、平均分子量４００のポ
リエチレングリコール０．８重量部を添加、溶解したリ
ン酸緩衝生理食塩水中に、実施例４で使用したのと同じ
抗原（不活化前生菌数が１０¹⁰個／ドース）を分散させ
た水性成分８重量部を、攪拌しながら徐々に加え、以下
実施例４と同様の方法により攪拌混合して、ワクチンｇ
を調製した。

【００４５】実施例６ 油成分としてエチルオレート〔日本油脂（株）製「オレ
イン酸エチル−８０Ｒ」、アシル基組成：シス−Δ９−
オクタデセン酸含量：７２重量％、シス−Δ９−不飽和
脂肪酸含量：８６重量％〕６重量部とスクアレン６重量
部とを用い、この油成分に、乳化剤としてソルビタンセ
スキオレート〔日本油脂（株）製「ＮＯＦＡＢＬＥ Ｓ
Ｏ−８５２」、アシル基組成：シス−Δ９−オクタデセ
ン酸含量：８７重量％、シス−Δ９−不飽和脂肪酸含
量：９１重量％〕１．６重量部と５０℃に加温したポリ
オキシエチレン硬化ヒマシ油〔エチレンオキサイド平均
付加モル数４０〕０．４重量部を加えて十分に攪拌した
後、これに、あらかじめ平均分子量６０００のポリエチ
レングリコール０．８重量部を添加、溶解したリン酸緩
衝生理食塩水中に実施例４で使用したのと同じ抗原（不
活化前生菌数が１０¹⁰個／ドース）を分散させた水性成
分８重量部を攪拌しながら徐々に加え、以下実施例４と
同様の方法により攪拌混合してワクチンｈを調製した。

【００４６】比較例３ 油成分として、エチルオレート〔日本油脂（株）製「オ
レイン酸エチル−８０Ｒ」、アシル基組成：シス−Δ９
−オクタデセン酸含量：７２重量％、シス−Δ９−不飽
和脂肪酸含量：８６重量％〕６重量部とスクアラン６重
量部とを用い、この油成分に、乳化剤としてソルビタン
セスキオレート〔日本油脂（株）製「ノニオンＯＰ−８
３ＲＡＴ」、アシル基組成：シス−Δ９−オクタデセン
酸含量：５５重量％、シス−Δ９−不飽和脂肪酸含量：
８３重量％〕１．６重量部と５０℃に加温したポリオキ
シエチレン硬化ヒマシ油〔エチレンオキサイド平均付加
モル数４０〕０．４重量部とを加えて十分に攪拌した
後、リン酸緩衝生理食塩水中に実施例４で使用したのと
同じ抗原（不活化前生菌数が１０¹⁰個／ドース）を分散
させた水性成分６重量部を、攪拌しながら徐々に加え、
以下実施例４と同様の方法により攪拌混合して、比較ワ
クチンｉを調製した。

【００４７】比較例４ 油成分として、軽質流動パラフィン〔エッソ（株）製
「クリストール５２」〕６重量部を用い、これに乳化剤
としてソルビタンセスキオレート〔日本油脂（株）製
「ノニオンＯＰ−８３ＲＡＴ」、アシル基組成：シス−
Δ９−オクタデセン酸含量：５５重量％、シス−Δ９−
不飽和脂肪酸含量：８３重量％〕０．８重量部とポリオ
キシエチレンソルビタンモノオレート〔日本油脂（株）
製「ノニオンＯＴ−２２１」、アシル基組成：シス−Δ
９−オクタデセン酸含量：５５重量％、シス−Δ９−不
飽和脂肪酸含量：７８重量％、エチレンオキサイド平均
付加モル数２０〕０．２重量部とを加えて十分に攪拌し
ながら、リン酸緩衝生理食塩水中に実施例４で使用した
のと同じ抗原（不活化前生菌数が１０¹⁰個／ドース）を
分散させた水性成分３重量部を徐々に加え、以下実施例
４と同様の方法により攪拌混合して、比較ワクチンｊを
調製した。

【００４８】以上の各実施例、比較例で使用したオイル
アジュバントワクチンは、いずれも加熱滅菌および濾過
滅菌のうち各々に適した方法により、滅菌処理済みの成
分を用いて、試験例中に示した処方にしたがって調製し
た。また、攪拌、乳化などの各操作は、すべてクリーン
ベンチ内で、無菌環境下にて行った。

【００４９】試験例２ 実施例４〜６および比較例３、４で得られた各オイルア
ジュバントワクチンについて、免疫試験を行った。表中
のワクチンの欄で示されている小文字のアルファベット
は、そのワクチンが実施例４〜６および比較例３、４に
示す各々の記号に対応した処方に基づいて調製されたも
のであることを示している。

【００５０】安全性 試験群（ワクチンｆ〜ｈを投与した群）および比較群
（ワクチンｉ、ｊを投与した群）共に、４週齢ＳＰＦブ
タ各ワクチン当たり５頭に１頭当たりワクチンｆ、ｇ、
ｈ、ｉ、ｊの１mlを４週間間隔で２回筋肉内に注射し
た。また、５頭の非免疫同居対照群をおいた。各回注射
後２週間について注射局所を含む臨床症状の観察および
体温の測定を行い、異常を認めた個数を記録した。安全
性の結果を表３に示す。

【００５１】

【表３】

【００５２】試験群に発熱、臨床症状の異常はみられな
かったが、比較群のワクチンｉの一部とワクチンｊで
は、初回および追加免疫直後に一過性の体温の上昇およ
び元気の消失が認められた。

【００５３】有効性（抗体産生） また試験期間中、経時的に血清を採取し、その血清につ
いて補体結合反応（ＣＦ）抗体価を測定し推移を観察し
た。結果を表４に示す。

【００５４】

【表４】

【００５５】試験群は注射後４週よりＣＦ抗体価の上昇
を認め、注射後８週においては１２８〜２５６倍の良好
な抗体応答を認め、比較群のワクチンｊ注射群とほぼ同
等の抗体応答を示した。以上の成績は、本発明のオイル
アジュバントが、従来用いられていた非代謝性の鉱物油
系アジュバントとほぼ同等の免疫賦活効果を示すととも
に、局所反応性においては、従来の鉱物油系アジュバン
トよりはるかに優れていることを証明するものである。

【００５６】

【発明の効果】本発明のオイルアジュバントワクチン
は、ワクチンとしての有効性と安定性だけでなく、安全
性、とくに生体に接種した際の局所反応が極めて抑えら
れるという特徴を有している。したがって、さまざまな
生物に対して、有効性と安全性の両面に優れたオイルア
ジュバントワクチンとして使用することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 岸本 洋子 兵庫県明石市魚住町錦が丘１−７−８ (72)発明者 徳山 悟 兵庫県西宮市鳴尾町５−７−10−404

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ａ）常温で液状を示す油成分１０〜９０
   重量％、 Ｂ）非イオン系界面活性剤から選択される乳化剤０．５
   〜３０重量％、および Ｃ）０．１〜３０重量％のポリエチレングリコールと生
   物学的に許容される有効量の抗原を含む水性成分とを含
   有するオイルアジュバントワクチン。
2. 【請求項２】 ポリエチレングリコールが、平均分子量
   ３００〜２００００のポリエチレングリコールである請
   求項１に記載のオイルアジュバントワクチン。
3. 【請求項３】 油成分（Ａ）が、シス−Δ９−オクタデ
   セン酸を８５重量％以上含有しかつシス−Δ９−不飽和
   脂肪酸を９０重量％以上含有する脂肪酸とアルコールと
   のエステルである請求項１記載のオイルアジュバントワ
   クチン。
4. 【請求項４】 乳化剤（Ｂ）が、３個以上の水酸基を有
   する多価アルコールと、シス−Δ９−オクタデセン酸を
   ８５重量％以上含有しかつシス−Δ９−不飽和脂肪酸を
   ９０重量％以上含有する脂肪酸との部分エステルと、ヒ
   ドロキシ脂肪酸トリグリセライドのエチレンオキサイド
   ２０〜６０モル付加物との混合物である請求項１記載の
   オイルアジュバントワクチン。
5. 【請求項５】 ０．１〜３０重量％のポリエチレングリ
   コールを含む水溶液中に生物学的に許容される有効量の
   抗原を分散させ、これを、得られるワクチン全量に対し
   て１０〜９０重量％の常温で液状を示す油成分と得られ
   るワクチン全量に対して０．５〜３０重量％の非イオン
   系界面活性剤から選択される乳化剤との混合物に加え、
   混合することを特徴とするオイルアジュバントワクチン
   の製造方法。