NO342565B1 - Rekombinante vaksiner mot caligid copepoder (sjølus) og antigene sekvenser av disse. - Google Patents

Abstract

Molekylære mål og vaksiner mot dem i behandling av fiskelus er skaffet til veie, særlig caligid kopepoder. Vaksiner målrettet mot L. salmonis trypsin er vist å redusere mengden av fiskelus som er til stede i immunutfordret laks fra dag 14 p. i. og fremover. Ytterligere og nye molekylære mål for vaksiner blir også skaffet til veie.

Description

REKOMBINANTE VAKSINER MOT CALIGID COPEPODER (SJØLUS) OG ANTIGENE SEKVENSER AV DISSE

Foreliggende oppfinnelse angår generelt laksevaksiner. Mer spesifikt angår foreliggende oppfinnelse vaksiner mot parasittiske caligid kopepoder (fiskelus) og de antigene sekvensene av disse.

BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN

Et antall nært beslektede arter av parasittiske kopepoder i familien Caligidae (caligid kopepoder) infiserer og forårsaker sykdom hos oppdrettsfisk. Samlet blir disse artene referert til som fiskelus. Det er tre hovedslekter av fiskelus:

Pseudocaligus, Caligus og Lepeophtheirus. Med hensyn på produksjon av laksefisk på den nordlige halvkule, er en art, lakselusen (Lepeophtheirus salmonis), ansvarlig for de fleste sykdomsutbrudd innen laksefisk oppdrett. Denne parasitten er ansvarlig for indirekte og direkte tap innen akvakultur med over 100 millioner US $ årlig (Johnson, S.C., et al., Zool Studies 43: 8 - 19, 2004). Alle utviklingstrinn hos fiskelus, hvilke er festet til verten, fôres på vertens mukus, skinn og blod. Festingen og fôringsaktiviteten til fiskelusen resulterer i skader som varierer i natur og alvorlighet avhengig av: arten av fiskelus, deres forekomst, foreliggende utviklingstrinn og vertens art (Johnson, S. C et al., "Interactions between sea lice and their hosts". I: Host-Parasite Interactions. Forfattere: G. Wiegertjes and G. Flik, Garland Science/Bios Science Publications, 2004, pp.131-160). På den sørlige halvkule er Caligus rogercresseyi den primære caligid som påvirker lakseoppdrettsindustrien i Chile (González, L. and Carvajal, J. Aquaculture 220: 101 - 117, 2003).

Caligid kopepoder har direkte livssykluser som består av to fritt-levende planktoniske nauplius trinn, et fritt-svømmende infeksiøst kopepode trinn, fire til seks festede chalimus trinn, et eller to for-voksne trinn, og et voksent trinn (Kabata, Z., Book 1: Crustacea as enemies of fishes. I: Diseases of Fishes., Forfattere: Snieszko, S. F. and Axelrod, H. R.; New York, T.F.H. Publications, 1970, p.171). Hvert av disse utviklingstrinnene er adskilt med et skallskifte. Med en gang det voksne trinnet er nådd vil caligid kopepodene ikke gjennomgå ytterligere skallskifte. I det tilfelle med L. salmonis, klekkes egg inn i det frittsvømmende første nauplius trinnet, hvilket blir etterfulgt av et andre nauplius trinn, og deretter det infeksiøse kopepodid trinnet. Med en gang kopepodid lokaliserer en velegnet vertsfisk, fortsetter den sin utvikling gjennom fire chalimus trinn, første og andre forvoksne trinn, og deretter et endelig voksent trinn (Schram, T.A. "Supplemental descriptions of the developmental stages of Lepeophtheirus salmonis (Krøyer, 1837) (Copepoda: Caligidae)". I: Pathogens of Wild and Farmed Fish: Sea Lice. Forfattere: Boxshall, G.A. and Defaye, D., 1993, s.30-50). Skallskiftene er kjennetegnet ved gradvise endringer ettersom dyret vokser og gjennomgår fysikalske modifikasjoner som gjør det mulig for det å leve som en fritt omstreifende parasitt, som fôrer og føder på overflaten av fisken.

Caligid kopepoder (fiskelus) fôres på mukus, skinn og blod på vertene sine og dette fører til skader som varierer i alvorlighet basert på utviklingsmessige trinn av kopepodene som er til stede, antall kopepoder som er til stede, deres festested(er) og vertens art. I situasjoner med alvorlig sykdom, slik man ser i Atlantisk laks (Salmo salar) når de er infisert av et stort antall L. salmonis, kan man se omfattende områder med skinn erosjon og blødninger på hode og rygg, og et bestemt område med erosjon og sub-epidermal blødning i perianal område kan sees (Grimnes, A. et al. J Fish Biol 48: 1179- 1194, 1996). Fiskelus kan forårsake fysiologiske endringer hos sine verter hvilket innbefatter utvikling av en stress respons, redusert immunfunksjon, osmoregulatorisk svikt og død dersom ubehandlet (Johnson et al., supra).

Det er flere styringsstrategier som har blitt anvendt for redusering av intensiteten ved caligid kopepode (fiskelus) infeksjoner. Disse inkluderer brakklegging av stedene før gjenoppretting, separasjon av årsklasser og seleksjon på oppdrettsstedet for å unngå områder det er høye tettheter av ville verter eller andre miljømessig betingelser som passer for etablering av fiskelus (Pike, A. W. et al. Adv Parasitol 44: 233-337, 1999). Selv om benyttelse av disse strategiene i noen tilfeller kan senke graden av fiskelus infeksjon, har bruken individuelt eller i kombinasjon ikke vært effektiv for eliminering av infeksjonen.

Et antall kjemikalier og medikamenter har blitt anvendt for å kontrollere fiskelus. Disse kjemikaliene er utformet for kontroll av terrestriske skadedyr og parasitter på planter og husdyr. Disse inkluderer forbindelser slik som hydrogenperoksid, organofosfater (for eksempel diklorvos og azametifos), ivermectin (og beslektede forbindelser slik som emamectin benzoat), insekt skallskifte regulatorer og pyretriner (MacKinnon, B. M., World Aquaculture 28: 5-10, 1997; Stone J., et al., J Fish Dis 22: 261-270, 1999). Fiskelus behandlinger kan bli klassifisert i de som blir administrert i badet (for eksempel organofosfater, pyretriner) og de som blir administrert oralt (for eksempel ivermectin). Bad behandlinger for fiskelus kontroll er vanskelige, kostbare å anvende og kan ha signifikante effekter på fiskevekst etter behandlingene (MacKinnon, supra). Kjemikalier anvendt i bad behandlinger er nødvendigvis ikke effektive mot alle trinnene hos fiskelusene som blir funnet på fisk. For tiden er anvendelse av orale behandlinger slik som SLICE® (emamectin benzoat) dominerende innenfor laksefisk industrien. I motsetning til kjemikalier administrert som bad behandlinger, skaffer SLICE® til veie kort-tids beskyttelse mot gjeninfeksjon. Denne behandlingen, selv om den er lettere å benytte enn bad behandlinger er den fremdeles kostbar, og som bad behandlinger, krever den en tilbaketrekkingstid før dyrene kan bli slaktet for menneskelig konsum (Stone, supra). Slik man kan se fra terrestriske skadedyr og parasitter er det evidens for utvikling av resistens i L. salmonis overfor noen av disse behandlingene, særlig i ofte-behandlede populasjoner (Denholm, I., Pest Manag Sci 58: 528 - 536, 2002). For å redusere kostnadene som er forbundet med fiskelus behandlingene og å eliminere risiko forbundet med disse behandlingene, er det nødvendig med nye metoder for fiskelus kontroll slik som vaksiner.

Et karakteristisk trekk ved festing og fôringssteder for caligid kopepoder på mange av deres verter er en mangel på en verts immunrespons (Johnson et al., supra; Jones, M.W., et al., J Fish Dis 13: 303 - 310, 1990; Jónsdóttir, H., et al., J Fish Dis 15: 521 - 527, 1992). Denne mangel på en immunrespons er lik den som er rapportert for andre artropod parasitter slik som flått (”ticks”) på terrestriske dyr. I disse situasjoner skyldes undertrykking av immunsystemet produksjon av immun modulatoriske substanser av parasitten (Wikel, S. K., et al., "Arthropod modulation of host immune responses". I The Immunology of Host-Ectoparasitic Arthropod Relationships. Forfattere: Wikel, S. K., CAB Int., 1996, s.107 - 130). Disse substansene blir undersøkt for anvendelse som vaksine antigener for å kontrollere disse parasittene. Fiskelus slik som L. salmonis, som andre artropod ektoparasitter produserer biologisk aktive substanser på stedet for festing og fôring hvilke begrenser vertens immunrespons. Da disse substansene har potensial for anvendelse i en vaksine mot fiskelus, har vi identifisert et antall av disse substansene fra L. salmonis og har undersøkt deres effekter av vertens immunfunksjon in vitro.

Potensielle antigener har blitt identifisert ved anvendelse av en kombinasjon av biologiske, proteomiske, biokjemiske og immunologiske teknikker. En økning i for eksempel protease aktivitet har blitt observert i mukus til L. salmonis infiserte Atlantisk laks, sammenliknet med ikke-infisert fisk (Ross, N.W., et al., Dis Aquat Org 41: 43 - 51, 2000; Fast, M. D., et al., Dis Aquat Org 52: 57 - 68, 2002). Denne økte aktiviteten skyldes primært forekomst av en serie med lav molekylvekt proteiner (18 – 24 kDa), som blir produsert av L. salmonis og ble identifisert som trypsiner basert på aktivitet, hemmingsstudier og størrelse. Trypsin aktivitet ble identifisert i infiserte salomon mukus ved anvendelse av aminobenzamidin affinitet adsorpsjon og protease zymografi (Firth, K.J., et al., J Parasitol 86: 1199 - 1205, 2000). Flere gener som koder for trypsin har blitt karakterisert fra L. salmonis og stedet for trypsin ekspresjon bestemt (Johnson, S.C., et al., Parasitol Res 88: 789 - 796, 2002; Kvamme, B.O., et al., Int. J. Parasitol. 34, 823 - 832, 2004; Kvamme, B.O. et al., Gene 352: 63 - 72, 2005).

Flere cDNA biblioteker har blitt utviklet fra kopepodene, for-voksne og voksne trinn av L. salmonis. En uttrykt sekvens tag (EST) studie av det for-voksne biblioteket resulterte i identifikasjon av et antall gener som koder for trypsin og beslektede proteaser (inkludert chymotrypsin og andre i peptidase S1 familien), varmesjokk proteiner, kutikula proteiner og metabolske enzymer. Noen av disse genene som er beskrevet her, kan utnyttes som antigener i fiskelus vaksine.

Trypsin-liknende aktivitet blir utskilt fra L. salmonis på lakseskinnet og er antatt å bli anvendt av fiskelusen som fôr på laksemukus, skinn og blod og å beskytte fiskelusen mot laksens immunrespons (Firth, et al., supra). Trypsin ble oppdaget i sekresjonsproduktene (SP) til fiskelusen, etter stimulering med dopamin, ved aminosyre sekvensering ved anvendelse av masse-spektroskopi. Tabell 1 viser peptidsekvensene til L. salmonis utskilt trypsin. Beskyttelse mot fiskelus trypsin kan redusere fôringen av lusen og redusere undertrykking av immunresponsen.

Tabell 1: Sammendrag av L. salmonis sekrert trypsin identifisert fra LC/MS/MS

<a>Forskjell (i parts-per-million) mellom målt masse og masse forutsagt fra DNA sekvensen.

<b>Score fra MASCOT<TM>søk, scor over 21 indikerer identitet eller omfattende homologi (p<0,05)

<c>Cyanogen bromid/tryptisk peptid sekvens forutsagt fra DNA sekvensen.

<d>+M oksidasjon menes at MASCOT matchen var for et peptid som inneholder et oksidert methionin residie.

Vitellogenin-liknende protein ble oppdaget i sekresjonsproduktene (SP) fra fiskelus etter stimulering med dopamin. Vitellogenin har tidligere blitt rapportert som et effektivt antigen i en flått vaksine (Tellam, R.I., et al., Vet Parasitol 103: 141 - 156, 2002). Inkludering av en vitellogenin i fiskelus vaksine kan interferere med produktiviteten til fiskelus og redusere antall avkom og reduserer således det fremtidige antallet av fiskelus. I tillegg har vitellogenin-liknende proteiner blitt implisert i syntese av melanin i invertebrater (Lee, K.M. et al., Eur J Biochem 267: 3695 - 3703, 2000). Melanin er et viktig forsvarsmolekyl hos invertebrater.

Musling adhesjons-liknende gener uttrykker proteiner som likner de som finnes i muslingens byssustråder som muslingen benytter for å feste seg selv til faste overflater. Hvordan disse genene relateres til fiskelus infeksjoner er for tiden ikke forstått, men de kan være involvert i produksjon av frontale filamenter. Det frontale filamentet blir anvendt i chalimus trinnene til fysisk festing av seg selv til verten. (Gonzalez-Alanis, P., et al., J Parasitol 87: 561 - 574, 2001).

BCS-1 gener blir uttrykt av barnacler når de går over fra en planktonisk form til en festet form (Okazaki.Y., et al., Gene 250 (1-2): 127 - 135, 2000). Det er for tiden evidens å hevde at disse er kutikula-bindende proteiner. Oppbryting av disse proteinene med antistoffer kan interferere med skallskifte, integriteten til fiskelus kutikula og normal vekst av lusen.

Sekretoriske proteiner produsert av fiskelusen kan virke som immunmodulatoriske midler eller hjelpe til i fôringsaktiviteter på verten (Fast, M. D., et al., Exp Parasitol.107: 5 - 13, 2004; Fast, M. D., et al., J Parasitol 89: 7 -13, 2003). Nøytralisering av disse aktivitetene med verts-utvunnede antistoffer kan forringe fiskelus vekst og overlevelse på laks.

Vaksiner er generelt sikrere enn kjemisk behandling, både for fisken og miljøet. Ingen kommersielle vaksiner mot fiskelus har blitt utviklet til dags dato. Utvikling av vaksine har blitt hindret av mangel på kunnskap om vert-patogen interaksjoner mellom fiskelus og deres verter. Det synes å være meget begrenset antistoff respons i naturlig infiserte verter. Eksperimentelle vaksiner, særlig gjennom hel-dyr ekstrakter, har blitt produsert mot L. salmonis.

Undersøkelser av utvikling av fiskelus vaksiner har vært rettet mot immunogene proteiner fra fiskelus og særlig rettet mot tarm antigener. Disse vaksinene, basert på hel dyr ekstrakter, har ikke blitt vist å være beskyttende selv om deres administrasjon resulterte i mindre endringer i L. salmonis produktivitet (Grayson T.H., et al., J Fish Biol 47: 85-94, 1995). Denne spesielle studien var imidlertid, en én-gangs prøve og ingen ytterligere resultater har blitt reportert fra denne gruppen. Liposom-baserte fiskevaksiner i visse arter av finne-fisk har også blitt undersøkt (Keough, PCT Application WO 03/101482), men ikke i kombinasjon med fiskelus antigener.

En senere diskusjon av mulige vaksinemål i tarmen er fremsatt av Raynard et al.; imidlertid har deres studier blitt møtt med begrenset suksess (Raynard, R.S., et al., Pest Manag Sci 58: 569-575, 2002).

Promiskøse T-celle epitoper (eller ”PTC epitoper”) er høyt immunogene peptider som kan bli delvis karakterisert ved deres evne til å binde flere isotypiske og allotypiske former for human MHC klasse II molekyler. Ved å hjelpe til med å forbipassere MHC restriksjon, kan de indusere T-celle og antistoff responser hos medlemmer i en genetisk mangfoldig populasjon som uttrykker forskjellige MHC haplotyper. PTC epitoper kan derfor bli kombinert med antigener som i seg selv, er dårlige immunogeniske, for å generere potente peptid immunogener. I foreliggende oppfinnelse blir disse epitopene inkorporert i sammensetningen for å forbedre immunogeniteten til antigenet, og den samlede sammensetningen, i et bredt område til artene.

Promiskøse T-celle epitoper kan bli utvunnet fra naturlig forekommende immunogener av viral og bakteriell opprinnelse. Naturlig forekommende PTC epitoper kan også bli konservativt modifisert ved enkel- eller multippel aminosyre tilsetninger, delesjoner eller substitusjoner (for eksempel innen klasser av ladde, hydrofile/hydrofobe, steriske aminosyrer) for å oppnå kandidat sekvenser som kan bli screenet for sin evne til å forbedre immunogenitet.

Ikke-naturlig forekommende PTC epitoper kan bli kunstig syntetisert for å oppnå sekvenser som har sammenliknbar eller bedre immunogenitet. Kunstige PTC epitoper kan være i et størrelsesområde fra ca.15 til ca.50 aminosyre residier i lengde og kan ha strukturelle trekk slik som amfipatiske helikser, hvilke er alfaheliske strukturer med hydrofobe aminosyre residier som dominerer en flate av heliks og ladde eller polare residier som dominerer de omgivende flatene. PTC epitopene kan også inneholde ytterligere primære aminosyre mønstre, slik som en Gly eller et ladd residie etterfulgt av to eller tre hydrofobe residier, etterfulgt i sin tur av et ladd eller polart residie (en Rothbard sekvens), i tillegg adlyder ofte PTC epitoper ofte 1, 4, 5, 8 regelen, der et positivt ladd residie blir etterfulgt av hydrofobe residier ved fjerde, femte og åttende posisjoner etter det ladde residiet.

Disse trekkene kan bli inkorporert inn i designen til de kunstige PTC epitopene. Variable posisjoner og foretrukkede aminosyrer er tilgjengelige for MHC-bindende motiver (Meister et al., Vaccine, 1995; 13: 581 - 591). For eksempel har den degenererte PTC epitopen beskrevet i WO 95/11998 som SSAL1TH1 den degenererte sekvensen (Asp/Glu)-(Leu/lle/Val/Phe)-Ser-(Asp/Gly)-(Leu/lle/Val/Phe)-(Lys/Arg)-Gly-(Leu/Ile/Val/Phe)- (Leu/lle/Val/Phe)-(Leu/lle/Val/Phe)-His-(Lys/Arg)-Leu/lle/Val/Phe)-(Asp/Glu)-Gly-(Leu/lle/Val/Phe)-.

I Raynard R.S. et al., «Development of a vaccine for the control of sea lice (Lepeophtheirus salmonis and Caligus elongatus( in Atlantic salmon (Salmo salar)», Ices Council Meeting Papers, vol.22, no.30, 1994, side 1-6, beskrevet forsøk der proteinkomponenter fra fiskelustarm ble utvalgt som mulige antigener til bruk i vaksiner. Det ble fremstilt ca.20 potensielle antigener som ble brukt for å immunisere laks. Fisk som responderte ved å produsere serumantistoffer ble utfordret med Lepeophtheirus salmonis.

I Labus, M.B et al., «Identification and Expression of antigenes from Lepeophtheirus salmonis for use in vaccine trials», Biochemical Society Transacions , vol.24, no.2, 1996, side 245S, er det beskrevet fremstilling av 14 monoklonale antistoffer mot skjulte antigener i tarm og eggstokker fra L. salmonis. Rekombinante antigenproteiner ble uttrykt og anvendt som basis i potensielle vaksiner i immuniseringsforsøk på atlantisk unglaks.

I Kvamme, B.O. et al., «Molecular characterization of five trypsin-like peptidase transcripts from salmon louse (Lepeophtheirus salmonis) intestine», Int. J. for Parasitology, vol. 34, 2004, side 823-832, er det karakterisert fire trypsinlignende S1A peptidase transkripter (LsTryp2-5) fra den marine parasittiske kopepoden Lepeophtheirus salmonis. I tillegg ble det ytterligere karakterisert et kjent lakselus-trypsin, LsTRyp1.

Roper J. et al., «The immunocytochemical localisation of potenstial candidate vaccine antigens from the salmon louse, Lepeophtheirus Salmonis (Kroyer, 1837)», Aquaculture, vol.132, no.3-4, 1995, side 221-232, vedrører den immunocytokjemiske lokaliseringen av potensielle vaksineantigener fra lakselus (Lepeophteirus salmonis). To av antigenene som ble isolert fra tarmepitelceller viste seg å ha trypsinaktivitet.

Spesifikke eksempler på PTC epitoper

Spesielt nyttige promiskøse T-celle epitoper er mesling virus protein F LSEIKGVIVHRLEGV (SEQ ID NO: 33); eller tetanus sekvens QYIKANSKFIGITEL (SEQ ID NO: 34).

Eksempler på spesielt nyttige promiskøse T-celle epitoper er opplistet i Tabell 2:

Tabell 2: Eksempler på Promiskøse T-celle Epitoper

beskrivelse aminosyresekvens SEQ ID NO: meslinger 289-302 LSEIKGVIVHRLEGV 33

tetanus toksin 830- 844 QYIKANSKFIGITEL 34

På grunn av mangel på forståelse av mekanismene og patologien som omgir fiskelus infeksjon av laks, har identifikasjon av passende mål for å behandle sykdommen ikke vært vellykket. Dette har hindret utvikling av vaksineforskning og så langt, til tross for løfte og suksess med vaksine-baserte terapier innenfor andre infeksjonsområder, har det ennå ikke blitt utviklet en velegnet vaksine mot fiskelus. Som en konsekvens av dette er det et behov for å skaffe til veie effektive passende molekylære mål (antigener) og en vaksine mot fiskelus infeksjon.

OPPSUMMERING AV OPPFINNELLSEN

Det er et mål med foreliggende oppfinnelse å unngå eller dempe minst en ulempe ved de tidligere behandlingene av fiskelusinfeksjon av fisk.

I et første trekk skaffer foreliggende oppfinnelse til veie en vaksine mot caligid kopepode infeksjon av fisk, idet vaksinen omfatter en immunologisk effektiv mengde av antigen. Spesielt er caligid kopepoden Lepeophtheirus salmonis, selv om en hvilken som helst kopepode infeksjon kan bli behandlet. I en utførelsesform omfatter vaksinen et nukleotid eller peptidfragment av L. salmonis trypsin og en farmasøytisk-akseptabel adjuvans, fortynningsmiddel eller bærer.

I et annet trekk av foreliggende oppfinnelse blir det skaffet til veie DNA og aminosyre sekvenser som koder for antigener for anvendelse i fremstilling av vaksineformuleringer for behandling av caligid kopepod infeksjon av fisk.

Utførelsesformer av disse sekvensene inkluderer sekretoriske produkter (SEP) 1, 2 og 3, vitellogenin-liknende protein, melanisasjons-relatert protein, adhesjonsprotein 1 og 2, og kutikula bindende protein 1.

Andre aspekter og trekk ved foreliggende oppfinnelse vil fremkomme tydelig for de med ordinær kunnskap innen fagområdet ved gjennomgang av følgende beskrivelse av spesifikke utførelsesformer av oppfinnelsen i forbindelse med de ledsagende figurene.

KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE

Utførelsesformer av oppfinnelsen vil nå bli forklart, bare ved hjelp av et eksempel, med referanse til de vedlagte figurene, der:

Fig. 1 viser a) nukleinsyre sekvensen og b) aminosyre sekvensen til vitellogenin-liknende protein (SEQ ID NO: 1, 2).

Fig. 2 viser a) nukleinsyre sekvensen og b) aminosyre sekvensen til SEP protein 1 (SEQ ID NO: 3, 4).

Fig. 3 viser a) nukleinsyre sekvensen og b) aminosyre sekvensen til SEP protein 2 (SEQ ID NO: 5, 6).

Fig. 4 viser a) nukleinsyre sekvensen og b) aminosyre sekvensen til SEP protein 3 (SEQ ID NO: 7, 8).

Fig. 5 viser a) nukleinsyre sekvensen og b) aminosyre sekvensen til adhesjonsprotein 2, homolog til muslingadhesiv plakk matriks protein 2 forløper (SEQ

ID NO: 9, 10).

Fig. 6 viser a) nukleinsyre sekvensen og b) aminosyre sekvensen til adhesjonsprotein 1, homolog til muslingadhesiv plakk matriks protein forløper (fot protein 1) (SEQ ID NO: 11, 12).

Fig. 7 viser a) nukleinsyre sekvensen og b) aminosyre sekvensen til kutikula bindende protein 1, homolog til BSC-1 liknende protein, homolog til BSC-1 liknende protein (moran 9-15) (SEQ ID NO: 13, 14).

Fig. 8 er en graf av lus per cm fisk i løpet av tiden etter infeksjon, ved anvendelse av vaksiner (A/B = uttrykt fiskelus trypsin gen med T-celle epitop; Y/Z = uttrykt fiskelus trypsin gen; C = kontroll) av foreliggende oppfinnelse.

Fig. 9 er en graf av lus per cm fisk i løpet av tiden etter infeksjon, ved anvendelse av vaksiner (A/B = uttrykt fiskelus trypsin gen med T-celle epitop; Y/Z = uttrykt fiskelus trypsin gen; C = kontroll) av foreliggende oppfinnelse.

Fig. 10 viser et stablet stolpediagram som viser prosentdel av forskjellige trinn av fiskelus til stede i fisk immunisert med L. salmonis trypsin vaksine sammenliknet med kontrollfisk ved hvert prøvetakingstidspunkt.

Fig. 11 viser en partiell nukleinsyre sekvens (SEQ ID NO: 15) av vitellogenin-liknende protein SL-903, lik men lenger enn en i Fig.1. Fete typer, understreket og kursiv TGA, TAA, eller TAG er forutsatte stopp kodons.

Fig. 12 viser fullengde nukleinsyre sekvensen av SEP protein 1 SL- 0547 (SEQ ID NO: 16). Fete typer og understreket ATG er antatte start kodons. Fete typer, understreket and kursiv TGA, TAA eller TAG er forutsatte stopp kodons.

Fig. 13 viser den antatte full-lengde nukleinsyre sekvensen til SEP protein 2 SL-0858 (SEQ ID NO: 17). Fete typer og understreket ATG er antatte start kodons for protein. Fete typer, understreket og kursiv TGA, TAA eller TAG er forutsatte stopp kodons.

Fig. 14 viser den antatte full-lengde sekvensen til SEP protein 3 SL-1469 (SEQ ID NO: 18). Fete typer og understreket ATG er antatte start kodons for protein. Fete typer, understreket og kursiv TGA, TAA eller TAG er forutsatte stopp kodons.

Fig. 15 viser den antatte full-lengde sekvensen til musling adhesivt protein SL-0927 (SEQ ID NO: 19). Fete typer og understreket ATG er antatte start kodons for protein. Fete typer, understreket og kursiv TGA, TAA eller TAG er forutsatte stopp kodons.

Fig. 16 viser en partiell aminosyre sekvens av vitellogeninliknende protein SL-903 (SEQ ID NO: 20), sammen med BLAST<TM>treff av denne sekvensen. Understrekede aminosyrer er peptidfragmentene fra Proteomics Mass Spectrometry data.

Fig. 17 viser den antatte full-lengde aminosyre sekvensen til SEP protein 1 SL-0547 (SEQ ID NO: 21), sammen med BLAST treff av sekvensen. Understrekede aminosyrer er peptidfragmentene fra Proteomics Mass Spectrometry data.

Fig. 18 viser den antatte full-lengde aminosyre sekvensen til SEP protein 2 SL-0858 (SEQ ID NO: 22), sammen med BLAST treff av sekvensen. Understrekede aminosyrer er peptidfragmentene fra Proteomics Mass Spectrometry data.

Fig. 19 viser den antatte full-lengde aminosyre sekvensen til SEP protein 3 SL-1469 (SEQ ID NO: 23), sammen med BLAST treff av sekvensen. Understrekede aminosyrer er peptidfragmentene fra Proteomics Mass Spectrometry data.

Fig. 20 viser den antatte full-lengde aminosyre sekvensen til musling adhesivt protein SL-0927 (SEQ ID NO: 24), sammen med BLAST treff av sekvensen. Understrekede aminosyrer er peptidfragmentene fra Proteomics Mass Spectrometry data.

Fig. 21 viser gjennomsnittlig (±SEM) ekspresjon av interleukin-1β gen, relativ til β-actin, i SHK-1 celler inkubert med og uten lipopolysakkarid (LPS), samlet L. salmonis sekretorisk/ekskretorisk produkt fraksjon 1, samlet L. salmonis sekretorisk/ekskretorisk produkt fraksjon 2, og samlet L. salmonis sekretorisk/ekskretorisk produkt fraksjon 3. * indikerer signifikante forskjeller fra kontroll; ┼ indikerer signifikante forskjeller fra LPS kontroll. ;;Fig. 22 viser gjennomsnittlig (±SEM) ekspresjon av interleukin-1β gen, relativ til β-actin, i SHK-1 celler inkubert med og uten lipopolysakkarid (LPS) og lyofilisert flytende kromatografi oppløsningsmiddel (LC) L. salmonis sekretorisk/ekskretorisk produkt fraksjon 1, L. salmonis sekretorisk/ekskretorisk produkt fraksjon 2, og L. salmonis ufraksjonert sekretorisk/ekskretorisk produkter. * indikerer signifikante forskjeller fra kontroll; ┼ indikerer signifikante forskjeller fra LPS kontroll.

DETALJERT BESKRIVELSE

Generelt skaffer foreliggende oppfinnelse til veie en vaksine for behandling av fiskelus infeksjon i fisk, særlig infeksjon fra L. salmonis. Den angår også DNA og aminosyre sekvensen til molekylære mål for anvendelse i fremstilling av disse vaksinene.

Vaksinene fra foreliggende oppfinnelse ble generert basert på studier gjennomført av vår gruppe og andre på genekspresjon i fiskelus. Flere gener i fiskelus som har potensiale som produsenter av antigener i vaksine formuleringer utformet for å beskytte laks mot fiskelus, særlig L. salmonis.

Genene inkluderer: 1) et gen for fiskelus trypsin; 2) et gen som har høy likhet med et vitellogenin-liknende protein som blir funnet i sekretoriske produkter; 3) et gen som har høy sekvenslikhet med musling adhesjonsprotein-1 genet; 4) et gen som har høy sekvenslikhet med musling adhesjonsprotein-2 genet; 5) et antall gener som har høy sekvenslikhet med genet som koder for Balanus amphrite trinn spesifikt protein BCS-1; og 6) gener som koder for tre sekretoriske produkter (SP) proteiner i fiskelus, som for tiden ikke har noen signifikant likhet med kjente proteiner i offentlige databaser.

Slik det blir brukt her referer et ”antigen” til et molekyl som inneholder en eller flere epitoper som vil stimulere en verts immunsystem til å lage en humoral og/eller cellulær antigen-spesifikk respons. Betegnelsen blir her også anvendt omvekslende med ”immunogen”.

Slik det blir brukt her referer betegnelsen ”epitop” til stedet på antigenet eller haptenet til hvilket et spesifikt antistoff molekyl binder. Betegnelsen blir her også anvendt omvekslende med ”antigen determinant” eller ”antigendeterminant sted”.

Figurene 1 til 6 viser sekvensene til genene fra foreliggende oppfinnelse beskrevet over og sekvensert i vårt laboratorium, med unntak for trypsin, for hvilken nukleinsyre sekvensen har blitt publisert (Johnson, 2002, supra). Vi har identifisert trypsin gen produkt i fiskelus sekresjoner ved aminosyre sekvensering ved anvendelse av massespektrometri. Disse genene ble selektert og undersøkt basert på en forutgående forståelse av deres antatte funksjon.

Figurene 11 til 20 viser lengre eller antatte full-lengde nukleotid og aminosyre sekvenser av genene og proteinene som beskrevet her.

Antigener utvunnet fra L. salmonis vil skaffe til veie beskyttelse for fisk mot andre fiskelus arter da de sannsynligvis vil bruke høyt konserverte metoder for å feste seg selv for å muliggjøre dem til vellykket fôring på verten.

Adjuvanser som kan bli anvendt i sammenheng med foreliggende oppfinnelse inkluderer Montanide<TM>ISA og IMS Adjuvants (Seppic, Paris, Frankrike), andre olje-i-vann, vann-i-olje, og vann-i-olje-i-vann adjuvanser, Ribi's Adjuvants (Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT), Hunter's TiterMax (CytRx Corp., Norcross, GA), aluminium salt adjuvanser, nitrocellulose-adsorberte proteiner, innkapslede antigener, nanopartikkel inneholdende adjuvanser. Foretrukkede adjuvanser inkluderer Seppic Montanide 720, Montanide IMS111x, Montanide IMS131x, Montanide IMS221x, Montanide IMS301x, Montanide ISA206, Montanide ISA 207, Montanide ISA25, Montanide ISA27, Montanide ISA28, Montanide ISA35, Montanide ISA50A, Montanide ISA563, Montanide ISA70, Montanide ISA51, Montanide ISA720, Montanide ISA264. Spesielt foretrukkede adjuvanser inkluderer, Montanide ISA740, Montanide ISA773, Montanide ISA 708, Montanide ISA266. Den anbefalte adjuvansen er Montanide ISA763.

Data fra studier som anvender vaksinene fra foreliggende oppfinnelse for behandling av fiskelus infeksjon er skaffet til veie her ved hjelp av følgende eksempler.

EKSEMPEL 1

Laks ble immunutfordret med L. salmonis trypsin som antigenet. Fisken ble immunisert med to formuleringsgrupper av trypsinvaksine: A/B (rekombinant fiskelus trypsin med en T-celle epitop) og Y/Z (bare rekombinant fiskelus trypsin). Visse fisk ble administrert med en kontrollvaksine, C som bare inneholder adjuvans. Beskyttelse av fisken er åpenbar ved dagene 6, 11 og 20 (Figur 8 og 9). Antall fiskelus per cm og per gram fisk blir redusert i den vaksinerte fisken sammenliknet med kontroller. A/B vaksine formuleringen resulterte i lavere fiskelus antall enn Y/Z formuleringen hvilket viser at inkludering av T-celle epitoper med fiskelus antigener skaffer til veie ytterligere beskyttelse mot fiskelus.

Figur 10 viser stablede dataresultater av immuniseringsutfordring og vaksinasjonseksperimenter. A/B (rekombinant fiskelus trypsin med en T-celle epitop) vaksine formulering synes å senke utviklingen av L. salmonis, som ved dager 6, 11 og 20, der det var lavere prosentdeler av lus som hadde skiftet skall til et mer avansert trinn, sammenliknet med kontrollfisk.

EKSEMPEL 2

Størrelse eksklusjonskromatografi og protein bestemmelse Lyofiliserte sekretoriske ekskretoriske produkter (SEP) ble rekonstituert med 1,0 M ammonium acetat (AMA) (pH 6,0). En Agilent 1100 HPLC utstyrt med en diode array detektor (overvåking ved 230 and 256 nm) og en Taso Haas (G3000PWX2, 6 µm dp (7.8 mm x 300 mm)) kolonne ble anvendt til å separere proteiner/peptider i sekresjonene. Disse prøvene ble deretter fraksjonert ved anvendelse av en Waters Fraction oppsamler i henhold til tidsintervaller.

Fraksjonene som vist i tabell 1 ble samlet for separate HPLC kjøringer og samlet for hvert tidsintervall. Disse prøvene ble deretter frysetørket (-80 °C) forut for protein bestemmelse. Kolonnen ble holdt ved romtemperatur og eluert isokratisk med 98:2 AMA: acetonitril (ACN) i 30 minutter ved 0,2 ml min<-1>.

Standard oppløsninger med bovint serum albumin (BSA) (20 µg, 2,0 µg, and 0,2 µg), SW DA, and bovint trypsin (40 µg) ble alle kjørt som kontroller for peak (topp) sammenlikning med SEP.

Proteinkonsentrasjoner av L. salmonis sekretoriske fraksjoner ble bestemt ved anvendelse av en fargebindingsmetode (Bradford, M. M. Anal Biochem 72: 248 - 254, 1976). Alle analyser ble kjørt på en Thermomax<TM>Microplate Reader (Molecular Devices). Prøver ble rekonstituert i ddH2O, og ble så, etter protein bestemmelse, splittet likt mellom cellebaserte funksjonelle undersøkelser og proteomiske analyser.

SHK cellekultur

SHK-1 celler ble dyrket ved 18 °C i 75 cm<2>vevs-kultur-behandlede flasker (Costar) i L-15 medium (med 300 mg/l L-glutamin) supplert med 500 µl gentamicin sulfat (50 mg/ml destillert i vann), 365 µl 2-mercaptoetanol (55 mM i D-PBS) and 5 % føtalt bovint serum (FBS), som beskrevet av Fast et al.2004 supra. Alle mediekomponenter ble innkjøpt fra Gibco. Konfluente flasker ble gjennomgått ukentlig ved deling av celler og medium jevnt mellom to flasker og tilsetning av et likt volum av nytt medium til hver flaske. Celler anvendt i denne studien ble gjennomgått mellom 64 og 68 ganger.

SHK-1 celler ble utsådd ved tilnærmet 4 x 10<6>celler/flaske i L-15 medium supplert som beskrevet over. Cellestimulering fulgte samme prosedyre som i Fast, M.D. et al. Dev. Comp. Immunol.29: 951 - 963, 2005. I korthet, etter en 48 timers periode, for å tillate at en eventuell manipuleringsindusert genekspresjon å returnere til konstitutive nivåer, ble medier fjernet og 20 ml friskt medium ble tilsatt. Lipopolysakkarid (LPS) ble tilsatt alle flaskene, unntatt kontrollene, for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 5 µg/ml.

I det første forsøket ble SEP fraksjoner samlet i 3 grupper (Tabell 1), hver inneholdende like tidsområder (10 min), og volumer fra størrelse eksklusjonskromatografien. Dette resulterte i 13 µg protein (samlet fraksjon 1), 8,0 µg protein (samlet fraksjon 2) og < 0,1 µg protein (samlet fraksjon 3) blir tilsatt hver flaske. Disse inkubasjonene ble gjennomført i 4 timer ved 18 °C før medier ble fjernet og celler lagret i RNA senere ved -80 °C inntil RNA ekstraksjon. Dette forsøket ble gjentatt to ganger med triple flasker for hver tilstand.

I det andre forsøket, ble SEP fraksjoner 1 og 2 fra den samlede fraksjon 1 (Tabell 1) tilsatt ved henholdsvis 1,0 og 1,4 µg per flaske. Disse konsentrasjonene ble oppnådd etter konsentrering av 4 størrelse eksklusjonskjøringer for hver fraksjon. For å undersøke noe effekt av resterende oppløsningsmiddel på den celle-baserte analysen, gjennomgikk 4 blindkjøringer av AMA den samme behandlingen og ble inkludert i eksperimentene som kontroller. Endelig ble ikke-fraksjonert SEP anvendt i makrofag inkubasjonene her ved samme konsentrasjon (660 ηg).

Disse inkubasjonene ble gjennomført triplikat og fulgte samme prosedyre som det første forsøket.

Real-tid PCR på Atlantiske laksegener

Total RNA ble isolert fra SHK-1 celler lagret i RNAlater<TM>med Nucleospin<TM>RNA Il kit (Clontech) og konsentrasjon målt med spektrofotometer. RNA prøver gjennomgikk PCR for å verifisere mangelen på DNA kontaminasjon. Sekvenser for Real-tid PCR primere var designet, testet and produkter sekvensert som tidligere beskrevet av Fast et al., supra (2004; 2005). Real-tid kvantitativ PCR ble gjennomført ved anvendelse av en iCycler iQ<TM>Real-Time deteksjonssystem og SYBR green kits (Bio-Rad) også tidligere beskrevet av Fast et al., supra (2004; 2005). For å sikre at ingen genomisk DNA kontaminasjon tilført den kvantifiserte cDNA, ble ikke-RT kontroller for hver RNA isolering kjørt under PCR og observert ved 2,5 % agarose gel elektroforese.

PCR profilen var som følger: et initielt 3 min denatureringstrinn ved 95 °C, etterfulgt av 40 sykluser med denaturering (30 s ved 95 °C), annealing (30 s ved 58 °C) og utvidelse (30 s ved 72 °C), og avslutning med et endelig utvidelsestrinn ved 72 °C i 5 min. Sensitiviteten til reaksjonene og amplifikasjon av kontaminant produkter slik som primer dimerer, tilfeldig detektert med SYBR green (det vil si SYBR green bindes til all dobbel trådet DNA), ble evaluert ved amplifisering 10 ganger fortynninger av klonene (10-<2>til 10<-8>ng) og duplikate prøver så vel som ved gjennomføring av en blindprøve uten cDNA med hver kjøring. Forholdet mellom terskelsyklus (Ct) og log (RNA) var lineær (-3.5<slope<- 3.2) for alle reaksjonene. Kopi tall ble estimert basert på den molekylære vekten av kloner og OD 260.

Immunmodulatorisk aktivitet av SEP proteiner

SEP ble fraksjonert basert på størrelse og fraksjoner ble samlet. I det første forsøket (Fig.21), ble samlede fraksjoner (PF1, PF2, PF3) inkubert med SHK-1 celler (en laks makrofag-liknende cellelinje) i kombinasjon med lipopolysakkarid (LPS) og ekspresjon av interleukin-1β genet ble overvåket for å bestemme den immun modulatoriske effekten til de fraksjonerte SEP proteinene på immun genekspresjon. Interleukin-Iβ genet ble redusert i ekspresjon av alle de tre samlede fraksjonene sammenliknet med celler stimulert med LPS alene (Fig. 21). Når individuelle fraksjoner som inneholder proteiner ble testet, ble interleukin-1β gen ekspresjon redusert med fraksjon 2. LC-MS analyse viste at Fraksjon 2 av pool 1 inneholdt SEP protein 1, SEP Protein 2 og trypsin. Evidens for immun modulatorisk aktivitet av SEP, hvilken inneholder alle beskrevne proteiner, er presentert i Fig.22 der det er en signifikant nedgang i LPS-indusert ekspresjon av interleukin-1β i nærvær av total SEP.

De ovenfor-beskrevne utførelsesformene av foreliggende oppfinnelse har bare til hensikt å være eksempler. Endringer, modifikasjoner og variasjoner kan bli gjennomført på de spesielle utførelsesformene av personer med kunnskap innen fagområdet, uten å avvike fra rekkevidden til oppfinnelsen, som er definert av de etterfølgende kravene.

Claims (18)

Patentkrav

1.

DNA karakterisert ved at DNA’et koder for aminosyresekvensen av SEQ ID NO: 4 eller 21.

2.

DNA i henhold til krav 1, karakterisert ved at DNA’et innbefatter nukleotidsekvensen til SEQ ID NO: 3.

3.

En vaksine mot caligid copepod infeksjon hos fisk, karakterisert ved at vaksinen innbefatter en immunologisk effektiv mengde av et DNA i henhold til krav 1 eller 2, og en farmasøytisk akseptabel adjuvans, fortynningsmiddel eller bærer.

4.

DNA i henhold til krav 1 eller 2, eller vaksinen i henhold til krav 3, karakterisert ved at DNA’et eller vaksinen er for bruk ved behandling eller for å forhindre caligid copepod infeksjon hos fisk.

5.

DNA eller vaksinen for bruk i henhold til krav 4, karakterisert ved at caligid copepoden er Lepeophtheirus salmonis.

6.

SEP protein 1, karakterisert ved at det innbefatter aminosyresekvensen til SEQ ID NO: 4 eller 21.

7.Et rekombinant protein karakterisert ved at det innbefatter en aminosyresekvens i henhold til krav 6.

En rekombinant vaksine mot caligid copepod infeksjon hos fisk, karakterisert ved at vaksinen innbefatter en immunologisk effektiv mengde av proteinet i henhold til krav 6, eller et rekombinant protein antigen i henhold til krav 7, og en farmasøytisk akseptabel adjuvans, fortynningsmiddel eller bærer.

9.

Vaksine i henhold til krav 8, karakterisert ved at caligid copepoden er Lepeophtheirus salmonis.

10.

Antigen karakterisert ved at det består av SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 eller SEQ ID NO: 21.

11.

SEP-protein 1 i henhold til krav 6, karakterisert ved at det er for bruk ved behandling eller for å forhindre caligid copepod infeksjon hos fisk.

12.

Rekombinant protein i henhold til krav 7, karakterisert ved at det er for bruk ved behandling eller for å forhindre caligid copepod infeksjon hos fisk.

13.

Vaksine i henhold til krav 8 eller 9, karakterisert ved at den er for bruk ved behandling eller for å forhindre caligid copepod infeksjon hos fisk.

14.

Antigen i henhold til krav 10, karakterisert ved at det er for bruk ved behandling eller for å forhindre caligid copepod infeksjon hos fisk.

15.SEP-protein 1 for bruk i henhold til krav 11, karakterisert ved at caligid copepoden er Lepeophtheirus salmonis.

Rekombinant protein for bruk i henhold til krav 12, karakterisert ved at caligid copepoden er Lepeophtheirus salmonis.

17.

Vaksine for bruk i henhold til krav 13, karakterisert ved at caligid copepoden er Lepeophtheirus salmonis.

18.

Antigen for bruk i henhold til krav 14, karakterisert ved at caligid copepoden er Lepeophtheirus salmonis.