WO2018082719A1 - Uso de peptido secretagogo de la hormona de crecimiento como adyuvante vacunal - Google Patents

Uso de peptido secretagogo de la hormona de crecimiento como adyuvante vacunal Download PDF

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Liz HERNANDEZ PEREZ
Lázaro GIL GONZÁLEZ
Yamila CARPIO GONZÁLEZ
Mario Pablo ESTRADA GARCÍA
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Centro De Ingenieria Genetica Y Biotecnologia
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Definitions

  • the present invention relates to the field of molecular biology and immunology, specifically, to the development of vaccines and adjuvants therefor.
  • the present invention reveals the use of a growth hormone secretagogue peptide, selected from the synthetic growth hormone releasing peptide GHRP-6 and its structural analog A233, as a molecular adjuvant for vaccines.
  • GHSs Growth hormone secretagogues
  • Ghrelin is the endogenous ligand of the GH secretagogue receptor (GHS-R) (Kojima et al., 1999, Nature 402: 656-660). It intervenes in multiple processes, including the regulation of energy balance, appetite, metabolic signals, among others (Dixit and Taub, 2005, Exp. Gerontol. And 40: 900-910).
  • GHS in addition to stimulating GH secretion, regulate the appetite and weight gain of mammals, birds and fish (Kaiya et al, 2008, Comp. Biochem. Physiol. A 149: 109-128). They also have cardioprotective properties, by improving cardiac function variables in several in vivo studies, and inhibiting the proliferation of cancer cells (Locatelli and Rossoni, 1999, Endocrinol. 140: 4024-4031; Tivesten and Bollano, 2000, Endocrinol. 141: 60-66; Cassoni et al., 2001, J. Clin. Endocrinol. Metab. 86: 1738-1745). In addition, they are involved in processes such as inflammation and aging (Hattori, 2009, J. Clin. Endocrinol. Metab. 86: 4284-4291).
  • LPS lipopolysaccharides
  • ghrelin and the synthetic agonist GHRP-2 significantly inhibited the release of interleukin 6 (IL-6) and activated macrophage nitric acid, and attenuated arthritis (Granado et al., 2005 , Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 288: E486-E492). Also, similar studies have been carried out that have demonstrated its anti-inflammatory effects (González-Rey et al., 2006, Gastroenterol. 130 (6), 1707-1720)
  • the present invention contributes to solving the aforementioned problem, by providing an adjuvant capable of effectively enhancing the immune response towards a co-administered antigen.
  • the invention aims at the use of a growth hormone secretagogue peptide, identified as SEQ ID No. 1 (GHRP-6) or SEQ ID No. 2 (A233), as a molecular adjuvant in the manufacture of a vaccine that is Used in different immunization strategies.
  • said vaccine is used in the prevention of diseases caused by infectious agents.
  • said diseases affect mammals, birds or fish; and infectious agents can be viruses, bacteria and ectoparasites, among others.
  • the term "molecular adjuvant” refers to a substance capable of positively modulating the immune response against a vaccine antigen, producing an increase thereof.
  • ghrelin or analogues thereof, as a molecular adjuvant.
  • the use of ghrelin for the treatment of inflammatory diseases has been proposed (González-Rey et al., 2006, Gastroenterology 130 (6), 1707-1720; Baatar et al., 201 1, Mol Cell Endocrinol 340 : 44-58).
  • the effect found as part of the present invention is unexpected, which demonstrates that the administration of GHRP-6 or A233, in combination with a vaccine antigen, stimulates the specific immune response against said antigen.
  • a vaccine composition comprising a growth hormone secretagogue peptide identified as SEQ ID No. 1 (GHRP-6) or SEQ ID No. 2 (A233), at least one vaccine antigen, and pharmaceutically acceptable carriers or diluents is also described.
  • the vaccine composition of the invention may comprise other compounds that act as vaccine adjuvants, and which are known to those skilled in this field of the art. Within these adjuvants are, for example, aluminum salts and oily adjuvants.
  • the vaccine compositions thereof included various antigens and the GHRP-6 or A233 peptides.
  • antigens that were combined with GHRP-6 or its structural analogue A233 are ovalbumin (OVA), the protein of the Dengue 2 virus capsid (C2), the phip peptide of Rhipicephalus sanguineus (Rodr ⁇ guez-Mallón et al., 2012 ; Vaccine 30: 1782-1789), the chimeric protein P0-my32 (fusion polypeptide of two Lepeophtheirus salmonis antigens) and the P0 fusion polypeptide of L. salmonis and T cell epitopes (P0-TT).
  • OVA ovalbumin
  • C2 Dengue 2 virus capsid
  • C2 the phip peptide of Rhipicephalus sanguineus
  • Vaccine 30: 1782-1789 the chimeric protein P0-my32 (fusion polypeptide of two Lepeophtheirus salmonis antigens)
  • compositions were administered in mice, birds and fish, and an adjuvant effect for said secretagogues was demonstrated for the first time.
  • administration of GHRP-6 or A233 combined with an antigen increases the levels of specific antibodies against said antigen, in several animal species.
  • the vaccine antigen is selected from the group consisting of attenuated peptides, proteins, viruses and bacteria.
  • said vaccines are administered to mammals, birds or fish.
  • the vaccine composition of the invention is administrable orally or by injection.
  • the sequence peptide SEQ ID No. 1 or SEQ ID No. 2 is in the vaccine composition, at a concentration of 50-600 ⁇ g / kg of formulated feed, when the vaccine is administered orally in fishes.
  • the invention also discloses a method for increasing the immune response against a vaccine antigen, characterized in that an effective amount of a growth hormone secretagogue peptide, identified as SEQ ID No. 1 (GHRP-6) or SEQ ID is administered. No. 2 (A233), as a molecular adjuvant of said antigen.
  • the vaccine antigen is used for the prevention of diseases caused by infectious agents.
  • the sequence peptide SEQ ID No. 1 or SEQ ID No. 2 is used at 50-600 ⁇ g / kg of formulated feed, when the vaccine antigen and the adjuvant peptide are administered orally.
  • peptides GHRP-6 and A233 known GH secretagogues, are obtained by chemical synthesis.
  • the increase in the immune response against the antigen of interest is reversed at higher levels of protection against various infectious agents, among which are viral, bacterial and ectoparasite entities.
  • FIG. 1 Antibody response in mice immunized with OVA, GHRP-6 and Freund's adjuvant, or with OVA and Freund's adjuvant.
  • FIG. 1 Antibody response in mice immunized with OVA, GHRP-6 and Freund's adjuvant, by sc and ip routes (Group 3 and 4, respectively); or with OVA and Freund's adjuvant, by sc and ip routes (Groups 5 and 6, respectively).
  • A titles of lgG1.
  • B titles of lgG2a. The mean and standard deviation within each group are represented. ** indicates p ⁇ 0.0014; *** indicates p ⁇ 0.001.
  • FIG. 1 IgG titers in mice immunized with P0 and Freund's adjuvant, or with P0, GHRP-6 and Freund's adjuvant, via ip, on day 36 of the immunization schedule. The mean and standard deviation are represented. * indicates p ⁇ 0.05.
  • Figure 6. Titles of immunoglobulin M (IgM) in tilapia immunized with P0-my32 or with P0-my32 combined with GHRP-6 or with the A233 peptide, detected on day 28 of the experiment, where the immunogens were administered via ip A and C. Titles of anti-my32 IgM, B. and D. Titles of anti-PO IgM.
  • IgM immunoglobulin M
  • Figure 7 Percentage of tilapia with IgM titres greater than 1: 1 000, after immunization with a formulation of P0-my32 that included Montanide ISA 50 or P0-my32 that included GHRP-6 and Montanide ISA 50, in the day 28 of the experiment.
  • A Percent of anti-my32 responding animals.
  • B Percent of anti-PO responding animals.
  • Figure 8 Response of IgM antibodies in ciaries immunized with P0-TT or with P0-TT in the presence of GHRP-6 or peptide A233, on day 28 of the experiment where the fish were immunized via ip
  • Figure 9 Title of binding antibodies against Aeromonas hydrophila in common carp.
  • the Y axis values represent the mean ⁇ standard error. * indicates p ⁇ 0.05; ** indicates p ⁇ 0.01.
  • Group 1 Injected with PBS
  • Group 2 Injected with formalin inactivated A. hydrophila cells
  • Group 3 Injected with formalin inactivated A. hydrophila cells and GHRP-6 (20 ⁇ g per fish). All immunogens were combined with Montanide ISA 50.
  • Example 1 Effect of co-administration of GHRP-6 on the humoral immune response against OVA.
  • mice 36 female Balb / c mice were used. Six study groups of 6 animals each were separated. Of these, three groups were immunized by s.c. and the rest via i.p. In all groups, immunogens were emulsified with Freund's adjuvant.
  • Group 1 Placebo (phosphate buffered saline, abbreviated PBS). Via s.c.
  • Group 2 Placebo (PBS). Via i.p.
  • Group 3 GHRP-6 at 10 pg / animal and OVA 5 pg / animal. Via s.c.
  • Group 4 GHRP-6 at 10 pg / animal and OVA 5 pg / animal. Via i.p.
  • Group 5 OVA 5 pg / animal. Via s.c.
  • Group 6 OVA 5 pg / animal. Via i.p.
  • FCA Freund's complete adjuvant
  • FIA incomplete Freund's adjuvant
  • titers of lgG1 and lgG2a were determined in sera extracted on day 36, for groups immunized with OVA in the presence or absence of GHRP-6, by s.c. and i.p. ( Figures 2A and 2B). There were no significant differences in lgG2a titres between the groups treated with GHRP-6 and those who did not receive said secretagogue, for any of the routes of administration. They were observed for lgG1, in both routes of administration, being higher in the groups vaccinated in the presence of GHRP-6.
  • the lgG1 / lgG2a ratio as a reflection of the differential reactivity towards a Th2 or Th1 response, respectively, was significantly higher in the group immunized, via ip, with OVA in the presence of GHRP-6 and Freund's adjuvant, with respect to injected with OVA and Freund's adjuvant only.
  • This ratio is shown in Table 1, where the data represent the average of the ratio lgG1 / lgG2a corresponding to the six animals in the group.
  • Example 2 Effect of co-administration of the A233 peptide on the humoral immune response against OVA.
  • mice 18 female Balb / c mice were used. The mice received 150 ⁇ of immunogen in all groups, via ip, which was administered to the mice on days 1 and 15 of the immunization schedule. Blood extractions were performed on days 0 (preimmune serum), 8, 15, 22, 36, 43 and 50. The total IgG titers present in the sera were evaluated. The animals were immunized with 5 g of OVA / animal and 10 g of A233 / animal (Group 2), or with 5 g of OVA / animal (Group 3). The control group was injected with PBS (Group 1). All immunogens were emulsified with Freund's adjuvant.
  • Example 3 Effect of co-administration of GHRP-6 on the humoral immune response against the C2 antigen.
  • the C2 antigen, protein of the Dengue virus capsid was obtained as a recombinant protein in Escher ⁇ chia coli, with a molecular weight of 15 kDa.
  • 24 female Balb / c mice were selected from
  • Group 2 10 g of C2 co-administered with 10 g of GHRP-6
  • the immunogens additionally comprised aluminum hydroxide, also known as alumina.
  • Immunizations were performed s.c, on days 0, 15 and 30 of the immunization schedule. Blood extractions were performed on days 0 (preimmune serum), 7, 16, 21, 28 and 35, to assess the total IgG titer.
  • Figure 4 shows that, on day 28 of the immunization schedule, Group 2, treated with C2 and GHRP-6, showed a significant increase in the titer of anti-C2 IgG, compared to Group 1, treated with C2 and the aluminum hydroxide adjuvant, without GHRP-6.
  • Example 4 Effect of co-administration of GHRP-6 on the humoral immune response against the P0 peptide of R. sanguineus.
  • the P0 peptide is a fragment corresponding to the region of least sequence identity between the P0 ribosomal protein of the R. sanguineus tick and its host mammals.
  • 24 female 6-week-old Balb / c mice were selected, which were divided into three groups of 8 mice each. Each animal received 150 ⁇ _ of immunogen, via ip, on days 1, 15 and 29 of the immunization schedule. In the first immunization FCA was used, and in the subsequent ones FIA was used.
  • Group 3 100 pg of P0 co-administered with 200Mg of GHRP-6.
  • Example 5 Effect of co-administration of GHRP-6 or A233 peptide on the humoral immune response against P0-my32 protein in tilapia (Oreochromis sp.).
  • the chimeric protein P0-my32 was generated by the cloning of the complementary deoxyribonucleic acid (cDNA) encoding a 35 amino acid peptide of the P0 ribosomal protein of L. salmonis fused to the N-terminal end of the cDNA encoding the my32 protein of the same ectoparasite (Carpió et al., 2013; Exp. Parasite! 135: 188-199), in a vector designed for the induced expression of genes of interest in the host bacterium E. coli. This protein was produced in the bacteria and purified, as a histidine fusion protein, by affinity chromatography by metal chelates.
  • cDNA complementary deoxyribonucleic acid
  • Group 2 P0-my32 (1 ⁇ g / g fish weight)
  • Group 3 P0-my32 (1 ⁇ g / g fish weight) co-administered with 20 ⁇ g GHRP-6
  • Group 4 P0-my32 (1 ⁇ g / g fish weight co-administered with 20 ⁇ g A233
  • Group 5 P0-my32 ( ⁇ ⁇ g / g fish weight) The fish in this group were fed with feed formulated with 100 ⁇ of GHRP-6 per kg of feed, daily, twice a day, for a week before and one week after the administration of my32 injections.
  • the PO-TT chimeric protein is based on: a) the 35 amino acid named pPO peptide, corresponding to the least conserved region between the P0 ribosomal protein of L. salmonis and that of one of its hosts, Salmo salar and b) two epitopes of T cells, from measles virus and tetanus toxoid, respectively.
  • pPO peptide 35 amino acid
  • b two epitopes of T cells, from measles virus and tetanus toxoid
  • Example 7 Demonstration of the adjuvant effect of GHRP-6 on the humoral immune response of common carp (Cyprinus carpió) against Aeromonas hydrophi ⁇ a bacteria.
  • Group 2 Inactivated A. hydrophia cells (1 x 10 8 Colony Forming Units, abbreviated UFC) + Montanide ISA 50
  • Group 3 Inactivated A. hydrophila cells (1 x 10 at CFU) and 20 pg of GHRP-6 per fish + Montanide ISA 50.
  • Example 8 Controlled challenge assay in fish immunized with the inactivated Aeromonas hydrophila bacterium and the inactivated bacterium co-administered with the GHRP-6 peptide.
  • Group 2 A. hydrophila cells (1 x 10 8 CFU) inactivated + Montanide ISA 50
  • Group 3 A. hydrophila cells (1 x 10 8 CFU) inactivated and 20 ⁇ g GHRP-6 per fish + Montanide ISA 50.
  • the fish were injected on day 0 and 14. On day 21 the challenge was made, by injection via i.p. of the lethal dose 50 (LD50) of the bacteria, and the mortality in each group was recorded for 7 days.
  • the relative survival percentage (RPS) was calculated as:
  • RPS (%) (% of control mortality -% of treatment mortality) / (% of control mortality) x100
  • the data shows the mean and standard deviation of the maximum absorbance values determined by indirect ELISA.

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Abstract

La presente invención se relaciona con el uso del péptido GHRP-6 y un análogo estructural de este como adyuvantes moleculares para vacunas. Entre otras aplicaciones, dichas vacunas pueden emplearse en la prevención de enfermedades causadas por agentes infecciosos, tales como virus, bacterias y ectoparásitos, que afectan a los mamíferos, las aves y a organismos acuáticos. Los péptidos GHRP-6 y su análogo A233 son eficaces como adyuvantes cuando se combinan con un antígeno dado, ya que potencian la respuesta inmune específica contra el mismo.

Description

USO DE PEPTIDO SECRETAGOGO DE LA HORMONA DE CRECIMIENTO COMO ADYUVANTE VACUNAL
Campo de la técnica
La presente invención se relaciona con el campo de la biología molecular y la inmunología, específicamente, con el desarrollo de las vacunas y de adyuvantes para las mismas. En particular, la presente invención revela el uso de un péptido secretagogo de la hormona de crecimiento, seleccionado entre el péptido sintético liberador de la hormona de crecimiento GHRP-6 y su análogo estructural A233, como adyuvante molecular para vacunas.
Estado de la técnica anterior
Los secretagogos de la hormona de crecimiento (GHSs, del inglés growth hormone secretagogues) (Davenport y col. 2005, Pharmacol. Rev. 57: 541 -546) son una familia de compuestos que incluye moléculas peptídicas y no peptídicas, que estimulan la secreción de la hormona de crecimiento (GH, del inglés growth hormone) in vitro e in vivo (Tannenbaum y Bowers, 2001 , Endocrine 14: 21 -27). La ghrelina es el ligando endógeno del receptor de secretagogos de la GH (GHS-R, del inglés Growth Hormone Secretagogues - Receptor) (Kojima y col., 1999, Nature 402: 656-660). Interviene en múltiples procesos, entre ellos la regulación del balance energético, del apetito, señales metabólicas, entre otros (Dixit y Taub, 2005, Exp. Gerontol. y 40: 900-910). Además, ejerce acciones anti-inflamatorias, modula la fagocitosis y promueve la timopoyesis, así como la atenuación del shock séptico (Hattori, 2009, J. Clin. Endocrinol. Metab. 86: 4284-4291 ).
Los GHS, además de estimular la secreción de GH, regulan el apetito y la ganancia de peso de mamíferos, aves y peces (Kaiya y col, 2008, Comp. Biochem. Physiol. A 149: 109-128). También poseen propiedades cardioprotectoras, al mejorar variables de la función cardíaca en varios estudios in vivo, e inhiben la proliferación de células cancerosas (Locatelli y Rossoni, 1999, Endocrinol. 140:4024-4031 ; Tivesten y Bollano, 2000, Endocrinol. 141 : 60-66; Cassoni y col, 2001 , J. Clin. Endocrinol. Metab. 86: 1738-1745). Además, intervienen en procesos como la inflamación y el envejecimiento (Hattori, 2009, J. Clin. Endocrinol. Metab. 86: 4284-4291 ).
Se sabe que el hexámero GHRP-6 (cuya secuencia de aminoácidos es His-D-Trp- Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2) es extremadamente potente, y seguro, al provocar la liberación de la hormona de crecimiento en mamíferos y aves (Bowers y col., 1984, Endocrino!. 1 14: 1537-45), así como en crustáceos (Patente Europea No. EP1477181 B1 ).
En modelos animales, se han descrito ejemplos de efectos anti-inflamatorios de la ghrelina (Smith y col., 2005, Trends Endocrino!. Metab. 16, 436-442). En la mayoría de estos estudios se ha planteado que el empleo de la ghrelina acilada suprime la expresión y/o producción de citocinas pro-inflamatorias, a pesar de la patología o la dosis, y del esquema de tratamiento empleado (Baatar y col., 201 1 , Molecular and Cellular Endocrinology 340: 44- 58). Su papel en la atenuación de la mortalidad y de los efectos inflamatorios de los lipopolisacáridos (LPS), tanto in vivo como in vitro, así como de la sepsis en modelos de roedores ha sido planteado con anterioridad (Dixit y col., 2004, J. Clin. Invest. 1 14: 57-66; Taub, 2007, Vitam. Horm. 77: 325-346).
En estudios realizados en modelos murinos de inflamación crónica, la ghrelina y el agonista sintético GHRP-2 inhibieron significativamente la liberación de interleucina 6 (IL-6) y de ácido nítrico de macrófagos activados, y atenuaron la artritis (Granado y col., 2005, Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 288: E486-E492). También, se han realizado estudios similares que han evidenciado sus efectos anti-inflamatorios (González-Rey y col., 2006, Gastroenterol. 130 (6), 1707-1720)
En un trabajo realizado por Lofti y colaboradores en el 201 1 (Lofti y col., 201 1 , Kafkas Univ Vet Fak Derg 17 (6): 949-952), la inyección de ghrelina in ovo influyó en el conteo diferencial de leucocitos en los pollos recién eclosionados. Con una dosis de 100 ng, en el día 10 de incubación, provocó un incremento en el conteo de heterófilos, basófilos y eosinófilos, y en la razón heterófilos/linfocitos, al mismo tiempo que disminuyó los linfocitos.
En el caso de los teleósteos, los estudios realizados in vitro han demostrado que el tratamiento de leucocitos de trucha arcoiris {Oncorhynchus mykiss) con ghrelina incrementa la producción de anión superóxido, de los niveles de ácido ribonucleico mensajero de GH, y de la enzima superóxido dismutasa en estas células (Yada y col., 2006, Endocrinol. 189: 57-65). En dicho estudio se informó que la incubación previa con el antagonista del receptor de secretagogos [D-Lys3]-GHRP-6, y la inmunoneutralización de la GH, disminuyó la producción de esta especie reactiva del oxígeno (O2 -), lo que sugiere que los efectos de la ghrelina sobre los leucocitos son mediados por la secreción de GH (Yada y col., 2007, Endocrinol. 152: 353-358). Por su parte, en estudios in vitro realizados con un péptido secretagogo análogo de GHRP-6, el péptido A233, se demostró que estimula la producción de indicadores de actividad fagocítica, como el anión superoxido, en leucocitos de tilapia {Oreochromis sp.) (Martínez y col., 2012, J. oí Endocrino!. 214: 409-419). En el mismo estudio, quedó evidenciado que la administración de A233, mediante baños de inmersión, estimula parámetros de la defensa antioxidante con la enzima superoxido dismutasa en larvas de tilapia {Oreochromis sp.), así como los títulos de las lectinas y la actividad antiproteasas. En otros experimentos, realizados en juveniles de tilapia a los que se administró GHRP-6, por vía oral, se mostró un incremento en el título de lectinas, y en el número de linfocitos intraepiteliales de la mucosa gástrica (Martínez y col., 2016, Aquaculture 452 304-310). Este último parámetro se relaciona con el sistema inmune innato, es inespecífico, y no está relacionado con la administración de un antígeno en particular.
La inmunidad protectora contra diferentes patógenos requiere respuestas que pueden generarse con el adyuvante vacunal apropiado (Awate y col., 2013, Frontiers in Immunology 4: 1 -10). Es por ello que, resulta necesario identificar y desarrollar nuevos adyuvantes, para vacunas contra agentes patógenos que han resultado resistentes a las estrategias de vacunación tradicionales, y para superar las limitaciones de los pocos adyuvantes aprobados que están disponibles (Harandi y col., 2010, Vaccine 28(12):2363-6; Pérez y col., 2012, Braz J Med Biol Res 45(8):681 -92).
Muchos adyuvantes potencian una fuerte respuesta inflamatoria indefinida, aumentan la inmunogenicidad de los antígenos coadministrados, pero pueden también provocar efectos no deseables, por lo que es preciso desarrollar nuevos adyuvantes que provoquen una respuesta inmune más específica y directa, para que la protección proporcionada por las vacunas sea óptima y segura.
Explicación de la invención
La presente invención contribuye a resolver el problema antes mencionado, al proveer un adyuvante capaz de potenciar de forma efectiva la respuesta inmune hacia un antígeno administrado conjuntamente. La invención tiene como objeto el uso de un péptido secretagogo de la hormona de crecimiento, identificado como SEQ ID No. 1 (GHRP-6) o SEQ ID No. 2 (A233), como adyuvante molecular en la fabricación de una vacuna que se emplea en diferentes estrategias de inmunización. En una realización de la invención dicha vacuna se emplea en la prevención de enfermedades causadas por agentes infecciosos. En una realización particular, dichas enfermedades afectan a mamíferos, aves o peces; y los agentes infecciosos pueden ser virus, bacterias y ectoparásitos, entre otros.
En el contexto de esta invención, el término "adyuvante molecular" se refiere a una sustancia capaz de modular positivamente la respuesta inmune contra un antígeno vacunal, produciendo un incremento de la misma. No existen investigaciones hasta el presente que demuestren ni sugieran el uso de la ghrelina, ni análogos de esta, como adyuvante molecular. Por el contrario, se ha propuesto el uso de la ghrelina para el tratamiento de enfermedades inflamatorias (González-Rey y col., 2006, Gastroenterology 130 (6), 1707-1720; Baatar y col., 201 1 , Mol Cell Endocrinol 340: 44- 58). Teniendo en cuenta estos antecedentes, resulta inesperado el efecto encontrado como parte de la presente invención, que demuestran que la administración de GHRP-6 o A233, en combinación con un antígeno vacunal, estimula la respuesta inmunitaria específica contra dicho antígeno.
Se describe también una composición vacunal que comprende un péptido secretagogo de la hormona de crecimiento identificado como SEQ ID No. 1 (GHRP- 6) o SEQ ID No. 2 (A233), al menos un antígeno vacunal, y vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables. La composición vacunal de la invención puede comprender otros compuestos que actúan como adyuvantes de vacunas, y que son conocidos por los versados en este campo de la técnica. Dentro de estos adyuvantes se encuentran, por ejemplo, las sales de aluminio y los adyuvantes oleosos.
A modo de ilustrar diferentes realizaciones de la invención, las composiciones vacunales de la misma incluyeron diversos antígenos y los péptidos GHRP-6 o A233. Entre los antígenos que se combinaron con GHRP-6 o su análogo estructural A233 está la ovoalbúmina (OVA), la proteína de la cápsida del virus Dengue 2 (C2), el péptido pPO de Rhipicephalus sanguineus (Rodríguez-Mallón y col., 2012; Vaccine 30: 1782-1789), la proteína quimérica P0-my32 (polipéptido de fusión de dos antígenos de Lepeophtheirus salmonis) y el polipéptido de fusión de P0 de L. salmonis y epitopos de células T (P0-TT). Sin que constituya una limitación a la invención, las composiciones se administraron en ratones, aves y peces, y se demostró un efecto adyuvante para dichos secretagogos, por primera vez. Inesperadamente, se observó que la administración de GHRP-6 o de A233 combinado con un antígeno incrementa los niveles de anticuerpos específicos contra dicho antígeno, en varias especies animales.
En una materialización de la invención el antígeno vacunal se selecciona dentro del grupo compuesto por péptidos, proteínas, virus y bacterias atenuadas. En una realización preferida de la invención dichas vacunas se administran a mamíferos, aves o peces. En una realización más preferida, la composición vacunal de la invención es administrable por vía oral o por inyección. En una realización particular, el péptido de secuencia SEQ ID No. 1 o SEQ ID No. 2 se encuentra en la composición vacunal, a una concentración de 50-600 μg/Kg de pienso formulado, cuando la vacuna se administra por vía oral en peces.
La invención también revela un método para incrementar la respuesta inmune contra un antígeno vacunal, que se caracteriza porque se administra una cantidad efectiva de un péptido secretagogo de la hormona de crecimiento, identificado como SEQ ID No. 1 (GHRP-6) o SEQ ID No. 2 (A233), como adyuvante molecular de dicho antígeno. En una realización de la invención, el antígeno vacunal se emplea para la prevención de enfermedades causadas por agentes infecciosos. En una realización particular de dicho método, el péptido de secuencia SEQ ID No. 1 o SEQ ID No. 2 se emplea a 50-600 μg/Kg de pienso formulado, cuando el antígeno vacunal y el péptido adyuvante se administran por vía oral. En otra realización de dicho método, el péptido de secuencia SEQ ID No. 1 o SEQ ID No. 2 se emplea a 0,1 -40 g/g de peso corporal del animal, cuando el antígeno vacunal y el péptido adyuvante molecular se administran mediante inyección. A los efectos de la invención, los péptidos GHRP-6 y A233, conocidos secretagogos de la GH, se obtienen por síntesis química.
Según se demuestra en varias materializaciones de la invención, el incremento en la respuesta inmune contra el antígeno de interés se revierte en mayores niveles de protección frente a diversos agentes infecciosos, entre los que se encuentran entidades virales, bacterianas y ectoparásitos. Breve descripción de las figuras
Figura 1. Respuesta de anticuerpos en ratones inmunizados con OVA, GHRP-6 y adyuvante de Freund, o con OVA y adyuvante de Freund. A. Títulos de inmunoglobulina G (IgG) en los grupos inmunizados por vía subcutánea (s.c). B, Títulos de IgG en los grupos inmunizados por vía intraperitoneal (i.p.). Se representan la media y la desviación estándar dentro de cada grupo. ** indica p< 0,0014; *** indica p< 0,001.
Figura 2. Respuesta de anticuerpos en ratones inmunizados con OVA, GHRP-6 y adyuvante de Freund, por las vías s.c. e i.p. (Grupo 3 y 4, respectivamente); o con OVA y adyuvante de Freund, por las vías s.c. e i.p. (Grupos 5 y 6, respectivamente). A, Títulos de lgG1 . B, Títulos de lgG2a. Se representan la media y la desviación estándar dentro de cada grupo. ** indica p< 0,0014; *** indica p< 0,001.
Figura 3. Títulos de IgG para los ratones inmunizados con péptido A233, OVA y adyuvante de Freund; u OVA y adyuvante de Freund, por vía i.p. Se muestran los niveles de anticuerpos detectados en el suero extraído en el día 22 del esquema de inmunización. Se representan la media y la desviación estándar por grupo. ** indica p< 0,0014.
Figura 4. Títulos de IgG (detectados al día 28 del esquema de inmunización) para los grupos inmunizados con C2 y alúmina, o con C2, GHRP-6 y alúmina, por vía s.c. Se representan la media y la desviación estándar. * indica p< 0,05.
Figura 5. Títulos de IgG en ratones inmunizados con P0 y adyuvante de Freund, o con P0, GHRP-6 y adyuvante de Freund, por vía i.p., en el día 36 del esquema de inmunización. Se representan la media y la desviación estándar. * indica p< 0,05. Figura 6. Títulos de inmunoglobulina M (IgM) en tilapias inmunizadas con P0-my32 o con P0-my32 combinado con GHRP-6 o con el péptido A233, detectados en el día 28 del experimento, donde los inmunógenos se administraron por vía i.p. A. y C. Títulos de IgM anti-my32, B. y D. Títulos de IgM anti-PO. En A y B se muestran los títulos en los animales tratados o no con GHRP-6, mientras que en C y D se presentan los títulos en los animales tratados o no con A233. Se representan la media y la desviación estándar. * indica p<0, 1; ** indica p<0,0014; *** indica p<0,001.
Figura 7. Porciento de tilapias con títulos de IgM superiores a 1 :1 000, luego de la inmunización con una formulación de P0-my32 que incluía Montanide ISA 50 o de P0-my32 que incluía GHRP-6 y Montanide ISA 50, en el día 28 del experimento. A. Porciento de animales respondedores anti-my32. B. Porciento de animales respondedores anti-PO.
Figura 8. Respuesta de anticuerpos IgM en ciarías inmunizadas con P0-TT o con P0-TTen presencia de GHRP-6 o del péptido A233, en el día 28 del experimento donde los peces se inmunizaron por vía i.p. A. Títulos anti-PO en los grupos del experimento de evaluación de GHRP-6 como adyuvante. B. Títulos anti-PO en los grupos del experimento de evaluación de A233 como adyuvante. Todos los inmunógenos se combinaron con Montanide ISA 50.
Figura 9. Título de anticuerpos aglutinantes contra Aeromonas hydrophila en carpa común. Los valores del eje Y representan la media ± error estándar. * indica p<0,05; ** indica p<0,01. Grupo 1 : Inyectados con PBS, Grupo 2: Inyectados con células de A. hydrophila inactivadas con formalina, Grupo 3: Inyectados con células de A. hydrophila inactivadas con formalina y GHRP-6 (20 μg por pez). Todos los inmunógenos se combinaron con Montanide ISA 50.
Exposición detallada de modos de realización / Ejemplos de realización
Ejemplo 1. Efecto de la co-administración de GHRP-6 sobre la respuesta inmune humoral contra la OVA.
Se emplearon 36 ratones Balb/c hembras. Se separaron seis grupos de estudio, de 6 animales cada uno. De estos, tres grupos fueron inmunizados por vía s.c. y el resto por vía i.p. En todos los grupos, los inmunógenos fueron emulsionados con adyuvante de Freund.
Grupo 1 : Placebo (tampón fosfato salino, abreviado PBS). Vía s.c.
Grupo 2: Placebo (PBS). Vía i.p.
Grupo 3: GHRP-6 a 10 pg/animal y OVA 5 pg/animal. Vía s.c.
Grupo 4: GHRP-6 a 10 pg/animal y OVA 5 pg/animal. Vía i.p.
Grupo 5: OVA 5 pg/animal. Vía s.c.
Grupo 6: OVA 5 pg/animal. Vía i.p.
Los ratones recibieron 150 μί de inmunógeno en todos los grupos, el que se administró a los animales en los días 1 y 15 del esquema de inmunización. Las extracciones de sangre se realizaron en los días 0 (suero preinmune), 8, 15, 22, 36, 43 y 50. Se evaluaron los títulos de IgG total, lgG1 e lgG2a. Se empleó adyuvante completo de Freund (FCA) en la primera inmunización, y adyuvante incompleto de Freund (FIA) en la siguiente.
Los animales del grupo inmunizado con GHRP-6 junto a la OVA, por vía s.c, tuvieron títulos superiores (con significación estadística; p<0,05) a los títulos del grupo al que se le administró OVA sin GHRP-6 por la misma vía, en los días 22, 36, 43 y 50 del experimento (Figura 1 A). Los animales inyectados con los mismos inmunógenos, pero por vía i.p., mostraron el mismo comportamiento en los días 36 y 43 del experimento (Figura 1 B).
Los títulos de lgG1 e lgG2a se determinaron en los sueros extraídos el día 36, para los grupos inmunizados con OVA en presencia o ausencia de GHRP-6, por vía s.c. e i.p. (Figuras 2A y 2B). No se observaron diferencias significativas en los títulos de lgG2a entre los grupos tratados con GHRP-6 y los que no recibieron dicho secretagogo, para ninguna de las vías de administración. Sí se observaron para lgG1 , en ambas vías de administración, siendo mayores en los grupos vacunados en presencia de GHRP-6.
La razón lgG1 /lgG2a, como reflejo de la reactividad diferencial hacia una respuesta tipo Th2 o Th1 , respectivamente, resultó significativamente superior en el grupo inmunizado, por vía i.p., con OVA en presencia de GHRP-6 y adyuvante de Freund, con respecto al inyectado con OVA y adyuvante de Freund solamente. Dicha razón se recoge en la Tabla 1 , donde los datos representan la media de la razón lgG1 /lgG2a correspondiente a los seis animales del grupo.
Tabla 1. Razón lgG1 /lgG2a en dos de los grupos inmunizados por vía intraperitoneal.
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* indica diferencias significativas p<0,05.
Ejemplo 2. Efecto de la co-administración del péptido A233 sobre la respuesta inmune humoral contra la OVA.
Para evaluar si el péptido A233 ejerce un efecto adyuvante sobre la OVA, se emplearon 18 ratones Balb/c hembras. Los ratones recibieron 150 μί de inmunógeno en todos los grupos, por vía i.p., el que se administró a los ratones a los días 1 y 15 del esquema de inmunización. Las extracciones de sangre se realizaron a los días 0 (suero preinmune), 8, 15, 22, 36, 43 y 50. Se evaluaron los títulos de IgG total presente en los sueros. Los animales se inmunizaron con 5 g de OVA/animal y 10 g de A233/animal (Grupo 2), o con 5 g de OVA /animal (Grupo 3). El grupo control fue inyectado con PBS (Grupo 1 ). Todos los inmunógenos se emulsificaron con adyuvante de Freund.
En los animales inyectados con OVA y péptido A233 hubo un incremento significativo en los títulos de anticuerpos anti-OVA, con respecto a los inmunizados con OVA solamente, en el día 22 del esquema de inmunización (Figura 3).
Ejemplo 3. Efecto de la co-administración de GHRP-6 sobre la respuesta inmune humoral contra el antígeno C2.
El antígeno C2, proteína de la cápsida del virus Dengue, se obtuvo como proteína recombinante en Escheríchia coli, con un peso molecular de 15 kDa. Para evaluar la respuesta inmune humoral y celular en los ratones vacunados con C2, en presencia o ausencia de GHRP-6, se seleccionaron 24 ratones Balb/c, hembras, de
6 semanas. Fueron distribuidos en 3 grupos. A cada animal se le administró un inmunógeno, de acuerdo al grupo experimental:
Grupo 1 : 10 Mg de C2
Grupo 2: 10 g de C2 co-administrados con 10 g de GHRP-6
Grupo 3: PBS
En todos los grupos, los inmunógenos comprendían adicionalmente hidróxido de aluminio, también conocido como alúmina. Las inmunizaciones se realizaron por vía s.c, los días 0, 15 y 30 del esquema de inmunización. Se realizaron extracciones de sangre en los días 0 (suero preinmune), 7, 16, 21 , 28 y 35, para evaluar el título de IgG total.
En la Figura 4 se aprecia que, en el día 28 del esquema de inmunización, el Grupo 2, tratado con C2 y GHRP-6, mostró un aumento significativo en el título de IgG anti- C2, con respecto al Grupo 1 , tratado con C2 y el adyuvante hidróxido de aluminio, sin GHRP-6.
Ejemplo 4. Efecto de la co-administración de GHRP-6 sobre la respuesta inmune humoral contra el péptido P0 de R. sanguineus.
El péptido P0 es un fragmento correspondiente a la región de menor identidad de secuencia entre la proteína ribosomal P0 de la garrapata R. sanguineus y sus mamíferos hospederos. Para evaluar la respuesta inmune humoral estimulada por la co-administración de GHRP-6 y P0, se seleccionaron 24 ratones Balb/c, hembras, de 6 semanas de edad, los que se dividieron en tres grupos, de 8 ratones cada uno. Cada animal recibió 150 μΙ_ de inmunogeno, por vía i.p., en los días 1 , 15 y 29 del esquema de inmunización. En la primera inmunización se empleó FCA, y en las posteriores se utilizó FIA.
Grupo 1 . Control (PBS).
Grupo 2. 100 pg de P0.
Grupo 3. 100 pg de P0 co-administrados con 200Mg de GHRP-6.
Se realizaron extracciones de sangre los días 0 (suero preinmune), 8, 16, 21 , 28, 36, 43, 50 y 58, para determinar los niveles de IgG total. En los animales inmunizados con P0, en presencia de GHRP-6, hubo un incremento significativo en los títulos de IgG, con respecto a los que no recibieron GHRP-6, tal como se aprecia en la Figura 5, que muestra los niveles de anticuerpos anti-P0 a los 36 días del esquema.
Ejemplo 5. Efecto de la co-administración de GHRP-6 o del péptido A233 sobre la respuesta inmune humoral contra la proteína P0-my32 en tilapias (Oreochromis sp.).
La proteína quimérica P0-my32 se generó mediante la clonación del ácido desoxirribonucleico complementario (ADNc) que codifica un péptido, de 35 aminoácidos, de la proteína ribosomal P0 de L. salmonis fusionado al extremo N-terminal del ADNc que codifica la proteína my32 del mismo ectoparásito (Carpió y col., 2013; Exp. Parásito! 135: 188-199), en un vector diseñado para la expresión inducida de genes de interés en la bacteria hospedera E. coli. Esta proteína se produjo en la bacteria y se purificó, como proteína de fusión a histidina, mediante cromatografía de afinidad por quelatos metálicos. Para la realización del experimento de inmunización, se conformaron 6 grupos de estudio, de juveniles machos de Oreochromis niloticus, con 15 animales cada uno. En todos los grupos, el inmunogeno se administró adyuvado con Montanide ISA 50, por ruta i.p. Los grupos experimentales recibieron los siguientes inmunógenos:
Grupo 1 : PBS
Grupo 2: P0-my32 (1 μg/g de peso del pez)
Grupo 3: P0-my32 (1 μg/g de peso del pez) co-administrado con 20 μg de GHRP-6 Grupo 4: P0-my32 (1 μg/g de peso del pez co-administrado con 20 μg de A233 Grupo 5: P0-my32 (^ μg/ g de peso del pez). Los peces de este grupo fueron alimentados con pienso formulado con 100 μς de GHRP-6 por kg de pienso, diariamente, dos veces al día, durante una semana antes y una semana después de la administración de my32 en inyecciones.
Durante el transcurso del experimento, los peces de los grupos 1 al 4 se alimentaron dos veces al día con una fórmula comercial balanceada, no medicada, a razón de 1 % de su peso corporal. Las inmunizaciones se realizaron en los días 0 y 14 del esquema. Se realizaron extracciones de sangre a los días 0, 21 , 28 y 35 del inicio del experimento.
En las tilapias inyectadas con P0-my32 en presencia de GHRP-6 hubo un incremento en los títulos de anticuerpos IgM anti-my32, en comparación con el grupo inyectado con P0-my32. Este incremento fue estadísticamente significativo, tal como se aprecia en la Figura 6A, que muestra los niveles de anticuerpos de esa clase en el suero extraído el día 28. El mismo efecto se observó para el título de IgM anti-PO (Figura 6B). La co-administración de A233 con el antígeno quimérico también permitió un incremento en los títulos de IgM contra sus dos componentes, en comparación con el grupo control (Figuras 6C y 6D). El grupo inyectado con P0- my32, y alimentado simultáneamente con el pienso que contenía GHRP-6, también mostró un incremento en los títulos obtenidos, con respecto al grupo inyectado con la proteína quimérica, que se alimentó con un pienso no modificado (Tabla 2). Tabla 2. Influencia sobre los títulos de IgM anti-my32 y anti-PO de la coadministración de GHRP-6 en el pienso
Figure imgf000012_0001
* indica diferencias significativas entre los grupos p<0,05.
Además, en el grupo inyectado por ruta i.p. con inmunógeno que contenía GHRP-6 (Grupo 3), el número de animales respondedores, con títulos de IgM superiores a 1 :1 000, fue superior para ambos componentes de la proteína, en comparación con el grupo tratado con P0-my32 que no recibió el péptido GHRP-6 (Grupo 2). Esto se aprecia en las Figuras 7A y 7B. Ejemplo 6. Efecto de la co-administración de GHRP-6 o A233 y la proteína P0- TT sobre la respuesta inmune humoral en ciarías {Ciarías garíepinus).
La proteína quimérica PO-TT está basada en: a) el péptido denominado pPO, de 35 aminoácidos, correspondiente a la región menos conservada entre la proteína ribosomal P0 de L. salmonis y la de uno de sus hospederos, Salmo salar y b) dos epítopos de células T, provenientes del virus del sarampión y del toxoide tetánico, respectivamente. Para la realización del experimento, se conformaron 4 grupos de estudio de C. garíepinus, con 12 animales en cada uno. Estos se inmunizaron por vía i.p. con 1 μg de la proteína PO-TT por gramo de peso del animal (Grupo 2) o con la misma dosis de la proteína quimérica PO-TT (1 μg/g de peso del animal) coadministrada con 20 μg de GHRP-6 o A233 por animal (Grupos 3 y 4, respectivamente), en un volumen total de 120 μΐ. El grupo control (Grupo 1 ) recibió el mismo volumen de PBS. Los inmunogenos correspondientes a todos los grupos se emulsionaron con el adyuvante oleoso Montanide ISA 50. La inmunización se realizó en las mismas condiciones los días 0 y 14 del esquema de administración. Se realizaron extracciones de sangre a los días 0, 21 , 28 y 35 contados desde el inicio del experimento.
En las ciarías inmunizadas con PO-TT más GHRP-6 hubo un incremento en el título de anticuerpos de tipo IgM anti-P0, en comparación con el grupo inyectado con P0- TT sin péptido GHRP-6, que tuvo significación estadística en el día 28 (Figura 8A). El mismo efecto se observó para los títulos obtenidos tras la administración de PO- TT más A233 (Figura 8B).
Ejemplo 7. Demostración del efecto adyuvante del GHRP-6 en la respuesta inmune humoral de carpa común (Cyprinus carpió) contra la bacteria Aeromonas hydrophiía.
El experimento se realizó con carpas (C. carpi ) de 40 ± 10 g. Estas se mantuvieron en acuarios de 600 L, a una temperatura de 28 ± 2 °C. Se establecieron 3 grupos experimentales, de 10 carpas cada uno, a las cuales se les inyectaron por vía i.p. los siguientes inmunogenos:
Grupo 1 : PBS + Montanide ISA 50
Grupo 2: Células de A. hydrophiía inactivadas (1 x 108 Unidades Formadoras de Colonias, abreviado UFC) + Montanide ISA 50 Grupo 3: Células de A. hydrophila inactivadas (1 x 10a UFC) y 20 pg de GHRP-6 por pez + Montanide ISA 50.
Los peces se inyectaron en el día 0 y 14, y se colectó sangre de la vena caudal de los mismos en los días 0 y 21 . Los resultados mostraron que los títulos de anticuerpos aglutinantes contra A. hydrophila fueron significativamente mayores en el grupo inmunizado con la bacteria más el GHRP-6, en comparación con el grupo inmunizado con la bacteria sin péptido GHRP-6 (Figura 9). Estos resultados corroboran el efecto de GHRP-6 como adyuvante molecular en peces. La preparación de las células de A. hydrophila y la determinación de los títulos de anticuerpos se realizaron según reportes previos (Yin et al. ((1996) Fish & Shellfish Immunol. 6, 57-69).
Ejemplo 8. Ensayo de reto controlado en peces inmunizados con la bacteria Aeromonas hydrophila inactivada y la bacteria inactivada co-administrada con el péptido GHRP-6.
El experimento se realizó con carpa común (C. carpió) de 30 ± 5 g. Estas se mantuvieron en acuarios de 250 L, a una temperatura de 30 ± 2 °C. Se establecieron 3 grupos experimentales, de 20 carpas cada uno, a los cuales se inyectó por ruta i.p.:
Grupo 1 : PBS + Montanide ISA 50
Grupo 2: Células de A. hydrophila (1 x 108 UFC) inactivadas + Montanide ISA 50 Grupo 3: Células de A. hydrophila (1 x 108 UFC) inactivadas y 20 μg GHRP-6 por pez + Montanide ISA 50.
Los peces se inyectaron en el día 0 y 14. En el día 21 se realizó el reto, mediante la inyección por vía i.p. de la dosis letal 50 (DL50) de la bacteria, y se registró la mortalidad en cada grupo durante 7 días. Se calculó el porciento relativo de sobrevida (RPS) como:
RPS (%)= (% de mortalidad de controles-% mortalidad de tratados)/ (% de mortalidad controles) x100
Como resultado se obtuvo un 65% de RPS en el Grupo 2, y un 95% en el Grupo 3, lo que demuestra que la administración del GHRP-6 incrementa la tasa de sobrevida de los peces vacunados y retados con el patógeno. Ejemplo 9. Demostración del efecto adyuvante del GHRP-6 en la respuesta inmune humoral de pollos contra la albúmina de suero bovino.
Se emplearon 15 pollos neonatos, tipo híbrido EB34 Cornish x White Plymoth Rock, que fueron divididos en tres grupos experimentales, de 5 animales cada uno. Los animales fueron inmunizados por vía i.p. los días 12 y 18 del esquema de inmunización, con 5 g de albúmina de suero bovino (BSA) por animal (Grupo 2), o con 5 g de BSA y 20 g de GHRP-6 por animal (Grupo 3). El grupo control (Grupo 1 ) fue inmunizado con PBS. Se determinaron los niveles de anticuerpos de tipo IgY en el suero, en el día 25 del experimento. Hubo diferencias estadísticamente significativas entre los títulos de anticuerpos en los animales del grupo inmunizado con BSA solamente y el que recibió, además de BSA, el péptido GHRP-6 (Tabla 3).
Tabla 3. Respuesta de anticuerpos de tipo IgY antígeno-específico en el suero de pollos inmunizados con BSA.
Figure imgf000015_0001
Los datos muestran la media y la desviación estándar de los valores máximos de absorbancia determinados mediante ELISA indirecto.

Claims

REIVINDICACIONES USO DE PEPTIDO SECRETAGOGO DE LA HORMONA DE CRECIMIENTO COMO ADYUVANTE VACUNAL
1 . Uso de un péptido secretagogo de la hormona de crecimiento identificado como SEQ ID No. 1 o SEQ ID No. 2 como adyuvante molecular en la fabricación de una vacuna.
2. El uso de la reivindicación 1 donde dicha vacuna se emplea en la prevención de enfermedades causadas por agentes infecciosos.
3. El uso de la reivindicación 2 donde dichas enfermedades afectan a mamíferos, aves o peces.
4. Composición vacunal que comprende un péptido secretagogo de la hormona de crecimiento identificado como SEQ ID No. 1 o SEQ ID No. 2, al menos un antígeno vacunal, y vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables.
5. La composición de la reivindicación 4 donde el antígeno vacunal se selecciona dentro del grupo compuesto por péptidos, proteínas, virus y bacterias atenuadas.
6. La composición de la reivindicación 5 caracterizada porque se administra en mamíferos, aves o peces, por vía oral o por inyección.
7. La composición de la reivindicación 6 donde el péptido de secuencia SEQ ID No. 1 o SEQ ID No. 2 se encuentra a una concentración de 50-600 μg/Kg de pienso formulado, cuando la vacuna se administra por vía oral en peces.
8. Método para incrementar la respuesta inmune contra un antígeno vacunal que se caracteriza porque se administra una cantidad efectiva de un péptido secretagogo de la hormona de crecimiento identificado como SEQ ID No. 1 o SEQ ID No. 2 como adyuvante molecular de dicho antígeno.
9. El método de la reivindicación 8 donde el antígeno vacunal se emplea para la prevención de enfermedades causadas por agentes infecciosos.
10. El método de la reivindicación 8 donde el péptido de secuencia SEQ ID No. 1 o SEQ ID No. 2 se emplea a 50-600 μg/Kg de pienso formulado cuando el antígeno vacunal y el péptido adyuvante molecular se administran por vía oral.
1 1 . El método de la reivindicación 8 donde el péptido de secuencia SEQ ID No. 1 o SEQ ID No. 2 se emplea a 0,1 -40 g/g de peso corporal del animal, cuando el antígeno vacunal y el péptido adyuvante molecular se administran mediante inyección.
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