NO20141508A1 - Peptider som induserer en immunrespons mot kopepoder og/eller utviklingen av et slimskjold hos fisk; vaksiner, anvendelser og fremgangsmåter for å modulere fiskens immunrespons og/eller for å indusere utvikling av et slimskjold hos fisk. - Google Patents
Peptider som induserer en immunrespons mot kopepoder og/eller utviklingen av et slimskjold hos fisk; vaksiner, anvendelser og fremgangsmåter for å modulere fiskens immunrespons og/eller for å indusere utvikling av et slimskjold hos fisk. Download PDFInfo
- Publication number
- NO20141508A1 NO20141508A1 NO20141508A NO20141508A NO20141508A1 NO 20141508 A1 NO20141508 A1 NO 20141508A1 NO 20141508 A NO20141508 A NO 20141508A NO 20141508 A NO20141508 A NO 20141508A NO 20141508 A1 NO20141508 A1 NO 20141508A1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- seq
- caligus
- fish
- vaccine
- peptide
- Prior art date
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 135
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 115
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 title claims abstract description 102
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 62
- 241000239250 Copepoda Species 0.000 title claims abstract description 35
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 title claims abstract description 31
- 230000028993 immune response Effects 0.000 title claims abstract description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 24
- 238000011161 development Methods 0.000 title claims description 11
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 title 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 54
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 54
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims abstract description 21
- 235000019688 fish Nutrition 0.000 claims description 103
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 26
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 23
- 241000277275 Oncorhynchus mykiss Species 0.000 claims description 22
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 claims description 21
- 241000542855 Megathura crenulata Species 0.000 claims description 20
- 241000277338 Oncorhynchus kisutch Species 0.000 claims description 20
- 241000277263 Salmo Species 0.000 claims description 19
- 241001280377 Oncorhynchus tshawytscha Species 0.000 claims description 17
- 241000277288 Salmo trutta Species 0.000 claims description 17
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 claims description 17
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 claims description 17
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 17
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 claims description 15
- 241000277289 Salmo salar Species 0.000 claims description 9
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 5
- 241001247232 Caligidae Species 0.000 claims description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 7
- 241001611011 Caligus Species 0.000 description 437
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 36
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 20
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 20
- 241001611004 Caligus rogercresseyi Species 0.000 description 19
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 19
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 19
- 206010061217 Infestation Diseases 0.000 description 17
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 13
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 13
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 12
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 12
- 241000277331 Salmonidae Species 0.000 description 10
- 241000237858 Gastropoda Species 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 8
- 101710161198 Vitellogenin-1 Proteins 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 8
- 230000000366 juvenile effect Effects 0.000 description 7
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 7
- 108010090932 Vitellogenins Proteins 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 6
- 241000239267 Arguloida Species 0.000 description 5
- 241000237988 Patellidae Species 0.000 description 5
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N Glycolic acid Chemical compound OCC(O)=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101710161186 Vitellogenin-2 Proteins 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- BLFLLBZGZJTVJG-UHFFFAOYSA-N benzocaine Chemical compound CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 BLFLLBZGZJTVJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 4
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 4
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 4
- 230000000091 immunopotentiator Effects 0.000 description 4
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 4
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 4
- 239000013535 sea water Substances 0.000 description 4
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 4
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 3
- 230000001524 infective effect Effects 0.000 description 3
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- 241000704622 Antennatus Species 0.000 description 2
- 231100000699 Bacterial toxin Toxicity 0.000 description 2
- 241000571350 Caligus aesopus Species 0.000 description 2
- 241001235711 Caligus centrodonti Species 0.000 description 2
- 241000420702 Caligus cheilodactyli Species 0.000 description 2
- 241000571348 Caligus chorinemi Species 0.000 description 2
- 241000712786 Caligus clemensi Species 0.000 description 2
- 241000571346 Caligus confusus Species 0.000 description 2
- 241001235719 Caligus curtus Species 0.000 description 2
- 241001382015 Caligus diaphanus Species 0.000 description 2
- 241001405819 Caligus elongatus Species 0.000 description 2
- 241000571427 Caligus hoplognathi Species 0.000 description 2
- 241001325422 Caligus longirostris Species 0.000 description 2
- 241000571430 Caligus mutabilis Species 0.000 description 2
- 241001155277 Caligus punctatus Species 0.000 description 2
- 241001382014 Caligus quadratus Species 0.000 description 2
- 241000571422 Caligus robustus Species 0.000 description 2
- 241000571399 Caligus serratus Species 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108010039939 Cell Wall Skeleton Proteins 0.000 description 2
- 241001436044 Chelifer Species 0.000 description 2
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 2
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 2
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 2
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 101710146739 Enterotoxin Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 108010040721 Flagellin Proteins 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 description 2
- 206010022095 Injection Site reaction Diseases 0.000 description 2
- 241001401881 Longicaudus Species 0.000 description 2
- 241000781273 Longipedis Species 0.000 description 2
- 241000972747 Macrourus Species 0.000 description 2
- 241000187481 Mycobacterium phlei Species 0.000 description 2
- 241000737052 Naso hexacanthus Species 0.000 description 2
- 240000002853 Nelumbo nucifera Species 0.000 description 2
- 235000006508 Nelumbo nucifera Nutrition 0.000 description 2
- 235000006510 Nelumbo pentapetala Nutrition 0.000 description 2
- 241000123077 Ocyurus Species 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 241000882917 Pomacentrus Species 0.000 description 2
- 241001098657 Pterois Species 0.000 description 2
- 241000353093 Raniceps Species 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 241000306752 Salmoneus Species 0.000 description 2
- 241000269851 Sarda sarda Species 0.000 description 2
- 241001194796 Schistonyx Species 0.000 description 2
- 241001290310 Sciaenops Species 0.000 description 2
- 241001187507 Sicarius Species 0.000 description 2
- 241000045687 Tigriopus japonicus Species 0.000 description 2
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 description 2
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 2
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 2
- 230000036528 appetite Effects 0.000 description 2
- 235000019789 appetite Nutrition 0.000 description 2
- 238000009360 aquaculture Methods 0.000 description 2
- 244000144974 aquaculture Species 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000688 bacterial toxin Substances 0.000 description 2
- 229960005274 benzocaine Drugs 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- FVMOEFABYNPCDS-UHFFFAOYSA-L calcium;1-(4-carboxy-2,6-dioxocyclohexylidene)propan-1-olate Chemical compound [Ca+2].CCC([O-])=C1C(=O)CC(C(O)=O)CC1=O.CCC([O-])=C1C(=O)CC(C(O)=O)CC1=O FVMOEFABYNPCDS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 210000004520 cell wall skeleton Anatomy 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 description 2
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- DOUYETYNHWVLEO-UHFFFAOYSA-N imiquimod Chemical compound C1=CC=CC2=C3N(CC(C)C)C=NC3=C(N)N=C21 DOUYETYNHWVLEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960002751 imiquimod Drugs 0.000 description 2
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 2
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 208000028454 lice infestation Diseases 0.000 description 2
- GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N lipid A (E. coli) Chemical class O1[C@H](CO)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC)[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](OP(O)(O)=O)O1 GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 229940055036 mycobacterium phlei Drugs 0.000 description 2
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 2
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 2
- 108010004034 stable plasma protein solution Proteins 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 2
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 2
- 239000012646 vaccine adjuvant Substances 0.000 description 2
- 229940124931 vaccine adjuvant Drugs 0.000 description 2
- 239000000277 virosome Substances 0.000 description 2
- LLXVXPPXELIDGQ-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)benzoate Chemical compound C=1C=CC(N2C(C=CC2=O)=O)=CC=1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O LLXVXPPXELIDGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZTOJFFHGPLIVKC-YAFCTCPESA-N (2e)-3-ethyl-2-[(z)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound S\1C2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=C2N(CC)C/1=N/N=C1/SC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=C2N1CC ZTOJFFHGPLIVKC-YAFCTCPESA-N 0.000 description 1
- VZQHRKZCAZCACO-PYJNHQTQSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]propanoyl]amino]prop-2-enoylamino]-3-methylbutanoyl]amino]propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N VZQHRKZCAZCACO-PYJNHQTQSA-N 0.000 description 1
- 150000003923 2,5-pyrrolediones Chemical class 0.000 description 1
- 241000238876 Acari Species 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000402794 Argulus foliaceus Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 Chemical compound C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N 0.000 description 1
- 241000571347 Caligus callaoensis Species 0.000 description 1
- 241000109841 Caligus fugu Species 0.000 description 1
- 241001235713 Caligus gurnardi Species 0.000 description 1
- 241001235717 Caligus pelamydis Species 0.000 description 1
- 241000571400 Caligus tylosuri Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000522241 Cordyla <angiosperm> Species 0.000 description 1
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 238000012313 Kruskal-Wallis test Methods 0.000 description 1
- 241001247234 Lepeophtheirus salmonis Species 0.000 description 1
- 206010062049 Lymphocytic infiltration Diseases 0.000 description 1
- 241000237852 Mollusca Species 0.000 description 1
- 208000029549 Muscle injury Diseases 0.000 description 1
- -1 N-protected amino Chemical group 0.000 description 1
- 241000566145 Otus Species 0.000 description 1
- 241000873857 Paracyclopina Species 0.000 description 1
- 241000873862 Paracyclopina nana Species 0.000 description 1
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 description 1
- 241000606012 Pectinatus Species 0.000 description 1
- 101710176384 Peptide 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 241001481703 Rhipicephalus <genus> Species 0.000 description 1
- 241000238680 Rhipicephalus microplus Species 0.000 description 1
- 240000002380 Rosa carolina Species 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- YVNQAIFQFWTPLQ-UHFFFAOYSA-O [4-[[4-(4-ethoxyanilino)phenyl]-[4-[ethyl-[(3-sulfophenyl)methyl]amino]-2-methylphenyl]methylidene]-3-methylcyclohexa-2,5-dien-1-ylidene]-ethyl-[(3-sulfophenyl)methyl]azanium Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C(=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S(O)(=O)=O)C)C=2C(=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S(O)(=O)=O)C)C=C1 YVNQAIFQFWTPLQ-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- ZTOJFFHGPLIVKC-CLFAGFIQSA-N abts Chemical compound S/1C2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N\N=C1/SC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=C2N1CC ZTOJFFHGPLIVKC-CLFAGFIQSA-N 0.000 description 1
- 125000000218 acetic acid group Chemical group C(C)(=O)* 0.000 description 1
- ZCHPKWUIAASXPV-UHFFFAOYSA-N acetic acid;methanol Chemical compound OC.CC(O)=O ZCHPKWUIAASXPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000004103 aminoalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 235000012501 ammonium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 230000005587 bubbling Effects 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- MCPKSFINULVDNX-UHFFFAOYSA-N drometrizole Chemical compound CC1=CC=C(O)C(N2N=C3C=CC=CC3=N2)=C1 MCPKSFINULVDNX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000078703 ectoparasite Species 0.000 description 1
- 230000003628 erosive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000009313 farming Methods 0.000 description 1
- 239000013505 freshwater Substances 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 150000008271 glucosaminides Chemical class 0.000 description 1
- 210000002175 goblet cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000001759 immunoprophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 1
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000001418 larval effect Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000000426 osmoregulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000036281 parasite infection Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 108010091748 peptide A Proteins 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940023041 peptide vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 210000002955 secretory cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- A61K38/10—Peptides having 12 to 20 amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/1767—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0003—Invertebrate antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
- A61P33/14—Ectoparasiticides, e.g. scabicides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
- A61K2039/552—Veterinary vaccine
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Zoology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Mycology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Isolerte peptider omfattende sekvensene SEQ ID NO. 17, SEQ ID NO. 18, SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 20, SEQ ID NO. 21, SEQ ID NO. 22, SEQ ID NO. 23, SEQ ID NO. 24, SEQ ID NO. 25, SEQ ID NO. 26, SEQ ID NO. 27 eller SEQ ID NO. 28, hvori ett eller flere peptider induserer en immunrespons mot kopepoder og/eller dannelsen av en slimskjoldbeskyttelse hos fisk. Peptidet kan være konjugert til et antigent protein; for eksempel kan det være kovalent konjugert til KLH. I tillegg er det tilveiebrakt vaksiner omfattende peptidene alene eller kombinert.
Description
BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN
Kopepoder i Caligidae-familien, vanligvis kjent som fiskelus, er de mest omfattende rapporterte ektoparasittene hos arter av vill- og oppdrettslaks.
Den dominante arten som angriper lakseoppdrett i Chile, er Caligus rogercresseyi, som er til stede i 99 % av laksefarmer, og infesterer både salmonider og naturlig hjemmehørende fisk og derved skaper høye dødsrater.
Global vekst av intensiv lakseoppdrett de siste tiårene har gjort kontrollen av fiskelus til et av hovedfokusene i bransjen på grunn av viktige økonomiske tap og miljøpåvirkninger skapt av disse parasittene.
Kopepoder livnærer seg av fiskehud, -slim og -blod, og det finnes veldokumentert litteratur vedrørende deres taksonomi, livssyklus og parasitt-vetr-relasj on.
Infestering med fiskelus hos salmonider danner erosjon, tap av epidermis og skjell, blødning i vertsvev og osmoregulatorisk stress som kan forårsake død for de angrepne eksemplarene på grunn av deres manglende evne til å bevare homeostase. Stressforhold øker laksens mottakelighet for infeksjoner på grunn av svakhet forårsaket av fiskelusangrepet.
Etter som produksjonsnivåene øker på oppdrettsanlegg, fører de store populasjonene av innesperret laks til en økende forekomst av ektoparasitt-skadedyr og assosierte sykdommer, en reduksjon av vekstrate for oppdrettsfisk og lavere kvalitetsstandarder på grunn av muskelskade. Dette fører til tap av økonomisk verdi, høyere produksjonskostnader som er nødvendig for å ha råd til behandlinger for å bekjempe skadedyrene og relaterte sykdommer hos salmonider. Ytterligere problemer er parasittresistens mot terapeutiske kjemikalier og disse produktenes toksisitet for marint liv.
Vaksiner som bruker vitelogenin 1 som antigen (EP 2 405 003 og WO2007/039599), antigener som omfatter proteiner fusjonert til en promiskuøs T-celleepitop (US 2010/00221271) er beskrevet. Det er imidlertid fortsatt et behov for høyeffektive vaksiner som kan fremstilles enklere, for å immunisere fisk som kan infesteres med kopepoder. Videre er det også behov for sammensetninger eller vaksiner som fremmer dannelsen hos fisk av et slimskjold som beskytter mot infesteringer med kopepoder.
BESKRIVELSE AV TEGNINGENE
Figur 1:
Figur 1 viser proteiner ekstrahert fra C. rogercresseyi separert på 8 % natriumdodekylsulfatpolyakrylamid-gel under reduksjonsbetingelser. Felt 1: Molekylvektmarkør (Fermentas #SM1811). Felt 2: Løselige proteinkonsentrater fra C. rogercresseyi;
Figur 2:
Figur 2 viser aminosyresekvensene til SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, og SEQ ID NO. 3 og peptidene brukt til identifikasjon; SEQ ID N°l Vitellogenin 1 [Le<p>eo<p>htheims salmonis], SEQ ID NO. 2 Vitellogenin 2 [Le<p>eo<p>htheims salmonis], og SEQ ID N°3 Vitellogenin-lignende protein [Le<p>eo<p>htheims salmonis] ;
Figur 3:
Figur 3 er en graf som viser effekten til vaksine A ifølge oppfinnelsen uttrykt som prosent reduksjon av antall parasittiske stadier etter provokasjon hos immuniserte ørreter sammenlignet med kontroller i tre provokasjonsstadier: fiksering, utvikling av juvenile Chalimus-stadier (I til IV) og voksne (hanner og hunner).
Figur 4:
Figur 4 er en graf som viser det gjennomsnittlige antallet voksne hann- og hunnparasitter funnet per fisk og standardavviket for hver gruppe (vaksine A og kontroller);
Figur 5:
Figur 5 er en graf som viser indusert immunrespons hos fisk vaksinert med vaksine A og kontroller; log serumtitere for spesifikke antistoffer fra 4 vaksinerte grupper (n=5) på ulike tidspunkter etter vaksinasjon er representert. Spesifikke antistofftitere ble bestemt ved hjelp av en Elisa;
Figur 6:
Figur 6 viser aminosyresekvensen til SEQ ID NO. 1 og identifiserer peptidene ifølge oppfinnelsen;
Figur 7:
Figur 7 er en graf som viser effekten til vaksinene ifølge oppfinnelsen uttrykt som prosent reduksjon av antall parasittiske stadier etter provokasjon hos immuniserte atlanterhavslaks sammenlignet med kontroller, i tre provokasjonsstadier: fiksering, utvikling av juvenile Chalimus-stadier (I til IV) og voksne (hanner og hunner).
Figur 8:
Figur 8 er en graf som viser det gjennomsnittlige antallet voksne hann- og hunnparasitter funnet per fisk og standardavviket for hver gruppe (vaksine 1-7 ifølge oppfinnelsen og kontroller);
Figur 9:
Figur 9 er en graf som viser induksjonskinetikk for spesifikke antistoffer hos atlanterhavslaks vaksinert med de ulike vaksinene ifølge oppfinnelsen og deres kontroller, provosert med infeksiøse stadier av C. rogercresseyi.
Figur 10:
Figur 10 er en graf som viser induksjonskinetikk for spesifikke antistoffer i slim fra atlanterhavslaks vaksinert med de ulike vaksinene ifølge oppfinnelsen og deres kontroller, provosert med infeksiøse stadier av C. rogercresseyi.
Figur 11:
Figur 11 er en graf som viser korrelasjon mellom prosentandel av PRI-infestering (%) og serologi er uttrykt som invers log av titeren for spesifikke antistoffer for vaksine 1 og
A.
Figur 12:
Figur 12 viser resultatene av en histologisk analyse av epidermis til fisk vaksinert med de ulike vaksinene og deres kontroller utført på tidspunktene 0, 10, 20 og 30 dager etter vaksinering. Hudstrimler farget med PAS-Alcian Blue for å identifisere slimutskillende celler er vist.
Figur 13:
Figur 13 viser en histologisk analyse av epidermis til fisk vaksinert med de ulike vaksinene og deres kontroller utført på dag 40-50-80 og 120 under immunisering og provokasjon (nedenfor). Hudstrimler farget med PAS for å identifisere slimutskillende celler er identifisert.
Figur 14:
Figur 14 er en appliseringsskjematidslinje som viser fiskers akklimatisering, immunisering, provokasjon med parasitten og prøvetaking.
KORT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN
Et formål med den foreliggende oppfinnelsen er å tilveiebringe et isolert peptid omfattende en aminosyresekvens som har minst 90 %, for eksempel 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 og 99 % identitet med de følgende sekvensene: SEQ ID NO. 17, SEQ ID NO. 18, SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 20, SEQ ID NO. 21, SEQ ID NO. 22, SEQ ID NO. 23, SEQ ID NO. 24, SEQ ID NO. 25, SEQ ID NO. 26, SEQ ID NO. 27 eller SEQ ID NO. 28, der peptidet induserer en immunrespons mot kopepoder hos fisk. Fisk kan omfatte salmonider, slik som atlanterhavslaks ( Salmo Salar), regnbueørret ( Oncorhynchus mykiss), Coho-laks ( Oncorhynchus kisutch), bekkeørret ( Salmo trutta), eller Chinook-laks ( O. tshawytschd) ; og kopepodene kan omfatte Caligus rogercresseyi, Caligus absens, Caligus acanthopagri, Caligus aduncus, Caligus aesopus, Caligus affinis, Caligus furcatus, Caligus alaihi, Caligus alatus, Caligus amblygenitalis, Caligus angustatus, Caligus antennatus, Caligus arii, Caligus ariicolus, Caligus asperimanus, Caligus asymmetricus, Caligus atromaculatus, Caligus balistae, Caligus belånes, Caligus bennetti, Caligus berychis, Caligus biaculeatus, Caligus bicycletus, Caligus bifurcatus, Caligus bifurcus, Caligus biseriodentatus, Caligus bocki, Caligus bonito, Caligus brevicaudatus, Caligus brevicaudus, Caligus brevis, Caligus buechlerae, Caligus callaoensis, Caligus callyodoni, Caligus calotomi, Caligus carangis, Caligus caudatus, Caligus centrodonti, Caligus chaenichthyis, Caligus cheilodactyli, Caligus chelifer, Caligus chiastos, Caligus chorinemi, Caligus chrysophrysi, Caligus clavatus, Caligus clemensi, Caligus confusus, Caligus constrictus, Caligus cookeoli, Caligus cordiventris, Caligus cordyla, Caligus cornutus, Caligus coryphaenae, Caligus cossacki, Caligus costatus, Caligus cresseyorum, Caligus cristatus, Caligus crusmae, Caligus cunicephalus, Caligus curtus, Caligus cybii, Caligus dactylopteni, Caligus dactylus, Caligus dakari, Caligus dampieri, Caligus dasyaticus, Caligus debueni, Caligus deformis, Caligus diaphanus, Caligus dicentrarchi, Caligus dieuzeidei, Caligus digitatus, Caligus djedabae, Caligus dubius, Caligus eleutheronemi, Caligus elevatus, Caligus elongatus, Caligus engraulidis, Caligus enormes, Caligus epidemicus, Caligus epinepheli, Caligus equulae, Caligus eventilis, Caligus fistulariae, Caligus flexispina, Caligus fortis, Caligus fronsuganinus, Caligusfugu, Caligusfurcisetifer, Caligus gayi, Caligus germoi, Caligus glacialis, Caligus glandifer, Caligus gracilis, Caligus grandiabdominalis, Caligus guerini, Caligus gurnardi, Caligus haemulonis, Caligus hamatus, Caligus hamruri, Caligus hemiconiati, Caligus hobsoni, Caligus hoplognathi, Caligus hottentotus, Caligus hyalinae, Caligus hyalinus, Caligus ignotus, Caligus inanis, Caligus infestans, Caligus inopinatus, Caligus irritans, Caligus isonyx, Caligus itacurussensis, Caligus jawahari, Caligus kabatae, Caligus kahawai, Caligus kala, Caligus kalumai, Caligus kanagurta, Caligus kapuhili, Caligus kirti, Caligus kirtiodes, Caligus klawei, Caligus kurochkini, Caligus kuwaitensis, Caligus labracis, Caligus lacustris, Caligus lalandei, Caligus laticaudus, Caligus latigenitalis, Caligus lotus, Caligus lepidopi, Caligus lessonius, Caligus lethrinicola, Caligus lichiae, Caligus ligatus, Caligus ligusticus, Caligus littoralis, Caligus lobodes, Caligus lolligunculae, Caligus longiabdominis, Caligus longicaudatus, Caligus longicaudus, Caligus longicervicis, Caligus longipedis, Caligus longipennatus, Caligus longirostris, Caligus longispinosus, Caligus lunatus, Caligus lutjani, Caligus macarovi, Caligus macrurus, Caligus malabaricus, Caligus mercatorus, Caligus minimus, Caligus mordax, Caligus mortis, Caligus mugilis, Caligus multispinosus, Caligus murrayanus, Caligus musaicus, Caligus mutabilis, Caligus nanhaiensis, Caligus nengai, Caligus nibeae, Caligus nolani, Caligus novocaledonicus, Caligus nuenonnae, Caligus obscurus, Caligus oculicola, Caligus ocyurus, Caligus oligoplitisi, Caligus olsoni, Caligus omissus, Caligus orientalis, Caligus oviceps, Caligus pagelli, Caligus pageti, Caligus pagri, Caligus pagrosomi, Caligus pampi, Caligus parvilatus, Caligus patulus, Caligus pauliani, Caligus pectinatus, Caligus pelagicus, Caligus pelamydis, Caligus penrithi, Caligus phipsoni, Caligus piscinus, Caligus placidus, Caligus platurus, Caligus platytarsis, Caligus polycanthi, Caligus pomacentrus, Caligus pomadasi, Caligus praetextus, Caligus priacanthi, Caligus productos, Caligus pseudokalumai, Caligus pseudoproductus, Caligus pterois, Caligus punctatus, Caligus quadratus, Caligus randalli, Caligus raniceps, Caligus rapax, Caligus rectus, Caligus regalis, Caligus remorae, Caligus reniformis, Caligus robustus, Caligus rotundigenitalis, Caligus rufimaculatus, Caligus russella, Caligus salmoneus, Caligus saucius, Caligus savala, Caligus schelegeli, Caligus schistonyx, Caligus sciaenops, Caligus selerotinosus, Caligus scribae, Caligus sensilis, Caligus sensorius, Caligus sepetibensis, Caligus seriolae, Caligus serratus, Caligus sibogae, Caligus sicarius, Caligus similis, Caligus spinosurculus, Caligus spinosus, Caligus stokes, Caligus stromatei, Caligus suffuscus, Caligus tanago, Caligus temnodontis, Caligus tenax, Caligus tenuicaudatus, Caligus tenuifurcatus, Caligus tenuis, Caligus teres, Caligus tetrodontis, Caligus thyrsitae, Caligus torpedinis, Caligus trachynoti, Caligus triabdominalis, Caligus triangularis, Caligus trichiuri, Caligus tripedalis, Caligus truttae, Caligus tylosuri, Caligus undulatus, Caligus unguidentatus, Caligus uranoscopi, Caligus validus, Caligus ventrosetosus, Caligus vexator, Caligus willungae, Caligus wilsoni, Caligus xystercus, Caligus zei, Caligus zylanica, Lepeophtheims europaensis, Lepeophtheims grohmanni, Lepeophtheims nordmannii, Lepeophtheims pectorales, Lepeophtheims salmonis, Lepeophtheims Thompson, eller Tigriopus japonicus.
Peptidet kan være konjugert til et antigent protein, for eksempel kan peptidet være kovalent konjugert til hemocyanin (KLH - keyhole limpet hemocyanin) fra Megathura crenulata, eller andre.
En vaksine mot infestering av fisk med kopepoder omfattende minst ett peptid er tilveiebrakt, der peptidet har minst 90 %, for eksempel 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 og 99 % identitet med sekvensene til SEQ ID NO. 17, SEQ ID NO. 18, SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 20, SEQ ID NO. 21, SEQ ID NO. 22, SEQ ID NO. 23, SEQ ID NO. 24, SEQ ID NO. 25, SEQ ID NO. 26, SEQ ID NO. 27 eller SEQ ID NO. 28; og eksipienter og adjuvanser. Adjuvansen kan være enhver kjent adjuvans, for eksempel Megathura crenulata hemocyanin (nøkkelhullsnegl) (H8283-Sigma), et renset saponin, gjær (3(1-3) D-glukaner, syntetiske eller naturlige mikrobielle derivater slik som monofosforyllipid A (MPL), virosomer, polylaktidglykolsyre-mikropartikler, Mycobacteriumphlei-celleveggskjelett, aminoalkylglukosaminidfosfat, syntetiske acetilerte monosakkarider, lipid A-derivater, flagelin, oligodeoksynukleotider som inneholder CpG-motiver, genetisk bakterielle modifiserte toksiner, koleratoksin fra Vibrio colerae, varmelabilt enterotoksin fra Escherichia coli, humane endogene immunmodulatorer, cytokin, kjemokiner, immunpotensiator, dobbelttrådet RNA, små immunpotensiatormolekyler slik som imikimod, resikimod.
Fortrinnsvis er vaksinen en emulsjon og eksipienten er en ikke-mineralsk olje Montanide ISA 763 Seppic. Fisk som skal behandles, kan være salmonider, slik som atlanterhavslaks ( Salmo Salar), regnbueørret ( Oncorhynchus mykiss), Coho-laks ( Oncorhynchus kisutch), bekkeørret ( Salmo truttd), eller Chinook-laks ( O. tshawytscha) ; og kopepodene kan være, uten begrensning Caligus absens, Caligus acanthopagri, Caligus aduncus, Caligus aesopus, Caligus affinis, Caligus furcatus, Caligus alaihi, Caligus alatus, Caligus amblygenitalis, Caligus angustatus, Caligus antennatus, Caligus arii, Caligus ariicolus, Caligus asperimanus, Caligus asymmetricus, Caligus atromaculatus, Caligus balistae, Caligus belånes, Caligus bennetti, Caligus berychis, Caligus biaculeatus, Caligus bicycletus, Caligus bifurcatus, Caligus bifurcus, Caligus biseriodentatus, Caligus bocki, Caligus bonito, Caligus brevicaudatus, Caligus brevicaudus, Caligus brevis, Caligus buechlerae, Caligus callaænsis, Caligus callyodoni, Caligus calotomi, Caligus carangis, Caligus caudatus, Caligus centrodonti, Caligus chaenichthyis, Caligus cheilodactyli, Caligus chelifer, Caligus chiastos, Caligus chorinemi, Caligus chrysophrysi, Caligus clavatus, Caligus clemensi, Caligus confusus, Caligus constrictus, Caligus cookeoli, Caligus cordiventris, Caligus cordyla, Caligus cornutus, Caligus coryphaenae, Caligus cossacki, Caligus costatus, Caligus cresseyorum, Caligus cristatus, Caligus crusmae, Caligus cunicephalus, Caligus curtus, Caligus cybii, Caligus dactylopteni, Caligus dactylus, Caligus dakari, Caligus dampieri, Caligus dasyaticus, Caligus debueni, Caligus deformis, Caligus diaphanus, Caligus dicentrarchi, Caligus dieuzeidei, Caligus digitatus, Caligus djedabae, Caligus dubius, Caligus eleutheronemi, Caligus elevatus, Caligus elongatus, Caligus engraulidis, Caligus enormes, Caligus epidemicus, Caligus epinepheli, Caligus equulae, Caligus eventilis, Caligus fistulariae, Caligus flexispina, Caligus fortis, Caligus fronsuganinus, Caligus fugu, Caligus furcisetifer, Caligus gayi, Caligus germoi, Caligus glacialis, Caligus glandifer, Caligus gracilis, Caligus grandiabdominalis, Caligus guerini, Caligus gurnardi, Caligus haemulonis, Caligus hamatus, Caligus hamruri, Caligus hemiconiati, Caligus hobsoni, Caligus hoplognathi, Caligus hottentotus, Caligus hyalinae, Caligus hyalinus, Caligus ignotus, Caligus inanis, Caligus infestans, Caligus inopinatus, Caligus irritans, Caligus isonyx, Caligus itacurussensis, Caligus jawahari, Caligus kabatae, Caligus kahawai, Caligus kala, Caligus kalumai, Caligus kanagurta, Caligus kapuhili, Caligus kirti, Caligus kirtiodes, Caligus klawei, Caligus kurochkini, Caligus kuwaitensis, Caligus labracis, Caligus lacustris, Caligus lalandei, Caligus laticaudus, Caligus latigenitalis, Caligus lotus, Caligus lepidopi, Caligus lessonius, Caligus lethrinicola, Caligus lichiae, Caligus ligatus, Caligus ligusticus, Caligus littoralis, Caligus lobodes, Caligus lolligunculae, Caligus longiabdominis, Caligus longicaudatus, Caligus longicaudus, Caligus longicervicis, Caligus longipedis, Caligus longipennatus, Caligus longirostris, Caligus longispinosus, Caligus lunatus, Caligus lutjani, Caligus macarovi, Caligus macrurus, Caligus malabaricus, Caligus mercatorus, Caligus minimus, Caligus mordax, Caligus mortis, Caligus mugilis, Caligus multispinosus, Caligus murrayanus, Caligus musaicus, Caligus mutabilis, Caligus nanhaiensis, Caligus nengai, Caligus nibeae, Caligus nolani, Caligus novocaledonicus, Caligus nuenonnae, Caligus obscurus, Caligus oculicola, Caligus ocyurus, Caligus oligoplitisi, Caligus olsoni, Caligus omissus, Caligus orientalis, Caligus oviceps, Caligus pagelli, Caligus pageti, Caligus pagri, Caligus pagrosomi, Caligus pampi, Caligus parvilatus, Caligus patulus, Caligus pauliani, Caligus pectinatus, Caligus pelagicus, Caligus pelamydis, Caligus penrithi, Caligus phipsoni, Caligus piscinus, Caligus placidus, Caligus platurus, Caligus platytarsis, Caligus polycanthi, Caligus pomacentrus, Caligus pomadasi, Caligus praetextus, Caligus priacanthi, Caligus productos, Caligus pseudokalumai, Caligus pseudoproductus, Caligus pterois, Caligus punctatus, Caligus quadratus, Caligus randalli, Caligus raniceps, Caligus rapax, Caligus rectus, Caligus regalis, Caligus remorae, Caligus reniformis, Caligus robustus, Caligus rogercresseyi, Caligus rotundigenitalis, Caligus rufimaculatus, Caligus russella, Caligus salmoneus, Caligus saucius, Caligus savala, Caligus schelegeli, Caligus schistonyx, Caligus sciaenops, Caligus scleroanosus, Caligus scribae, Caligus sensilis, Caligus sensorius, Caligus sepeabensis, Caligus seriolae, Caligus serratus, Caligus sibogae, Caligus sicarius, Caligus similis, Caligus spinosurculus, Caligus spinosus, Caligus stokes, Caligus stromatei, Caligus suffuscus, Caligus tanago, Caligus temnodontis, Caligus tenax, Caligus tenuicaudatus, Caligus tenuifurcatus, Caligus tenuis, Caligus teres, Caligus tetrodontis, Caligus thyrsitae, Caligus torpedinis, Caligus trachynoti, Caligus triabdominalis, Caligus triangularis, Caligus trichiuri, Caligus tripedalis, Caligus truttae, Caligus tylosuri, Caligus undulatus, Caligus unguidentatus, Caligus uranoscopi, Caligus validus, Caligus ventrosetosus, Caligus vexator, Caligus willungae, Caligus wilsoni, Caligus xystercus, Caligus zei, Caligus zylanica, Lepeophtheims europaensis, Lepeophtheims grohmanni, Lepeophtheims nordmannii, Lepeophtheims pectoralis, Lepeophtheims salmonis, Lepeophtheims thompsoni, Tigriopus japonicus, Paracyclopina nona.
En vaksine mot fiskeinfestering med kopepoder omfattende minst ett peptid er tilveiebrakt, der peptidet har minst 90 %, for eksempel 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 og 99 % identitet med sekvensene til SEQ ID NO. 17, SEQ ID NO. 18, SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 20, SEQ ID NO. 21, SEQ ID NO. 22, SEQ ID NO. 23, SEQ ID NO. 24, SEQ ID NO. 25, SEQ ID NO. 26, SEQ ID NO. 27 eller SEQ ID NO. 28; og eksipienter og adjuvanser. Adjuvansen kan være enhver kjent adjuvans, for eksempel Megathura crenulata hemocyanin (nøkkelhullsnegl) (H8283-Sigma), et renset saponin, gjær (3(1-3) D-glukan, syntetiske eller naturlige mikrobielle derivater slik som monofosforyllipid A (MPL), virosomer, polylaktidglykolsyre-mikropartikler, Mycobacterium phlei-celleveggskjelett, aminoalkylglukosaminidfosfat, syntetiske acetyl erte monosakkarider, lipid A-derivater, flagelin, oligodeoksynukleotider som inneholder CpG-motiver, genetisk bakterielle modifiserte toksiner, koleratoksin fra Vibrio colerae, varmelabilt enterotoksin fra Escherichia coli, humane endogene immunmodulatorer, cytokiner, kjemokiner, immunpotensiator dobbelttrådet RNA, små immunpotensiatormolekyler slik som imikimod, resikimod.
Peptidene kan være konjugert til et antigent protein, for eksempel KLH eller til ethvert
annet kjent antigent protein.
Ytterligere tilveiebrakt er anvendelsen av peptidet for fremstilling av en vaksine som induserer en immunrespons hos fisk, eller for fremstilling av en sammensetning som genererer dannelsen av en slimskjoldbeskyttelse hos fisk.
Ytterligere tilveiebrakt er en vaksine mot fiskeinfestering med kopepoder omfattende proteinene til SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, og SEQ ID NO. 3; eksipienter og adjuvanser.
En fremgangsmåte for å modulere en immunrespons hos fisk omfattende administrering til fisken en nødvendig mengde av en vaksine omfattende minst ett peptid valgt fra gruppen bestående av SEQ ID NO. 17, SEQ ID NO. 18, SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 20, SEQ ID NO. 21, SEQ ID NO. 22, SEQ ID NO. 23, SEQ ID NO. 24, SEQ ID NO. 25, SEQ ID NO. 26, SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO. 28; og eksipienter. Fremgangsmåten omfatter å administrere fra 1 til 500 ug peptid. Når vaksinen omfatter 4 peptider, administreres 1 til 500 ug av hvert peptid. Peptidet kan være konjugert til et antigent protein, for eksempel KLH.
En fremgangsmåte for å generere dannelsen av et slimskjold hos fisk omfattende å administrere til fisken en nødvendig mengde av en vaksine omfattende minst ett peptid som har minst 90 % identitet med en sekvens valgt fra gruppen bestående av SEQ ID NO. 17, SEQ ID NO. 18, SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 20, SEQ ID NO. 21, SEQ ID NO. 22, SEQ ID NO. 23, SEQ ID NO. 24, SEQ ID NO. 25, SEQ ID NO. 26, SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO. 28 og kombinasjoner derav; og eksipienter. For eksempel å administrere fra 1 til 500 ug av peptidet. Fisken kan være atlanterhavslaks ( Salmo Salar), regnbueørret ( Oncorhynchus mykiss) og Coho-laks ( Oncorhynchus kisutch), bekkeørret ( Salmo trutta) og Chinook-laks ( O. tshawytscha) og kopepodene kan tilhøre Caligidae-familien. Peptidet kan være konjugert til et antigent protein, for eksempel Keyhole Limpet Hemocyanin fra Megathura crenulata.
DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN
For den foreliggende oppfinnelsens formål henviser betegnelsen "vaksine" til en sammensetning som induserer en immunrespons hos et dyr, for eksempel hos fisk, og det henviser også til en sammensetning som induserer dannelsen av et slimskjold, der skjoldet er en biologisk beskyttelse mot infestering med kopepoder hos fisk. Effektanalyser ble utført med multimere proteiner fra vitellogenin-familien som kandidatimmunogener for å utvikle en ny vaksine mot C. rogercresseyi og andre kopepoder.
Kandidater for løselige proteiner som immunogener ble separert ved elektroforese på
8 % natriumdodekylsulfatpolyakrylamid-geler fra en suspensjon av homogeniserte voksne Caligus rogercresseyi- paiasitter.
Ved utsettelse for elektroforese på natriumdodekylsulfatpolyakrylamid-geler under ikke-reduksjonsbetingelser, ble 3 prominente bånd på 220 kDa (SEQ ID NO. 1), 212 kDa (SEQ ID NO. 2) og 173 kDa (SEQ ID NO. 3) fra de løselige proteinkonsentratene fra de homogeniserte voksne parasittene suspensjon observert. Under reduksjonsbetingelser ble 4 bånd som samsvarer med proteiner på 220 kDa, 173 kDa, 116 kDa og 97 kDa, observert (figur 1) .
Tryptisk spaltingsanalyse og matriseassistert laserdesorpsjon/-ionisering (Maldi-tof) av bånd ekstrahert fra gelen viste at de ulike peptidiske fraksjonene var svært homologe (>90 %) med aminosyresekvenser til multimere fosfolipoglykoproteiner fra vitellogenin-familien av kopepoder, slik som vitellogenin 1, vitellogenin 2 og vitellogenin-ligninger av henholdsvis Lepeophtheims salmonis, Trigiopus japonicus, og Paracyclopina nana.
Sekvenser til de peptidiske fraksjonene ble analysert ved bruk av informasjonen tilgjengelig i GenBank. Resultatene viste at det var en korrelasjon mellom de isolerte proteinene ifølge oppfinnelsen og kjente proteiner fra vitellogenin-familien (figur 2).
Tabell 1 viser at aminosyresekvensene til Vitellogenin 1 [Le<p>eo<p>htheims salmonis], Vitellogenin 2 [Le<p>eo<p>htheims salmonis] og Vitellogenin-lignende proteiner [Le<p>eo<p>htheims salmonis] spesifiserer de identifiserte peptidenes homologi med de isolerte proteinene fra Caligus rogercresseyi.
Peptider oppnådd fra spaltingen av isolerte proteiner fra Caligus rogercresseyi ifølge oppfinnelsen korrelerte med kjente proteiner som tilhører vitellogenin-familien. Figur 2 viser sekvensene til Vitellogenin 1 [Le<p>eo<p>htheims salmonis'], Vitellogenin 2 [Le<p>eo<p>htheims salmonis] og Vitellogenin-lignende proteiner [Le<p>eo<p>htheims salmonis]. Peptidene som viste seg å være en del av aminosyresekvensene til proteinene ifølge oppfinnelsen, er identifisert.
De isolerte proteinene fra C. rogercresseyi ble brukt til å fremstille ulike vaksiner for immunisering av fisk (ørret), der vaksinene omfatter: Vaksine A: omfatter 1 ug av hvert av de følgende proteinene: 220 kDa (SEQ ID NO. 1), 212 kDa (SEQ ID NO. 2) og 173 kDa (SEQ ID NO. 3) i en oljeemulsjon formulert med
Montanide ISA 763 Seppic ikke-mineralsk olje (70 % volum/volum olje - 30 % volum/volum vann), og 10 ug Megathura crenulata hemocyanin (nøkkelhullsnegl)
(H8283-Sigma).
Ikke-spesifikk kontroll sammensetning: Hver dose inneholdt 3 ug BmSS (BmSS rekombinant protein fra Boophilus microplus gutj i en oljeemulsjon formulert med Montanide ISA 763 Seppic ikke-mineralsk olje (70 % volum/volum olje - 30 % volum/volum vann) og 10 u<g>Megathura crenulata hemocyanin (nøkkelhullsnegl)
(H8283-Sigma).
Adjuvanskontrollsammensetninger: Hver dose inneholdt 30 ug PBS i en oljeemulsjon formulert med Montanide ISA 763 Seppic ikke-mineralsk olje (70 % volum/volum olje - 30 % volum/volum vann) og 10 ug Megathura crenulata hemocyanin (nøkkelhullsnegl) (H8283-Sigma).
PBS-kontrollsammensetning: Hver dose inneholdt bare 100 ul PBS.
Etter inokulering av fisk med vaksinen eller deres kontroller, ble fisken provosert med en infeksjon med C. rogercresseyi
Under fiskeimmuniserings-, provokasjons- og overvåkingsperioder ble det observert at vaksinene ikke forårsaket lokale, systemiske, inflammatoriske og/eller granulomatøse reaksjoner på administreringsstedet. Vaksinene viste seg ufarlige og trygge. Ingen av sammensetningene eller vaksinene modifiserte fiskens atferd eller appetitt.
For å verifisere kopepodenes fikseringsgrad ble det utført en telling av parasitteksemplarer 72 timer etter provokasjon på alle de provoserte fiskene. Kopepoditter var fiksert med den forventede raten. Vaksinenes beskyttelsesgrad ble uttrykt som reduksjonsprosenten av antall parasittiske stadier etter provokasjon hos ørret immunisert med hver av vaksinene sammenlignet med kontroller.
En signifikant og gradvis økning av utvikling av juvenile stadier og voksne av kopepodparasitter ble observert i kontrollgruppene. Bare vaksine A ifølge oppfinnelsen viste seg svært effektiv i å redusere antallet juvenile og voksne eksemplarer. Denne vaksinen viste en beskyttelse på fra 70 til 75 % avhengig av stadiet. I dammer med fisk behandlet med en ikke-spesifikk kontroll sammensetning nådde beskyttelse bare 25 og 32 %, mens i dammer med fisk behandlet med adjuvanskontrollsammensetning nådde beskyttelsen bare 19 til 20 %, i begge tilfeller i forhold til PBS-kontrollen (fig. 3).
Gjennomsnittlig abundans ble beregnet som gjennomsnittet av voksne hann- og hunnparasitter per fisk, tatt i betraktning det totale antallet fisker i hver gruppe (fig. 4). Det gjennomsnittlige antallet voksne hann- og hunnparasitter per fisk i PBS-kontrollgruppen var fra 4,1 til 4,6 ganger høyere enn antallet detektert hos fisk behandlet med vaksine A ifølge oppfinnelsen. Fisk immunisert med vaksine A viste mindre forskjell i abundans mellom hanner og hunner.
En sammenligning mellom det gjennomsnittlige antallet voksne hann- og hunnparasitter funnet i PBS-kontrollgruppen og i gruppene behandlet med ikke-spesifikke kontroll sammensetninger og adjuvanskontroll tilveiebrakte ingen signifikante forskjeller.
Det ble observert at immunisering med vaksine A og etterfølgende provokasjon av den vaksinerte fisken forårsaket en 75 % reduksjon i infesteringen med C. rogercresseyi, og videre at denne sammensetningen eller vaksinen viste seg å være trygg, ufarlig og effektiv.
Figur 5 viser spesifikke antistofftitere detektert ved ELISA i serum fra dyr behandlet med de ulike vaksinene. Bare vaksine A viste seg å være immunogen, og viste en signifikant forskjell med hensyn til antistofftitere for fisk inokulert med ikke-spesifikke, adjuvans- og PBS-kontroller.
For å bestemme eksistensen av antistofftitere i gruppen med fisk behandlet ifølge figur 5, ble fiskene tappet for blod på ulike tidspunkter, og sera ble analysert ved ELISA som beskrevet i eksemplene. Som det kan ses i figur 5 var det bare vaksine A ifølge oppfinnelsen som induserte en spesifikk immunrespons som varte i minst 120 dager og var signifikant høyere enn den indusert av kontrollsammensetningene.
Den foreliggende oppfinnelsen vedrører også peptider og kombinasjoner derav, konjugert eller ikke, i en oljet sammensetning eller vaksine for forebygging og/eller aktivering av en humoral immunrespons hos salmonider. Peptidene, eller en kombinasjon derav, øker slimtykkelse, antallet og diameteren til sekretoriske celler og epitel tykkelse, for derved å generere et biologisk skjold eller slim mot infesteringer med patogener, for eksempel med fiskelus C. rogercresseyi, for således å redusere med 80 %
(i forhold til kontrollen) antallet fiskelus i juvenile stadier og voksne etter provokasjon
med parasitten hos de behandlede salmonidene.
Som tidligere nevnt tilhører proteinene ifølge oppfinnelsen identifisert ved massespektroskopi med molekylvekter på 220 kDa (SEQ ID NO. 1), 212 kDa (SEQ ID NO. 2) og 173 kDa (SEQ ID NO. 3) multimerer i vitellogenin-familien.
For å finne immunogene peptider i proteinsekvensen ble det utført en analyse for å predikere lineære B-epitoper med BepiPred 1.0b (Danmarks Tekniske Universitet) i 220 kDa-proteinet (Vitellogenin 1 [Le<p>eo<p>htheims salmonis] (SEQ ID NO. 1). Tolv peptider ble valgt. Deres sekvens er den som vises i figur 6. De valgte peptidene ble også konjugert til et hemocyanin ekstrahert fra bløtdyret betegnet nøkkelhullsnegl (KLH - Keyhole limpet hemocyanin [ Lapa californiana]).
Peptidsekvenser brukt til fremstilling av vaksinene var som følger:
Peptid 1: GYSPSYYGWAPSKEYVYEFE (SEQ ID NO. 17). MV: 2525,75 D
Cystein ble tilsatt til COOHt, og det ble konjugert til KLH.
Peptid 2: ESLFVEKDEPVWTNWKKALL (SEQ ID NO. 18). MV: 2548,01
Cystein ble tilsatt til COOHt, og det ble konjugert til KLH.
Peptid 3: SQKEIHEVMEESGRACTGKQ (SEQ ID NO. 19) MV: 2282,70
Det ble konjugert til KLH ved cysteinet til sekvensen.
Peptid 4: STVSHQIPKPKTPKTVGNLF (SEQ ID NO. 20) MV: 2282,70.
Cystein ble tilsatt til COOHt, og det ble konjugert til KLH.
Peptid 5: KTLKAKSPQLYYVSTVSFSD (SEQ ID NO. 21) MV: 2282,70
Cystein ble tilsatt til COOHt, og det ble konjugert til KLH.
Peptid 6: QKITQKLQITPRTLQEPELS (SEQ ID NO. 22) MV: 2282,70
Cystein ble tilsatt til COOHt, og det ble konjugert til KLH.
Peptid 7: HGLPFKYTKTRNFVDVQSVAPTASGFPVRIQ (SEQ ID NO. 23) MV: 2282,70
Cystein ble tilsatt til COOHt, og det ble konjugert til KLH.
Peptid 8: CSQSSTNTVNPNTCEEKERS (SEQ ID NO. 24) MV: 2282,70
Det ble konjugert til KLH ved cysteinet til sekvensen.
Peptid 9: PVNESSGSSTPPSSTPGPLL (SEQ ID NO. 25) MV: 2282,70
Cystein ble tilsatt til COOHt, og det ble konjugert til KLH.
Peptid 10: SCQGIPTPEEKTKFEKESHE (SEQ ID NO. 26) MV: 2282,70
Det ble konjugert til KLH ved cysteinet til sekvensen.
Peptid 11: PTTYNRMIEEASNCQSSSSSGSGMGGGS (SEQ ID NO. 27) MV: 2282,70. Det ble konjugert til KLH ved cysteinet til sekvensen.
Peptid 12: SSPSSSDSSSHHAQPSTGRFQ (SEQ ID NO. 28) MV: 2282,70
Cystein ble tilsatt til COOHt, og det ble konjugert til KLH.
Peptid 1 til 4 motsvarer den aminoterminale sekvensen, peptid 5 til 8 motsvarer mellomregionen og peptid 9 til 12 motsvarer den karboksylterminale regionen av vitellogenin 1-proteinet (SEQ ID NO. 1) til Lepeophtheims salmonis.
Under immuniserings-, provokasjons- og overvåkingsperiodene for fisken ble det observert at vaksinene ikke forårsaket lokale, systemiske, inflammatoriske og/eller granulomatøse reaksjoner på administreringsstedet.
Vaksine 1 ifølge oppfinnelsen omfatter 50 ug av hvert av de konjugerte peptidene 1-4 (peptider til SEQ ID NO. 17, SEQ ID NO. 18, SEQ ID NO. 19, og SEQ ID NO. 20);
Vaksine 2 ifølge oppfinnelsen omfatter 50 ug av hvert av de konjugerte peptidene 5-8 (peptider til SEQ ID NO. 21, SEQ ID NO. 22, SEQ ID NO. 23, og SEQ ID NO. 24);
Vaksine 3 ifølge oppfinnelsen omfatter 50 ug av hvert av de konjugerte peptidene 9-12 (peptider til SEQ ID NO. 25, SEQ ID NO. 26, SEQ ID NO. 27, og SEQ ID NO. 28);
Hver av vaksinene ble fremstilt som en emulsjon i Montanide ISA 763 Seppic ikke-mineralsk olje (70 % volum/volum olje - 30 % volum/volum vann) og 10 ug hemocyanin keyhole limpet ^ Megathura crenulata (H8283-Sigma) til et endelig volum på 0,05 ml.
Vaksine 5 ifølge oppfinnelsen omfatter 50 ug av hvert av de ikke-konjugerte peptidene 1-4 (peptider til SEQ ID NO. 17, SEQ ID NO. 18, SEQ ID NO. 19, og SEQ ID NO. 20);
Vaksine 6 ifølge oppfinnelsen omfatter 50 ug av hvert av de ikke-konjugerte peptidene 5-8 (peptider til SEQ ID NO. 21, SEQ ID NO. 22, SEQ ID NO. 23, og SEQ ID NO. 24);
Vaksine 7 ifølge oppfinnelsen omfatter 50 ug av hvert av de ikke-konjugerte peptidene 9-12 (peptider til SEQ ID NO. 25, SEQ ID NO. 26, SEQ ID NO. 27, og SEQ ID NO. 28).
Hver av vaksinene ble fremstilt som en emulsjon i Montanide ISA 763 Seppic ikke-mineralsk olje (70 % volum/volum olje - 30 % volum/volum vann) og 10 ug hemocyanin keyhole limpet ^ Megathura crenulata (H8283-Sigma) til et endelig volum på 0,05 ml.
Sammensetning 8 er adjuvanskontrollsammensetningen: Hver dose inneholdt 30 ug PBS i en oljeemulsjon formulert med Montanide ISA 763 Seppic ikke-mineralsk olje (70 % volum/volum olje - 30 % volum/volum vann) og pluss 10 ug Megathura crenulata hemocyanin (nøkkelhullsnegl) (H8283-Sigma).
Sammensetning 9 motsvarer PBS-kontrollsammensetningen: Hver dose av PBS-kontrollvaksinen inneholdt bare 0,05 ul PBS.
Vaksinene var alle ufarlige og trygge. Ingen av sammensetningene eller vaksinene modifiserte fiskens atferd eller appetitt.
En telling av parasitteksemplarer ble utført 72 timer etter provokasjon hos alle de provoserte fiskene for å måle fiksering. Kopepoditter var fiksert med den forventede raten. Vaksinenes beskyttelsesgrad ble uttrykt som prosent reduksjonen av parasittiske stadier etter provokasjon hos laks immunisert med hver av vaksinene sammenlignet med kontroller.
Vaksine 1 og A viste seg å være de mest effektive. Vaksine 1 viste en reduksjon på henholdsvis 81 % og 77,7 %, og vaksine A på 72 og 68,5 % i antallet juvenile og voksne eksemplarer. Vaksine 2, 3, 4, 5, 6 og 7 viste mindre reduksjon i antallet
eksemplarer (fig. 7).
Tellinger utført i dammer med fisk immunisert med vaksine 2 og 3 viste 11-24,2 % og 25-35,4 % effekt sammenlignet med kontrollen med PBS (fig. 7). En beskyttelse på henholdsvis 18-28 %, 22-27 % og 28-24 % ble observert hos kontroller formulert med ikke-konjugerte peptider (vaksine 5-6-7), mens adjuvanskontrollsammensetningen viste 18-20 % mindre enn PBS-kontrollen (fig. 7).
I tillegg ble gjennomsnittlig abundans per fisk bestemt. Gjennomsnittlig abundans motsvarer mengden voksne hann- og hunnparasitter funnet hos hver fisk sammenlignet med det totale antallet hos alle fisker i hver gruppe. Antallet voksne hann- og hunnparasitter funnet per fisk i PBS-kontrollgruppen var 5,5 og 3,88 ganger mer enn det som ble detektert hos fisk behandlet med vaksine 1 som omfattet peptid 1-4 konjugert med KLH, der den siste vaksinen viste den minste differansen i gjennomsnittlig abundans mellom hann- og hunnparasitter (fig. 8).
En sammenligning av gjennomsnittlig abundans i PBS-kontrollgruppen med den for vaksine A viser en abundans 3,6 og 2,84 ganger høyere enn den siste. De observerte forskjellene var statistisk signifikante.
Det ble ikke observert noen signifikante forskjeller mellom antallet voksne hann- og hunnparasitter i PBS-kontrollgruppen og adjuvanskontrollgruppene og vaksine 5, 6 og 7. Det var imidlertid en relativt lavere abundans i gruppen behandlet med vaksine 2 og 3 sammenlignet med PBS-kontrollen.
Det ble observert at gjennom immunisering med peptid 1-4 av den aminoterminale delen av C rogercresseyi-<p>rotemet på 220 kDa (SEQ ID NO. 1) konjugert med KLH ble det oppnådd en 78 % reduksjon av infestering indusert gjennom provokasjon med infestering av C rogercresseyi, og i tillegg er denne vaksinen trygg, ufarlig og effektiv.
Det ble videre observert at effekten til vaksine 1 er noe overlegen den som ses hos fisk immunisert med vaksine A omfattende fullstendige proteiner. Videre er syntesen av slike små peptider, for eksempel ved fastfaseteknikker, en automatisert prosess og utføres enkelt. Konjugering med transportproteiner, for eksempel KLH, induserer en forbedret immunologisk respons og en adekvat beskyttelse for laks infestert med C rogercresseyi.
Sera ble titrert i 2-gangers seriefortynninger fra l:4-fortynningene. Variasjonskoeffisienten for positive og negative sera ble beregnet i 12 bestemmelser som en intra-assay repeterbarhetsrate, som resulterte i verdier fra 4 til 19 %.
Resultatene viser at immunisering av atlanterhavslaks med en dose på 200 ug av peptid 1-4 (vaksine 1) induserer høye titere med spesifikke serumantistoffer, detektert ved ELISA (fig. 9). En enkelt immunisering i vaksinert fisk var nok til å indusere serumtitere høyere enn 1,5 og 2 log mellom 20 og 40 dpv, hvilket økte til 3 log under immuniseringsforløpet. Serumtitere oppnådd fra fisk behandlet med vaksine 1 ble korrelert med en økning i spesifikke antistoffnivåer funnet i gruppen med fisk vaksinert med vaksine A. Vaksine 2-3-5-6 og 7 induserte lignende og lavere serumtitere enn de som ble observert med vaksine 1 og A. Kontroller med PBS og adjuvans induserte ikke en spesifikk antistoffrespons hos vaksinert fisk (fig. 9).
Nivået av spesifikke antistoffer ble bestemt ved å måle absorbans ved 405 nm i slim ekstrahert fra vaksinert fisk (fig. 10). Prøver ble analysert uten fortynning. Resultatene viser for eksempel at en enkelt immunisering av atlanterhavslaks med 200 ug av peptid \- A formulert med hemocyanin i ikke-mineralsk olje (vaksine 1) induserte produksjon av spesifikke antistoffer i slim som økte i løpet av immuniseringsperioden. Disse nivåene av antistoffer oppnådd ved immunisering av fisk med vaksine 1 ble korrelert med økningen i spesifikke antistoffnivåer funnet i slim fra gruppen med fisk vaksinert med vaksine A. Vaksine 2-3-5-6 og 7 induserte lavere nivåer av antistoffer. Kontroller med PBS og adjuvans induserte ikke spesifikk antistoffrespons i slim fra ubehandlet kontrollfisk (fig. 10).
Det vil være åpenbart for fagmannen at peptidene og vaksinene ifølge oppfinnelsen kan brukes til immunisering mot enhver type kopepod, gitt at peptidene som brukes til dette, er omfattet i vitellogenin 1 fra for eksempel Lepeophtheims salmonis eller andre kjente kopepoder.
Tilstedeværelsen av spesifikke antistoffer i serum og slim fra fisk vaksinert med vaksine 1 og A er korrelert med en signifikant reduksjon i infesteringsprosent etter provokasjon av fisk med C. rogercresseyi. Vaksinen formulert med peptid 1-4 viste de beste resultatene. Disse resultatene antyder sterkt at detektering av serum-slim-antistoffer er et avgjørende verktøy for å demonstrere en vaksines potens, og at det er en korrelasjon mellom effektiv beskyttelse (som prosent reduksjon av infestering) og immunrespons (fig. 11).
Histologiske studier som evaluerer antallet slimutskillende celler, deres diameter, og tykkelse på epitel ble også utført ved analysering av tre felt per strimmel. En statistisk behandling av resultatene ble utført ifølge Kruskal Wallis-testen for forskjeller i medianene. På lignende vis ble det gjort korrelasjoner mellom reduksjon av infestering ved provokasjon med C rogercresseyi og SHIELD (skjold)-effekten dannet ved variasjon i antallet og diameteren til slimproduserende celler, samt variasjon av veggtykkelse. (Tabell 2 til 9)
På tidspunkt 0 ble histologiske prøver tatt fra fiskens abdominale og laterale sone farget med den samme intensiteten både PAS- og for PAS-Alcian Blue-farging, med prevalens av nøytrale mukopolysakkarider. Mellom dag 10 og 50 etter vaksinasjon ble slimet til fisken immunisert med Vaksine 1 og Vaksine A tykkere og surere (figur 12 og 13)
Tykkelsen på epitelet og antallet PAS+-celler viste ikke signifikante forskjeller mellom dag 0 og dag 20. Disse observasjonene er beskrevet i tabell 2 til 9 og er også vist i figur 12 og 13.
Ved dag 30 etter vaksinasjon ble det observert en signifikant fortykning av epitelet, samt en økning i antallet og diameteren til slimutskillende celler PAS+ i gruppene behandlet med vaksine 1 og A sammenlignet med dag 0 og sammenlignet med kontrollene (PBS og adjuvans). I tilfellet med vaksine 2-3-5-6 og 7 var verdiene lavere enn de som ble observert for vaksine 1 og A. Immunogen stimulering forårsaket også hyperplasi av begerceller.
På dag 40 etter vaksinasjon ble det observert aktivering av makrofager og en økning av lymfocyttisk infiltrasjon, og de ble ledsaget av en økning av spesifikke serumantistofftitere. På dag 50 etter vaksinasjon ble immunresponsen potensielt, hvilket ytterligere økte epiteltykkelsen, antallet PAS+-celler og deres diameter, hovedsakelig, men ikke utelukkende, hos fisk behandlet med vaksine 1 og A.
Fra dag 80 til dag 120 etter vaksinasjon ble det observert en signifikant økning i antallet og diameteren til celler, som opprettholder de samme verdiene som ble observert under provokasjon. En relativt signifikant økning av epiteltykkelse ble registrert sammenlignet med data fra dag 50.
Det var ingen statistisk signifikante forskjeller i epiteltykkelse, antall PAS+-celler og deres diameter i kontrollfisk. Det var imidlertid små variasjoner i fisk behandlet med vaksine 2-3-5-6 og 7.
Det vil være åpenbart for fagmannen at peptidene og vaksinene ifølge oppfinnelsen kan brukes som sammensetninger som er nyttige for å generere et slimskjold, og, som det er vist, reduserer slimskjoldet infestering med kopepoder hos behandlet fisk.
Denne oppfinnelsen er bedre illustrert i de følgende eksemplene, som ikke skal fortolkes som å begrense dens omfang. Tvert imot skal det klart forstås at andre utførelsesformer, modifikasjoner og ekvivalenter derav kan være mulige etter lesing av den foreliggende beskrivelsen, som kan være foreslått av en fagmann uten å avvike fra den foreliggende oppfinnelsens formål og/eller omfanget til de medfølgende kravene.
Eksempler
Eksempel 1: Isolering, prosessering, analyse og identifikasjon av proteiner og peptider
Proteiner ble isolert fra en suspensjon med 0,5 g voksne eksemplarer av C. rogercresseyi i PBS-Tween 0,05 %. Prøver ble frosset og homogenisert ved hjelp av en Precellys 24 vevshomogeniserer (Bertin Technologies-France) ved bruk av 2 ml rør inneholdende keramiske kuler og glasskuler (forhåndsfylte kulerør kat. nr. 03119.200.RD000 Precellys-France). To sykluser på 50 sek ved 6000 rpm ble utført, og så ved 5000 rpm i 15 min i en sentrifuge (Eppendorf Refrigerated Microcentrifuge Model 5417 R-USA). Supernatanten ble samlet inn og så konsentrert med CentriPlus YM50 (grenseverdi > 50 kDa) (Millipore-Fisher Sei) ved 2500 rpm i en Sorvall-sentrifuge med SS34-rotor.
De innsamlede løselige proteinene ble separert ved elektroforese på 8 % natriumdodekylsulfatpolyakrylamid-geler under reduksjons- og ikke-reduksjonsbetingelser og farget med Coomassie Brilliant Blue G-250 som beskrevet av Laemmli et al 1970.
Tryptisk spalting etterfulgt av massespektrometri og Maldi-tof (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization- time of flight).
Bånd ekstrahert fra en 8 % natriumdodekylsulfatpolyakrylamid-gel ble avfarget ved hjelp av metanol-eddiksyre (20:7), fortynnet i 0,1 M med ammoniumkarbonat pH 8,0 og så redusert med 10 mM Ditiotreitol i 30 minutter ved romtemperatur, etterfulgt av alkylering med 50 mM jodacetamid. Tryptisk spalting og bidimensjonal separasjon ble utført ifølge Cordwell et al 1999. Et Thermo Electron LTQ-FT-spektrometer med et Protana-nanospraysystem som ionekilde ble brukt til massespektrometri. Phenomenex Jupiter 10/C18 reversfasekolonner ble brukt som interfase. Prøvene utsatt for tryptisk spalting ble injisert i kolonnen og peptider ble eluert med 0,1 M eddiksyre - 100 % acetonitril med en gradientstrømning på 0,4 ul/min i løpet av 2 timer. Nanospraykilden ble operert ved 2,5 kV. Analyse ved tryptisk spalting og massespektrometri Maldi-tof av de gel-ekstraherte båndene avslørte at ulike peptidiske fraksjoner var oppnådd som ble analysert ved hjelp av Sequest-algoritmen og NCBI NR -2006-databasen.
Eksempel 2: Fremstilling av konjugerte peptider
Konjugerte peptider ble oppnådd ved hjelp av fastfase kjemisk syntese (SPPS)-teknikker. SPPS følger et generelt mønster med repetitive sykluser av kobling-vasking-avbeskyttelse-vasking. Den frie aminoterminale enden av et peptid bundet til en fastfase ble koblet til én enkelt N-beskyttet aminosyreenhet. Denne enheten ble så avbeskyttet, for derved å vise en ny aminoterminal ende som kan binde til en annen aminosyre.
Konjugeringen til KLH ble utført gjennom den frie cysteingruppen eller ved tilsetning ved hjelp av MBS-metoden (m-maleimidobenzoyl-N- hydroksysukkinimid Ester eller aktivert maileimid) som er foretrukket for kobling av aminosyrer ifølge Hermanson. Peptidene ble sekvensert ved hjelp av fremgangsmåten beskrevet av Merrifield
Eksempel 3: Fremstilling av vaksinene
Vaksine A: Tre løselige proteiner med høy molekylvekt ble valgt fra parasitthomogenatet. Proteinkvantifisering ble utført ved densitometri i et densitometer UV-P-system med BSA (V-Sigma-fraksjon) som referanse. Hver dose med vaksine A inneholdt 1 ug av hvert av proteinene på 220465,60 Da (SEQ ID NO. 1), 212947,00 Da (SEQ ID NO. 2) og 173132,50 Da (SEQ ID NO. 3) i en oljeemulsjon formulert med Montanide ISA 763 Seppic ikke-mineralsk olje (70 % volum/volum olje - 30 % volum/volum vann), og 10 ug hemocyanin keyhole limpet fra Megathura crenulata (H8283-Sigma).
Ikke-spesifikk kontroll sammensetning: BmSS rekombinant protein fra Boophilus microplus- taxm ble brukt, som er svært immunogent og beskyttende i bovin infestering med hjemmehørende flått. Hver dose med vaksine inneholdt 3 ug BmSS i en oljeemulsjon formulert med Montanide ISA 763 Seppic ikke-mineralsk olje (70 % volum/volum olje - 30 % volum/volum vann) og 10 ug Megathura crenulata hemocyanin (nøkkelhullsnegl) (H8283-Sigma).
Adjuvanskontrollsammensetninger: Hver dose med vaksineadjuvanskontroller inneholdt 30 ug PBS i en oljeemulsjon formulert med Montanide ISA 763 Seppic ikke-mineralsk olje (70 % volum/volum olje - 30 % volum/volum vann) og 10 ug Megathura crenulata hemocyanin (nøkkelhullsnegl) (H8283-Sigma).
PBS-kontroll: Hver dose med PBS-kontrollvaksine inneholdt bare 100 ul PBS.
Så snart peptidene var oppnådd, ble en del av det samme konjugert med det antigene proteinet KLH ved bruk av en væskefasekonjugeringsmetode slik som den beskrevet i eksemplene. Følgende vaksiner ble fremstilt: Vaksine 1 omfattet 50 ug av hvert av de konjugerte peptidene 1-4 (peptider til SEQ ID NO. 17, SEQ ID NO. 18, SEQ ID NO. 19, og SEQ ID NO. 20);
Vaksine 2 omfattet 50 ug av hvert av de konjugerte peptidene 5-8 (peptider til SEQ ID NO. 21, SEQ ID NO. 22, SEQ ID NO. 23, og SEQ ID NO. 24);
Vaksine 3 omfattet 50 ug av hvert av de konjugerte peptidene 9-12 (peptider til SEQ ID NO. 25, SEQ ID NO. 26, SEQ ID NO. 27, og SEQ ID NO. 28);
Hver vaksine ble fremstilt som en emulsjon i Montanide ISA 763 Seppic ikke-mineralsk olje (70 % volum/volum olje - 30 % volum/volum vann) og 10 ug hemocyanin keyhole limpet fraMegathura crenulata (H8283-Sigma) til et endelig volum på 0,05 ml.
Vaksine 5 omfattet 50 ug av hvert av de ikke-konjugerte peptidene 1-4;
Vaksine 6 omfattet 50 ug av hvert av de ikke-konjugerte peptidene 5-8;
Vaksine 7 omfattet 50 ug av hvert av de ikke-konjugerte peptidene 9-12.
Hver av dem ble fremstilt som en emulsjon i Montanide ISA 763 Seppic ikke-mineralsk olje (70 % volum/volum olje - 30 % volum/volum vann) og 10 ug hemocyanin keyhole limpet fraMegathura crenulata (H8283-Sigma) til et endelig volum på 0,05 ml.
Sammensetning 8, adjuvanskontroller: Hver dose med vaksineadjuvanskontroller inneholdt 30 ug PBS i en oljeemulsjon formulert med Montanide ISA 763 Seppic ikke-mineralsk olje (70 % volum/volum olje - 30 % volum/volum vann) og pluss 10 ug Megathura crenulata hemocyanin (nøkkelhullsnegl) (H8283-Sigma).
Sammensetning 9, PBS-kontroll: Hver dose med PBS-kontrollvaksine inneholdt bare 0,05 ml PBS.
Eksempel 4: Analyser i fisk og provokasjon:
Analysen inkluderte artene som er mest sensitive overfor C. rogercresseyi: regnbueørreter (Oncorhynchus mykiss) på 30 g fri fra infestering (n = 50/gruppe) uten tidligere vaksinasjon og uten antibiotikabehandling før studien startet.
Gruppe 1 ble vaksinert med vaksine A, gruppe 2 med den ikke-spesifikke kontroll sammensetningen, gruppe 3 med adjuvanskontrollsammensetningen og gruppe 4 bare med PBS.
Analysene ble utført ved akvakulturenheten i byen Mercedes [ Unidadde Acuicultura de la ciudad de Me/*cefifes](provinsen Buenos Aires, Argentina). Dyrene ble akklimatisert i løpet av 4 dager i dammer på 200 1 ferskvann ved en temperatur på 17-20 °C, med 5 mg/l oksygen (minimum), med en omsetningsrate på 1 l/time og med en tetthet på opptil 20kg/m3.
Fisker ble anestetisert med 20 % benzokain med en dose på 50 ppm. En enkelt immunisering ble utført (0,1 ml/fisk) intraperitonealt i den ventrale midtlinjen ved bruk av en 1 ml sprøyte og 25G x 5/8" nål. Kontrollgruppen ble vaksinert med 0,1 ml/fisk med sterilt PBS og merket med et kutt i fettfinnen for senere identifisering. Ingen reaksjoner på injeksjonsstedet / vevsskade / overlevelse ble observert. Etter vaksinasjonen ble fiskene plassert i identifiserte dammer der de ble værende uten stressende forhold inntil deres immuniseringsperiode var fullført. Ved 450-500 UTA ble fisker flyttet til dammer med sjøvann (25 ppt), før provokasjonen med infiserende stadier av C. rogercresseyi. Temperaturen ble overvåket daglig gjennom hele denne perioden.
I løpet av dagene med tilpasning og i løpet av immuniseringsperioden ble fiskene matet med en kommersiell diett på 3,5 % kroppsvekt hver dag. Immuniseringsplan og prøvetaking er vist i figur 14.
Serum- og slimprøver ble tatt før vaksinasjon, på provokasjonstidspunktet og hver 10. dag etter dette for å bestemme immunresponsen på vaksinen. Gjennomsnittlig parasittbelastning for provosert fisk ble bestemt.
Provokasjon med C . rosercresseyi
For kulturen med C rogercresseyi, spesifikt stadiet med små kopepoder, ble eggbærende hunner samlet inn ukentlig fra et filter på et oppdrettsanlegg for atlanterhavslaks ved bruk av pinsett med spiss. Prøver ble sendt til laboratoriet transportert i plastbeholdere som inneholdt sjøvann, med konstant luftesystem. Etter klekking ble larvestadiene trukket ut og plassert i begre som inneholdt 600 ml filtrert og sterilisert sjøvann under konstant lufting. De ble holdt i et Hotcold-S-kulturkammer ved en gjennomsnittlig temperatur på 13 °C, inntil kopepoditter dukket opp. Så snart infeksiøse stadier var oppnådd, ble telling utført i et Neubauer-kammer, og konsentrasjon av eksemplarene på 4000 kopepoditter / 600 ml filtrert vann.
Provokasjon fant sted da fisken nådde 600UTA, så introduksjon av 4000 kopepoditter (i det spesifiserte mengden filtrert sjøvann) inn i hver 50 fisker/dam, og forventende en 50 % fikseringsrate. Mengden vann ble redusert til 50 %, oksygenbobling og vannstrømning ble stoppet i 6 timer etter infisering (statisk strømning), og etter dette ble de gjenopptatt og vannstrømningsraten ble holdt på 0,5 liter/time for å unngå å påvirke fiksering av C rogercresseyi.
Parasittbelastning etter provokasjon og reduksjonseffekt av C rogercresseyi-belastninger ble bestemt i vaksinerte versus kontrollgrupper på fikseringstidspunktet, på tidspunktet for utvikling av juvenile stadier (Chalimus L II, IO) og ved utvikling av chalimus IV, voksne hunner og hanner.
Behandling med peptidvaksiner
Behandlingen ble utført i den mest kommersialiserte arten, atlanterhavslaks ( Salmo salar), ved bruk av 30 g eksemplarer fri for infestering (n = 50/gruppe) uten forutgående vaksinering, uten en historikk med nylig tilstand og uten antibiotikabehandlinger før oppstart av analysen. Analysene ble utført ved akvakulturenheten i byen Mercedes [ Unidad de Acuicultura de la ciudad de Mercedes](provinsen Buenos Aires, Argentina). Fisker ble anestetisert med 20 % benzokain med en dose på 50 ppm. En enkelt immunisering ble utført (0,1 ml/fisk) intraperitonealt i den ventrale midtlinjen ved bruk av en 1 ml sprøyte og 25G x 5/8" nål. Kontrollgruppen ble vaksinert med 0,1 ml/fisk med sterilt PBS og merket med et kutt utført i fettfinnen for senere identifisering. Ikke noen reaksjoner på injeksjonsstedet / vevsskade / overlevelse ble observert. Provokasjon ble utført da atlanterhavslaksen nådde en vekt på 80 g, ved 600UTA.
Eksempel 5: Serum og histologjske analyser
Serum- og slimprøver ble samlet inn for å teste spesifikke antistofftitere ved hjelp av en ELISA fra dag 0 eller pre-immun, opptil 10, 20, 30, 40 dager, på provokasjonstidspunktet (50 dager) og hver 10. dag etter provokasjon frem til 120 dager etter vaksinasjon (dpv).
Proteiner på 220 kDa (SEQ ID NO. 1), 212 kDa (SEQ ID NO. 2) og 173 kDa (SEQ ID NO. 3) ble brukt som fengslingsantigener (eng.: capture antigens) i konsentrasjoner på 50 ug/ml. Som et sekundært antistoff ble et anti-IgM fra coho-laks ( Oncorhyncus kisutch) (IgGl monoklonal fraksjon) (Grupo Bios-Bios, Chile) benyttet, og som et konjugert antistoff et antimurint IgG merket med peroksidase (geite-antimurint, Dako, Danmark) og ABTS (2,2'-azino-bis(3-etylbenzotiazolin-6-sulfonsyre) som et substrat.
For den histologjske analysen ble prøver av fiskeepidermis tatt med en skalpell, med kutt i fiskens abdominale og laterale soner på dag 0-10-20-30-40-50, 80 og 120. Kuttene ble innkapslet i 4 % formalinbuffer, og de ble farget med PAS- (periodic acid- Shiff) og PAS-Alcian Blue-farger.
Slim ble oppnådd ved å skrape fiskens overflate med en skalpell. Det ekstraherte materialet ble plassert i 15 ml rør med 2 ml PBS+-proteaseinhibitorcocktail (Promega G6521 50X) for derved å oppnå en tett suspensjon. Det ble sentrifugert ved 3000 g i 10 minutter og supernatanten ble samlet inn og holdt på -20 °C. Prøver ble analysert ikke-fortynnet og i duplikat. 5 serum- og slimprøver ble tatt per gruppe og per prøvetidspunkt for serumanalysen, og 3 prøver ble brukt til den histologiske analysen.
Referanser:
Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 Nature 1970 227 (5259): 680-685.
Cordwell SJ, Wilkins MR, Cerpa-Poljak A, Gooley AA, Duncan M, Williams KL, Humphery-Smith L, Cross-species identification of proteins separated by two-dimensional gel electrophoresis using matrix-assisted laser desorption ionisation/time-of-flight mass spectrometry and amino acid composition. Electrophoresis. 1995 Mar;16(3):438-43.
Raynard RS; Bricknell IR ,Billingsley PF, Nisbet AJ, Vigneau A, Sommerville C Development of vaccines against sea lice. Pest Manag Sei 58:569-575.
Kollner B , Wasserrab B , Kotterba G, Fischer U Evaluation of immune functions of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss)—how can environmental influences be detected? Toxicology Letters 131 (2002) 83-95.
Alvarez-Pellitero P. Fish immunity and parasite infections: from innate immunity to immunoprophylactic prospects. Veterinary Immunology and Immunopathology Vet Immunol Immunopathol. 2008 Dec 15;126(3-4):171-98. Epub 2008 Aug 3.
Tadiso TM, Krasnov A, Skugor S, Afanasyev S, Hordvik I, Nilsen F. Gene expression analyses of immune responses in Atlantic salmon during early stages of infection by salmon louse (Le<p>eo<p>htheims salmonis) reveal ed bi-phasic responses coinciding with the copepod-chalimus transition. BMC Genomics 2011, 12:141
Bravo S.The reproductive output of sea lice Caligus rogercresseyi under controlled conditions. Experimental Parasitology 125 (2010) 51-54
Hermanson, G.T. (2008). Bioconjugate Techniques. 2nd edition, Academic Press, New York. (Part No. 20036). Chapter 19 discusses carrier protein uses and the maleimide-activation chemistry.
Solid Phase Peptide Synthesis. I. The Synthesis of a Tetrapeptide Merrifield B. Journal of the American Chemical Society 1963 85 (14): 2149
Claims (26)
- Etter således å ha spesifikt beskrevet og bestemt egenskapen til og den beste måten for utførelse av den foreliggende oppfinnelsen, krever oppfinnerne eierskap og enerett til: 1. Isolert peptid,karakterisert vedå omfatte en aminosyresekvens som har minst 90 % identitet med en sekvens valgt fra gruppen bestående av SEQ ID NO. 17, SEQ ID NO. 18, SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 20, SEQ ID NO. 21, SEQ ID NO. 22, SEQ ID NO. 23, SEQ ID NO. 24, SEQ ID NO. 25, SEQ ID NO. 26, SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO. 28 og kombinasjoner derav, der peptidet induserer en immunrespons mot kopepoder og/eller genererer et slimskjold hos fisk.
- 2. Peptidet ifølge krav 1,karakterisert vedat fisken er valgt fra gruppen bestående av atlanterhavslaks ( Salmo Salar), regnbueørret ( Oncorhynchus mykiss), Coho-laks ( Oncorhynchus kisutch), bekkeørret (Salmo trutta) og Chinook-laks (O. tshawytscha) og kopepodene tilhører Caligidae-familien.
- 3. Peptidet ifølge krav 1,karakterisert vedå omfatte et antigent protein konjugert til peptidet.
- 4. Peptidet ifølge krav 3,karakterisert vedat det antigene proteinet er hemocyanin (KLH - Keyhole Limpet Hemocyanin) fra. Megathura crenulata.
- 5. Vaksine som induserer en immunrespons mot kopepoder og/eller et slimskjold hos fisk,karakterisert vedå omfatte minst ett peptid, der peptidet har en aminosyresekvens som viser minst 90 % identitet med en sekvens valgt fra gruppen bestående av SEQ ID NO. 17, SEQ ID NO. 18, SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 20, SEQ ID NO. 21, SEQ ID NO. 22, SEQ ID NO. 23, SEQ ID NO. 24, SEQ ID NO. 25, SEQ ID NO. 26, SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO. 28 og kombinasjoner derav; eksipienter og adjuvanser.
- 6. Vaksinen ifølge krav 5,karakterisert vedat fisken er valgt fra gruppen bestående av atlanterhavslaks ( Salmo Salar), regnbueørret ( Oncorhynchus mykiss), Coho-laks ( Oncorhynchus kisutch), bekkeørret (Salmo trutta) og Chinook-laks (O. tshawytscha) og kopepodene tilhører Caligidae-familien.
- 7. Vaksinen ifølge krav 5,karakterisert vedat at den er i form av en emulsjon.
- 8. Vaksinen ifølge krav 5,karakterisert vedat eksipienten er en ikke-mineralsk olje.
- 9. Vaksinen ifølge krav 5,karakterisert vedat peptidet omfatter et antigent protein konjugert til peptidet.
- 10. Vaksinen ifølge krav 9,karakterisert vedat det antigene proteinet er hemocyanin fra nøkkelhullsnegl en Megathura crenulata.
- 11. Vaksine som induserer en immunrespons mot kopepoder og/eller utviklingen av et slimskjold hos fisk,karakterisert vedå omfatte peptider som vist i SEQ ID NO. 17, SEQ ID NO. 18, SEQ ID NO. 19, og SEQ ID NO. 20; og eksipienter.
- 12. Vaksinen ifølge krav 11,karakterisert vedat minst ett av peptidene er konjugert til et antigent protein.
- 13. Vaksinen ifølge krav 11,karakterisert vedat de fire peptidene er konjugert til et antigent protein.
- 14. Vaksine som induserer en immunrespons mot kopepoder og/eller et slimskjold hos fisk,karakterisert vedå omfatte peptider som vist i SEQ JD NO. 21, SEQ ID NO. 22, SEQ ID NO. 23, og SEQ ID NO. 24; og eksipienter.
- 15. Vaksinen ifølge krav 14,karakterisert vedat minst ett av peptidene er konjugert til et antigent protein.
- 16. Vaksinen ifølge krav 14,karakterisert vedat de fire peptidene er konjugert til et antigent protein. 17. Vaksine som induserer en immunrespons mot kopepoder og/eller utviklingen av et slimskjold hos fisk,karakterisert vedå omfatte peptider som vist i SEQ ID NO. 25, SEQ ID NO. 26, SEQ ID NO. 27, og SEQ ID NO. 28; og eksipienter. 18. Vaksinen ifølge krav 17,karakterisert vedat minst ett av peptidene er konjugert til et antigent protein. 19. Vaksinen ifølge krav 17,karakterisert vedat de fire peptidene er konjugert til et antigent protein. 20. Vaksinen ifølge hvilke som helst av kravene 11, 14 og 17,karakterisert vedat kopepoden tilhører Caligjdae-familien. 21. Vaksinen ifølge hvilke som helst av kravene 11, 14 og 17,karakterisert vedat eksipi enten er en ikke-mineralsk olje. 22. Vaksinen ifølge hvilke som helst av kravene 11, 14 og 17,karakterisert vedat fisken er valgt fra gruppen bestående av atlanterhavslaks ( Salmo Salar), regnbueørret ( Oncorhynchus mykiss), Coho-laks ( Oncorhynchus kisutch), bekkeørret (Salmo trutta) og Chinook-laks (O. tshawytscha) og kopepodene tilhører Caligjdae-familien. 23. Vaksinen ifølge hvilke som helst av kravene 11, 14 og 17,karakterisert vedat den er i form av en emulsjon. 24. Anvendelse av peptidene ifølge krav 1 for fremstilling av en vaksine. 25. Anvendelse av peptidene ifølge krav 1 for fremstilling av en sammensetning som induserer utvikling av et slimskjold hos fisk. 26. Vaksine mot kopepoder som infesterer fisk,karakterisertv e d å omfatte proteinene til SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, og SEQ ID NO. 3; eksipienter og adjuvanser. 27. Vaksinen ifølge krav 26,karakterisert vedat eksipienten er en ikke-mineralsk olje. 28. Fremgangsmåte for å modulere en immunrespons hos fisk,karakterisert vedå omfatte administrering til fisken av den nødvendige mengden av en vaksine omfattende minst ett peptid som har minst 90 % identitet med en sekvens valgt fra gruppen bestående av SEQ ID NO. 17, SEQ ID NO. 18, SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 20, SEQ ID NO. 21, SEQ ID NO. 22, SEQ ID NO. 23, SEQ ID NO. 24, SEQ ID NO. 25, SEQ ID NO. 26, SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO. 28 og kombinasjoner derav; og eksipienter. 29. Fremgangsmåten ifølge krav 28,karakterisert vedat peptidet administreres i en mengde på fra 1 og 500 ug. 30. Fremgangsmåten ifølge krav 28,karakterisert vedat fisken er valgt fra gruppen omfattende atlanterhavslaks ( Salmo Salar), regnbueørret ( Oncorhynchus mykiss) og Coho-laks ( Oncorhynchus kisutch), bekkeørret ( Salmo trutta) og Chinook-laks ( O. tshawytscha) og kopepodene tilhører Caligjdae-familien. 31. Fremgangsmåten ifølge krav 28,karakterisert vedat peptidet omfatter et antigent protein konjugert til peptidet. 32. Fremgangsmåten ifølge krav 31,karakterisert vedat det antigene proteinet er hemocyanin fra nøkkelhullsnegl en Megathura crenulata. 33. Fremgangsmåte for å modulere immunrespons hos fisk,karakterisert vedå omfatte administrering til fisken av en nødvendig mengde av en vaksine omfattende proteinene som vist i SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, og SEQ ID NO. 3; eksipienter og adjuvanser. 34. Fremgangsmåten ifølge krav 33,karakterisert vedat hvert protein administreres i en mengde på fra 1 og 10 ug. 35. Fremgangsmåten ifølge krav 33,karakterisert vedat fisken er valgt fra gruppen omfattende atlanterhavslaks ( Salmo Salar), regnbueørret ( Oncorhynchus mykiss) og Coho-laks ( Oncorhynchus kisutch), bekkeørret ( Salmo trutta) og Chinook-laks ( O. tshawytscha) og kopepodene tilhører Caligjdae-familien. 36. Fremgangsmåte for å generere utviklingen av et slimskjold hos fisk,karakterisert vedå omfatte administrering til fisken av en nødvendig mengde av en vaksine omfattende minst ett peptid som har minst 90 % identitet med en sekvens valgt fra gruppen bestående av SEQ ID NO.
- 17, SEQ ID NO.
- 18, SEQ ID NO.
- 19, SEQ ID NO.
- 20, SEQ ID NO.
- 21, SEQ ID NO.
- 22, SEQ ID NO.
- 23, SEQ ID NO.
- 24, SEQ ID NO.
- 25, SEQ ID NO.
- 26, SEQ ID NO. 27 og SEQ ID NO. 28; og eksipienter. 37. Fremgangsmåten ifølge krav 36,karakterisert vedat peptidet administreres en mengde på fra 1 og 500 ug. 38. Fremgangsmåten ifølge krav 36,karakterisert vedat fisken er valgt fra gruppen omfattende atlanterhavslaks ( Salmo Salar), regnbueørret ( Oncorhynchus mykiss) og Coho-laks ( Oncorhynchus kisutch), bekkeørret ( Salmo trutta) og Chinook-laks ( O. tshawytscha) og kopepodene tilhører Caligjdae-familien. 39. Fremgangsmåten ifølge krav 36,karakterisert vedat peptidet omfatter et antigent protein konjugert til peptidet. 40. Fremgangsmåten ifølge krav 39,karakterisert vedat det antigene proteinet er hemocyanin fra nøkkelhullsnegl en Megathura crenulata.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/IB2012/052487 WO2013171548A2 (es) | 2012-05-17 | 2012-05-17 | Peptidos que inducen en peces una respuesta inmune contra copepodos y/o un escudo mucoso, vacunas, usos y métodos para modular la respuesta inmune de un pez y/o inducir la generación de un escudo mucoso |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO20141508A1 true NO20141508A1 (no) | 2015-02-05 |
| NO342822B1 NO342822B1 (no) | 2018-08-13 |
Family
ID=49584397
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO20141508A NO342822B1 (no) | 2012-05-17 | 2014-12-12 | Vaksine som induserer en immunrespons mot kopepoder og/eller et slimskjold hos fisk omfattende peptidkombinasjoner, og anvendelse av peptidene for fremstilling av en vaksine. |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| AR (1) | AR092320A1 (no) |
| CA (1) | CA2873599A1 (no) |
| GB (1) | GB2522119A (no) |
| NO (1) | NO342822B1 (no) |
| WO (1) | WO2013171548A2 (no) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NO20170778A1 (en) * | 2016-06-10 | 2017-12-11 | Aqua Health As | Peptides for the inhibition of trypsin and sea lice infestation. |
| NO20162073A1 (en) * | 2016-12-30 | 2018-07-02 | Aqua Health As | Peptides for the inhibition of trypsin and sea lice infestation. |
| NO20211347A1 (en) * | 2021-11-08 | 2023-05-09 | Kapp Det Gode Haap As | Peptides for the inhibition of parasite infection |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2397553B1 (en) * | 2004-07-28 | 2016-05-04 | National Research Council Of Canada | Recombinant vaccines against caligid copepods (sea lice) and antigen sequences thereof |
| CU23919B1 (es) * | 2010-09-28 | 2013-07-31 | Ct De Ingeniería Genética Y Biotecnología | Composición vacunal para el control de las infestaciones por ectoparásitos |
-
2012
- 2012-05-17 WO PCT/IB2012/052487 patent/WO2013171548A2/es active Application Filing
- 2012-05-17 CA CA2873599A patent/CA2873599A1/en not_active Abandoned
- 2012-05-17 GB GB1421363.1A patent/GB2522119A/en not_active Withdrawn
-
2013
- 2013-05-16 AR ARP130101697A patent/AR092320A1/es unknown
-
2014
- 2014-12-12 NO NO20141508A patent/NO342822B1/no unknown
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NO20170778A1 (en) * | 2016-06-10 | 2017-12-11 | Aqua Health As | Peptides for the inhibition of trypsin and sea lice infestation. |
| NO343723B1 (en) * | 2016-06-10 | 2019-05-20 | Aqua Health As | Peptides for the inhibition of trypsin and sea lice infestation. |
| NO20162073A1 (en) * | 2016-12-30 | 2018-07-02 | Aqua Health As | Peptides for the inhibition of trypsin and sea lice infestation. |
| NO343281B1 (en) * | 2016-12-30 | 2019-01-14 | Aqua Health As | Peptides for the inhibition of trypsin and sea lice infestation. |
| NO20211347A1 (en) * | 2021-11-08 | 2023-05-09 | Kapp Det Gode Haap As | Peptides for the inhibition of parasite infection |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2873599A1 (en) | 2013-11-21 |
| AR092320A1 (es) | 2015-04-15 |
| GB201421363D0 (en) | 2015-01-14 |
| NO342822B1 (no) | 2018-08-13 |
| WO2013171548A2 (es) | 2013-11-21 |
| GB2522119A (en) | 2015-07-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Nisbet et al. | Immunity to Haemonchus contortus and vaccine development | |
| US9085634B2 (en) | Vaccine composition for controlling ectoparasite infestations | |
| Li et al. | Protective effects of chicken egg yolk antibody (IgY) against experimental Vibrio splendidus infection in the sea cucumber (Apostichopus japonicus) | |
| Yan et al. | Vaccination of goats with DNA vaccine encoding Dim-1 induced partial protection against Haemonchus contortus: A preliminary experimental study | |
| NO342565B1 (no) | Rekombinante vaksiner mot caligid copepoder (sjølus) og antigene sekvenser av disse. | |
| JPH02500799A (ja) | ワクチン | |
| NO20141508A1 (no) | Peptider som induserer en immunrespons mot kopepoder og/eller utviklingen av et slimskjold hos fisk; vaksiner, anvendelser og fremgangsmåter for å modulere fiskens immunrespons og/eller for å indusere utvikling av et slimskjold hos fisk. | |
| US8110202B2 (en) | Synthetic vaccine for tick control | |
| WO2016162672A2 (en) | Avian vaccine | |
| US20180369349A1 (en) | Cooperia vaccine | |
| Hoan et al. | Identification and immunogenicity of microneme protein 2 (EbMIC2) of Eimeria brunetti | |
| ArunKumar et al. | A comparative analysis on serum antibody levels of sheep immunized with crude and thiol-purified excretory/secretory antigen of Haemonchus contortus. | |
| Zhu et al. | Identification and characterization of a cDNA clone-encoding antigen of Eimeria acervulina | |
| CN108727505B (zh) | 一种免疫保护组合蛋白及其免疫疫苗 | |
| García-Coiradas et al. | Immunization against lamb haemonchosis with a recombinant somatic antigen of Haemonchus contortus (rHcp26/23) | |
| US20220118067A1 (en) | Sea lice vaccines | |
| EP0540128B1 (en) | Nematode vaccine | |
| EP3743100A1 (en) | Sea lice antigens and vaccines | |
| CN110655564B (zh) | 一种组合蛋白及其应用 | |
| Fereig | Serosurveillance and vaccine development as a strategy for control of Toxoplasma infection | |
| CUNHA et al. | rROP2 from Toxoplasma gondii as a potential vaccine against oocyst shedding in domestic cats | |
| CA3236874A1 (en) | Methods and compositions for preventing infection | |
| Selvarayar Arunkumar | Immunoprotection in sheep against Haemonchus contortus using its thiol-purified excretory/secretory proteins. | |
| Ryckaert | Heat shock proteins as protective agents against the enteric redmouth syndrome caused by Yersinia ruckeri | |
| Martınez et al. | Research Article Immunization against Lamb Haemonchosis with a Recombinant Somatic Antigen of Haemonchus contortus (rHcp26/23) |