BR122015019697B1 - composição de vacina para west nile, e uso de plasmídeo com inserções de sequência de dna de vírus west nile na preparação da mesma - Google Patents

Abstract

resumo patente de invenção: "composição de vacina para west nile, e uso de dna de vírus west nile de plasmídeo na preparação da mesma". a presente invenção refere-se a uma composição de vacina compreendendo uma quantidade imunizante eficaz de dna de vírus west nile de plasmídeo, um adjuvante compreendendo uma quantidade imunogenicamente estimulante de óleo sp compreendendo esqualano, copolímero de bloco de polioxietileno/polioxipropileno, monooleato de polioxietileno sorbitano e uma solução salina tamponada; e um veículo farmaceuticamente aceitável. a presente invenção também se refere ao uso de dna de vírus west nile de plasmídeo na preparação da referida composição de vacina.

Description

(54) Título: COMPOSIÇÃO DE VACINA PARA WEST NILE, E USO DE PLASMÍDEO COM INSERÇÕES DE SEQUÊNCIA DE DNA DE VÍRUS WEST NILE NA PREPARAÇÃO DA MESMA (51) Int.CI.: A61K 39/12; A61K 39/193; C12N 13/00; C12N 7/04; C12N 15/00 (30) Prioridade Unionista: 27/07/2001 US 60/308,334 (73) Titular(es): ZOETIS W LLC (72) Inventor(es): HSIEN-JUE CHU (85) Data do Início da Fase Nacional: 17/08/2015

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Relatório Descritivo da Patente de Invenção para COMPOSIÇÃO DE VACINA PARA WEST NILE, E USO DE PLASMÍDEO COM INSERÇÕES DE SEQUÊNCIA DE DNA DE VÍRUS WEST NILE NA PREPARAÇÃO DA MESMA.

[001] Dividido do PI0211492-5, depositado em 23/07/2002.

[002] Este pedido reivindica prioridade a partir do pedido U.S. copendente número de série 60/308.334 depositado em 27 de julho de 2001.

CAMPO DA INVENÇÃO [003] A presente invenção refere-se a vacinas para Vírus West Nile, e a métodos de administrar as mesmas a mamíferos, em particular cavalos.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO [004] Conhecido como um Flavivirus, o vírus West Nile foi primeiro identificado em 1937 na África e primeiro encontrado na América do Norte em 1999. Aves migratórias são consideradas os meios primários pelos quais infecção é dispersa dentro e entre países. O vírus é transmitido por mosquitos que adquiriram infecção alimentando-se em aves virêmicas. O vírus é então ampliado durante períodos de alimentação por sangue de mosquito adulto. Mosquitos infectados então transmitem o vírus a seres humanos e animais quando alimentando-se deles.

[005] Vírus West Nile é o agente causador para doença do Vírus West Nile, particularmente encefalite de West Nile, predominantemente em seres humanos, outros mamíferos e aves. Uma relação principal é a falta de tratamento eficaz para doença do vírus West Nile. Drogas antiinflamatórias são usadas para combater inchação de tecidos do sistema nervoso central, mas além disto nenhuma intervenção médica está disponível. Nem é acreditado existir uma vacina adequada conhecida para prevenir a infecção. Até hoje, prevenindo contato com transmissores parece ser o único meio de controlar o vírus West Nile.

Petição 870160006669, de 26/02/2016, pág. 8/14

2/23 [006] Cientistas acreditam que o vírus West Nile segue o mesmo modelo de infecção encontrado com outros vírus transmitidos por mosquitos. Quando um mosquito infectado morde um equídeo, o vírus entra na pele ou tecidos logo abaixo do local da mordida, onde é recolhido pela circulação. O vírus pode multiplicar-se na corrente sanguínea, e o equídeo pode desenvolver febre, a qual frequentemente não é detectada porque não existem outros sinais de enfermidade naquele momento. Entretanto, uma vez que o vírus invadiu o sistema nervoso, sinais clínicos aparecem dentro de um a três dias. A maioria dos equídeos infectados, tais como cavalos, primeiro exibe sinais de fraqueza ou paralisia posterior e coordenação fraca. Depressão e mudanças de comportamento relacionadas podem acompanhar as mudanças físicas. Em casos graves, tremores, convulsões, tropeços dos membros e paralisia podem desenvolver. Problemas neurológicos graves e mortalidade foram também observados. Até hoje, nenhuma vacina conhecida para prevenir infecção por vírus West Nile em equídeo está disponível; e o único meio de controlar o vírus West Nile parece ser a prevenção de contato com o transmissor.

[007] Portanto, existe uma necessidade por meios seguros e eficazes de controlar a dispersão do vírus West Nile em mamíferos e aves. Em particular existe uma necessidade por uma vacina, primeiramente para administração a equídeos a qual é suficientemente segura a fim de ser adequada para administração mesmo a éguas prenhas sem efeito adverso. Também necessária é uma vacina capaz da prevenção ou melhoramento de doença por Vírus West Nile, particularmente encefalite por West Nile, em equídeos e outros mamíferos. SUMÁRIO DA INVENÇÃO [008] A presente invenção fornece uma composição de vacina a qual compreende: um componente imunogenicamente ativo selecionado a partir do grupo consistindo de um vírus inteiro ou subunidade

3/23 de West Nile atenuado vivo, inativo ou morto, um antígeno derivado a partir de dito vírus, DNA derivado a partir de dito vírus, DNA de vírus West Nile de plasmídeo, plasmídeo com inserções de sequência de dito vírus, e uma mistura disso; um adjuvante, preferivelmente compreendendo uma quantidade imunogenicamente estimulante de um óleo metabolizável; e opcionalmente um veículo farmaceuticamente aceitável.

[009] A presente invenção também fornece um método para a prevenção ou melhoramento de encefalite de West Nile em equídeos o qual compreende administrar a ditos equídeos uma composição de vacina a qual compreende um componente imunogenicamente ativo selecionado a partir do grupo consistindo de um vírus inteiro ou subunidade de West Nile atenuado vivo, inativo ou morto, um antígeno derivado a partir de dito vírus, DNA derivado a partir de dito vírus, DNA de vírus West Nile de plasmídeo, plasmídeo com inserções de sequência de dito vírus, e uma mistura disso; um adjuvante, preferivelmente compreendendo uma quantidade imunogenicamente estimulante de um óleo metabolizável; e opcionalmente um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0010] A presente invenção também fornece uma vacina para vírus West Nile adequada para uso em cavalos a qual compreende um componente imunogenicamente ativo selecionado a partir do grupo consistindo em um vírus inteiro ou subunidade de West Nile atenuado vivo, inativo ou morto, um antígeno derivado a partir de dito vírus, DNA derivado a partir de dito vírus, DNA de vírus West Nile de plasmídeo, plasmídeo com inserções de sequência de dito vírus, e uma mistura disso; um adjuvante, preferivelmente compreendendo uma quantidade imunogenicamente estimulante de um óleo metabolizável; e opcionalmente um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0011] Em uma concretização adicional da invenção a composição

4/23 de vacina compreende pelo menos 1x10⁴ de TCID₅₀ por unidade de dose de vírus West Nile inativo, ou um componente disso, e aproximadamente 4% a 10% em vol/vol de um adjuvante compreendendo aproximadamente 1 a 3% de copolímero de bloco de polioxietilenopolioxipropileno, aproximadamente 2 a 6% de esqualano e aproximadamente 0,1 a 0,5% de monooleato de polioxietileno sorbitano.

[0012] Além disso é fornecida uma vacina para vírus West Nile segura e eficaz para equídeos, compreendendo pelo menos aproximadamente 1 x 10⁶ de TCID₅₀ por unidade de dose de vírus West Nile morto ou inativo, e pelo menos aproximadamente 1% em vol/vol de um adjuvante compreendendo pelo menos um óleo metabolizável e pelo menos um agente umedecedor ou dispersante.

[0013] Uma concretização particularmente preferida da invenção é uma composição de vacina para cavalos, compreendendo pelo menos duas unidades de dosagem de vírus West Nile morto ou inativo, onde cada dita unidade de dosagem compreende aproximadamente 0,5 a 5 mililitros de uma composição contendo pelo menos aproximadamente 5 x 10⁷ de TCID₅₀ de dito vírus e aproximadamente 1 a 10% em vol/vol de um adjuvante, dito adjuvante compreendendo pelo menos um óleo metabolizável e pelo menos dois tensoativos não-iônicos, e além disso onde dita unidade de dosagem compreende um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0014] Além disso, objetivos e aspectos da invenção tornarão-se aparentes a partir da descrição detalhada das reivindicações descritas aqui abaixo.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [0015] Em geral, o problema com planejamento de uma nova vacina é que uma vacina de vírus vivo pode potencialmente necessitar de segurança suficiente em um dado hospedeiro alvo, e que uma vacina de vírus morto ou inativo pode potencialmente necessitar da capacida5/23 de de estimular uma resposta imunológica suficientemente eficaz. Comumente, um adjuvante ou composto imunogenicamente estimulante é usado em combinação com um vírus morto ou inativo em uma composição de vacina para obter eficácia aceitável. Entretanto, segurança ao hospedeiro alvo é frequentemente comprometida pela adição de um adjuvante. Por exemplo, animais prenhos muitas vezes foram conhecidos terem taxa significantemente maior de aborto depois de ser administrada uma vacina de vírus morto ou inativo que continha um adjuvante.

[0016] Foi verificado que quando um adjuvante adequado, por exemplo um óleo metabolizável tal como óleo SP é usado em combinação com um componente imunogenicamente ativo como descrito aqui, a composição de vacina de West Nile resultante é segura para uso e é particularmente útil em equídeos, particularmente cavalos, e ainda para uso em éguas prenhas, enquanto demonstrando eficácia importante igualmente. Assim, a invenção alcança os objetivos concomitantes de imunização eficaz e segurança, especialmente para animais prenhos.

[0017] Uma composição de vacina segura e eficaz compreende: um componente imunogenicamente ativo selecionado a partir do grupo consistindo de um vírus inteiro ou subunidade de West Nile atenuado vivo, inativo ou morto, um antígeno derivado a partir de dito vírus, DNA derivado a partir de dito vírus, DNA de vírus West Nile de plasmídeo, plasmídeo com inserções de sequência de dito vírus, e uma mistura disso; um adjuvante; e opcionalmente um veículo farmaceuticamente aceitável. Esta composição de vacina pode ser administrada seguramente e eficazmente a mamíferos e aves, particularmente a equídeos, tais como cavalos, burros, asnos, etc. A composição de vacina é particularmente adequada para cavalos, para prevenir ou melhorar a doença por vírus West Nile tal como encefalite.

6/23 [0018] DNA derivado a partir de vírus West Nile pode ser obtido via isolamento de fontes tais como os fluidos ou tecidos de espécies de equino ou ave diagnosticados terem encefalite por West Nile. Tais fontes incluem fluido espinhal cerebral ou secções de medula espinhal ou cérebro. DNA pode também ser obtido usando outras técnicas disponíveis tais como tecnologia de plasmídeo. Por exemplo, células adequadas de um organismo, por exemplo E. coli, podem ser transformadas com um plasmídeo contendo inserções de sequência de proteína de West Nile para obter uma semente mestre. A semente mestre pode então ser cultivada e passada. Células transformadas contendo o DNA de West Nile podem então ser colhidas, e o DNA isolado e obtido usando técnicas disponíveis ao artífice versado.

[0019] Vírus West Nile inteiro ou subunidade pode ser isolado a partir de animais infectados usando-se técnicas convencionais. Amostras de vírus podem ser obtidas a partir de coleções de cultura de tecido as quais mantêm um depositário para organismos tais como West Nile. Na American Type Culture Collection (ATCC), por exemplo, o vírus West Nile foi depositado sob N°^s de ATCC VR-82, VR-1267 e VR1267 AF.

[0020] Vírus West Nile inteiro ou subunidade pode ser usado como um vírus atenuado vivo, entretanto, está preferivelmente morto, ou inativo por meios de inativação convencionais, por exemplo inativação química usando agentes inativadores químicos tais como etilenoimina binária, beta-propiolactona, formalina, gluteraldeído, dodecil sulfato de sódio, ou outros mais ou uma mistura disso, preferivelmente formalina. Dito vírus pode também estar inativo por calor ou psoraleno na presença de luz ultravioleta. Atenuação é alcançada por métodos convencionais.

[0021] Vírus West Nile inteiro ou subunidade pode ser mantido ou cultivado em cérebros de camundongos ou em meios de cultura de

7/23 tecido adequados, tais como optiMEM (LTI, Grand Island, NY) ou meios MEM, ou em células conhecidas na técnica tais como células de rim de macaco verde africano (Vero) ou células de filhotes de hamster (BHK), preferivelmente células Vero. Dito vírus pode então ser separado da cultura de tecido ou meios celulares usando-se técnicas convencionais tais como centrifugação, filtração ou outras mais.

[0022] Um vírus West Nile isolado preferido pode ser obtido a partir do National Veterinary Services Laboratory (parte do United States Department of Agriculture) em Ames, IA como cepa de VM-2. A cepa de vírus pode estar purificada em placa até três vezes, e passada a X + 5 em células Vero.

[0023] Como usado aqui o termo imunogenicamente ativo significa a capacidade para estimular uma resposta imunológica, isto é estimular a produção de anticorpos, particularmente anticorpos humorais, ou estimular uma resposta mediada por célula. Por exemplo, a capacidade para estimular a produção de anticorpos circulantes ou secretores ou a produção de uma resposta mediada por célula em regiões mucosais locais (por exemplo, mucosa intestinal), sangue periférico, fluido espinhal cerebral ou outros mais.

[0024] A quantidade de componente imunogenicamente ativo a qual é eficaz e imunizante pode variar e é qualquer quantidade suficiente para evocar uma resposta imunológica e fornecer proteção imunológica contra doença por vírus West Nile. A quantidade de componente imunogenicamente ativo por unidade de dosagem é preferivelmente pelo menos aproximadamente 1 x 10⁴ de TCID50, preferivelmente a partir de 1 x 10⁴ de TCID50 a cerca de 10⁹ de TCID50, mais preferivelmente pelo menos aproximadamente 1 x 10⁶ de TCID50, particularmente 10⁶ a 10⁷ de TCID₅₀ (preferivelmente pelo menos aproximadamente 1 x 10⁷). Estas quantidades são adequadas para vírus inteiro ou subunidade morto ou inativo ou antígeno ou DNA derivado disso ou

8/23 uma mistura disso. É especialmente desejável que pelo menos aproximadamente 5 x 10⁷ de TCID₅₀ de vírus West Nile inteiro ou subunidade morto ou inativo ou antígeno ou DNA derivado disso ou uma mistura disso seja usado na composição de vacina da invenção.

[0025] Em uma concretização adicional da invenção, é contemplado que aproximadamente 50 a 3.000 microgramas (qg ou 10^-6 gramas) de DNA de plasmídeo de West Nile podem ser utilizados em uma unidade de dosagem da composição de vacina. Mais preferivelmente, aproximadamente 100 a 1.000 qg podem ser usados, com aproximadamente 100 a 250 qg de DNA de plasmídeo sendo mais preferidos. [0026] Pelo menos uma unidade de dosagem por animal é contemplada aqui como um regime de vacinação. Duas ou mais unidades de dosagem podem ser especialmente úteis. Uma unidade de dosagem pode tipicamente ser aproximadamente 0,1 a 10 mililitros da composição de vacina, preferivelmente aproximadamente 0,5 a 5 mililitros, e ainda mais preferivelmente aproximadamente 1 a 2 mililitros, com cada unidade de dosagem contendo a quantidade descrita até agora de vírus ou componente de vírus. O versado reconhecerá que uma quantidade particular da composição de vacina por unidade de dosagem, bem como o número total de unidades de dosagem por regime de vacinação, podem ser otimizados, contanto que uma quantidade imunizante eficaz do vírus ou um componente disso seja distribuída ao animal.

[0027] A composição de vacina de vírus West Nile da invenção contém um ou mais adjuvantes. Como usado aqui o termo adjuvante refere-se a qualquer componente o qual melhore a resposta corporal a uma vacina ou um imunogene. O adjuvante tipicamente compreenderá aproximadamente 0,1 a 50% em vol/vol da formulação de vacina da invenção, preferivelmente aproximadamente 1 a 50% da vacina, mais preferivelmente aproximadamente 1 a 20%, particularmente 1 a 10%

9/23 em vol/vol disso. Quantidades de aproximadamente 4 a 10% são ainda mais preferidas.

[0028] Adjuvantes adequados incluem óleos imunoestimulantes tais como certos óleos metabolizáveis. Óleos metabolizáveis adequados para uso na composição da invenção incluem emulsões oleosas, por exemplo, óleo SP (descrito nas partes que se seguem), Emulsigen (MPV Laboratories, Ralston, NZ), Montanide 264.266.26 (Seppic SA, Paris, França), bem como óleo de amendoim e outros óleos à base de vegetais, esqualano (óleo de fígado de tubarão) ou outro óleo metabolizável o qual pode ser apresentado adequado como um adjuvante em prática de vacina veterinária.

[0029] O adjuvante pode ser uma composição compreendendo além do óleo metabolizável, um ou mais agentes umedecedores ou dispersantes em quantidades de aproximadamente 0,1 a 25%, mais preferivelmente aproximadamente 1 a 10%, e ainda mais preferivelmente aproximadamente 1 a 3% por volume do adjuvante. Particularmente preferidos como agentes umedecedores ou dispersantes são tensoativos não-iônicos. Tensoativos não-iônicos úteis incluem copolímeros de bloco de polioxietileno/polioxipropileno, especialmente aqueles comercializados sob o nome comercial PLURONIC^® e disponíveis a partir de BASF Corporation (Mt. Olive, NJ). Outros tensoativos não-iônicos úteis incluem ésteres de polioxietileno tais como monooleato de polioxietileno sorbitano, disponível sob o nome comercial TWEEN 80^®. Pode ser desejável para incluir mais do que um, por exemplo, pelo menos dois, agentes umedecedores ou dispersantes no adjuvante como parte da composição de vacina da invenção.

[0030] Outros componentes do adjuvante podem incluir tais compostos conservantes como formalina e timerosal em quantidades de até aproximadamente 1% em vol/vol do adjuvante.

[0031] Um adjuvante particularmente preferido é referido como

10/23 óleo SP. Como usado na descrição e exemplos, o termo óleo SP designa uma emulsão oleosa compreendendo um copolímero de bloco de polioxietileno-polioxipropileno, esqualano, monooleato de polioxietileno sorbitano e uma solução salina tamponada. Em geral, a emulsão de óleo SP compreenderá aproximadamente 1 a 3% em vol//vol de copolímero de bloco, aproximadamente 2 a 6% em vol/vol de esqualano, mais particularmente aproximadamente 3 a 6% de esqualano, e aproximadamente 0,1 a 0,5% em vol/vol de monooleato de polioxietileno sorbitano, com o resíduo sendo uma solução salina tamponada. [0032] Quando utilizadas, quantidades imunogenicamente estimulantes de óleo SP como adjuvante na composição de vacina da invenção podem variar de acordo com o componente imunogenicamente ativo, o grau de exposição infecciosa potencial, método de administração da composição de vacina, a idade e tamanho do equídeo, ou outros mais. Em geral, quantidades de aproximadamente 1% a 50% em vol/vol da composição de vacina são adequadas, preferivelmente aproximadamente 4% a 10% em vol/vol, e mais preferivelmente aproximadamente 4% a 5% em vol/vol de óleo SP.

[0033] Veículos farmaceuticamente (ou farmacologicamente) aceitáveis adequados para uso na composição de vacina da invenção podem ser qualquer veículo líquido convencional adequado para composições farmacêuticas veterinárias, preferivelmente uma solução salina equilibrada ou outra solução à base de água adequada para uso em meio de cultura de tecido. Outros veículos disponíveis podem também ser utilizados.

[0034] Excipientes adicionais disponíveis na técnica podem também ser incluídos na composição de vacina de acordo com as várias concretizações descritas até agora. Por exemplo, modificadores de pH podem ser utilizados.

[0035] Os componentes da composição de vacina da invenção

11/23 como descrito até agora, incluindo o veículo, podem ser combinados juntos usando-se técnicas disponíveis.

[0036] Além do componente imunogenicamente ativo de vírus West Nile como descrito aqui acima como ingrediente ativo, é contemplado que a composição de vacina da invenção pode também conter outros componentes ativos tais como um componente antipatogênico direcionado contra vírus da raiva, vírus de encefalite equina oriental, vírus de encefalite equina ocidental, vírus de encefalite equina Venezuelano, vírus de herpes equina tais como EHV-1 ou EHV-4, Ehrlichia risticii, Streptococcus equi, toxóide de tétano, vírus de gripe equina (EIV), vírus de rinopneumonite Ocidental, Oriental e Venezuelano ou outros mais ou uma combinação disso. As quantidades de uma ou mais destes vírus podem ser determinadas a partir da literatura eficácia na técnica, ou determinado usando-se técnicas disponíveis.

[0037] Em uma concretização da invenção o componente imunogenicamente ativo da invenção pode ser incorporado em lipossomas usando tecnologia conhecida tal como aquela descrita em Nature, 1974, 252, 252-254 ou Journal of Immunology, 1978, 120, 1109-13. Em outra concretização da invenção, o componente imunogenicamente ativo da invenção pode ser conjugado a compostos biológicos adequados tais como polissacarídeos, peptídeos, proteínas, ou outros mais, ou uma combinação disso.

[0038] Em uma concretização preferida da invenção, a composição de vacina inventiva pode ser formulada em forma de unidade de dosagem como descrito até agora para facilitar administração e garantir uniformidade da dosagem. Formulação pode ser efetuada usandose técnicas disponíveis, tais como aquelas aplicáveis a preparações de emulsões.

[0039] A composição de vacina inventiva pode ser administrada parenteralmente, por exemplo, intramuscularmente, subcutaneamente,

12/23 intraperitonealmente, intradermicamente ou outras mais, preferivelmente intramuscularmente; ou dita composição pode ser administrada oralmente ou intranasalmente.

[0040] Conformemente, a presente invenção também fornece um método para a prevenção ou melhora de encefalite de West Nile em equídeos, preferivelmente cavalos, o qual compreende administrar a ditos equídeos uma composição de vacina segura como descrita aqui acima.

[0041] Em prática atual, a composição de vacina da invenção é administrada parenteralmente, subcutaneamente, oralmente, intranasalmente, ou por outros meios disponíveis, preferivelmente parenteralmente, mais preferivelmente intramuscularmente, em quantidades eficazes de acordo com a relação a qual pode ser determinada pelo tempo de exposição potencial antecipada a um transmissor do vírus West Nile. Deste modo, o animal tratado pode ter tempo para construir imunidade antes da exposição natural. Por meio de exemplo nãolimitante, uma relação ou regime de dosagem de tratamento típico pode incluir administração parenteral, preferivelmente injeção intramuscular de uma unidade de dosagem, pelo menos aproximadamente 2-8 semanas antes da exposição potencial. Pelo menos duas administrações são preferidas, por exemplo uma unidade de dosagem a aproximadamente 8 semanas antes da exposição potencial ao vírus e uma segunda unidade de dosagem a aproximadamente 3-5 semanas antes da exposição potencial do animal tratado. Como descrito até agora, uma unidade de dosagem tipicamente estará dentro do limite de aproximadamente 0,1 a 10 mililitros da composição de vacina contendo as quantidades de ativos e percentagens de adjuvante e inativo(s) como previamente descrito. Uma unidade de dosagem dentro do limite de aproximadamente 0,5 a 5 mililitros é talvez mais preferida, com aproximadamente 1 a 2 mililitros sendo particularmente preferidos.

13/23 [0042] Para uma compreensão clara da invenção, os seguintes exemplos são relacionados abaixo. Estes exemplos são meramente ilustrativos e não são pretendidos limitar o objetivo ou princípios subjacentes da invenção em qualquer modo. Realmente, várias modificações da invenção, além daquelas mostradas e descritas aqui, tornarão-se aparentes àqueles versados na técnica a partir dos seguintes exemplos e da descrição precedente. Tais modificações são também pretendidas incluírem-se dentro do objetivo das reivindicações anexas.

EXEMPLO 1

Preparação da Vacina [0043] A/Formulação de óleo SP

Descrição do Ingrediente Volume

Copolímero de bloco de polioxietileno-polioxipropileno 20,0 ml (Pluronic® L121, BASF, Mt. Olive, NJ)

Esqualano (Kodak, Rochester, NY) 40,0 ml

Monooleato de polioxietileno sorbitano 3,2 ml (Tween® 80, Sigma Chemical, St. Louis, MO)

Solução salina tamponada 936,8 ml (Solução de PBS D-V, Ca, sem Mg) [0044] Os ingredientes são misturados e homogeneizados até uma massa ou emulsão estável ser formada. Antes da homogeneização, os ingredientes ou mistura podem ser autoclavados. A emulsão pode ser além disso esterilizada por filtração. Formalina pode ser adicionada até uma concentração final de 0,2%. Timerosal pode ser adicionado a uma diluição final de 1:10.000.

[0045] B/Preparação da Vacina [0046] Um isolato equino de vírus West Nile, obtido a partir de facilidades de USDA em Ames, IA (N° do Lote VM-2, Equine Origin, 1999 North American isolate, segunda passagem em cultura de célula de VeroM), foi cultivado em culturas múltiplas de células Vero em meio de

14/23 cultura de tecido OptiMEM (LTI, Grand Island, NY) a 37°C. As colheitas são tituladas e então tornadas inativas por meio de adição de uma solução de formalina a 10% a uma concentração final de 0,1%. Isto é permitido inativar a 37°C por um período de não menos do que 144 horas. Então, outra adição de formalina a 0,1% é adicionada e incubada a 37°C por outro período de não menos do que 144 horas.

[0047] As vacinas são formuladas suspendendo o volume apropriado de fluido de vírus inativo em 1-20% por volume de óleo SP por 1 mL de dose.

EXEMPLO 2

Avaliação de Resposta do Anticorpo à Injeção Intramuscular de Vacina de Teste [0048] Nesta avaliação, cavalos são aleatoriamente divididos em quatro grupos: um grupo de vinte cavalos é administrada vacina de teste em uma dose de 1x10⁷ de TCID50 (Dose Infecciosa de Cultura de Tecido); um segundo grupo de vinte cavalos é administrada vacina de teste em uma dose de 5 x 10⁷ de TCID50; um terceiro grupo de cinco cavalos é administrada vacina de teste a uma dose de 1 x 10⁸ de TCID₅₀; e um quarto grupo de oito cavalos é mantido como controle ambiental não-vacinado. A cavalos tratados são é dada uma primeira dose de vacina de acordo com o grupo ao qual eles estão designados. Em vinte e um dias seguintes à administração da primeira dose, uma segunda dose da mesma vacina é administrada. Todos os cavalos são sangrados para soro na hora da administração das primeira e segunda doses e em intervalos semanalmente através de 28 dias após a segunda administração da dose.

Vacina de Teste A

Componente Vírus West Nile-Inativo

MEM¹

Conc./Dose

Volume/mL

1x10⁷TCID₅₀

NA

0,0347 ml 0,9138 ml

15/23

Óleo SP	5%	0,0500 ml
Polimixina B1 2	30,0 mcg/ml	0,0003 ml
Neomicina	30,0 mcg/ml	0,0003 ml
Timerosal (5%)	1:20.000	0,0010 ml
Vacina de Teste B
Componente	Conc./Dose	Volume/mL
Vírus West Nile-Inativo	5 x 107 TCID50	0,1734 ml
MEM	NA	0,7752 ml
Óleo SP	5%	0,0500 ml
Polimixina B2	30,0 mcg/ml	0,0002 ml
Neomicina3	30,0 mcg/ml	0,0002 ml
Timerosal4 * * (5%)	1:20.000	0,0010 ml
Vacina de Teste C
Componente	Conc./Dose	Volume/mL
Vírus West Nile-Inativo	1 x 108 TCID50	0,3467 ml
MEM1	NA	0,6019 ml
Óleo SP	5%	0,0500 ML
Polimixina B2	30,0 mcg/ml	0,0002 ml
Neomicina3	30,0 mcg/ml	0,0002 ml
Timerosal4 (5%)	1:20.000	0,0010 ml

¹ LTI, Grand Island, NY ² Sigma, St Louis, MO ³ Sigma, St Louis, MO ⁴ Sigma, St Louis, MO [0050] Os dados sorológicos obtidos são mostrados em Tabela I abaixo, onde: 0 DPV 1 designa dia zero, pré-vacinação; e 14 DPV 2 designa dia 14, pós-vacinação. NR designa nenhum resultado.

[0051] Como pode ser visto a partir dos dados na Tabela I, cavalos tratados de todos os grupos mostraram aumentos significantes em anticorpos a vírus West Nile enquanto os cavalos de controle mantiveram

16/23 um baixo nível de anticorpo não-resistente. O nível de resposta nos cavalos que receberam vacina foi independente do nível de antígeno na vacina que eles receberam.

Tabela I
Vacina de Teste	Dose (TC1D50)	Teste #1	Teste #2
0DPV1	14DPV2	0DPV1	14DPV2
A	1x107	<10	160	<10	80
A	1x107	<10	20	<10	10
A	1x107	<10	>320	<10	40
A	1x107	<10	80	<10	>320
A	1x107	<10	80	<10	40
A	1x107	<10	80	<10	160
A	1x107	<10	40	<10	40
A	1x107	<10	80	<10	80
A	1x107	<10	160	<10	80
A	1x107	<10	40	<10	10
A	1x107	<10	40	<10	10
A	1x107	<10	160	<10	40
A	1x107	<10	>320	<10	NR*
A	1x107	<10	>320	<10	NR
A	1x107	<10	>320	<10	80
A	1x107	<10	160	<10	20
A	1x107	>20	>320	<10	160
A	1x107	<10	80	<10	80
A	1x107	<10	80	<10	160
A	1x107	<10	160	<10	160
B	5x107	<10	80	<10	40
B	5x107	<10	20	<10	<10
B	5x107	<10	>320	<10	160
B	5x107	<10	80	<10	>320

17/23

B	5x107	<10	>320	<10	160
Tabela I (continuação)
Vacina	Dose	Teste #1	Teste #2
de Teste	(TC1Dsn)	0DPV1	14DPV2	0DPV1	14DPV2
B	5x107	<10	80	<10	80
B	5x107	<10	160	<10	>320
B	5x107	<10	80	<10	40
B	5x107	<10	160	<10	40
B	5x107	<10	40	<10	80
B	5x107	<10	20	<10	20
B	5x107	<10	>320	<10	160
B	5x107	<10	>40	10	>320
B	5x107	<10	80	<10	40
B	5x107	<10	80	<10	NR
B	5x107	<20	>320	<10	80
B	5x107	>20	160	<10	80
B	5x107	<10	>320	<10	160
B	5x107	<10	>320	<10	>320
B	5x107	<10	80	<10	160
C	1x108	<10	>320	<10	>320
C	1x108	<10	>320	<10	160
C	1x108	<10	160	<10	80
C	1x108	<10	>320	<10	NR
C	1x108	<10	40	<10	40
Controle	0 <10	<10	<10	<10
Controle	0 <10	<10	<10	<10
Controle	0 <10	<10	<10	<10
Controle	0 <10	<10	<10	NR
Controle	0 <10	<10	<10	<10
Controle	0 <10	<10	<10	<10

18/23

Controle 0	<10	<10	<10	<10
Controle 0	<10	<10	<10	<10
EXEMPLO 3

Avaliação de Segurança da Vacina de Teste em Cavalos Sob Condições de Campo [0052] Nesta avaliação, 200 cavalos machos e fêmeas saudáveis são vacinados com uma dose de 6 x 10⁶ de TCID₅₀ de vacina de teste inativa administrada como uma vacinação de dose de 1 mL por administração intramuscular e seguido em três a quatro semanas por uma segunda vacinação de dose de 1 mL. Os cavalos tratados são alojados e alimentados usando práticas de frugalidade convencionais para fazenda ou estábulo. Todos os cavalos tratados são observados por um veterinário por 30 minutos seguinte à vacinação para reações imediatas tais como salivação, cansaço ou respiração irregular, agitação, ou anafilaxia. Por duas semanas pós-vacinação, os cavalos são observados diariamente para quaisquer reações tardias tais como letargia, anorexia, ou inchação incomum no local da injeção. Amostras de sangue de 5 a 10 mL são tomadas por venipunção a partir de cavalos tratados no dia da primeira vacinação (dia Zero) e pelo menos uma vez mais em duas ou mais semanas após a segunda vacinação (dia 36 ou mais). Análises sorológicas usando teste de PRNT^{* 5} são executadas.

Vacina de Teste

Componente

Vírus West Nile-Inativo

Óleo SP

MEM

Conc./Dose 6x10⁶ TCID₅₀ 5%

N/A

Volume/mL

0,21 ml 0,05 ml 0,74 ml ⁵Chang, G.J.; Hunt, A.R. and Davis B., Journal of Virology, 74 pp 42445422 (2000).

[0053] Menos do que 2% dos cavalos foram observados a terem

19/23 quaisquer sinais clínicos de debilitação. Esta avaliação demonstra que a vacina da invenção é segura para uso em cavalos sob condições de campo.

EXEMPLO 4

Avaliação de Eficácia da Vacina de Teste (Preparações Multivalente e

Monovalente) em Cavalos sob Condições de Campo [0054] A eficácia de uma vacina de combinação contendo vírus West Nile morto (WNV) contra contestação de WNV experimental foi avaliada.

[0055] Um total de 30 cavalos foi distribuído em um grupo vacinado (20 cavalos) e um grupo de controle (10 cavalos). Cavalos no grupo vacinado receberam intramuscularmente duas doses da vacina de teste contendo vírus West Nile morto (5 x 10⁷ de TCID₅₀ por dose com óleo SP a 5%), vírus da gripe, vírus de encefalomielite (Ocidental, Oriental e Venezuelano), vírus de rinopneumonite (serótipos 1 e 4), e toxóide do tétano, três semanas à parte. Amostras de soro foram coletadas periodicamente para resposta do anticorpo medida por teste de neutralização de redução de placa (PRNT). Vinte e quatro (24) dias após a segunda vacinação, todos os cavalos foram contestados subcutaneamente com WNV. Após contestação, cavalos foram monitorados por temperatura retal e quaisquer sinais clínicos duas vezes ao dia por duas semanas e uma vez semanalmente por conseguinte para detecção de viremia. Cavalos foram eutanizados e necropsiados em 21 e 22 DPC. Amostras de tecido de fluido cerebroespinhal (CSF), medula espinhal (cervical, torácica e lombar) e cérebro (frontal, ocipital, medula oblongata, e tronco cerebral) foram examinadas para patologia volumosa e coletadas para isolamento de vírus.

[0056] Quatorze dias após a segunda vacinação, 75% dos animais vacinados soroconvertidos (titulação > 5) com uma titulação de média geométrica de 10 enquanto animais de controle permaneceram nega20/23 tivos (titulação < 5). A vacinação conferiu uma proteção significante contra viremia (um precursor para desenvolvimento de doença de Vírus West Nile de inchação completa). Nove de 10 (90%) controles desenvolveram viremia após contestação, enquanto somente oito de 20 (40%) vacinados tiveram viremia transitória, ou viremia durando somente uns poucos dias no máximo. De importância, nenhum sinal clínico de doença WNV foi observado em qualquer um dos animais vacinados contestados por todo o período de observação. (Respostas febris transitórias foram observadas em um controle e dois cavalos vacinados. Entretanto, não houve evidência para sugerir que estas respostas foram devido à infecção por WNV). Hemorragia petequial em massa branca e hemorragia subdural foram encontradas no tecido cerebral de um animal de controle. WNV foi isolado a partir do cérebro mas não de amostras do CSF e medula espinhal coletadas deste animal. Nenhum WNV foi isolado de qualquer uma das amostras de tecido coletadas a partir de outros cavalos contestados.

[0057] Resultados deste estudo demonstraram uma proteção significante contra ambos viremia e sinais de doença de WNV clínica em cavalos vacinados com a vacina de combinação de teste.

[0058] Um segundo estudo foi conduzido com um protocolo similar àquele acima, exceto que uma vacina de WNV monovalente (vacina de WNV sozinha) foi utilizada, e todos os cavalos foram contestados com WNV em 12 meses após a segunda vacinação. Nove de 11 (81,8%) dos controles desenvolveram viremia após contestação, enquanto somente um de 19 (5,3%) dos vacinados teve viremia transitória. Nenhum sinal clínico associado a WNV foi observado em qualquer um dos animais contestados por todo o período de observação. Nenhuma resposta febril foi observada em qualquer um dos cavalos contestados. Nenhum WNV foi isolado a partir de qualquer uma das amostras de tecido ou CSF coletadas a partir de qualquer um dos ca21/23 valos contestados. (Antes de contestar no final do período de 12 meses, 17 dos dezenove cavalos vacinados fizerem titulações de teste de neutralização de redução de placa (PRNT) de 5 ou maior, enquanto o grupo de controle permaneceu negativo (<5)).

[0059] Resultados a partir deste segundo estudo demonstram uma proteção significante (94% de fração preventiva) contra viremia em cavalos vacinados com a vacina de WNV monovalente morto. Estes resultados também demonstram uma duração longa de imunidade protetora.

EXEMPLO 5

Avaliação de Eficácia de Vacina de Teste de DNA em Cavalos sob

Condições de Campo [0060] Este exemplo demonstra a eficácia de uma vacina de DNA de Vírus West Nile (WNV), como parte de uma concretização adicional da invenção. A vacina de DNA conteve 100 qg de DNA purificado auxiliado com óleo SP a 5% por 2 mL de dose, e foi avaliada contra contestação de WNV experimental.

[0061] Para a composição de vacina de DNA de WNV, células bacteriais foram colhidas a partir de uma cultura passada 10 vezes de uma semente mestre usando E. coli DH10B obtida do Invitrogen (Carlsbad, CA) contendo um plasmídeo de West Nile pCBWN obtido do Centers for Disease Control (Fort Collins, CO). As células bacteriais foram suspensas em tampão de glicose-tris-EDTA e fragmentadas com hidróxido de sódio e dodecil sulfato de sódio. O lisato foi neutralizado com uma solução de acetato de potássio. O material complexo precipitado contendo DNA, RNA, fragmentos celulares e proteínas foi removido por filtração. O filtrado foi precipitado com a adição de álcool isopropílico. O precipitado foi coletado por centrifugação e ressuspenso em tampão. Este processo foi repetido usando acetato de amônio. O precipitado coletado foi ressuspenso em tampão e carregado em

22/23 uma coluna de cromatografia embalada com resina Polyflo®. A coluna foi então lavada e o DNA de plasmídeo foi eluído a partir da coluna. O eluato foi finalmente diafiltrado extensivamente contra salina tamponada de fosfato. As provisões de DNA de plasmídeo purificado foram então expedidas para combinação. A vacina de teste conteve 100pg de DNA de plasmídeo auxiliado com óleo Sp a 5%.

[0062] Os cavalos usados para teste foram aleatoriamente designados em dois grupos: 20 animais receberam a vacina de DNA de WNV, e 10 animais foram usados como controle. O primeiro grupo foi vacinado intramuscularmente com duas doses de 2,0 mL de vacina três semanas à parte. Os cavalos de controle não receberam vacinações ou placebos. Um grupo de cavalos (9 vacinados e 5 controles) foi contestado 5 semanas após a segunda vacinação, enquanto um segundo grupo de cavalos (11 vacinados e 5 controles) foi contestado 12 semanas após a segunda vacinação. Resumidamente, mosquitos Aedes albopictus os quais foram infectados com WNV 12 dias antes da contestação dos cavalos, foram permitidos alimentarem-se em cada cavalo por pelo menos 5 minutos. Seguindo contestação, somente aqueles mosquitos os quais foram encontrados terem engorgitado com refeições de sangue de cada cavalo foram congelados a -20°C, e o vírus carregado foi titulado como uma poça subsequente. Mosquitos foram então homogeneizados por vórtice usando diluente. O homogenato foi centrifugado e o sobrenadante foi removido para titulação em células Vero.

[0063] Após contestação, temperaturas retais foram tomadas duas vezes diariamente por pelo menos 9 dias e sinais clínicos foram monitorados duas vezes ao dia por pelo menos 21 dias. Amostras de soro foram tomadas duas vezes ao dia pelos primeiros 9 dias após contestação (DPC); uma vez diariamente de 10 a 14 DPC e finalmente a 21 DPC. Isolamento de vírus foi executado em amostras de soro de 0

23/23

DPC a 10 DPC para o primeiro grupo de contestação e de 0 DPC a 11 DPC para o segundo grupo de contestação. O primeiro grupo de 14 cavalos e o segundo grupo de 16 cavalos foram eutanizados e necropsiados 28 a 37 DPC e 29 a 38 DPC, respectivamente. Amostras de Fluido cerebroespinhal (CSF) e de tecido do cérebro, cerebelo e o tronco cerebral foram coletadas para patologia volumosa e isolamento do vírus.

[0064] A 14 dias após a segunda vacinação, 6 de 20 vacinados tiveram uma titulação mensurável de 2 ou mais, e um cavalo teve uma titulação de 5. Vacinação conferiu proteção contra contestação de West Nile experimental usando mosquitos. Viremia foi detectada em 5 de 5 animais de controle e 4 de 9 vacinados no primeiro grupo de contestação, enquanto 4 de 5 controles e 2 de 11 vacinados foram virêmicos no segundo grupo de contestação de cavalos. A viremia detectada foi transitória, e ocorreu somente dentro dos primeiros seis dias após contestação. Como um todo, viremia foi detectada em 9 de 10 (90%) dos cavalos de controle, enquanto somente 6 de 20 (30%) vacinados foram detectados com viremia.

[0065] Nenhum sinal neurológico atribuível para a infecção por WNV foi observado em qualquer um dos estudos com cavalos por todo o período de observação de contestação. Nenhum WNV foi isolado a partir de qualquer uma das amostras de tecido coletadas de qualquer um dos cavalos de estudo. Um cavalo do primeiro grupo de contestação o qual foi eutanizado em 7 DPC não mostrou nenhuma evidência volumosa ou microscópica de encefalite ou meningite.

[0066] Resultados deste estudo demonstraram uma proteção significante contra viremia em cavalos vacinados com a vacina de teste.

1/2

Claims (11)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Composição de vacina, caracterizada pelo fato de que compreende:

   (i) 100 a 250 microgramas por dose de um plasmídeo como definido na SEQ ID NO: 1;

   (ii) 4 a 10% em vol/vol de um adjuvante compreendendo óleo SP compreendendo

   a) esqualano, copolímero de bloco de polioxietileno/polioxipropileno, monooleato de polioxietileno sorbitano, e

   b) uma solução salina tamponada; e (iii) um veículo farmaceuticamente aceitável, qsp.
2. 2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o óleo SP está presente na quantidade de 4% a 5% em vol/vol da composição de vacina.
3. 3. Composição de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o óleo SP compreende de 1 a 3% em vol/vol de copolímero de bloco de polioxietileno/polioxipropileno, de 2 a 6% em vol/vol de esqualano e de 0,1 a 0,5% em vol/vol de monooleato de polioxietileno sorbitano, com o restante sendo a solução salina tamponada.
4. 4. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que é formulada em pelo menos duas unidades de dosagem.
5. 5. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a composição é fornecida em uma ou mais unidades de dosagem de 0,5 a 5 ml da composição.
6. 6. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de ser para uso na

   Petição 870170087706, de 13/11/2017, pág. 3/15

   2/2 prevenção ou melhora de encefalite de West Nile em equídeos.
7. 7. Composição de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que os ditos equídeos são cavalos.
8. 8. Composição de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que os ditos cavalos são éguas prenhas.
9. 9. Composição de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a dita composição de vacina é administrada parenteralmente.
10. 10. Composição de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a dita composição de vacina é administrada intramuscularmente.
11. 11. Uso de plasmídeo pCBWN como definido na SEQ ID NO: 1, caracterizado pelo fato de ser na preparação de uma composição de vacina como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 10 para a prevenção ou melhora de encefalite de West Nile em equídeos.

    Petição 870170087706, de 13/11/2017, pág. 4/15

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