KR20150129746A - 피타아제 제제 - Google Patents

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KR20150129746A
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Abstract

액상 효소 제제, 효소 과립 제제, 유동층 건조기를 이용하는 효소 과립의 제조 방법으로서, 상기 효소 과립은 열안정성 코팅을 필요로 하지 않고 열안정적인 방법이 제공된다. 상기 효소 과립은 동물 사료의 제조에 사용되는 피타아제 과립이며, 여기서 상기 피타아제 과립은 열안정성 코팅을 필요로 하지 않고 열안정적이며, 상기 피타아제는 80℃에서의 펠렛화 후 이의 활성의 약 63%∼약 134%를 유지한다.

Description

피타아제 제제{PHYTASE FORMULATION}
본 발명은 액상 효소 제제, 입상 효소 제제, 및 효소 과립이 열안정성 코팅을 필요로 하지 않고 열안정적인, 유동층 건조기를 이용하는 효소 과립의 제조 방법에 관한 것이다.
동물 사료의 제조 공정은 잘 확립되어 있다. 동물 사료의 산업적 규모의 생산은 공급 원료를 얻는 단계, 공급 원료를 분쇄하는 단계, 건조 및/또는 액상 성분과 공급 원료를 혼합하는 단계, 펠렛화 단계 및 건조 단계를 수반한다.
동물 사료의 미가공(raw) 성분인 공급 원료는 하기를 비롯한 다양한 공급원으로부터 온다: 동물; 식용 부산물; 및 첨가제, 예컨대 비타민, 미네랄, 효소 및 다른 영양소(SAPKOTA; Environ Health Perspect. 2007 May; 115(5): 663-670).
효소와 같은 동물 사료 첨가제는 영양소를 방출하고 동물에서의 필수 비타민 및 미네랄의 흡수를 증가시킴으로써 사료의 영양가를 증가시키기 위해, 즉, 동물 폐기물 내 유해 물질을 감소시키면서 동물 제품 수율을 증가시키기 위해 설계된다.
동물 사료의 제조에서 첨가제로서 사용되는 효소는 하기를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다: 피타아제, 셀룰라아제, 락타아제, 리파아제, 프로테아제, 카탈라아제, 크실라나아제, 베타-글루카나아제, 만나나아제, 아밀라아제, 아미다아제, 에폭시드 히드롤라아제, 에스테라아제, 포스포리파아제, 트랜스아미나아제, 아민 옥시다아제, 셀로비오히드롤라아제, 암모니아 리아제, 또는 이의 임의의 조합.
효소는 보통 건조 효소 과립으로서 또는 액상 효소 제제로서 동물 사료 제조 공정에 도입된다. 건조 효소 제제 또는 액상 효소 제제의 선택은 동물 사료 분쇄기에 사용되는 조작 조건에 따라 달라진다. 예컨대, 동물 사료 제조의 혼합 및 펠렛화 공정 동안의 온도는 37℃∼95℃ 범위이다.
액상 효소 제제는 펠렛화 공정 동안 일어날 수 있는 효소(들)의 열 불활성화를 피하기 위해 펠렛화 후 사료 또는 식품에 첨가될 수 있다. 그러나, 최종 사료 또는 식품 제제 내 효소의 양은 일반적으로 매우 적어서, 사료 또는 식품 내 효소의 균질한 분배를 달성하기 어렵게 하며, 액체는 주지의 사실로서 건조 성분보다 균일하게 혼합하기가 더욱 어렵다. 또한, 이는 대부분의 사료 분쇄기에서 최근에는 이용 가능하지 않은(추가 비용으로 인함), 펠렛화 후 사료에 액체를 첨가하기 위한 전문화된(고가의) 장비를 필요로 한다. 효소를 포함하는 액상 제제를 적용시에도, 이러한 제제의 저장 안정성은 종종 문제가 된다. WO 2005/074705를 참조하라.
펠렛화 공정 전에 건조 또는 입상 효소 제제를 믹서에 첨가할 수 있다. 그러나, 혼합 및 펠렛화 공정 동안 이용되는 고온은, 최종 사료 펠렛 중에서 효소가 활성인 채로 남기 위해, 일반적으로 특별히 코팅된 과립화 효소 제제를 필요로 한다. 추가로, 효소는 일반적으로 액상 제제로 제조되어서, 효소의 과립으로의 건조 공정, 과립 코팅, 과립의 사료 분쇄기로의 수송, 및 사료 믹서에의 과립 첨가가 비용 및 시간을 추가시킨다.
압출, 고전단 과립화 및 유동층 과립화를 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 과립화 기술이 있다.
압출 및 구상화(spheronizatioin) 공정은 효소, 담체를 혼합하고 혼합물을 압출하여 과립을 형성시키는 과립 제조 공정이다.
고전단 과립화는 일반적으로 건조 성분 및 액상 성분을 혼합 블레이드, 쵸퍼 및/또는 임펠러로 혼합하는 것을 포함한다. 혼합은 고강도 또는 저강도에서 실시할 수 있다.
유동층 과립화는 성분이 가열 공기 중에 뜨고 성분의 응집이 일어나며 과립이 건조되고 층으로 떨어지는 단일 용기를 수반한다. 유동층 과립화의 이점은, 이것이 단위 조작 및 제조 비용을 감소시킨다는 것이다. 그러나, 고온 공기는 효소의 활성을 변성, 감소 또는 변성 및 감소시킬 수 있다. 따라서, 유동층 과립화 공정에 사용될 수 있는 열안정성 효소 및 효소 제제, 또는 이의 조합을 제공할 필요가 존재한다.
일구체예에서, 제조된 효소 과립은 동물 사료용 첨가제로서 사용된다.
하기를 포함하는 다양한 동물이 효소 함유 동물 사료로부터 이익을 얻을 수 있다: 비반추 동물, 예컨대 가금류, 영계(broiler), 조류, 닭, 암탉, 칠면조, 오리, 거위 및 가금류; 반추 동물, 예컨대 암소, 소, 말 및 양; 돼지(pig 및 swine), 새끼 돼지, 성장하는 돼지(growing pig) 및 암퇘지; 고양이, 개, 설치류 및 토끼를 포함하나 이에 한정되지 않는 반려 동물; 연어, 송어, 틸라피아, 메기 및 잉어를 포함하나 이에 한정되지 않는 어류; 및 새우 및 참새우를 포함하나 이에 한정되지 않는 갑각류.
본 명세서에서 사용되는 바의 "효소"는 동물 사료용 첨가제로서 사용될 수 있는 임의의 효소를 지칭한다. 예컨대, 본 발명에 유용한 효소는 하기를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다: 피타아제, 락타아제, 리파아제, 프로테아제, 카탈라아제, 크실라나아제, 셀룰라아제, 글루카나아제, 만나나아제, 아밀라아제, 아미다아제, 에폭시드 히드롤라아제, 에스테라아제, 포스포리파아제, 트랜스아미나아제, 아민 옥시다아제, 셀로비오히드롤라아제, 암모니아 리아제 및 이의 임의의 조합.
"피타아제"는 피테이트 기질로부터의 1 이상의 포스페이트기의 제거를 촉매화하는 효소이다. 다른 구체예에서, 피타아제는 피트산(미오-이노시톨-헥사키스포스페이트)의 포스페이트 및 6개보다 적은 포스페이트기를 갖는 미오-이노시톨로의 가수분해를 촉매화하는 인산 모노에스테르 히드롤라아제 효소이다. Nomenclature Committee of International Union of Biochemistry and Molecular Biology(IUBMB) 및 Bairoch A., "The ENZYME database in 2000," Nucleic Acids Res 28:304-305(2000)의 권고에 따르면, 피타아제는 다양한 명칭 및 식별 번호로 기재될 수 있다. 다른 구체예에서, 피타아제는 효소 위원회(EC) 번호 EC 3.1.3.8로서 특징화되며, 또한 1-피타아제; 미오-이노시톨-헥사키스포스페이트 3-포스포히드롤라아제; 피테이트 1-포스파타아제; 피테이트 3-포스파타아제; 또는 피테이트 6-포스파타아제로도 지칭된다. 다른 구체예에서, 피타아제는 EC 3.1.3.26으로서 특징화되며, 4-피타아제; 6-피타아제(1D-넘버링이 아닌 1L-넘버링 시스템에 기초한 명칭); 또는 피테이트 6-포스파타아제로도 지칭된다. 다른 구체예에서, 피타아제는 EC 3.1.3.72로서 특징화되며, 5-피타아제로도 지칭된다. 다른 구체예에서, 피타아제는 히스티딘 산 포스파타아제(HAP); β-프로펠러 피타아제; 퍼플 산 포스파타아제(PAP); 및 단백질 티로신 포스파타아제(PTP)이다. 일부 구체예에서, 피타아제는 당업계에 공지된 명명법을 이용하여 기재된다.
"이노시톨 포스파타아제"는 이노시톨 포스페이트 분자로부터의 1 이상의 포스페이트기의 제거를 촉매화하는 효소이다.
"피테이트" 또는 피트산은 미오-이노시톨 헥사포스페이트이다. 이는 이노시톨 포스페이트의 완전 인산화 형태이다.
"이노시톨 포스페이트"는 히드록실 위치 중 1 이상에서 인산화되는 미오-이노시톨이다.
"셀룰라아제"는 예컨대 셀룰로오스, 글루코만난, 만난, 글루칸 및 크실로글루칸과 같은 중합체 탄수화물 화합물의 가수분해를 촉매화하는 효소이다.
"크실라나아제"는 선형 다당류 베타-1,4-크실란의 크실로오스로의 분해를 촉매화하는 효소이다.
"글루카나아제"는 글루코오스 하위 단위를 포함하는 글루칸의 분해를 촉매화하는 효소이다. 글루카나아제의 예는 알파-1,4-글루카나아제, 알파-1,6-글루카나아제, 풀룰라나아제, 베타-1,3-글루카나아제, 베타-1,4-글루카나아제 및 베타-1,6-글루카나아제를 포함한다.
"만나나아제"는 만노오스 다당류 중합체의 분해를 촉매화하는 효소이다.
"아밀라아제"는 다당류, 올리고당류 및/또는 전분을 글루코오스 하위 단위로 분해하기 위한, 1,4-알파-D-글루코시드 결합의 가수분해를 촉매화하는 효소이다.
본 명세서에서 사용되는 바의 용어 "포함하다"는 "포괄하다", "함유하다" 또는 "∼을 특징으로 한다"와 동의어이며, 포괄적 또는 비제한적이며, 추가의 열거되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다.
효소는 적어도 약 65℃∼약 95℃의 고온 처리 후에 또는 95℃ 초과의 온도에서 실질적인 양의 이의 활성을 유지할 경우 "열안정적"이라 한다.
일부 구체예에서, 열안정성 효소는 펠렛화 공정 후 이의 활성의 적어도 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%를 유지한다. 일구체예에서, 펠렛화 공정은 적어도 75℃, 80℃, 85℃, 88℃, 90℃ 또는 93℃의 온도에서 수행된다.
"효소의 조합"은 동물 사료용 첨가제로서 사용될 수 있는 효소의 임의의 조합이다. 이러한 효소의 조합의 예를 하기 표 1에 기재한다.
Figure pct00001
본 명세서에서 사용되는 바의 "액상 효소 제제"는 효소, 완충제, 안정화제 및 항균제를 포함하는 조성물이다.
일구체예에서, 액상 효소 제제는 효소를 포함하며, 여기서 효소는 피타아제, 셀룰라아제, 락타아제, 리파아제, 프로테아제, 카탈라아제, 크실라나아제, 베타-글루카나아제, 만나나아제, 아밀라아제, 아미다아제, 에폭시드 히드롤라아제, 에스테라아제, 포스포리파아제, 트랜스아미나아제, 아민 옥시다아제, 셀로비오히드롤라아제, 암모니아 리아제, 또는 이의 임의의 조합이다.
일구체예에서, 액상 효소 제제는 시트르산나트륨, 시트르산칼륨, 시트르산, 아세트산나트륨, 아세트산, 인산나트륨, 인산칼륨 및 이의 임의의 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는 완충제를 포함한다.
일구체예에서, 액상 효소 제제는 안정화제를 포함하며, 여기서 안정화제는 염화나트륨, 소르비톨, 글리세롤, 수크로오스, 만니톨, 트레할로오스, 또는 이의 임의의 조합이다. 다른 구체예에서, 액상 효소 제제는 2가지 안정화제를 포함할 수 있다.
일구체예에서, 액상 효소 제제는 항균제를 포함하며, 여기서 항균제는 소르브산칼륨; 소르브산나트륨, 소르브산; 벤조산나트륨; 벤조산, 프로피온산칼슘, 프로피온산나트륨, 프로피온산암모늄; 프로피온산 또는 이의 임의의 조합이다.
일구체예에서, 액상 효소 제제를 하기 표 2에 기재한다.
Figure pct00002
일구체예에서, 액상 효소 제제는 액상 제품이며, 여기서 액상 제품은 펠렛화 후에 적용된다. 다른 구체예에서, 액상 제품은 효소, 염화나트륨, 소르비톨, 시트르산나트륨, 소르브산칼륨 및 벤조산나트륨이다. 다른 구체예에서, 액상 제품은 11,000∼12,000 단위/g을 갖는 피타아제, 염화나트륨 15%, 소르비톨 4%, 시트르산나트륨 50 mM, 소르브산칼륨 0.2%, 벤조산나트륨 0.1% 및 프로피온산나트륨 0.1%(모든 %는 w/v%임)를 갖는 조성물이다. 다른 구체예에서, 액상 제품은 11,000∼12,000 단위/g을 갖는 피타아제, 염화나트륨 15%, 수크로오스 6%, 시트르산나트륨 50 mM, 소르브산칼륨 0.2%, 벤조산나트륨 0.1%, 프로피온산나트륨 0.1%(모든 %는 w/v%임)를 갖는 조성물이다.
일구체예에서, 액상 효소 제제는 액상 농축물이며, 여기서 액상 농축물은 펠렛화 공정 전에 사료 매쉬에 첨가된다. 일구체예에서, 액상 농축물은 효소 및 수크로오스 및 염화나트륨 및 시트르산나트륨 및 소르브산칼륨, 벤조산나트륨 및 프로피온산나트륨이다. 다른 구체예에서, 액상 농축물은 하기를 포함하는 조성물이다: 44,000-48,000 단위/g을 갖는 피타아제, 20% 수크로오스, 1% NaCl, 50mM 시트르산나트륨, pH 5.1, 0.1% 벤조산나트륨, 0.4% 소르브산칼륨, 0.4% 프로피온산나트륨. 다른 구체예에서, 액상 농축물은 하기를 포함하는 조성물이다: 44,000-48,000 단위/g을 갖는 피타아제, 2%-40% 소르비톨, 1% NaCl, 50mM 시트르산나트륨, pH 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 또는 5.5, 0.1% 벤조산나트륨, 0.4% 소르브산칼륨, 0.4% 프로피온산나트륨. 다른 구체예에서, 액상 농축물은 최종 제품이 아니고, 액상 제품 및 입상 건조 제품의 제조에 나중에 사용되는 중간 조성물 또는 제제이다.
본 명세서에서 사용되는 바의 "입상 효소 제제"는 하기를 포함하는 조성물이다: 담체; 효소, 완충제, 안정화제, 결합제, 가소제, 항균제, 또는 이의 임의의 조합을 포함하는 1차 용액. 다른 구체예에서, 입상 효소 제제는 하기를 포함하는 조성물이다: 담체; 효소, 완충제, 안정화제, 결합제, 가소제, 항균제를 포함하는 1차 용액 및 증강제, 가소제, 또는 이의 임의의 조합을 포함하는 2차 용액. 일구체예에서, 입상 효소 제제는 효소 과립이 보호성 코팅을 가질 필요가 없이 열안정적이다. 다른 구체예에서, 입상 생성물은 효소, 수크로오스, 염화나트륨, 시트르산나트륨, 소르브산칼륨, 벤조산나트륨, 프로피온산나트륨, 구아검, 밀가루이다.
일구체예에서, 1차 용액은 액상 효소 제제이다. 다른 구체예에서, 액상 효소 제제는 액상 제품 또는 액상 농축물이다.
일구체예에서, 입상 효소 제제는 담체를 포함하며, 여기서 담체는 소맥분이다. 다른 구체예에서, 담체는 전분이다. 일구체예에서, 소맥분은 밀가루이다. 다른 구체예에서, 밀가루는 표백 밀가루이다. 다른 구체예에서, 담체는 밀가루 및 말토덱스트린이다. 다른 구체예에서, 담체는 밀가루 및 전호화 전분이다. 다른 구체예에서, 말토덱스트린 또는 전호화 전분은 소맥분과의 건조 혼합물로서 사용된다. 다른 구체예에서, 소맥분은 밀가루 또는 표백 소맥분이다. 일구체예에서, 말토덱스트린 또는 전호화 전분은 건조 혼합물로서 사용된다. 일구체예에서, 밀가루 및 카올린은 건조 혼합물이다.
일구체예에서, 입상 효소 제제는 효소를 포함하며, 여기서 효소는 피타아제, 셀룰라아제, 락타아제, 리파아제, 프로테아제, 카탈라아제, 크실라나아제, 베타-글루카나아제, 만나나아제, 아밀라아제, 아미다아제, 에폭시드 히드롤라아제, 에스테라아제, 포스포리파아제, 트랜스아미나아제, 아민 옥시다아제, 셀로비오히드롤라아제, 암모니아 리아제, 또는 이의 임의의 조합이다.
일구체예에서, 입상 효소 제제는 완충제를 포함하며, 여기서 완충제는 시트르산나트륨, 시트르산칼륨, 시트르산, 아세트산나트륨, 아세트산, 인산나트륨, 인산칼륨 및 이의 임의의 조합이다.
일구체예에서, 입상 효소 제제는 안정화제를 포함하며, 여기서 안정화제는 수크로오스, 염화나트륨, 소르비톨, 글리세롤, 수크로오스, 만니톨, 트레할로오스, 카올린, 규산알루미늄, 규산마그네슘 또는 이의 임의의 조합이다.
일구체예에서, 입상 효소 제제는 결합제를 포함하며, 여기서 결합제는 구아검, 크산탄, 알겐산나트륨, 로커스트빈검, 카라기난검, 전호화 개질 전분, 말토덱스트린, 젤라틴, 메틸 셀룰라아제, 히드록시프로필 셀룰라아제, 히드록시프로필 메틸 셀룰라아제, 카르복시메틸 셀룰라아제, 또는 이의 임의의 조합이다. 다른 구체예에서, 천연 검은 개별적으로 또는 2 이상의 검의 조합으로서 사용될 수 있다. 다른 구체예에서, 전분 또는 말토덱스트린은 구아검과 병용된다. 다른 구체예에서, 전분 또는 말토덱스트린은 안정화제로서도 작용한다.
일구체예에서, 입상 효소 제제는 가소제를 포함하며, 여기서 가소제는 하기로 이루어진 군에서 선택된다: 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜, 시트르산트리에틸, 트리아세틴, 트리에틸시트르산아세틸.
일구체예에서, 입상 효소 제제는 항균제를 포함하며, 여기서 항균제는 소르브산칼륨, 소르브산나트륨, 소르브산, 프로피온산, 벤조산나트륨, 벤조산, 프로피온산나트륨, 프로피온산칼슘, 프로피온산암모늄, 메틸 파라벤, 또는 이의 임의의 조합이다. 다른 구체예에서, 2 이상의 항균제를 입상 효소 제제에 사용한다.
일구체예에서, 입상 효소 제제는 2차 과립화 용액을 포함하며, 여기서 2차 과립화 용액은 과립 증강제 및 가소제를 포함하는 조성물이다. 다른 구체예에서, 2차 과립화 용액은 과립 크기를 증강시키거나, 더 큰 변이성을 생성시키거나, 또는 둘다를 한다. 다른 구체예에서, 과립 크기는 약 12 메쉬∼약 100 메쉬 크기 범위의 임의의 수 메쉬 크기이다. 다른 구체예에서, 과립 크기는 약 20 메쉬∼약 80 메쉬 범위의 임의의 수 메쉬 크기이다. 다른 구체예에서, 과립 크기는 약 30 메쉬∼약 60 메쉬 범위의 임의의 수 메쉬 크기이다.
일구체예에서, 입상 효소 제제는 과립 증강제를 포함하며, 여기서 과립 증강제는 전호화 개질 전분, 말토덱스트린, 알겐산나트륨, CaCl2 포함 카라기난, CaCl2 불포함 카라기난, 붕산나트륨 포함 구아검, 붕산나트륨 불포함 구아검, 젤라틴; 메틸 셀룰로아제; 히드록시프로필 셀룰로오스; 히드록시프로필 메틸 셀룰로아제; 카르복시메틸 셀룰로아제; 염화나트륨; 황산나트륨; 카올린; 규산알루미늄, 규산마그네슘 및 이의 임의의 조합이다. 다른 구체예에서, 증강제는 입상 효소 제제에 임의 첨가된다. 다른 구체예에서, 천연 검 및 이온 조합이 보호성 겔에 검을 가교시키겠지만; 검이 이미 결합제로서 사용될 경우에는, 여분의 검의 첨가 없이 이온 단독 첨가만으로 충분할 것이다.
일구체예에서, 입상 효소 제제는 가소제를 포함하며, 여기서 가소제는 글리세롤이다. 다른 구체예에서, 전호화 개질 전분이 사용될 때 글리세롤을 사용할 수 있다.
일구체예에서, 입상 효소 제제는 유동 보조제 또는 윤활제를 더 포함하며, 여기서 유동 보조제는 하기로 이루어진 군에서 선택된다: 이산화규소, 스테아르산마그네슘, 카올린, 탈크, 규조토, 또는 이의 임의의 조합. 다른 구체예에서, 입상 효소 제제에 대한 유동 보조제 또는 윤활제의 첨가는 임의이다. 다른 구체예에서, 유동 보조제 또는 윤활제는 건조 후의 건조 블렌드이다. 다른 구체예에서, 유동 보조제 또는 윤활제는 2차 과립화 용액 중 현탁액으로서 첨가된다. 다른 구체예에서, 입상 건조 제품은 하기를 포함하는 조성물이다: 11,000∼12,000 단위/g을 갖는 피타아제, 수크로오스 4.5%, 시트르산나트륨 0.3%, 소르브산칼륨 0.1%, 벤조산나트륨 0.1%, 프로피온산나트륨 0.1%, 구아검 0-0.25% 및 밀가루 95%(모든 %는 w/w%임).
일구체예에서, 입상 효소 제제를 하기 표 3에 기재한다.
Figure pct00003
명세서에서 사용되는 성분의 양, 반응 조건 등을 나타내는 모든 수는 모든 경우 용어 "약"으로 변경되는 것으로 이해해야 한다. 따라서, 반대로 지시되지 않는 한, 본 명세서에 기재된 수 파라미터는 얻고자 하는 소정 특성에 따라 달라질 수 있는 대략치이다. 적어도 그리고 본 출원에 대한 우선권을 청구하는 임의의 출원의 임의의 청구범위의 범위에 대한 등가물의 원리의 적용을 한정하려는 시도가 아니며, 각각의 수 파라미터는 유의적인 자리수 및 보통의 주위의 접근법의 수의 관점에서 해석되어야 한다. 또한, 본 출원에 개시된 수 범위는 포괄적인 것이며, 범위 내의 자리수 모두를 개시한다. 예컨대, 4.5∼5.5의 pH 범위는 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4 및 5.5의 pH를 포함한다.
상기 설명은 본 발명의 몇 가지 방법 및 재료를 개시한다. 본 발명에는 제작 방법 및 장비의 변경 뿐 아니라, 방법 및 재료의 변경의 여지가 있다. 이러한 변경은 본 개시 또는 본 명세서에 개시된 본 발명의 실시의 고려로부터 당업자에게는 명백할 것이다. 결과적으로, 본 발명을 본 명세서에 개시된 특정 구체예에 한정시키려 하지 않으며, 본 발명은 본 발명의 참 범위 및 사상 내에 있는 모든 변경 및 대체를 커버한다.
공개 및 비공개 출원, 특허 및 참고문헌을 포함하나 이에 한정되지 않는 본 명세서에 기재된 모든 참고물은 그 전체를 본 명세서에서 참고로 인용하며, 이에 의해 본 명세서의 일부를 이룬다. 참고에 의해 인용되는 공개 및 특허 또는 특허 출원이 본 명세서에 포함된 개시에 모순되는 경우에는, 본 명세서는 임의의 이러한 모순되는 자료를 대체하고 및/또는 이에 우선하고자 한다.
실시예
실시예 1
(비입상 피타아제의 비교예)
제제 1 - 10% 염화나트륨 및 10% 소르비톨을 함유하는 액상 농축물 피타아제 제제를 동결 건조에 의해 건조시켰다. 그 다음, 건조된 효소 분말을 탄산칼슘 및 쌀겨와 혼합하여 희석하여 쌀겨 효소 생성물을 형성시켰다.
제제 2 - 10% 염화나트륨 및 10% 소르비톨을 함유하는 액상 농축물 피타아제 제제를 쌀겨 위에 침지하였다. 생성된 습윤 블렌드를 동결 건조에 의해 건조시켰다. 건조된 물질을 탄산칼슘과 혼합하여 희석하여 쌀겨 효소 생성물을 형성시켰다.
펠렛화 시험 - 쌀겨 효소 생성물을 25∼100 ppm 농도로 가금류 사료 매쉬와 블렌딩하고, 75℃∼93℃ 범위의 다양한 제어 온도에서 California Pellet Mill에서 펠렛화하였다. 매쉬 혼합물을 15 초 동안 상기 온도에서 직접 증기에 의해 제1 컨디셔닝한 후, 펠렛화 프레스를 통해 펠렛화하였다. 이어서 펠렛을 건조시켰다.
효소 안정성 측정 - 출발 매쉬 및 완성된 펠렛(매쉬로 분쇄됨)을 트리스 완충제 중에서 추출하였다. 추출물 중 피타아제 활성을 변형된 AOAC 방법에 의해 측정하였다. 변형된 AOAC 방법은 증류수 + 0.01% Tween 20을 포함하는 AOAC 완충제이며(GIZZI, J. of AOAC International, Vol. 91, No. 2, 2008), 하기를 포함하는 조성물로 개질시켰다: 50 mM 트리스 pH 8.0, 0.01% Tween20, 10 mM CaCl2.
각각의 온도에서의 펠렛화된 생성물의 효소 활성의 회수%를 출발 매쉬와 비교하였다. 결과를 하기 표 4에 나타낸다.
Figure pct00004
결과는, 펠렛화된 사료로부터 추출된 피타아제 활성은 제제 1 및 제제 2 양쪽에 대한 높은 컨디셔닝 온도보다 낮음을 보여준다.
실시예 2
제제 3 - 250 g의 쌀겨를 GEA Aeromatic-Fielder Strea-1 유동층 과립기에 로딩하고; 10% 소르비톨 및 10% 염화나트륨을 함유하는 50 ml의 액상 농축물 피타아제 제제를 탑 스프레이 2 유체 노즐을 통해 쌀겨에 분무하였다. 하기 유동층 셋팅을 이용하였다: 55℃ 입구 공기 온도, 5 ml/분 분무 속도, 1 바 분무화 압력, 0.8 mm 스프레이 노즐. 효소 분무 후 쌀겨 효소 생성물을 건조시켰다.
제제 4 - 200 g의 쌀겨를 GEA Aeromatic-Fielder Strea-1 유동층 과립기에 로딩하고; 20% 수크로오스를 함유하는 100 ml의 액상 농축물 피타아제 제제를 탑 스프레이 2 유체 노즐을 통해 쌀겨에 분무하였다. 유동층 셋팅을 제제 3과 동일하게 하여 쌀겨 효소 생성물의 형성에 사용하였다.
제제 5 - 200 g의 밀가루를 GEA Aeromatic-Fielder Strea-1 유동층 과립기에 로딩하고; 20% 수크로오스 및 7% 전호화 전분을 함유하는 100 ml의 액상 농축물 피타아제 제제를 탑 스프레이 2 유체 노즐을 통해 밀가루에 분무하였다. 하기 유동층 셋팅을 이용하였다: 50℃ 입구 공기 온도, 10-15 ml/분 분무 속도, 1.5-2 바 분무화 압력, 0.8 mm 스프레이 노즐. 효소 분무 후에 밀가루 및 효소 생성물을 건조시켜 피타아제 과립을 형성시켰다.
펠렛화 시험 및 효소 안정성 측정은 실시예 1과 동일하였다. 결과를 하기 표 5에 나타낸다.
Figure pct00005
제제 3 및 4에서 담체로서 쌀겨를 사용하였다. 쌀겨는 미분쇄되지 않았고, 흡수성이 크지 않았으며; 또한, 이들 제제에 결합제를 사용하지 않았다. 그 결과, 쌀겨 효소 생성물에서 효과적인 과립화가 보이지 않았다. 양쪽 제제에 대한 열안정성은 제제 5에 비해 높은 컨디셔닝 온도에서 비교적 낮았다. 염화나트륨 및 소르비톨로부터 수크로오스로의 안정화제 변경이 피타아제의 열안정성을 개선시켰다. 그러나, 제제 5에서와 같이 결합제로서의 전호화 전분의 사용과 조합하여, 담체를 쌀겨로부터 미분쇄 밀가루로 변경시, 밀가루 효소 생성물이 과립화되었고, 동물 사료 펠렛으로부터 추출된 피타아제의 열안정성이 모든 온도에 걸쳐, 특히 90℃에서 개선되었다.
실시예 3
제제 6 - 3 kg의 밀가루를 Vector VFC-Lab 3 유동층 과립기에 로딩하고; 20% 수크로오스 및 0.5% 구아검을 함유하는 1.6 kg의 액상 농축물 피타아제 제제를 탑 스프레이 2 유체 노즐을 통해 밀가루에 분무하였다. 유동층 셋팅을 1.2 mm 노즐 직경, 20 psi 분무화 압력, 50-55℃ 입구 공기 온도, 23-27℃ 생성물 온도, 25-50 g/분 분무 동안의 분무 속도; 70-80℃ 건조 동안의 입구 공기 온도로 하여, 45℃ 최종 생성물 온도로 건조시켜 피타아제 과립을 형성시켰다.
제제 7 - 3 kg의 밀가루를 Vector VFC-Lab 3 유동층 과립기에 로딩하고; 20% 수크로오스, 10% 말토덱스트린 및 0.5% 구아검을 함유하는 1.6 kg의 액상 농축물 피타아제 제제를 탑 스프레이 2 유체 노즐을 통해 밀가루에 분무하였다. 유동층 셋팅을 1.2 mm 노즐 직경, 20 psi 분무화 압력, 50℃ 입구 공기 온도, 23-29℃ 생성물 온도, 25-50 g/분 분무 동안의 분무 속도; 70-80℃ 건조 동안의 입구 공기 온도로 하여, 45℃ 최종 생성물 온도로 건조시켜 피타아제 과립을 형성시켰다.
펠렛화 시험 및 효소 안정성 측정은 실시예 1과 동일하였다. 결과를 하기 표 6에 나타낸다. 모든 잔류 활성을 동일한 샘플의 75℃ 안정성으로 정규화하였다.
Figure pct00006
제제 3은 실시예 2와 동일한 샘플이었고, 이 실험에서 대조로서 사용하였다. 제제 3에 대한 열안정성은 실시예 2의 값보다 낮았는데, 이는 아마 이 시험에서의 더 가혹한 펠렛화 조건 때문인 것으로 보인다. 제제 6 및 7 모두 펠렛화된 동물 사료로부터 추출시에 피타아제의 열안정성을 개선시킨 피타아제 과립이 생성되었다.
추가의 펠렛화 시험 - 열안정성의 개선을 확인하기 위해, 상이한 California Pellet Mill을 이용하여 2개의 샘플(제제 6 및 7)로부터 제조된 피타아제 과립에 대해 추가의 펠렛화 시험을 하였다. 증기 컨디셔닝 지속 기간은 40 초였고, 이는 이전 펠렛화 시험에 비해 상당히 길었다. 결과를 하기 표 7에 나타낸다. 모든 잔류 활성을 동일한 샘플의 75℃ 안정성으로 정규화하였다.
Figure pct00007
결과는, 연장된 증기 컨디셔닝 하에서도, 제제 6 및 7로부터의 피타아제 과립 모두는 높은 펠렛화 온도에서 생성된 동물 사료 펠렛으로부터 추출한 피타아제에 대한 높은 피타아제 활성을 제공함을 확인시켜 주었다.
실시예 4
제제 8 - 3 kg의 밀가루를 Vector VFC-Lab 3 유동층 과립기에 로딩하고; 20% 수크로오스, 10% 카올린 및 0.5% 구아검을 함유하는 1.6 kg의 액상 농축물 피타아제 제제를 탑 스프레이 2 유체 노즐을 통해 밀가루에 분무하였다. 유동층 셋팅을 1.2 mm 노즐 직경, 20 psi 분무화 압력, 50℃ 입구 공기 온도, 22-30℃ 생성물 온도, 25-50 g/분 분무 동안의 분무 속도; 70-80℃ 건조 동안의 입구 공기 온도로 하여, 45℃ 최종 생성물 온도로 건조시켜 피타아제 과립을 형성시켰다.
제제 9 - 3 kg의 밀가루를 Vector VFC-Lab 3 유동층 과립기에 로딩하고; 20% 수크로오스, 10% 말토덱스트린, 5% 카올린 및 0.5% 구아검을 함유하는 1.6 kg의 액상 농축물 피타아제 제제를 탑 스프레이 2 유체 노즐을 통해 밀가루에 분무하였다. 유동층 셋팅을 제제 8과 동일하게 하여 피타아제 과립을 형성시켰다.
제제 10 - 2 kg의 밀가루를 Vector VFC-Lab 3 유동층 과립기에 로딩하고; 20% 수크로오스 및 0.5% 구아검을 함유하는 1 kg의 액상 농축물 피타아제 제제를 탑 스프레이 2 유체 노즐을 통해 밀가루에 분무하고; 그 다음, 10% 개질 전분, 10% 카올린 및 1% 글리세롤을 함유하는 1 kg의 2차 과립화 용액을 분무하였다. 효소 분무 동안의 유동층 셋팅을 제제 8에서와 동일하게 하였고; 2차 과립화 용액 분무 동안, 분무 속도는 17-18 g/분, 입구 공기 온도는 60℃, 생성물 온도는 30-31℃였으며; 건조 동안, 입구 공기 온도는 70-80℃로 하여 피타아제 과립을 형성시켰다.
펠렛화 시험 및 효소 안정성 측정은 실시예 1과 동일하였고, 결과를 하기 표 8에 나타낸다.
Figure pct00008
결과는, 2차 과립화 용액 스프레이에 카올린을 포함시키면 피타아제 열안정성이 증가하며; 2차 과립화 용액의 사용으로 동물 사료 펠렛으로부터 추출된 피타아제의 피타아제 열안정성이 추가로 향상됨을 보여주었다.
실시예 5
제제 11 - 3 kg의 밀가루를 Vector VFC-Lab 3 유동층 과립기에 로딩하고; 20% 수크로오스 및 0.5% 구아검을 함유하는 1.3 kg의 액상 농축물 피타아제 제제를 탑 스프레이 2 유체 노즐을 통해 밀가루에 분무하였다. 유동층 셋팅을 1.2 mm 노즐 직경, 20 psi 분무화 압력, 50℃ 입구 공기 온도, 22-29℃ 생성물 온도, 25-50 g/분 분무 동안의 분무 속도; 70-80℃ 건조 동안의 입구 공기 온도로 하여, 45℃ 최종 생성물 온도로 건조시켜 피타아제 과립을 형성시켰다.
제제 12 - 4.6 kg의 밀가루를 5 kg 스케일 주문형(customized) 유동층 과립기에 로딩하고; 20% 수크로오스 및 0.5% 구아검을 함유하는 1.25 kg의 액상 농축물 피타아제 제제를 탑 스프레이 2 유체 노즐을 통해 밀가루에 분무하고; 그 다음, 0.5% 구아검만을 함유하는 1 kg의 2차 과립화 용액을 분무하였다. 유동층 셋팅을60-80℃ 입구 공기 온도, 28-36℃ 생성물 온도 및 40 g/분 분무 속도로 하여 피타아제 과립을 형성시켰다.
펠렛화 시험 및 효소 안정성 측정은 실시예 1과 동일하였고, 결과를 하기 표 9에 나타낸다.
Figure pct00009
결과는, 양쪽 샘플이 피타아제 열안정성을 개선시켰으며; 2차 과립화 용액의 사용으로 높은 펠렛화 온도에서 생성된 동물 사료 펠렛으로부터 추출된 피타아제의 열안정성이 추가로 향상됨을 보여주었다.
실시예 6
현재 상업적으로 입수 가능한 대부분의 열안정성 사료 효소는 열 보호 코팅에 의존한다. 이들 코팅 중 일부는 용액으로의 효소 방출을 의도하지 않게 지연시키고, 이로 인해 효소 효능을 감소시키는 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명의 입상 생성물로부터의 피타아제 활성의 시간 방출 프로필을 검사하였다.
제제 12로부터의 100 mg의 입상 피타아제를 pH 5.5의 400 ㎕의 100 mM 아세트산나트륨 완충제와 혼합하였다. 혼합물을 60 분 이하 동안 교반하였다. 지정된 시점에서, 분취량을 제거하고, 원심 분리하였다. 투명 상청액 내 피타아제 활성을 분석하였다. 결과를 하기 표 10에 나타낸다.
Figure pct00010
결과는, 피타아제가 매우 짧은 시간에 가용성이 됨을 보여준다. 한편, 일부 상업적으로 입수 가능한 열 코팅된 피타아제 과립은 20 분(데이터 미제시)만큼 많이, 용액으로의 효소 활성의 방출의 상당한 지연을 나타냈다.

Claims (22)

  1. (a) 피타아제;
    (b) 시트르산나트륨, 시트르산칼륨, 시트르산, 아세트산나트륨, 아세트산, 인산나트륨, 인산칼륨 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 완충제;
    (c) 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 글리세롤, 트레할로오스, 염화나트륨, 황산나트륨 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 안정화제; 및
    (d) 소르브산칼륨, 소르브산나트륨, 소르브산, 벤조산나트륨, 벤조산, 메틸 파라벤, 프로피온산칼슘, 프로피온산나트륨, 프로피온산암모늄, 프로피온산 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 항균제
    를 포함하는 액상 효소 제제.
  2. 제1항에 있어서, 완충제는 pH가 약 4.5∼약 5.50 범위인 액상 효소 제제.
  3. 제1항에 있어서, 안정화제는 2 이상의 안정화제의 조합인 액상 효소 제제.
  4. 제1항에 있어서, 안정화제는 약 5%∼약 30%의 농도로 존재하는 액상 효소 제제.
  5. 제1항에 있어서, 항균제는 2 이상의 항균제의 조합인 액상 효소 제제.
  6. (a) 담체;
    (b) 피타아제, 완충제, 안정화제, 결합제, 제1 가소제, 항균제, 또는 이의 임의의 조합을 포함하는 1차 용액; 및
    (c) 증강제(enhancer), 제2 가소제, 또는 이의 임의의 조합을 포함하는 2차 용액
    을 포함하는 입상(granulated) 효소 제제.
  7. 제6항에 있어서, 담체는
    (a) 소맥분(flour);
    (b) 밀가루(wheat flour);
    (c) 표백 소맥분;
    (d) 밀가루 및 말토덱스트린;
    (e) 밀가루 및 전호화 전분; 및
    (f) 전분
    으로 이루어진 군에서 선택되는 입상 효소 제제.
  8. 제6항에 있어서, 완충제는 시트르산나트륨인 입상 효소 제제.
  9. 제6항에 있어서, 안정화제는 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 글리세롤, 트레할로오스, 염화나트륨, 황산나트륨, 카올린, 규산알루미늄, 규산마그네슘 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 입상 효소 제제.
  10. 제6항에 있어서, 결합제는 구아검, 크산탄, 알겐산나트륨, 로커스트빈검, 카라기난검, 전호화 개질 전분, 말토덱스트린, 젤라틴, 메틸 셀룰로아제, 히드록시프로필 셀룰로오스, 히드록시프로필 메틸 셀룰로아제, 카르복시메틸 셀룰로아제 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 입상 효소 제제.
  11. 제6항에 있어서, 제1 가소제는 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜, 시트르산트리에틸, 트리아세틴 및 트리에틸시트르산아세틸로 이루어진 군에서 선택되는 입상 효소 제제.
  12. 제6항에 있어서, 항균제는 소르브산칼륨, 소르브산나트륨, 벤조산나트륨, 프로피온산나트륨, 프로피온산칼슘, 프로피온산암모늄, 메틸 파라벤, 벤조산, 소르브산 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 입상 효소 제제.
  13. 제6항에 있어서, 증강제는 전호화 개질 전분, 말토덱스트린, 알겐산나트륨, CaCl2 포함 카라기난, CaCl2 불포함 카라기난, 붕산나트륨 포함 구아검, 붕산나트륨 불포함 구아검, 젤라틴; 메틸 셀룰라아제; 히드록시프로필 셀룰라아제; 히드록시프로필 메틸 셀룰라아제; 카르복시메틸 셀룰라아제; 염화나트륨; 황산나트륨; 카올린; 규산알루미늄, 규산마그네슘 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 입상 효소 제제.
  14. 제6항에 있어서, 제2 가소제는 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜, 시트르산트리에틸, 트리아세틴 및 트리에틸시트르산아세틸로 이루어진 군에서 선택되는 입상 효소 제제.
  15. 제6항에 있어서, 유동 보조제를 더 포함하며, 여기서 유동 보조제는 이산화규소, 스테아르산마그네슘, 카올린, 탈크, 규조토 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 입상 효소 제제.
  16. 유동층에서의 효소 과립의 제조 방법으로서, 효소가 75℃에서 63% 이상의 활성을 유지하며,
    (a) 유동층 과립기에 건조 담체를 로딩하는 단계;
    (b) 건조 담체에 1차 효소 용액을 첨가하는 단계; 및
    (c) (a) 및 (b)의 조합을 소정 함수량으로 건조시키는 단계
    를 포함하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, (b) (i) 2차 과립화 용액을 (a) 및 (b)에 첨가하는 단계를 더 포함하는 방법.
  18. 제16항에 있어서, (d) 건조 후에 유동 보조제를 유동층 건조기 또는 건조 블렌더에 첨가하는 단계를 더 포함하는 방법.
  19. 제16항에 있어서, 2차 과립화 용액은 유동 보조제를 더 포함하는 방법.
  20. 제16항에 있어서, 효소는 피타아제, 셀룰라아제, 락타아제, 리파아제, 프로테아제, 카탈라아제, 크실라나아제(xylanase), 베타-글루카나아제, 만나나아제, 아밀라아제, 아미다아제, 에폭시드 히드롤라아제, 에스테라아제, 포스포리파아제, 트랜스아미나아제, 아민 옥시다아제, 셀로비오히드롤라아제, 암모니아 리아제 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
  21. 제16항에 있어서, 소정 함수량은 약 3%∼약 10%인 방법.
  22. 피타아제용 제제로서, 상기 피타아제는
    (a) 80℃에서 63% 이상의 활성;
    (b) 85℃에서 58% 이상의 활성;
    (c) 88℃에서 43% 이상의 활성;
    (d) 90℃에서 27% 이상의 활성; 및
    (e) 93℃에서 6% 이상의 활성
    을 포함하는, 하나의 온도에서 하나의 활성을 유지하는 제제.
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