JP2016513967A

JP2016513967A - フィターゼ製剤

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Publication number: JP2016513967A
Application number: JP2016500966A
Authority: JP
Inventors: ハン，ユン; ジョンプラット，マイケル; ウー，イ
Original assignee: ビーエーエスエフエンザイムズエルエルシー
Priority date: 2013-03-14
Filing date: 2014-03-10
Publication date: 2016-05-19
Anticipated expiration: 2034-03-10
Also published as: TW201940073A; AR095174A1; EP3363895A2; MX2020004124A; MX2015012682A; CA2902752A1; JP6442471B2; TWI665969B; CA3139266A1; CA2902752C; JP6968777B2; ES2745998T3; EP2970924A1; KR20150129746A; CN105102615A; JP2019068808A; EP3578644A1; EP2970924B1; US20200094208A1; KR102173529B1

Abstract

液体酵素製剤、顆粒酵素製剤、流動層乾燥機を使用する酵素顆粒製造法が与えられるが、この酵素顆粒は耐熱性コーティングの必要なしに耐熱性である。酵素顆粒は、動物飼料の製造に使用されるフィターゼ顆粒であるが、このフィターゼ顆粒は、耐熱性コーティングの必要なしに耐熱性であり、フィターゼは、80℃でペレット形成後に、約63%から約134%までの活性を保持する。【選択図】なし

Description

本発明は、液体酵素製剤、顆粒酵素製剤、ならびに流動層乾燥機を使用する酵素顆粒製造法に関するものであって、この酵素顆粒は耐熱性コーティングの必要なしに耐熱性である。

動物飼料の製造プロセスは十分に確立されている。工業的規模での動物飼料製造は一般に、原料の調達、原料の粉砕、原料と粉体材料および/または液体材料との混合、ペレット形成、ならびに乾燥を含む。

原料は、動物飼料の生の材料であって、さまざまな起源からもたらされるが、その起源は、植物；動物；可食副産物；および添加物、たとえばビタミン類、無機質、酵素、および他の栄養分などである（SAPKOTA; Environ Health Perspect. 2007 May; 115(5): 663-670）。

酵素などの動物飼料添加物は、栄養分を放出し、動物の必須ビタミンおよび無機質の吸収を高めることによって、飼料の栄養価を高めることを目的とするものであり、それがまた畜産物の収量を向上させる一方で、動物排泄物中の有害物質を減少させる。

動物飼料製造で添加物として使用される酵素には、フィターゼ、セルラーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、カタラーゼ、キシラナーゼ、β-グルカナーゼ、マンナーゼ、アミラーゼ、アミダーゼ、エポキシドヒドロラーゼ、エステラーゼ、ホスホリパーゼ、トランスアミナーゼ、アミンオキシダーゼ、セロビオヒドロラーゼ、アンモニアリアーゼ、またはそれらの任意の組み合わせがあるがそれらに限定されない。

酵素は通常、粉体の酵素顆粒として、または液体酵素製剤として、動物飼料製造プロセスに導入される。粉体の酵素製剤か液体酵素製剤かの選択は、動物飼料製造機で用いられる運転条件によって左右される。たとえば、動物飼料製造の、混合およびペレット形成工程の温度は37℃から95℃の間、またはそれ以上である。

液体酵素製剤は、ペレット形成中に起こりうる（1つまたは複数の）酵素の熱不活化を回避するために、ペレット形成後に、飼料または食料に添加することができる。しかしながら、飼料もしくは食料の最終調製品中の酵素の量は、通常ごく小量であって、そのことが飼料もしくは食料における酵素の均一分布の達成を困難にしており、しかも液体は粉体材料よりも均一に混合しにくいことで知られる。それに加えて、ペレット形成後に飼料に液体を添加するためには、特殊な（高価な）装置が必要であるが、それは現在ほとんどの飼料工場で利用できない（余分な費用がかかるため）。酵素を含む液体製剤を使用する場合でも、そうした製剤の保存安定性は問題であり、WO 2005/074705を参照されたい。

粉体すなわち顆粒状の酵素製剤は、ペレット形成工程の前にミキサーに加えることができる。しかしながら、混合およびペレット形成工程中に用いられる高温のため、最終的な飼料ペレットにおいて酵素が活性を保持するためには、通常、特別にコーティングされた顆粒酵素製剤が必要となる。その上、酵素は普通、液体製剤の形で製造されるので、酵素を乾燥させて顆粒とし、その顆粒をコーティングし、顆粒を飼料製造機に運び、飼料ミキサーにその顆粒を入れる工程は、コストおよび時間の追加となる。

押出、高剪断造粒、および流動層造粒などのさまざまな造粒技術があるがそれに限定されない。

押出および球形化は、酵素と担体を混合し、その混合物を押し出して顆粒を形作ることによって顆粒を製造するための工程である。

高剪断造粒は一般に、粉体成分および液体成分を、混合ブレード、チョッパー、および/またはインペラで混合することを含む。混合の強度は強い場合も弱い場合もある。

WO 2005/074705

SAPKOTA; Environ Health Perspect. 2007 May; 115(5): 663-670

流動層造粒には1つの容器が必要であり、その容器内で熱風中に材料を浮遊させると、材料の凝集が生じ、顆粒が乾燥して、底部に落下する。流動層造粒の利点は、単位操作および製造時間を少なくする点である。しかしながら、熱風は酵素の活性を変性、減少させる可能性があり、またはその両方の可能性がある。したがって、流動層造粒工程に使用することができる、耐熱性酵素および酵素製剤、またはそれらの組み合わせを提供する必要がある。

ある実施形態において、製造された酵素顆粒は、動物飼料用の添加物として使用される。

さまざまな動物が、酵素を含有する動物飼料から恩恵を受ける可能性があるが、そうした動物としては、たとえば家禽（poultry）、ブロイラー、鳥、ニワトリ、産卵鶏、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、および家禽（fowl）などの非反芻動物；たとえば乳牛、畜牛、ウマ、およびヒツジなどの反芻動物；豚（pigs）、豚（swine）、子豚、育成豚、および雌豚；ネコ、イヌ、齧歯動物、およびウサギなどであるがそれに限らないコンパニオンアニマル；サケ、マス、テラピア、ナマズ、およびコイなどであるがそれに限らない魚類；ならびに小エビおよびそれより大きい食用エビなどであるがそれに限らない甲殻類：などが挙げられる。
詳細な説明
本明細書で使用される「酵素」は、動物飼料用の添加物として使用することができる任意の酵素を表す。たとえば、本発明に有用な酵素は、フィターゼ、ラクターゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、カタラーゼ、キシラナーゼ、セルラーゼ、グルカナーゼ、マンナーゼ、アミラーゼ、アミダーゼ、エポキシドヒドロラーゼ、エステラーゼ、ホスホリパーゼ、トランスアミナーゼ、アミンオキシダーゼ、セロビオヒドロラーゼ、アンモニアリアーゼ、またはそれらの任意の組み合わせ、などであるがそれらに限定されない。

「フィターゼ」は、1つもしくは複数のリン酸基をフィチン酸基質から除去する反応を触媒する酵素である。もう1つの実施形態において、フィターゼは、フィチン酸（myo-イノシトール-六リン酸）を、6個未満のリン酸基を有するmyo-イノシトールおよびリン酸へと加水分解する反応を触媒する、リン酸モノエステル加水分解酵素である。国際生化学・分子生物学連合（IUBMB）命名法勧告、およびBairoch A., "The ENZYME database in 2000," Nucleic Acids Res 28:304-305(2000)にしたがって、フィターゼはさまざまな名称および識別番号で表すことができる。別の実施形態において、フィターゼは、酵素番号（EC番号）EC 3.1.3.8を有すると特徴付けられるが、1-フィターゼ；myo-イノシトール-六リン酸3-ホスホヒドロラーゼ；フィチン酸1-ホスファターゼ；フィチン酸3-ホスファターゼ；またはフィチン酸6-ホスファターゼとも称される。もう1つの実施形態において、フィターゼは、EC 3.1.3.26として位置づけられ、4-フィターゼ；6-フィターゼ（名称は1L-ナンバリングシステムに基づいており、1D-ナンバリングではない）；またはフィチン酸6-ホスファターゼとも呼ばれる。別の実施形態において、フィターゼは、EC 3.1.3.72として位置づけられ、5-フィターゼとも呼ばれる。もう1つの実施形態において、フィターゼは、ヒスチジン酸ホスファターゼ（HAP）；β-プロペラフィターゼ；紫色酸性ホスファターゼ（PAP）；およびタンパク質チロシンホスファターゼ（PTP）である。実施形態によって、フィターゼは、当技術分野で公知の命名法を用いて記述される。

「イノシトールホスファターゼ」は、イノシトールリン酸分子から1つもしくは複数のリン酸基を除去する反応を触媒する酵素である。

「フィチン酸（phytate）」もしくはフィチン酸（phytic acid）は、myo-イノシトール六リン酸である。それはイノシトールリン酸の完全にリン酸化された形である。

「イノシトールリン酸」は、myo-イノシトールがそのヒドロキシル基のうち1つもしくは複数の位置でリン酸化されている、前記myo-イノシトールである。

「セルラーゼ」は、たとえばセルロース、グルコマンナン、マンナン、グルカン、およびキシログルカンなどの高分子炭水化物の加水分解を触媒する酵素である。

「キシラナーゼ」は、直鎖状多糖β-1,4-キシランをキシロースに分解する反応を触媒する酵素である。

「グルカナーゼ」は、グルコースサブユニットを含有するグルカンの分解を触媒する酵素である。グルカナーゼの例としては、α-1,4-グルカナーゼ、α-1,6-グルカナーゼ、プルラナーゼ、β-1,3-グルカナーゼ、β-1,4-グルカナーゼ、およびβ-1,6-グルカナーゼがある。

「マンナーゼ」は、マンノース多糖ポリマーの分解を触媒する酵素である。

「アミラーゼ」は、多糖類、オリゴ糖、および/またはデンプンをグルコースサブユニットに分解する、1,4-α-D-グルコシド結合の加水分解を触媒する酵素である。

本明細書で使用される「含んでなる（comprising）」という表現は、「含む（including）」、「含有する（containing）」、または「特徴とする（characterized by）」と同義であって、両立的、すなわち無制限であり、記載されていない追加の要素もしくは方法ステップを排除しない。

酵素が、少なくとも約65℃から約95℃まで；または95℃を越える温度での高温処理後に、その活性の相当量を保持しているならば、その酵素は「耐熱性(熱安定)」である。

一部の実施形態において、耐熱性酵素は、ペレット形成工程の後、その活性の少なくとも5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、 27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%を保持している。ある実施形態において、ペレット形成工程は少なくとも75℃、80℃、85℃、88℃、90℃、または93℃の温度で実施される。

「酵素の組み合わせ」は、動物飼料用の添加物として使用することができる、酵素の任意の組み合わせである。そうした酵素の組み合わせ例を表1に示す。

本明細書で使用される「液体酵素製剤」は、酵素、バッファー、安定化剤、および抗菌剤を含んでなる組成物である。

ある実施形態において、液体酵素製剤は酵素を含んでなるが、この酵素はフィターゼ、セルラーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、カタラーゼ、キシラナーゼ、β-グルカナーゼ、マンナーゼ、アミラーゼ、アミダーゼ、エポキシドヒドロラーゼ、エステラーゼ、ホスホリパーゼ、トランスアミナーゼ、アミンオキシダーゼ、セロビオヒドロラーゼ、アンモニアリアーゼ、またはそれらの任意の組み合わせである。

ある実施形態において、液体酵素製剤はバッファーを含んでなり、そのバッファーにはクエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、クエン酸、酢酸ナトリウム、酢酸、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、およびそれらの任意の組み合わせがあるが、それに限定されない。

ある実施形態において、液体酵素製剤は安定化剤を含んでなるが、この安定化剤は塩化ナトリウム、ソルビトール、グリセロール、スクロース、マンニトール、トレハロース、またはそれらの任意の組み合わせである。別の実施形態において、液体酵素製剤は、2つの安定化剤を含んでいてもよい。

ある実施形態において、液体酵素製剤は抗菌剤を含んでなるが、この抗菌剤は、ソルビン酸カリウム；ソルビン酸ナトリウム、ソルビン酸；安息香酸ナトリウム；安息香酸、プロピオン酸カルシウム、プロピオン酸ナトリウム、プロピオン酸アンモニウム；プロピオン酸、またはそれらの任意の組み合わせである。

ある実施形態において、液体酵素製剤を表2に示す：

ある実施形態において、液体酵素製剤は液体製品であって、この液体製品はペレット形成後に適用される。別の実施形態において、液体製品は、酵素、塩化ナトリウム、ソルビトール、クエン酸ナトリウム、ソルビン酸カリウム、および安息香酸ナトリウムである。もう1つの実施形態において、液体製品は、11,000 - 12,000ユニット/gのフィターゼ、塩化ナトリウム15%、ソルビトール4%、クエン酸ナトリウム50mM、ソルビン酸カリウム0.2%、安息香酸ナトリウム0.1%、およびプロピオン酸ナトリウム0.1%を有する組成物である（%はすべてw/v%）。別の実施形態において、液体製品は、11,000-12,000ユニット/gのフィターゼ、塩化ナトリウム15%、ソルビトール6%、クエン酸ナトリウム50mM、ソルビン酸カリウム0.2%、安息香酸ナトリウム0.1%、およびプロピオン酸ナトリウム0.1%を有する組成物である（%はすべてw/v%）。

ある実施形態において、液体酵素製剤は液体濃縮物であって、この液体濃縮物は、ペレット形成工程前に飼料マッシュに添加される。ある実施形態において、液体濃縮物は、酵素、スクロース、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、およびプロピオン酸ナトリウムである。別の実施形態において、液体濃縮物は、44,000-48,000ユニット/gのフィターゼ、20%スクロース、1% NaCl、50mMクエン酸ナトリウム、pH 5.1、0.1%安息香酸ナトリウム、0.4%ソルビン酸カリウム、0.4%プロピオン酸ナトリウムを含んでなる組成物である。もう1つの実施形態において、液体濃縮物は、44,000-48,000ユニット/gのフィターゼ、2%-40%ソルビトール、1% NaCl、50mMクエン酸ナトリウム、pH 4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、もしくは5.5、0.1%安息香酸ナトリウム、0.4%ソルビン酸カリウム、0.4%プロピオン酸ナトリウムを含んでなる組成物である。別の実施形態において、液体濃縮物は最終製品ではなく、後に、液体製品、顆粒状の粉体製品の製造用に使用される、中間的な組成物もしくは製剤である。

本明細書で使用される「顆粒酵素製剤」は、担体；一次溶液を含んでなる組成物であって、この一次溶液は、酵素、バッファー、安定化剤、結合剤、可塑剤、抗菌剤、もしくはそれらの任意の組み合わせを含んでなる。別の実施形態において、顆粒酵素製剤は、担体；一次溶液および二次溶液を含んでなる組成物であって、この一次溶液は、酵素、バッファー、安定化剤、結合剤、可塑剤、抗菌剤を含み、二次溶液は、増強剤、可塑剤、もしくはそれらの任意の組み合わせを含む。ある実施形態において、顆粒酵素製剤は耐熱性であって、酵素顆粒が保護コーティングを有する必要がない。別の実施形態において、顆粒製品は、酵素、スクロース、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、グアーガム、小麦粉である。

ある実施形態において、一次溶液は液体酵素製剤である。別の実施形態において、液体酵素製剤は、液体製品もしくは液体濃縮物である。

ある実施形態において、顆粒酵素製剤は担体を含んでなるが、この担体は穀粉である。別の実施形態において、担体はデンプンである。ある実施形態において、穀粉は小麦粉である。別の実施形態において、小麦粉は漂白小麦粉である。別の実施形態において、担体は小麦粉およびマルトデキストリンである。別の実施形態において、担体は小麦粉およびアルファ化デンプンである。別の実施形態において、マルトデキストリンまたはアルファ化デンプンは、穀粉とともに粉体混合物として使用される。別の実施形態において、その穀粉は小麦粉もしくは漂白小麦粉である。ある実施形態において、マルトデキストリンもしくはアルファ化デンプンは、粉体混合物として使用される。ある実施形態において、小麦粉およびカオリンは粉体混合物である。

ある実施形態において、顆粒酵素製剤は酵素を含んでなるが、その酵素は、フィターゼ、セルラーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、カタラーゼ、キシラナーゼ、β-グルカナーゼ、マンナーゼ、アミラーゼ、アミダーゼ、エポキシドヒドロラーゼ、エステラーゼ、ホスホリパーゼ、トランスアミナーゼ、アミンオキシダーゼ、セロビオヒドロラーゼ、アンモニアリアーゼ、またはそれらの任意の組み合わせである。

ある実施形態において、顆粒酵素製剤はバッファーを含んでなるが、そのバッファーはクエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、クエン酸、酢酸ナトリウム、酢酸、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、およびそれらの任意の組み合わせである。

ある実施形態において、顆粒酵素製剤は安定化剤を含んでなるが、この安定化剤は、スクロース、塩化ナトリウム、ソルビトール、グリセロール、スクロース、マンニトール、トレハロース、カオリン、ケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウム、またはそれらの任意の組み合わせである。

ある実施形態において、顆粒酵素製剤は結合剤を含んでなるが、この結合剤は、グアーガム、キサンタン、アルギン酸ナトリウム、ローカストビーンガム、カラギーナンガム、アルファ化加工デンプン、マルトデキストリン、ゼラチン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、またはそれらの任意の組み合わせである。別の実施形態において、天然ガムを個々に、または少なくとも2つのガムの組み合わせとして、使用することができる。別の実施形態において、デンプンもしくはマルトデキストリンはグアーガムと組み合わせて使用される。別の実施形態において、デンプンもしくはマルトデキストリンは安定化剤としての機能も果たす。

ある実施形態において、顆粒酵素製剤は可塑剤を含んでなるが、この可塑剤は、グリセロール、ポリエチレングリコール、クエン酸トリエチル、トリアセチン、クエン酸アセチルトリエチルからなる一群から選択される。

ある実施形態において、顆粒酵素製剤は抗菌剤を含んでなるが、この抗菌剤は、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸ナトリウム、ソルビン酸、プロピオン酸、安息香酸ナトリウム、安息香酸、プロピオン酸ナトリウム、プロピオン酸カルシウム、プロピオン酸アンモニウム、メチルパラベン、またはそれらの任意の組み合わせである。別の実施形態において、少なくとも2つの抗菌剤が顆粒酵素製剤に使用される。

ある実施形態において、顆粒酵素製剤は二次造粒溶液を含んでなるが、この二次造粒溶液は、顆粒増強剤および可塑剤を含んでなる組成物である。別の実施形態において、二次造粒溶液は、顆粒サイズを大きくし、大きなばらつきを生じ、あるいはその両方である。別の実施形態において、顆粒サイズは、約12メッシュから約100メッシュサイズの間の任意の数値のメッシュサイズである。別の実施形態において、顆粒サイズは、約20メッシュから約80メッシュの範囲の間の任意の数値のメッシュサイズである。別の実施形態において、顆粒サイズは約30メッシュから約60メッシュの範囲の間の任意の数値のメッシュサイズである。

ある実施形態において、顆粒酵素製剤は顆粒増強剤(促進剤)を含んでなるが、この顆粒増強剤は、アルファ化加工デンプン、マルトデキストリン、アルギン酸ナトリウム、CaCl₂添加カラギーナン、CaCl₂無添加カラギーナン、ホウ酸ナトリウム添加グアーガム、ホウ酸ナトリウム無添加グアーガム、ゼラチン；メチルセルロース；ヒドロキシプロピルセルロース；ヒドロキシプロピルメチルセルロース；カルボキシメチルセルロース；塩化ナトリウム；硫酸ナトリウム；カオリン；ケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウム、およびそれらの任意の組み合わせである。別の実施形態において、増強剤を顆粒酵素製剤に添加することは任意選択である。別の実施形態において、天然ガムおよびイオンの組み合わせは、ガムを保護ゲル中にクロスリンクすることができる；しかしながら、ガムがすでに結合剤として使用されている場合には、追加のガムを添加することなく、イオンだけの添加で十分となる。

ある実施形態において、顆粒酵素製剤は可塑剤を含んでなるが、その可塑剤は、グリセロールである。別の実施形態において、アルファ化加工デンプンが使用されるときに、グリセロールを使用することができる。

ある実施形態において、顆粒酵素製剤は、流動性補助剤もしくは滑沢剤をさらに追加して含んでなるが、この流動性補助剤は、二酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウム、カオリン、タルク、珪藻土、またはそれらの任意の組み合わせからなる一群から選択される。別の実施形態において、顆粒酵素製剤への流動性補助剤もしくは滑沢剤の添加は任意選択である。別の実施形態において、流動性補助剤もしくは滑沢剤は、乾燥後の乾式混合である。別の実施形態において、流動性補助剤もしくは滑沢剤は、二次造粒溶液中の懸濁液として添加される。別の実施形態において、顆粒状の粉体製品は、11,000 - 12,000ユニット/gのフィターゼ、スクロース4.5%、クエン酸ナトリウム0.3%、ソルビン酸カリウム0.1%、安息香酸ナトリウム0.1%、プロピオン酸ナトリウム0.1%、グアーガム0-0.25%、および小麦粉95%を含んでなる組成物である（%はすべてw/w%）。

ある実施形態において、顆粒酵素製剤を表3に示す：

本明細書で使用される成分、反応条件などの、量を表すすべての数字は、あらゆる場合において「約」という言葉で修飾されていると考えられるべきである。したがって、そうでないと指示されない限り、本明細書に示される数値パラメーターは、獲得したい望ましい性質に応じて変動しうる概数である。少なくとも、本出願への優先権を主張するいかなる出願のいかなるクレームの範囲に対しても均等論の適用を制限しようとする試みとしてではなく、どの数値パラメーターも、有効桁数および通常の丸めの近似を踏まえて解釈されるべきである。それに加えて、本出願に記載の数値範囲は包括的であって、範囲内の数字のすべてを表す。たとえば、4.5から5.5までのpH範囲は、pH4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、および5.5を含む。

上記の説明は、本発明のいくつかの方法および材料を明らかにする。本発明は、方法および材料の修正、ならびに製造技術および設備の変更が可能である。そうした修正は、本明細書に記載の本発明の開示もしくは実施に関する考察から、当業者に明白となる。したがって、本発明は本明細書に記載の具体的な実施形態に限定されるものではなく、本発明の真の範囲および精神に含まれるすべての修正および変更に及ぶものとする。

公開および未公開の出願、特許、ならびに文献資料を含むがそれに限定されない、本明細書に記載のすべての参考文献は、参考としてその全体が本明細書に組み入れられ、これによって本明細書の一部となる。参考として組み入れられる論文および特許もしくは特許出願が、本明細書に含まれる開示と矛盾する限りにおいて、本明細書はそうしたいかなる矛盾資料にも代わるものであり、および/または、それに優先するものとする。
（実施例）

（顆粒状でないフィターゼの比較例）
製剤1 - 10%塩化ナトリウムおよび10%ソルビトールを含有する液体濃縮フィターゼ製剤を凍結乾燥により乾燥した。乾燥させた酵素粉末を、その後、炭酸カルシウムおよび籾殻と混合して薄め、籾殻酵素製品を形成した。

製剤2 - 10%塩化ナトリウムおよび10%ソルビトールを含有する液体濃縮フィターゼ製剤を籾殻に吸収させた。そうして得られた湿った調合品を凍結乾燥により乾燥した。乾燥させた材料を炭酸カルシウムと混合することにより薄めて、籾殻酵素製品を形成した。

ペレット形成実験 - 籾殻酵素製品を25-100 ppmの濃度で家禽飼料マッシュと調合し、California Pellet Mill内で、75℃から93℃までの範囲内のさまざまな一定の制御温度にてペレット形成した。マッシュ混合物を最初に当該温度の直接蒸気で15秒間コンディショニングした後、ペレット形成プレスによりペレット化した。その後ペレットを乾燥した。

酵素安定性の測定 - 出発マッシュおよび最終ペレット（マッシュになるまで粉砕した）をTrisバッファーで抽出した。抽出物中のフィターゼ活性は、改変AOAC法により測定した。改変AOAC法は、蒸留水および0.01% Tween 20を含有するAOACバッファーであるが（GIZZI, J. of AOAC International, Vol. 91, No. 2, 2008）、50 mM Tris pH 8.0、0.01% Tween 20、10 mM CaCl₂を含有する組成物に変更された。

それぞれの温度でペレット化した製品の酵素活性の回収率は、出発マッシュと比較した。結果を表4に示す。
表４：さまざまなコンディショニング温度でペレット形成した後の家禽飼料中の残存フィターゼ活性（%）

結果は、ペレット飼料から抽出されたフィターゼ活性が、製剤１についても、製剤2についても、高いコンディショニング温度で低くなることを示す。

製剤3 - 籾殻250gをGEA Aeromatic-Fielder Strea-1流動層造粒機に加えた；10%ソルビトールおよび10%塩化ナトリウムを含有する液体濃縮フィターゼ製剤50mlをトップスプレー2流体ノズルによって籾殻上に噴霧した。次の流動層設定を使用した：流入空気温度55℃、スプレー速度5 ml/分、噴霧圧力1バール、スプレーノズル0.8 mm。籾殻酵素製品は、酵素スプレー後に乾燥した。

製剤4 - 籾殻200gをGEA Aeromatic-Fielder Strea-1流動層造粒機に加えた；20%スクロースを含有する液体濃縮フィターゼ製剤100mlをトップスプレー2流体ノズルによって籾殻上に噴霧した。流動層設定は製剤3と同じとし、それを使用して籾殻酵素製品を形成した。

製剤5 - 小麦粉200gをGEA Aeromatic-Fielder Strea-1流動層造粒機に加えた；20%スクロースおよび7%アルファ化デンプンを含有する液体濃縮フィターゼ製剤100mlをトップスプレー2流体ノズルによって小麦粉の上に噴霧した。次の流動層設定を使用した：流入空気温度50℃、スプレー速度10-15 ml/分、噴霧圧力1.5-2バール、スプレーノズル0.8 mm。酵素付き小麦粉製品は、酵素スプレー後に乾燥し、フィターゼ顆粒を形成した
ペレット形成実験および酵素安定性の測定は、実施例1と同様に行った。その結果を表5に示す。
表5：さまざまなコンディショニング温度でペレット形成した後の家禽飼料中の残存フィターゼ活性（%）

籾殻は製剤3および4の担体として使用された。籾殻は、細かく粉砕されておらず、あまり吸収性もなく；その上これらの製剤ではバインダーが使用されていなかった。その結果、籾殻酵素製品では、実質的な顆粒形成はみられなかった。2つの製剤の耐熱性はいずれも、製剤5と比べて、高いコンディショニング温度で比較的低かった。安定化剤を塩化ナトリウムおよびソルビトールから、スクロースに変えると、フィターゼの耐熱性は向上した。しかしながら、製剤5のように、結合剤としてアルファ化デンプンを使用することと併せて、担体を籾殻から微粉砕された小麦粉に変えると、小麦粉酵素製品は顆粒を形成し、動物飼料ペレットから抽出されたフィターゼの耐熱性は、すべての温度にわたって、とりわけ90℃で、向上した。

製剤6 - 小麦粉3kgをVector VFC-Lab 3流動層造粒機に加えた；20%スクロースおよび0.5%グアーガムを含有する液体濃縮フィターゼ製剤1.6kgをトップスプレー2流体ノズルによって小麦粉の上に噴霧した。流動層の設定は、ノズル直径1.2mm、噴霧圧力20psi、噴霧中の流入空気温度50-55℃、製品温度23-27℃、スプレー速度25-50 g/分；乾燥中の流入空気温度70-80℃とし、乾燥させて最終製品温度45℃として、フィターゼ顆粒を形成した。

製剤7 -小麦粉3kgをVector VFC-Lab 3流動層造粒機に加えた；20%スクロース、10%マルトデキストリン、および0.5%グアーガムを含有する液体濃縮フィターゼ製剤1.6kgをトップスプレー2流体ノズルによって小麦粉の上に噴霧した。流動層の設定は、ノズル直径1.2mm、噴霧圧力20psi、噴霧中の流入空気温度50℃、製品温度23-29℃、スプレー速度25-50 g/分；乾燥中の流入空気温度70-80℃とし、乾燥させて最終製品温度45℃として、フィターゼ顆粒を形成した。

ペレット形成実験および酵素安定性の測定は実施例1と同様とした。結果を表6に示す。すべての残存活性は、同一サンプルの75℃での安定性を基準とした。
表6：さまざまなコンディショニング温度でペレット形成した後の家禽飼料中の残存フィターゼ活性（%）

製剤3は、実施例2から得られた同じサンプルとし、この実験の対照として使用した。製剤3の耐熱性はここでは実施例2の値より低いが、これはおそらくこの実験のペレット形成条件のほうが過酷であったためであろう。製剤6および7はいずれも、ペレット化した動物飼料から抽出されたときにフィターゼの耐熱性を向上させるフィターゼ顆粒をもたらした。

追加のペレット形成実験 - 耐熱性の向上を確認するために、異なるCalifornia Pellet Millを用いて、2つのサンプル（製剤6および7）から製造されたフィターゼ顆粒をさらに別のペレット形成実験に供した。蒸気コンディショニングの持続時間は40秒としたが、これは前のペレット形成実験よりもかなり長い。結果を表7に示す。すべての残存活性は、同一サンプルの75℃での安定性を基準とした。
表7：さまざまなコンディショニング温度でペレット形成した後の家禽飼料中の残存フィターゼ活性（%）

その結果から、蒸気コンディショニングを延長した条件下でも、製剤6および7から作製されたフィターゼ顆粒はいずれも、高いペレット形成温度で作製された動物飼料ペレットから抽出されたフィターゼに、高いフィターゼ活性をもたらすことが確認された。

製剤8 - 小麦粉3kgをVector VFC-Lab 3流動層造粒機に加えた；20%スクロース、10%カオリン、および0.5%グアーガムを含有する液体濃縮フィターゼ製剤1.6kgをトップスプレー2流体ノズルによって小麦粉の上に噴霧した。流動層の設定は、ノズル直径1.2mm、噴霧圧力20psi、噴霧中の流入空気温度50℃、製品温度22-30℃、スプレー速度25-50 g/分；乾燥中の流入空気温度70-80℃とし、乾燥させて最終製品温度45℃として、フィターゼ顆粒を形成した。

製剤9 - 小麦粉3kgをVector VFC-Lab 3流動層造粒機に加えた；20%スクロース、10%マルトデキストリン、5%カオリン、および0.5%グアーガムを含有する液体濃縮フィターゼ製剤1.6kgをトップスプレー2流体ノズルによって小麦粉の上に噴霧した。流動層の設定は製剤8の場合と同じとし、フィターゼ顆粒を形成した。

製剤10 - 小麦粉2kgをVector VFC-Lab 3流動層造粒機に加えた；20%スクロースおよび0.5%グアーガムを含有する液体濃縮フィターゼ製剤1kgをトップスプレー2流体ノズルによって小麦粉の上に噴霧した。次に、10%加工デンプン、10%カオリン、および1%グリセロールを含有する二次造粒溶液1kgを噴霧した。酵素噴霧中の流動層の設定は製剤8の場合と同じとした；二次造粒溶液噴霧中は、スプレー速度17-18 g/分、流入空気温度60℃、製品温度30-31℃とし；乾燥中は、流入空気温度70-80℃として、フィターゼ顆粒を形成した。

ペレット形成実験および酵素安定性の測定は実施例1と同様とし、結果を表8に示す。
表8：さまざまなコンディショニング温度でペレット形成した後の家禽飼料中の残存フィターゼ活性（%）

その結果から、二次造粒溶液噴霧液にカオリンを含めることで、フィターゼ耐熱性の向上がもたらされること；ならびに、二次造粒溶液の使用が、動物飼料ペレットから抽出されたフィターゼの、フィターゼ耐熱性をさらに高めることが明らかになった。

製剤11 - 小麦粉3kgをVector VFC-Lab 3流動層造粒機に加えた；20%スクロースおよび0.5%グアーガムを含有する液体濃縮フィターゼ製剤1.3kgをトップスプレー2流体ノズルによって小麦粉の上に噴霧した。流動層の設定は、ノズル直径1.2mm、噴霧圧力20psi、噴霧中の流入空気温度50℃、製品温度22-29℃、スプレー速度25-50 g/分；乾燥中の流入空気温度70-80℃とし、乾燥させて最終製品温度45℃として、フィターゼ顆粒を形成した。

製剤12 - 小麦粉4.6kgを、5kgスケールにカスタマイズした流動層造粒機に加えた；20%スクロースおよび0.5%グアーガムを含有する液体濃縮フィターゼ製剤1.25kgをトップスプレー2流体ノズルによって小麦粉の上に噴霧した。次に、0.5%グアーガムのみ含有する二次造粒溶液1kgを噴霧した。流動層の設定は、流入空気温度60-80℃、製品温度28-36℃、スプレー速度40 g/分として、フィターゼ顆粒を形成した。

ペレット形成実験および酵素安定性の測定は実施例1と同様とし、結果を表9に示す。
表9：さまざまなコンディショニング温度でペレット形成した後の家禽飼料中の残存フィターゼ活性（%）

その結果は、2つのサンプルがいずれもフィターゼ耐熱性の向上を示すこと；ならびに二次造粒溶液の使用が、高いペレット形成温度で作製された動物飼料ペレットから抽出されたフィターゼの耐熱性を、さらに高めることを明らかにした。

現在市販されている飼料用耐熱酵素の大半は、耐熱コーティングによるものである。こうしたコーティングの一部は、溶液中への酵素の放出を意図せず遅らせることが判明しており、これは酵素の有効性の低下をもたらす。したがって、本発明の顆粒製品からのフィターゼ活性の時間放出プロファイルを調べた。

製剤12から得られた顆粒フィターゼ100mgを、100 mM酢酸ナトリウムバッファー、pH 5.5、400μlと混合した。混合物を60分間撹拌した。指定の時点で、一定量を分け取り、遠心分離した。透明な上清中のフィターゼ活性をアッセイした。結果を表10に示す。
表10：フィターゼ活性の時間放出プロファイル

結果は、フィターゼが非常に短時間で溶解するようになることを示している。その一方で、市販の耐熱コーティングされたフィターゼ顆粒の一部は、溶液への酵素活性の放出に、20分ほどもの大幅な遅れを示した（データ示さず）。

Claims

(a)フィターゼ：
(b)クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、クエン酸、酢酸ナトリウム、酢酸、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、およびそれらの任意の組み合わせからなる一群から選択される、バッファー；
(c)スクロース、ソルビトール、マンニトール、グリセロール、トレハロース、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、またはそれらの任意の組み合わせからなる一群から選択される、安定化剤；ならびに
(d)ソルビン酸カリウム、ソルビン酸ナトリウム、ソルビン酸、安息香酸ナトリウム、安息香酸、メチルパラベン、プロピオン酸カルシウム、プロピオン酸ナトリウム、プロピオン酸アンモニウム、プロピオン酸、またはそれらの任意の組み合わせからなる一群から選択される、抗菌剤：
を含んでなる、液体酵素製剤。
バッファーが約4.5から約5.50までの範囲のpHを有する、請求項1に記載の液体酵素製剤。
安定化剤が、少なくとも2つの安定化剤の組み合わせである、請求項1に記載の液体酵素製剤。
安定化剤の濃度が約5%から約30%の間である、請求項1に記載の液体酵素製剤。
抗菌剤が、少なくとも2つの抗菌剤の組み合わせである、請求項1に記載の液体酵素製剤。
(a)担体；
(b)フィターゼ、バッファー、安定化剤、結合剤、第1の可塑剤、抗菌剤、またはそれらの任意の組み合わせを含んでなる、一次溶液；ならびに
(c)増強剤、第2の可塑剤、またはそれらの任意の組み合わせを含んでなる、二次溶液：
を含んでなる、顆粒酵素製剤。
担体が、
(a)穀粉；
(b)小麦粉；
(c)漂白小麦粉；
(d)小麦粉およびマルトデキストリン；
(e)小麦粉およびアルファ化デンプン；ならびに
(f)デンプン：
からなる一群から選択される、請求項6に記載の顆粒酵素製剤。
バッファーがクエン酸ナトリウムである、請求項6に記載の顆粒酵素製剤。
安定化剤が、スクロース、ソルビトール、マンニトール、グリセロール、トレハロース、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、カオリン、ケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウム、
およびそれらの任意の組み合わせからなる一群から選択される、請求項6に記載の顆粒酵素製剤。
結合剤が、グアーガム、キサンタン、アルギン酸ナトリウム、ローカストビーンガム、カラギーナンガム、アルファ化加工デンプン、マルトデキストリン、ゼラチン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、およびそれらの任意の組み合わせからなる一群から選択される、請求項6に記載の顆粒酵素製剤。
第1の可塑剤が、グリセロール、ポリエチレングリコール、クエン酸トリエチル、トリアセチン、およびクエン酸アセチルトリエチルからなる一群から選択される、請求項6に記載の顆粒酵素製剤。
抗菌剤が、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、プロピオン酸カルシウム、プロピオン酸アンモニウム、メチルパラベン、安息香酸、ソルビン酸、およびそれらの任意の組み合わせからなる一群から選択される、請求項6に記載の顆粒酵素製剤。
増強剤が、アルファ化加工デンプン、マルトデキストリン、アルギン酸ナトリウム、CaCl₂添加カラギーナン、CaCl₂無添加カラギーナン、ホウ酸ナトリウム添加グアーガム、ホウ酸ナトリウム無添加グアーガム、ゼラチン；メチルセルロース；ヒドロキシプロピルセルロース；ヒドロキシプロピルメチルセルロース；カルボキシメチルセルロース；塩化ナトリウム；硫酸ナトリウム；カオリン；ケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウム、およびそれらの任意の組み合わせからなる一群から選択される、請求項6に記載の顆粒酵素製剤。
第2の可塑剤が、グリセロール、ポリエチレングリコール、クエン酸トリエチル、トリアセチン、およびクエン酸アセチルトリエチルからなる一群から選択される、請求項6に記載の顆粒酵素製剤。
流動性補助剤をさらに追加して含んでなる、請求項6に記載の顆粒酵素製剤であって、その流動性補助剤が、二酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウム、カオリン、タルク、珪藻土、およびそれらの任意の組み合わせからなる一群から選択される、前記顆粒酵素製剤。
酵素が75℃で少なくとも63%の活性を保持するような、酵素顆粒を流動層で製造するための方法であって、
(a) 乾燥した担体を流動層造粒機に加えること；
(b) 一次酵素溶液を乾燥した担体に添加すること；ならびに
(c) (a)および(b)を組み合せて得られたものを、望ましい水分含量まで乾燥させること：
を含む、前記方法。
(b)(i) 二次造粒溶液を(a)および(b)に加えること：をさらに追加して含む、請求項16に記載の方法。
(d) 乾燥後に流動性補助剤を流動層乾燥機または乾式混合機に添加すること、をさらに追加して含む、請求項16に記載の方法。
二次造粒溶液が流動性補助剤をさらに追加して含んでいる、請求項16に記載の方法。
酵素が、フィターゼ、セルラーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、カタラーゼ、キシラナーゼ、β-グルカナーゼ、マンナーゼ、アミラーゼ、アミダーゼ、エポキシドヒドロラーゼ、エステラーゼ、ホスホリパーゼ、トランスアミナーゼ、アミンオキシダーゼ、セロビオヒドロラーゼ、アンモニアリアーゼ、およびそれらの任意の組み合わせからなる一群から選択される、請求項16に記載の方法。
望ましい水分含量が約3%から約10%の間である、請求項16に記載の方法。
フィターゼが、
(a) 80℃で少なくとも63%の活性；
(b) 85℃で少なくとも58%の活性；
(c) 88℃で少なくとも43%の活性；
(d) 90℃で少なくとも27%の活性；ならびに
(e) 93℃で少なくとも6%の活性：
を含む、一定温度で一定の活性を保持する、フィターゼのための製剤。