JP2009519238A - 消化器、および免疫‐関連疾患の予防または処置のためのバチルスpb6の使用 - Google Patents
消化器、および免疫‐関連疾患の予防または処置のためのバチルスpb6の使用 Download PDFInfo
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Abstract
Description
本発明は一般に、消化器疾患を治療するための細菌の投与、およびいっそう明確には、抗生物質関連下痢症(AAD)およびクロストリジウムディフィシル獲得性下痢症(CDAD)を治療するためのバチルスアミロリキファシエンス菌株の細菌の投与に関する。
本発明は、リポペプチドを生産する有効量のバチルス細菌を投与することによる、抗生物質関連下痢症、クロストリジウムディフィシル獲得性下痢症、炎症性腸疾患、および消化器疾患のような、腸異常の予防に関する。バチルス細菌はプロバイオティックとして投与されてもよく、イヌリンのような他のプロバイオティックスと一緒に組み合わせてもよい。
好ましいバチルスPB6は、その万能で特有の特徴のために、いくつかの満たされていない医学的必要性にとって重要であり得る。
PB6は天然から分離され、遺伝的に改変されていない特許登録された細菌菌株である。リボタイピング技術を使用して、この細菌はバチルスサブチリスの菌株であると同定された。DNA:DNAハイブリダイゼーション研究は、バチルスPB6菌株が、十中八九バチルスアミロリキファシエンスであってもよいことを示唆し、そのことは以下でさらに記載されることになる。
バチルスPB6の拮抗特性は、C.パーフリンジェンス(C. perfringens)ATCC13124およびC.ディフィシルATCC9689に対して試験された。
純粋なサーファクチン(我々の発酵産物から精製するか、またはSigmaから購入)の活性がクロストリジウムに対して測定された場合、より高いMICが見いだされた。C.パーフリンジェンスに対するMICは10〜25μg/mlであることが証明された。純粋な活性化合物が粗発酵抽出物より活性が低いことは注目に値する。このことは、抽出物中に存在するサーファクチンの活性を高める補因子に起因すると考えられる。このことは、サーファクチンのMICを不活性化合物と組み合わせたサーファクチンのMICと比較した実験によって示されている。この不活性化合物は、我々がサーファクチンを分離したものと同じ抽出物から分離された。この組み合わせのMICは1〜10μg/mlであった。
バチルス、より明確にはバチルスサブチリスは依然としてすべての健康状態‐促進および免疫‐刺激細菌の中の最も強力で有益な菌の1種である。医学的調査報告に引証されたいくつかの臨床研究に従って、摂取されたバチルスの細胞壁成分は少なくとも3種の特異的抗体(IgM、IgGおよびIgA)の活性化を含む、ヒト免疫防御のほとんどすべてのシステムを活性化することが可能であり、そのような抗体は通例ヒトシステムに侵入し、冒すことを企てる多くの有害なウイルス、真菌および細菌病原体に対して非常に効果的である。バチルスサブチリスはまた、BおよびTリンパ球ならびにマクロファージを刺激することが示されている。また、バチルスサブチリス芽胞がin vivoで免疫調節作用を発揮する可能性があるという証拠が提供されている。そして、芽胞への暴露後のT依存的抗原に対するプラーク形成細胞の増大した反応、および異なる食作用機能の増進が記載されている34、35、36、37、38,39、40、41。
このことから、我々はバチルスアミロリキファシエンスも免疫‐刺激特性を有すると結論することができる。
初めの研究はWistarラットにおける、噴霧乾燥バチルスPB6産物(1010cfu/g)の急性経口毒性を測定するために計画され、行われた。全部で5匹の雄および5匹の雌動物は5000mg/kg(2回蒸留水中の懸濁液、および10ml/kgの投与容量を使用)の経口投与量を投与された。対照群は5匹の雄および5匹の雌動物からなり、10ml/kgの投与量で2回蒸留水を与えられた。5000mg/kg処置動物では、死亡は観察されなかった。バチルスPB6産物を与えられた動物の50%は、対照群と比較していっそう活発であった。バチルスPB6で処置された動物はいずれも下痢を起こさなかった。剖検後、両群のいずれの器官でも病的変化は見られなかった。従って、Wistarラットに経口投与されたバチルスPB6産物の最大非致死量(LD0)およびLD50は5000mg/kgより多いことが見いだされた。
この研究はWistarラットにおけるB.PB6(1010cfu/g)の反復投与(28日間)経口毒性を測定するために計画され、行われた。それぞれの群において、6匹の雄および6匹の雌動物は28日間、250、500、または1000mg/kgの経口投与量を投与された。対照ベヒクル群も6匹の雄および6匹の雌動物からなり、それらは、10ml/kgの投与量で28日間、2回蒸留水を与えられた。これらの群は29日目に供試した。
この研究では皮膚および眼刺激に、全部で3羽のNew−Zealand Whiteウサギ(任意の性)‐同じウサギが使用された。2種の研究の間隔は最少で5日間維持された。1gのB.PB6(1010cfu/g)が皮膚刺激のために皮膚にペーストとして適用され、100μlの10%B.PB6の懸濁液が眼刺激のために左眼に点滴された。
眼:100μlの10%B.PB6(1010cfu/g)懸濁液が点滴された場合、刺激は全く観察されなかった。
この研究は、試験物質によってSwissアルビノマウスのクロモソームまたは有糸分裂装置に誘発された損傷を検出するために計画され、実行された。全部で5匹の雄と5匹の雌動物は2500および5000mg/kgの経口投与量を投与され、対照ベヒクル群は5匹の雄と5匹の雌マウスからなり、2回蒸留水を10ml/kgの投与量で経口的に与えられた。陽性対照群(5匹の雄+5匹の雌)は40mg/kgの投与量で経口的にシクロホスファミドを与えられた。
結論:2500&5000mg/kg投与量のB.PB6(1010cfu/g)はマウスにおいて小核多染性赤血球を有意に誘発しなかった。
研究計画
42匹の雄ゴールデンシリアンハムスターはNational Centre for Laboratory Animal Sciences,NIN(Hyderabad,India)から得た。処置期間の開始時に、動物は12〜14週齢であった。試験施設への到着時に、動物は獣医師の管理下で完全な臨床検査を受け、それらが良好な状態であることを確かめた。動物は、少なくとも7日間、研究条件に順応させた。トライアル開始時に体重を記録し、その後研究群に動物を割り当てた。動物はポリカーボネートケージで個々に飼育した(290x22x140mm、LxWxH)。動物室および試験室の条件は以下の通りに設定した:温度:22±4℃、相対湿度:50±20%、明/暗周期:12時間/12時間(明期:07:00〜19:00)および換気:フィルターを通し、再循環させない空気をおよそ7サイクル/時間。すべての動物はHamster Pellet Feed(NIN,Hyderabad)とAquaguard精製水を随意に自由に摂取した。
クロストリジウムディフィシルATCC9689を含むCulti−loop(Oxoid,Basingstoke,England)は取り扱い説明に従って接種し、培養液は生理食塩水で希釈して10000CFU/mlを得た。クリンダマイシン塩酸塩(Pharmacia,Puurs−Belgium)およびバンコマイシン(Neon Laboratories,Bombay,India)は、それぞれ10および50mg/mlの濃度になるまで2回蒸留水で懸濁した。投与量はクリンダマイシンおよびバンコマイシンそれぞれに対して10および1ml/Kg体重であった。マルト−およびシクロデキストリンキャリア上で乾燥したバチルス‘PB6’発酵培養液である、PB6乾燥物(Kemin Consumer Care,Des Moines,USA)は、1.5E8、1.5E6および1.5E5 CFU/mlの濃度になるまで2回蒸留水で懸濁した。投与量は10ml/kg体重であった。新鮮な調製物はそれぞれの投与前に作製した。クリンダマイシン、バンコマイシンおよびPB6は最近測定した体重を基にして投与した。調製物はそれぞれの投与前に激しく攪拌した。
クリンダマイシンが投与された後約6時間目に、無処置群の3匹の動物、およびバンコマイシンで処置されることになる群の1匹の動物に軽度な下痢が観察された。C、D、E群では、クリンダマイシン投与後約1時間目に、動物はPB6の1回目の投与量を与えられたが、その同じ日に、いずれかの下痢の徴候を示す動物はいなかった。下痢を患う動物の数および下痢の重症度は、その後の2日間で、処置群間で異なって出現した(表4)。クロストリジウムディフィシル関連下痢症が誘発されたすべての群は下痢の徴候を示した。バンコマイシンで処置された群および高投与量のPB6で処置された群では下痢の強度が低かった。無処置群ならびに、低および中間投与量のPB6群では、糞便は非常に水っぽく、全腹部領域は湿っていた。
この研究は、十分に確立され、この感染の非常に感度の高いモデルであるクリンダマイシン‐誘発CDADのハムスターモデルにおいて、CDADを治療することにおけるB.PB6の有効性を評価するために計画され、実施された。CDAD誘発後処置されなかったハムスターはすべて重症の下痢を起こし、体重が減少し、5日以内に死亡した。PB6による治療は投与量に関連した反応を生じた。最も高い投与量のPB6では、下痢、体重減少および死亡率は最低であった。治療停止時に、クリンダマイシン‐誘発CDADをハムスターが乗り切るのを助けることにおいて、最高投与量のPB6はバンコマイシンと等しく有効であったことを示した。
プロバイオティックス(たとえばイヌリン)の新規な食物概念は、栄養学者、医師、食物製造業者および消費者の間で人気を獲得し続けている。プロバイオティック食品の最も広く受け入れられている定義は以下の通りである:“プロバイオティックは消化器内細菌叢の組成および活性の両方において、特定の変化を可能にする選択的に発酵された成分であり、宿主の幸福および健康状態に利点を与える”。食物製品においてプロバイオティク成分として分類されるためには、その成分は以下の通りである必要がある。:1)胃および小腸の消化酵素による消化(加水分解)に耐える;2)化学的に無傷で結腸に入り、部分的な、または完全な発酵過程を経る;および3)健康状態に刺激された腸内細菌の活発な増殖および/または活性を刺激する。プロバイオティックに刺激された細菌増殖の健康状態への利点は広範に及び、たとえば結腸癌および病原体に対する好ましい効果、トリアシルグリセロールの減少、CaおよびMgの吸収増加、ならびに便通頻度および糞便重量の増加のような利点を含む。イヌリンは、2〜60ユニットの範囲の鎖長を持つポリディスパースβ(2→1)フラクタンである。イヌリンのフルクトース分子とオリゴフルクトース間の特有の結合が、典型的な炭水化物とそれらを識別する。それらはヒトの消化酵素による消化および小腸における吸収に耐えるが、結腸内細菌叢により加水分解され、発酵し、それゆえプロバイオティックダイエタリーファイバーとして分類される42、43、44、45、46。
分離されたPB6細菌の同定
分離されたPB6バチルス菌株はグラム陽性桿菌であり、カタラーゼを有する。マラカイトグリーン染色は、この微生物が内生芽胞を有し、芽胞形成体であることを確証した。この微生物は、長期のインキュベーション期間に全寒天表面に広がる傾向があることから、“有走細胞(swarmer)”でもある。公知のバチルス属との関連性の点から、分離されたバチルス菌株は92.0%IDを有する。API生化学的プロファイルに基づいて、PB6バチルス菌株はB.サブチリス候補として同定された。PB6バチルス菌株はそれゆえATCC‐PTA6737として寄託され、そこでバチルスサブチリスと命名された。2002年11月27日に出願された米国特許出願番号10/306,365は本明細書に参照として援用される。
バチルスPB6のほとんど完全な16rRNA配列が完成され、アラインメントされた(SEQ ID NO:1、図6)。
2つの異なるグループによって得られたPB6の部分的gyrA配列は図7(SEQ ID NO:2)および図8(SEQ ID NO:3)に示す。
ハイブリダイゼーションはEzaki et al.,47によって記載された方法を改変し、ストリンジェントな条件下(40℃で)行われた。DNA相同性のパーセンテージは少なくとも4ハイブリダイゼーションの平均である。括弧で示された値は、逆数値間の差である。この技術による平均標準偏差は14ユニットである48。結果は表7に表す。
これらの結果から、B.ベレゼンシス(B. velezensis)とB.アミロリキファシエンスは同じ遺伝種に属し、それゆえ主観的な異名であり、それゆえ命名規則42を適用する場合、最も古い規則に合った名称、すなわちB.アミロリキファシエンスが保持されるべきであり、バチルスPB6(ATCC‐PTA6737)はより適切にはB.アミロリキファシエンス種に分類されてもよいように見える。
バチルスアミロリキファシエンスPB6は、Tryptone Soy血液プレート(Oxoid,Belgium)上に直線として接種し、嫌気性条件下、37℃で24時間インキュベーション後、異なる指標菌株がバチルスPB6培養物に対して直角に接種された。クロストリジウム種を接種したプレートは、嫌気性条件下、Anaerogen Pak(Oxoid,Belgium)を使用してインキュベーションした。37℃で一晩インキュベーション後、一方の微生物の他方に対する阻止作用を示唆する、画線の交差点周囲の透明帯の出現によって拮抗作用が評価された。
バチルスPB6は5%ヒツジ血液(Oxoid,Belgium)を添加したTryptone Soya寒天プレート上、24時間、37℃で培養した。この培養物を使用して、0.6%酵母抽出物(Oxoid,Belgium)を添加した100mlのTryptic Soy培養液を接種した。24時間、振とうインキュベーター(100rpm)中、37℃でインキュベーション後、培養液は等量のジエチルエーテル(Acros,Belgium)と混合(3回)した。代謝産物の抽出後、両層を分離し、エーテル画分を集め、4000rpmで5分間遠心分離した。
B.アミロリキファシエンスPB6発酵産物のエーテル抽出物は調整用TLC(Kieselge160、20x2cm、層の厚さ2mm)によって分離した。使用した溶離液はヘキサン/アセトン(30/70)であった。サーファクチンはRf0〜0.33のゾーンで分離された。このゾーンから分離されたサーファクチンのC.パーフリンジェンスに対するMICは10〜25μg/mlであった。別のゾーン(Rf0.33〜0.76)ではC.パーフリンジェンスに対して活性でない(MIC>100μg/ml)1種以上の産物が見いだされた。それぞれ10μg/mlの両抽出物の最終濃度で、両方のゾーンの産物の組み合わせが試験された場合、C.パーフリンジェンスの増殖は全く見られなかった。単独で活性を持たないこれらの産物と組み合わせた場合、サーファクチンのMICは10μg/ml未満に減少した。
アセトニトリル/0.1N HCl(1/1;v/v)中のサーファクチン(Sigma)750μg/mlの溶液が調製された。この溶液0.5mlを37℃で30′、60′または90′インキュベーションし、その後0.1N NaHCO3溶液0.25mlを添加し、混合物はボルテックスシェイカーを使用して混合した。すべての溶液はクロストリジウムパーフリンジェンスに対する活性に関してスクリーニングした。
細菌菌株および培養条件。 バチルスPB6は0.6%酵母抽出物(Oxoid Limited,England)(TSBYE)を添加した容量100mlのTryptic Soy培養液(Becton Dickenson and Company,Cockeysville,MD)中で培養し、100rpmにセットした振とうインキュベーター中、37℃でインキュベーションした。1種のB.セレウスの毒素生産菌株ATCC11778も振とうインキュベーター中、37℃、TSBYE中で培養した。同じようにB.セレウスATCC49064および大腸菌ATCC25922の非毒素生産菌株も嫌気性条件下、37℃、TSBYE中で培養した。この研究に使用したすべての細菌菌株は毎週新鮮なTSBYEに移し、常用培養物として4℃冷蔵庫に保存した。新しく増殖した菌株は40%グリセロールに再懸濁し、長期保管のために−80℃のフリーザーで保存した。
試験は逆受動ラテックス凝集反応(RPLA)(Unipath,Basingstoke,UK)によるバチルスセレウスの下痢毒素の検出のために開発された。ポリスチレンラテックス粒子はB.セレウスの下痢毒素により免疫したウサギ由来の精製した抗血清により感作する。キットはまた、陽性(エンテロトキシン)および陰性(特定のB.セレウスエンテロトキシンを含まないラテックス粒子)の両方を提供した。25μlの希釈剤、および試験および対照(陽性および陰性)試料を含むアリコートは、2つの異なるV−ウェルマイクロタイタープレートのセットに連続して分配した。次に25μlの感作されたラテックスおよびラテックス対照を含む溶液はV−ウェルマイクロタイタープレートの第1および第2セットにそれぞれ分配した。それぞれのウェルは25℃、20〜24時間のインキュベーション後に、凝集を調べた。
14 C−ロイシン取り込みの阻止割合=[(毒素を添加しないVero細胞のcpm−試験試料のcpm)]/[毒素を添加しないVero細胞のcpm]x100%。 14C−ロイシン取り込みの阻止割合を計算するために使用されるcpmは、バックグラウンドカウントの値(約30〜60cpm)を差し引く必要がある。14C−ロイシン取り込みの阻止が10倍に濃縮後に20%未満である場合、毒素は存在しない。それぞれのアッセイはデュプリケートで行った。結果は表8および9に示す。
この研究では、我々はバチルスPB6ならびに4種の市販のプロバイオティックス:Bactisubtil(登録商標)(Sanofisynthelabo)、Perenterol(登録商標)(Biodiphar)、Bioplus 2B(Miavit GmbH)およびBiosporinum(Dniprofarm)由来の代謝産物の抗クロストリジウム特性を検討した。異なるプロバイオティックスから分離された種による小規模発酵が設定された。代謝産物を含む発酵培養液のエーテル抽出物は微量液体希釈法を使用してC.パーフリンジェンスATCC13124およびC.ディフィシルATCC9689に対してスクリーニングした。B.PB6の代謝産物は顕著な抗クロストリジウム特性を示した。最小阻止濃度はC.パーフリンジェンスに対して2.5〜5.0μg/ml、そしてC.ディフィシルに対して5.0〜10.0μg/mlの間にあった。Bactisubtil(登録商標)、Perenterol(登録商標)、Bioplus 2BおよびBiosporinum由来発酵のエーテル抽出物は、両方のクロストリジウム種に対する顕著な抗菌活性を全く示さなかった。
バチルスPB6およびBactisubtil(登録商標)(Sanofi−synthelabo)から分離されたバチルスセレウス菌株は、5%ヒツジ血液(Oxoid,Belgium)を添加したTrypton Soya寒天プレート上、24時間、37℃で培養した。フィードプロバイオティックBioplus 2Bは、2つの異なる種、バチルスリケニフォーミスDSM5749およびバチルスサブチリスDSM5750を含んでいた。両種も5%ヒツジ血液(Oxoid,Belgium)を添加したTrypton Soya 寒天プレート上、24時間、37℃で培養した。これらの培養物の混合物を使用して、0.6%酵母抽出物(Oxoid, Belgium)を添加した100mlTryptic Soy培養液に接種した。Biosporinumも2つの種、すなわちバチルスリケニフォーミスとバチルスサブチリスを含む。この製品はガラスバイアル中の凍結乾燥した培養物として市販されている。1バイアルの内容物は培養液に再懸濁し、この混合物を使用して0.6%酵母抽出物(Oxoid, Belgium)を添加した100ml Tryptic Soy培養液に接種した。すべてのプロバイオティックスを振とうインキュベーター(100rpm)中、37℃で24時間インキュベーション後、培養液を等しい量のジエチルエーテル(Acros,Belgium)と(3回)混合した。代謝産物の抽出後、両方の層を分け、エーテル画分を集め、4000rpmで5分間遠心分離した。
ODの強い増加が両方の種の陰性対照ウェルで認められた。1.0および0.5μg/mlバンコマイシンを含むウェルでは増殖は全く起きず、0.1μg/mlバンコマイシンはC.パーフリンジェンスの増殖を阻止しなかった。1および2.5μg/mlのPB6抽出物を含むウェルでは、C.パーフリンジェンスの正常な増殖が起きた。5μg/mlからC.パーフリンジェンスの増殖は全く認めることができなかった。PB6粗発酵抽出物のC.パーフリンジェンスに対するMICは、2.5〜5.0μg/mlの間にあった。また、陰性対照群ウェルではC.ディフィシルに対して強いODの増加が認められた。1.0および0.5μg/mlバンコマイシンを含むウェルでは増殖が全く認められず、0.1μg/mlバンコマイシンは増殖を阻止しなかった。1、2.5および5μg/ml粗PB6‐抽出物を含むウェルでは、C.ディフィシルの正常な増殖が見られた。10μg/mlから、増殖は全く検出されなかった。C.ディフィシルに対するPB6代謝産物のエーテル抽出物のMICは5.0〜10μg/mlであった。Bactisubtil(登録商標)(B.セレウス)、Perenterol(登録商標)(S.ボウラディー)、Bioplus 2B(バチルスリケニフォーミスDSM5749およびバチルスサブチリスDSM5750)およびBiosporinum(バチルスリケニフォーミス属種およびバチルスサブチリス属種)のエーテル抽出物は試験したすべての濃度に関して有意な抗菌活性を全く示さなかった。試験した両方のクロストリジウム種に対するMICは50μg/mlより大きかった。これらの結果は表10に見いだすことができる。
我々はB.PB6、Bactisubtil(登録商標)(B.セレウス)、Perenterol(登録商標)(S.ボウラディー)、Bioplus 2B(B.リケニフォーミスDSM5749およびB.サブチリスDSM5750)およびBiosporinum(バチルスリケニフォーミス属種およびバチルスサブチリス属種)由来のエーテル抽出物の抗クロストリジウム特性を検討した。これらの種によるラボスケール発酵が設定され、エーテル抽出物は、微量液体希釈法を使用してC.パーフリンジェンスATCC13124およびC.ディフィシルATCC9689に対してスクリーニングした。B.PB6の代謝産物は顕著な抗クロストリジウム特性を有し、MICはC.パーフリンジェンスに対して2.5〜5.0μg/ml、そしてC.ディフィシルに対して5.0〜10.0μg/mlの間にある。Bactisubtil(登録商標)、Perenterol(登録商標)、Bioplus 2BおよびBiosporinum発酵物のエーテル抽出物は、C.パーフリンジェンスATCC13124およびC.ディフィシルATCC9689に対して有意な作用が全く見られなかった。
サーファクチンは多くの炎症過程に中心的に関係する酵素である細胞質性PLA2の活性を阻止することが公知である58。炎症プロセスの阻止はサーファクチンを生産するプロバイオティックスを、炎症性腸疾患(IBD)のような炎症性疾患の治療に対して非常に興味あるものにしている。
CDは腸壁の慢性炎症であり、典型的には腸壁の完全な厚さに影響を与える。最も一般的には、それは小腸の最も低部(回腸)および大腸に発生するが、口から肛門までの消化管および肛門周囲の皮膚のいずれかの部分にも発生しうる。
CDの最も一般的な初期の症状は慢性下痢、腹部痛、発熱、食欲不振、および体重減少である。症状はCD患者間で異なるが、4種の共通のパターンがある:
・腹部の右下部における疼痛および圧痛を伴う炎症;
・腸壁の激しい痛みを伴う痙攣、腹部の腫れ、便秘、および嘔吐を引き起こす、繰り返し起こる急性腸閉塞;
・栄養不良および慢性衰弱を引き起こす炎症および慢性部分的腸閉塞;
・しばしば発熱、疼痛を伴う腹部腫瘤および激しい体重減少を引き起こす異常な瘻孔および膿瘍。
この実験では、2,4,5−トリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)の直腸内投与により誘発されるラットの大腸炎に対するPB6の有効性を研究した。
2つの連続したトライアルが行われた。雄WistarラットはNational Centre of Laboratory Animal Sciences(Hyderabad,India)(トライアル1)またはDepartment of Animal Medicine,TANUVAS(Chennai,India)(トライアル2)から得た。処置期間の初めに動物は10〜12週齢であった。試験施設到着時に、動物が良好な状態であることを確実にするために、獣医師の監督の下で動物に完全な臨床検査が行われた。動物は少なくとも7日間、研究条件に順応させた。トライアル毎に、動物を無作為に選び、研究グループの1つに割り当てた。動物は研究グループごとにポリカーボネートケージ(421x290x190mm、LxWxH)で飼育した。動物室および試験室の状態は以下のように設定した:温度22±3℃、相対湿度50±20%、明/暗周期:12時間/12時間(明期07.00−19.00)および換気:濾過した、再循環しない空気を約7サイクル/時間。すべての動物はNational Institute of Nutrition(NIN,Hyderabad,India)のラットペレットフィードとAquaguard精製水を随意に自由に摂取した(TNBS投与に先立つ一晩の絶食を除く)。両トライアルでは、大腸炎の誘発日は1日目に設定した。大腸炎は一晩絶食後に、肛門から8cmのところへのTNBS100mg/kg体重の1回直腸内投与を使用して誘発した。大腸炎陰性対照群は、1日目に直腸内に生理食塩水(動物毎に0.5mlを1回)を与えられた。大腸炎陰性および大腸菌陽性対照群は、蒸留水10ml/kgを1日3回、4時間間隔で、1日目に開始し、7日目まで与えられた。1回目のトライアルで、TNBS‐誘発大腸炎群は、PB6(それぞれ1.5 108CFU/Kgまたは1.5 109CFU/Kg)、1日3回、4時間間隔、1日目に開始し、7日目まで;メサラジン(250mg/Kg/日)、1日目に開始し、7日目までの;またはインフリキシマブ(3mg/Kg)、1日目の単回投与として、で処置される。2回目のトライアルでは、PB6(1.5 108CFU/Kg)、メサラジンおよびインフリキシマブ処置に関する1回目のトライアルを部分的に反復し、そしてS.ボウラディー(1.5 108CFU/kg)、1日3回、4時間間隔、1日目に開始し、7日目まで、による付加的な処置を含んだ。1回目またはただ1回(インフリキシマブの場合)の処置の投与量は、TNBS投与後2(蒸留水、PB6、ボウラディーおよびメサラジン)または3(インフリキシマブ)時間以内に与えられた。静脈内に注射された59インフリキシマブを除いて、すべての処置は強制経口によって投与された。臨床徴候および死亡に関して1日2回の観察が行われた。動物の体重は1、4および7日目に記録した。8日目に、動物を供試し、(肛門基部5〜10cmまでの)5cmの長さの結腸セグメントを切除した。これらのセグメントは縦方向に切り開いた。内容物を生理食塩水で洗浄することにより除去し、以下のスケールを使用して肉眼的形態を採点した:0‐潰瘍または炎症なし、1‐潰瘍はなく、局所的な充血だけ、2‐充血のない潰瘍化、3‐1か所だけの潰瘍化および炎症、4‐2か所以上の潰瘍化および炎症、および5‐2cmより長い潰瘍化。それぞれ5cmの結腸セグメントの重量も記録し、炎症によって誘発された水腫を評価した。
5%TNBS水溶液(w/v)(Sigma−aldrich,St Louis,USA)は50%エタノールにより2.5%溶液に希釈した。投与量は4ml/Kg体重であった。マルト‐およびシクロデキストリンキャリア上で乾燥したバチルス‘PB6’発酵培養液である、PB6乾燥物(Kemin Health,Des Moines,USA)は蒸留水で1.5 107および1.5 108CFU/mlの濃度に懸濁した。投与容量は10ml/kg体重であった。サッカロミセスボウラディー(Enterol(登録商標),Biodiphar,Brussel,Belgium)は1.5 107CFU/mlの濃度に蒸留水で懸濁した。投与量は10ml/Kg体重であった。メサラジン(Mesacol(登録商標),Sun Pharmaceutical Ind.Ltd,Mumbai,India)錠剤は乳棒と乳鉢を使用して粉末にし、1mlに25mgの5−アミノサリチル酸を含む蒸留水中の溶液を調製した。投与容量は10ml/Kg体重であった。Remicade(登録商標)(インフリキシマブ)(Centocor B.V.,Leiden,The Netherlands)は初めに注射用に10mlの水に溶かし、さらに生理食塩水を使用して2mg/mlの濃度に希釈した。用いた投与容量は1.5ml/Kg体重であった。体重に依存した投与容量はすべて、最近測定した個々の体重を基礎に投与した。それぞれの投与前に新鮮な調製物が作製された。調製物はそれぞれの投与前に激しく攪拌した。
1回目のトライアルで、インフリキシマブで処置したラットの中の1匹は2日目に死亡した。この動物は、1日目に1回目の注射で薬物溶液が漏れたため、2回目の注射を受けていた。TNBSによる大腸炎の誘発後、いくつかの動物は軽度な下痢の徴候を示した。1日目から7日目までに、異なる処置群で記録された下痢の観察数(および冒された動物の数)は、1回目のトライアルでは、大腸炎‐陰性対照、大腸炎‐陽性対照、PB6 3x1.5 108CFU/Kg/日、PB6 3x1.5 109CFU/Kg/日、メサラジン250mg/Kg/日およびインフリキシマブ3mg/Kg単回投与量それぞれに対して0、22(2)、4(1)、0、0および8(1)であり;そして2回目のトライアルでは、大腸炎‐陰性対照、大腸炎‐陽性対照、PB6 3x1.5 108CFU/Kg/日、S.ボウラディー3x1.5 108CFU/Kg/日、メサラジン250mg/Kg/日およびインフリキシマブ3mg/Kg単回投与量それぞれに対して0、42(4)、10(1)、34(3)、12(1)および24(2)であった。大腸炎‐陽性対照群は、大腸炎に伴って実質的な体重減少を示した。トライアル1では、この減少はトライアル2より大きく、このことは大腸炎の誘発時期での年齢および成長速度の違いに関連する可能性がある。トライアル1の大腸炎‐陰性対照群の、開始時の一般に低い体重と、トライアル期間にわたる百分率に換算した高い体重増加は、これらの動物がトライアル2の動物より平均で幾分若かったことを示唆する。トライアル1における共通の処置はすべて、体重増加に対する大腸炎の負の作用を有意に抑制したが、トライアル2ではこれはPB6処置による場合だけであった(表11)。
この研究は、以前のトライアルで観察された、ラットにおける2,4,6−トリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)‐誘発大腸炎に対するバチルス‘PB6’の有効性を確かめ、証拠を提供するため、ならびにその有効性をS.ボウラディー(プロバイオティック)、メサラジンおよびインフリキシマブ(標準薬)の有効性と比較するために計画され、実施された。このラットモデルは十分に確立され、信頼性があり、IBDを処置することを目的とした薬物の効率を試験するために広く使用されている。大腸炎の誘発後にいずれかの処置をしないと、数匹のラットは軽度な下痢の徴候を示し、その後のトライアル期間中、平均して体重を減らし続けた。それらの結腸の腸壁の肉眼的形態は炎症、潰瘍化により、そして壊死にさえ特徴付けられた。1.5 108CFU/Kg/日を3回、または1.5 109CFU/Kg/日を3回、7日間の処置により、結腸壁を、陰性対照群の健康状態および抗炎症薬である、標準薬メサラジンで処置した群の健康状態と統計的に同一である健康な状態にした。
方法と材料
バチルスPB6およびBactisubtil(Sanofi−synthelabo)から分離されたバチルスセレウスの拮抗特性は、たとえばC.パーフリンジェンスATCC13124、C.ディフィシルATCC9689、およびカンピロバクタージェジュニATCC3291のような異なる指標菌株に対して試験した。
PB6はC.パーフリンジェンスATCC13124およびC.ディフィシルATCC9689に対する拮抗作用を有した。両種に対し、プレート上の画線の交差点で透明帯を観察することができた。C.パーフリンジェンスに対する拮抗作用は、この種の溶血特性のために明確に肉眼で見える。例は図1に表す。この写真ほど明確ではないが、著しい透明帯がPB6とC.ディフィシル培養物の交点でも認められた。
天然から分離したバチルスPB6は明確に、C.パーフリンジェンスATCC13124、C.ディフィシルATCC9689およびC.ジェジュニATCC33291に対して強い拮抗特性を有する。対照的に、試験した他のヒト病原性細菌に対しては作用が観察できなかった。
1 McFarland LV. Epidemiology, risk factors and treatments for antibiotic-associated
diarrhea. Dig Dis. 1998;16:292-307.
2 Bulusu M, Narayan S, Shetler K, Triadafilopoulos G. Leukocytosis as a harbinger and
surrogate marker of Clostridium difficile infection in hospitalized patients with diarrhea.
Am J Gastroenterol. 2000;95:3137-3141.
3 McFarland LV, Mulligan ME, Kwok RYY, Stamm WE. Nosocomial acquisition of
Clostridium difficile infection. N Engl J Med. 1989;320:204-210.
4 Cheng SH, Lu JJ, Young TG, Perng CL, Chi WM. Clostridium difficile-associated
diseases: comparison of symptomatic infection versus carriage on the basis ofrisk factors,
toxin production, and genotyping results. Clin Infect Dis. 1997;25:157-158.
5 Hall, I.C., O'Tool, E. Intestinal flora in newborn infants with a description of a new
pathogenic anaerobe, Bacillus difficilis. AJDC. 1935;49:390-402
6 Lyerly, D.M.; Krivan, H.C., Wilkins, T.D. Clostridium difficile its disease and toxins.
Clin Microbiol Rev 1988; 1: 1-18
7 Gerding, D.N. Disease associated with Clostridium difficile infection Ann Intern Med
1989; 110:255-257
8 McFarland, L.V. Stamm, W.E. Review of Clostridium difficile-associated diseases. AMJ
Infect Control 1986;14:99-109
9 Anand, A., Glatt A.E. Clostridium difficile infection associated with antineoplastic
chemotherapy: a review. Clin Infect Dis. 1993;17:109-113
10 Sharma, AX., Holer, F.E. Clostridium difficile diarrhea after use oftacrolimus
following renal transplantation. Clin Infect Dis. 1998;27:1540-1541.
11 Kelly, C.P. LaMont, J.T. Clostridium difficile infection. Annu Rev 1998;49:375-390
12 Kelly, c.P., Pothoulakis, K, LaMont, J.T. Clostridium Difficile colitis. N Engl J Med.
1994;330:257-262
13 AnarJd, A., Bashey, B., Mir, T., Glatt, A.E. Epidemiologiy, clinical manifestations, and
outcome of Clostridium difficile-associated diarrhea. Am J Gastroenterol. 1994;89:519523
14 Kyne, L. et al. Asymptomatic carriage of Clostridium difficile and serum levels ofIgG
antibody against toxin A. N Engl J Med. 2000;342:390-397
15 Bartlett, J.G. Antibiotic-associated diarrhea. Clin Infect Dis. 1992.15/573-581
16 Rubin, M.S. et al Severe Clostridium difficile colitis. Dis Colon Rectum. 1995;38:350354
17 Anand, A. et al Epidemiology, clinical manifestations, and outcome of Clostridium
difficile-associated diarrhea. Am J Gastroenterol. 1994;89:519-523
18 Wilcox, M.H. et al Financial burden ofhospital-acquired Clostridium difficile
infections. J Hosp Infect. 1996;34:23-30
19 Riley, T.V. et al Community-acquired Clostridium difficile-associated diarrhea. Clin
Infect Dis. 1995;20 (supp12):S263-S265
20 Samore, M.H. et al Clinical and molecular epidemiology ofsporadic and clustered cases
ofnosocomial Clostridium difficile diarrhea. Am J Med. 1996;100:32-40
21 Djuretic, T. et al Infectious intestinal disease in elderly people. Commun Dis Rep CDR
Wkly.1996;19:R107-Rl12
22 Olson, M.M. et al Ten years ofprospective Clostridium difficile-associated disease
surveillance and treatment at the Minneapolis A Medical Cener, 1982 -1991. Infect
.. Control Hosp EpidemioI1994;15(6):371-381
23 Teasley, D.G. et al. Prospective randomized trial ofmetronidazole versus vancomycin
for Clostridium difficile-associated diarrhea and colitis. Lancet 1983;2(8358):10431046
24 Gerding, D.N. Is there a relationship between vancomycin-resistant enterococcal
infection and Clostridium difficile infection? Clin Infect Dis 1997;25 Supp12:S206-210
25 Kelly, C.P. et al. Clostridium difficile colitis. N Engl J Med 1994;330(4):257-262
26 Fekety, R. and Shah, A.B. Diagnosis and treatment of Clostridium difficile colitis.
JAMA 1993;269(1):71-75
27 Pothoulakis, C. and LaMont, J.T. Clostridium difficile colitis and diarrhea.
Gastroenterol Clin North Am 1993;22(3):623-637
28 Fekety, R. et al. Recurrent Clostridium difficile diarrhea: characteristics of and risk
factors for patients enrolled in a prospective, randomized, double-blinded trial. Clin
Infect Dis 1997;24(3):324-333
29 Carmeli, Y. et al. Antecedent treatment with different antibiotic agents as a risk factor
for vancmycin resistant enterococcus. Emerg Infect Dis 2002;8:802-807
30 Gerding, D.N. Is there a relationship between vancomycin-resistant enterococcal
infection and Clostridium difficile infection? Clin Infect Dis 1997;25 Supp12:S206-210
31 Poduval, R.D. et al. Clostridium difficile and vancomycin-resistant enteroccoccus: the
new nosocomial alliance. Am J GastroenteroI2000;95:3513-3515
32 Pelaez, T. et al. Metronidazole Resistance in Clostridium difficile: a new emerging
problem? 38the Interscience Conference on antimicrobial agents and chemotherapy.
Sept. 24-27, San Diego, CA, American Society for Microbiology
33 Pinchuk, 1. et al. In Vitro Anti-Helicobacterpylori Activity ofthe Probiotic Strain
Bacillus subtilis 3 Is Due to Secretion ofAntibiotics. Antimicrob. Agents Chemother.
2001; 45: 3156 - 3161
34 Caruso A, Flamminio S., Folghera S., Peroni L., Foresti 1., Balsari A, Turano A
Expression of activation markets on peripheral-blood lymphocytes following oral
administration ofBacillus subtilis spores. IntL J. ImmunopharmacoL (1993) 15,87-92
35 Ciprandi G., ScordamagliaA, Venuti D., CariaM., Caninica G.W. In vitro effects of
Bacillus subtilis on the immune response. Chemioterapia (1986) 5,404-407.
36 Grasso G., Migliaccio P., Tanganelli C., Brugo M.A, Muscettola M. Restorative effect
ofBacillus subtilis spores on interferon production in aged mice. Ann. N.Y. Acad. Sci.
(1994) 717, 198 - 208
37 Duc L.H., Hong H.A, Cutting S.M. Germination ofthe spores in the gastroinstestinal
tract provides a novel route for heterologous antigen delivery. Vaccine (2003) 21 (2730),
4215 - 4224
38 Duc L.R., Hong H.A, Uyen N.Q., Cutting S.M. Intracellular fate and immunogenicity
ofBacillus subtilis spores. Vaccine (2004),22(15-16), 1873 - 1885.
39 Fais S., Pallone F., Nava C., Magnani M. Lymphocyte activation by B. subtilis spores.
Boll. 1st. Sieroter. Milan (1987) 66(5), 391 - 394
40 Prokesova L., Novakova M., Julak J., Mara M. Effect ofBacillus firmus and other
sporulating aerobic microorganisms on in vitro stimulation ofhuman lymphocytes: a
comparative study. Folia Microbiol (1994) 39, 501 -504
41 Kosaka T., Maeda T., Nakada Y., Yukawa M., Tanaka S. Effect ofBacillus subtilis
spore administration on activation ofmacrophages and natural killer cells in mice. Vet.
MicrobioL (1998) 60(2-4), 215 - 225.
42 PaulAA C. Inulin and Oligofructose: Safe Intakes and Legal Status. Journal of
Nutrition (1999) 129, 1412S-1417S.
43 Gibson G.R, Probert H.M., Loo J.V., Rastall RA, Roberfroid M.B. Dietary modulation
ofthe human colonic microbacteria: updating the concept ofprobiotics. Nutr. Res. Rev.
(2004) 17,259-275
44 Gibson G.R., Roberfroid M.B. Dietary modulation. ofthe human colonic microbiotaintroducing
the concept ofprobiotic. J. Nutr. (1995) 125, 1401-1412
45 Roberfroid M. Dietary Fiber, Inulin, and Oligofructose: aReview Comparing their
Physiological Effects. Crit. Rev. Food Sci. Nutri. (1993) 33, 103-148
46 Van Loo l, Coussement P., De Leenheer L., Hoebregs H., Smits G. On the presence of
inulin and oligofructose as natural ingredients in the Western diet. Crit. Rev. Food Sci.
Nutr. (1995) 35, 525-552
47 Ezaki, T., Hashimoto, Y. and Yabuuchi, E. Fluorometric deoxyribonucleic aciddeoxyribonucleic
acid hybridization in microdilution wells as an alternative to
membrane filter hybridization in which radioisotopes are used to determine genetic
relatedness among bacterial strains. Int. 1. Syst. Bacterial. 1989; 39: 224-229
48 Goris, J., Suzuki, K., De Vos, P., Nakase, T. and Kersters, K. Evaluation of a microplate
DNA-DNA hybridization method compared with the initial renaturation method. Can 1.
Microbial. 1998; 44: 1148-1153
49 Wayne et al. Int. 1. Syst. Bacterial. 1987; 37: 463-464
50 Smith L.D.S., Williams B.L. 1984. The Pathogenic Anaerobic Bacteria, 3rd ed. Charles
C. Thomas, Springfield, Ill.
51 Gorbach S.L. 1998. Gas gangrene and other clostridial skin and soft tissue infections, p.
915-922. In Gorbach S.L, Bartlett J.G., and Blacklow N.R (ed.), Infectious Diseases, 2nd
ed. W.B. Saunders Company, Philadelphia, Pa.
52 Anand A, Glatt AE. 1993. Clostridium difficile infection associated with antineoplastic
chemotherapy: a review. Clin. Infect. Dis. 17:109-113.
53 Sharma AK., Holder F.E. 1998. Clostridium difficile diarrhea after use oftacrolimus
following renal transplantation. Clin. Infect. Dis. 27: 1540-1541.
54 Johnson S., Gerding D.N. 1998. Clostridium difficile-associated diarrhea. Clin. Infect.
Dis. 26:1027-1034.
55 Bartlett J.G. 2002. Clinical practice Antibiotic-associated diarrhea. N. Eng. J. Med.
346:334-339.
56 Dzink J., Bartlett J.G. 1980. In vitro susceptibility of C. difficile isolates from patients
with antibiotic-associated diarrhea or colitis. Antimicrob. Agents Chemother. 17:695698.
57 Tannock G.W. 1999. Probiotics: A critical review. Horizon Scientific Press.
58 Kim, K. et ai. Suppression ofinflammatory responses by surfactin, a selective inhibitor
of platelet cytosolic phospholipase A2? Biochem. Pharmacal. 1998; 55: 975 - 985.
Claims (20)
- リポペプチドを生産する有効量のバチルス細菌をプロバイオティックとして投与するステップを含む、腸異常の予防の方法。
- 腸異常が抗生物質関連下痢症、クロストリジウムディフィシル(Clostridium difficile)獲得性下痢症、炎症性腸疾患、および消化器疾患からなる群から選択される、請求項1に定義された方法。
- リポペプチドを生産する有効量のバチルス細菌をプロバイオティックとして投与するステップを含む、腸異常の治療の方法。
- 腸異常が抗生物質関連下痢症、クロストリジウムディフィシル獲得性下痢症、炎症性腸疾患、および消化器疾患からなる群から選択される、請求項3に定義された方法。
- バチルス細菌と合わせたイヌリンの投与をさらに含む、請求項1に定義された方法。
- バチルス細菌と合わせたイヌリンの投与をさらに含む、請求項3に定義された方法。
- バチルス細菌と合わせたプロバイオティックの投与をさらに含む、請求項1に定義された方法。
- バチルス細菌と合わせたプロバイオティックの投与をさらに含む、請求項3に定義された方法。
- 細菌がバチルスアミロリキファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)およびバチルスサブチリス(Bacillus subtilis)からなる群から選択される、請求項1に定義された方法。
- 細菌がバチルスアミロリキファシエンスおよびバチルスサブチリスからなる群から選択される、請求項3に定義された方法。
- バチルス細菌が投与時に相乗作用を持つ化合物を生産する、請求項1に定義された方法。
- バチルス細菌が投与時に相乗作用を持つ化合物を生産する、請求項3に定義された方法。
- SEQ ID NO:1の16S rRNA配列を有する、分離された細菌菌株。
- 菌株がSEQ ID NO:1の16S rRNA配列に少なくとも90%相同性を有する、請求項13に定義された、分離された細菌菌株。
- SEQ ID NO:2の部分的gyrA配列を有する、分離された細菌菌株。
- SEQ ID NO:2の部分的gyrA配列に少なくとも90%相同性を有する、請求項15に定義された、分離された細菌菌株。
- SEQ ID NO:3の部分的gyrA配列を有する、分離された細菌菌株。
- SEQ ID NO:3の部分的gyrA配列に少なくとも90%相同性を有する、請求項17に定義された、分離された細菌菌株。
- バチルス細菌がATCC菌株PTA−6737として同定された菌株の細菌からなる、請求項1に定義された方法。
- バチルス細菌がATCC菌株PTA−6737として同定された菌株の細菌からなる、請求項3に定義された方法。
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Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011111783A1 (ja) * | 2010-03-12 | 2011-09-15 | カルピス株式会社 | 大腸におけるビフィズス菌の増加及び減少抑制剤 |
JP2016505254A (ja) * | 2012-12-12 | 2016-02-25 | ルサッフル・エ・コンパニーLesaffre Et Compagnie | 下痢を治療および/または予防するプロバイオティクス株 |
JP2018531036A (ja) * | 2015-10-26 | 2018-10-25 | シージェー チェイルジェダン コーポレーション | 酵素生産能が優秀である伝統発酵食品由来の新たな菌株及びこれを用いた穀物発酵酵素食品の製造方法 |
JP2020525034A (ja) * | 2017-06-30 | 2020-08-27 | エボニック オペレーションズ ゲーエムベーハー | プロバイオティクス活性がある枯草菌株 |
JP2021526856A (ja) * | 2018-06-07 | 2021-10-11 | アルチュジェン セラピューティクス リミテッド | C.ディフィシル治療方法及び組成物 |
JP2022532242A (ja) * | 2019-05-14 | 2022-07-13 | オルメンデス・ソシエテ・アノニム | 活性プロバイオティクス組成物の増強または不活性プロバイオティクス組成物の活性化のためのバチルス・アミロリクエファシエンスおよび/またはバチルス・サブティリスの使用、このようにして得られた組成物、ならびに関連方法 |
Families Citing this family (34)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20100074949A1 (en) | 2008-08-13 | 2010-03-25 | William Rowe | Pharmaceutical composition and administration thereof |
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ES2527673T3 (es) * | 2008-09-17 | 2015-01-28 | Bayer Cropscience Lp | Procedimiento para usar una cepa de Bacillus subtilis para potenciar la salud animal |
US11028454B2 (en) * | 2008-09-24 | 2021-06-08 | Resilux | Incorporation of thermo-resistant and/or pressure-resistant organisms in materials |
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EP2547348B1 (en) | 2010-03-17 | 2015-05-20 | Bayer Cropscience LP | Method for using a bacillus subtilis strain for prophylaxis and treatment of gastro-intestinal conditions |
BR112013001107B1 (pt) | 2010-07-16 | 2022-01-25 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Métodos e composições incluindo bactéria formadora de esporos para aumento da saúde dos animais |
US9107938B2 (en) | 2010-09-30 | 2015-08-18 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Methods of selecting and using therapeutic and prophylactic probiotic cultures to reduce bacterial pathogen loads |
CA2834402A1 (en) * | 2010-12-29 | 2012-07-05 | Cangene Corporation | Clostridium difficile antigens |
BR112014021090B1 (pt) | 2012-02-27 | 2023-01-24 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Composição farmacêutica e uso de n-[2,4-bis(1,1-dimetiletil)-5-hidróxifenil]-1,4-di-hidro-4-oxoquinolina3-carboxamida na preparação da mesma |
WO2014022572A1 (en) | 2012-08-01 | 2014-02-06 | Pacific Vet Group-Usa, Inc. | Probiotic for amelioration of coccidiosis vaccine reaction |
RU2534356C2 (ru) * | 2012-10-04 | 2014-11-27 | Государственное научное учреждение Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Россельхозакадемии (ГНУ ИЭВСиДВ Россельхозакадемии) | Способ контроля качества дезинфекции птицеводческих помещений |
FR3007655B1 (fr) * | 2013-06-28 | 2016-12-23 | Lesaffre & Cie | Souche bacillus subtilis pour le traitement et/ou la prevention de maladies inflammatoires chroniques |
EP2923710A1 (en) | 2014-03-27 | 2015-09-30 | Universitätsklinikum Heidelberg | Bacterial phospholipase inhibitors as modulator of colonic bacterial flora |
AU2015292271B2 (en) * | 2014-07-25 | 2020-09-10 | The University Of Queensland | Bacillus amyloliquefaciens probiotic compositions, methods of production, and methods of use |
KR20170063954A (ko) | 2014-10-07 | 2017-06-08 | 버텍스 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 낭성 섬유증 막횡단 전도도 조절자의 조정제의 공-결정 |
JP6595761B2 (ja) * | 2014-12-19 | 2019-10-23 | 東亜薬品工業株式会社 | バチルスアミロリキファシエンス菌株及び該菌株を含む抗菌組成物 |
US11473052B2 (en) | 2015-01-23 | 2022-10-18 | Novozymes A/S | Bacillus subtilis subspecies |
ES2954455T3 (es) * | 2015-01-23 | 2023-11-22 | Novozymes As | Cepas de Bacillus que mejoran la salud y el rendimiento de animales de producción |
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WO2016194427A1 (ja) * | 2015-05-30 | 2016-12-08 | 日環科学株式会社 | プロバイオティクス、あるいはプレバイオティクス、並びにその製造方法、微生物製剤、健康食品並びに医薬品 |
WO2017062175A1 (en) | 2015-10-06 | 2017-04-13 | Albert Einstein College Of Medicine, Inc. | Microbial hyperswarmers and uses thereof |
RU2641979C1 (ru) * | 2016-10-24 | 2018-01-23 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии - МВА имени К.И. Скрябина" (ФГБОУ ВО МГАВМиБ - МВА имени К.И. Скрябина) | Способ морфологической оценки влияния различных лекарственных форм железа для энтерального применения на тонкий отдел кишечника у экспериментальных животных |
US20190289878A1 (en) * | 2018-03-23 | 2019-09-26 | Purina Animal Nutrition Llc | Methods of feeding animals feed products containing direct-fed microbials |
US20220347234A1 (en) * | 2019-06-21 | 2022-11-03 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Bacillus isolate compositions and methods of using and producing the same |
GB201911925D0 (en) * | 2019-08-20 | 2019-10-02 | Sporegen Ltd | Formulations for prevention or reduction of c. difficile infections |
WO2021116983A1 (en) * | 2019-12-11 | 2021-06-17 | Artugen Therapeutics, Ltd. | Edible products comprising bacterial strains and methods of use |
US20210283199A1 (en) * | 2020-03-13 | 2021-09-16 | Kemin Industries, Inc. | Method for controlling clostridium infection in animals |
GB202013874D0 (en) * | 2020-09-03 | 2020-10-21 | Sporegen Ltd | Treatment and prevention of viral infections |
CN113151069B (zh) * | 2021-04-01 | 2022-07-26 | 安杰利(重庆)生物科技有限公司 | 一种枯草芽孢杆菌及其在制备抗菌肽、饲料中的应用 |
KR102546973B1 (ko) * | 2021-10-20 | 2023-06-26 | 주식회사 리빙진 | 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균주를 포함하는 면역증강용 조성물 |
WO2023220279A1 (en) * | 2022-05-12 | 2023-11-16 | Can Technologies, Inc. | Compositions and methods for the treatment and prevention of campylobacter infection |
CN115725461B (zh) * | 2022-11-03 | 2024-03-19 | 东北农业大学 | 一株具有抗幽门螺杆菌作用的解淀粉芽孢杆菌及其应用 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002523372A (ja) * | 1998-08-24 | 2002-07-30 | ガネデン バイオテック, インコーポレイテッド | 共生乳酸産生細菌およびその使用 |
WO2004050832A2 (en) * | 2002-11-27 | 2004-06-17 | Kemin Industries, Inc. | Antimicrobial compounds from bacillus subtilis for use against animal and human pathogens |
WO2005110445A2 (en) * | 2004-05-11 | 2005-11-24 | Ganeden Biotech, Inc. | Methods and compositions for the dietary management of autoimmune disorders |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4968493A (en) * | 1986-06-30 | 1990-11-06 | American Cyanamid Company | Method for controlling chronic respiratory disease, fowl cholera and necrotic enteritis in avian species |
US5352586A (en) * | 1987-05-01 | 1994-10-04 | Biogaia Ab | Method of determining the presence of an antibiotic produced by Lactobacillus reuteri |
ZA926834B (en) * | 1991-09-09 | 1993-03-15 | American Cyanamid Co | Antibiotic LL-E19020 Gamma. |
JP2879321B2 (ja) * | 1996-03-14 | 1999-04-05 | 久保田 豊秋 | 動物用経口組成物 |
DE29724816U1 (de) * | 1997-01-09 | 2004-07-22 | Société des Produits Nestlé S.A. | Probiotik enthaltendes Getreideprodukt |
JP4189224B2 (ja) * | 2003-01-14 | 2008-12-03 | 株式会社カンサイ | バチルス属に属する微生物及びそれを用いる防除剤 |
KR100535912B1 (ko) * | 2003-12-17 | 2005-12-09 | 주식회사 케이티앤지 | 신규한 미생물 바실러스 아밀로리쿼페이션스 케이티지비0202 및 이를 이용한 식물병원균의 방제방법 |
JP2005198518A (ja) * | 2004-01-13 | 2005-07-28 | Asahi Business Support Co Ltd | 海苔屑分解処理法及び微生物 |
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Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002523372A (ja) * | 1998-08-24 | 2002-07-30 | ガネデン バイオテック, インコーポレイテッド | 共生乳酸産生細菌およびその使用 |
WO2004050832A2 (en) * | 2002-11-27 | 2004-06-17 | Kemin Industries, Inc. | Antimicrobial compounds from bacillus subtilis for use against animal and human pathogens |
WO2005110445A2 (en) * | 2004-05-11 | 2005-11-24 | Ganeden Biotech, Inc. | Methods and compositions for the dietary management of autoimmune disorders |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
JPN6012032804; TEO, A.Y. et al.: 'Inhibition of Clostridium perfringens by a novel strain of Bacillus subtilis isolated from the gastr' Appl Environ Microbiol. Vol.71, No.8, 200508, p.4185-4190 * |
JPN6012032805; HOA,N.T. et al: 'Characterization of Bacillus species used for oral bacteriotherapy and bacterioprophylaxis of gastro' Appl Environ Microbiol Vol.66, No.12, 2000, p.5241-5247 * |
Cited By (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011111783A1 (ja) * | 2010-03-12 | 2011-09-15 | カルピス株式会社 | 大腸におけるビフィズス菌の増加及び減少抑制剤 |
JP2016505254A (ja) * | 2012-12-12 | 2016-02-25 | ルサッフル・エ・コンパニーLesaffre Et Compagnie | 下痢を治療および/または予防するプロバイオティクス株 |
JP2018531036A (ja) * | 2015-10-26 | 2018-10-25 | シージェー チェイルジェダン コーポレーション | 酵素生産能が優秀である伝統発酵食品由来の新たな菌株及びこれを用いた穀物発酵酵素食品の製造方法 |
US11571012B2 (en) | 2015-10-26 | 2023-02-07 | CJ Wellcare Corporation | Strain derived from traditional fermented food and having excellent enzyme productivity, and method for preparing fermented cereal enzyme food by using same |
JP2020525034A (ja) * | 2017-06-30 | 2020-08-27 | エボニック オペレーションズ ゲーエムベーハー | プロバイオティクス活性がある枯草菌株 |
JP7104078B2 (ja) | 2017-06-30 | 2022-07-20 | エボニック オペレーションズ ゲーエムベーハー | プロバイオティクス活性がある枯草菌株 |
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