BR122022016032B1 - Composição de cepa bacteriana - Google Patents

Abstract

São revelados composições e métodos nesse documento para prevenir, melhorar ou tratar infecções por Clostridium difficile e/ou reduzir a gravidade de um ou mais de fatores de risco, sinais ou sintomas associados a infecções por C. difficile. Em particular, a tecnologia da presente revelação se refere a métodos para administrar uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo cepas de bactérias Bacillus amyloliquefaciens identificadas como ART24, ART4 e ART12, a um indivíduo que sofre ou está em risco de infecções por C. difficile.

Description

(Dividido do Pedido BR 11 2020 024798 7, depositado em 06/06/2019) REFERÊNCIA CRUZADA COM O PEDIDO RELACIONADO

[001] O presente pedido reivindica prioridade ao Pedido de Patente Provisório U.S. N° 62/681.774, depositado em 7 de junho de 2018, cujo conteúdo é incorporado nesse documento por referência em sua totalidade.

CAMPO TÉCNICO

[002] A presente tecnologia se refere geralmente a métodos e composições para prevenir, melhorar ou tratar infecções por Clostridium difficile e/ou reduzir a gravidade de um ou mais de fatores de risco, sinais ou sintomas associados a infecções por C. difficile. Em particular, a presente tecnologia se refere à administração de uma quantidade eficaz de uma composição que compreende cepas de bactérias Bacillus amyloliquefaciens identificadas como ART24, ART4 e ART12, a um indivíduo que sofre ou está em risco de infecções por C. difficile.

ANTECEDENTES

[003] A seguinte descrição é fornecida para auxiliar a compreensão do leitor. Nenhuma das informações fornecidas ou referências citadas é admitida como técnica anterior para as composições e métodos revelados nesse documento.

[004] Clostridium difficile é um bacilo anaeróbico Gram- positivo formador de esporos que pode colonizar o intestino grosso. Em condições clínicas particulares, por exemplo, quando a microbiota natural foi rompida ou depletada, C. difficile pode crescer demais e produzir toxinas que causam doenças patológicas. A infecção por C. difficile (CDI) pode causar sintomas que variam de diarreia leve a colite pseudomembranosa com risco de vida e megacólon tóxico. O uso prolongado de antibióticos, especialmente agentes de amplo espectro, pode induzir uma mudança na composição e na função da microbiota intestinal, resultando em diarreia associada a antibióticos (DAA). CDI ou doença associada ao Clostridium difficile (CDAD) é usado para descrever uma constelação de doenças causadas pelas toxinas A e B produzidas pelo bacilo C. difficile.

[005] C. difficileé a causa mais comum de diarreia infecciosa nosocomial e está se tornando uma carga crescente para o sistema de saúde, resultando em aproximadamente 29.000 mortes e totalizando mais de $ 1 bilhão por ano nos Estados Unidos. O surgimento de cepas altamente virulentas de C. difficile foi associado ao aumento da prevalência e da gravidade da doença, bem como a taxas mais altas de falha do tratamento com metronidazol.

[006] As abordagens terapêuticas atuais envolvem a interrupção do tratamento com o(s) antibiótico(s) agressor(es) e o início do tratamento com vancomicina ou metronidazol ou fidaxomicina. O tratamento de pacientes com infecção por C. difficile com antibióticos de padrão de atendimento (SOC) reduz a morbidade e a mortalidade. No entanto, o número de pacientes que não respondem ao metronidazol está aumentando. Os tratamentos com antibióticos interromperão e podem inibir o restabelecimento da microbiota endógena benéfica do trato gastrointestinal (GIT), o que torna os pacientes efetivamente curados para correrem o risco de recorrência da doença. Apesar dos avanços no tratamento de infecções, a recorrência de CDI é observada em cerca de 10-35% dos pacientes após seu caso inicial de CDI e em 35-65% dos pacientes após uma recorrência primária. Consequentemente, há uma necessidade de terapias mais eficazes para CDI e, em particular, terapias que preservem a microbiota gastrointestinal endógena.

SUMÁRIO

[007] Em um aspecto, a presente revelação fornece uma cepa bacteriana selecionada do grupo que consiste em ART24 (N° de acesso NCIMB 43088), ART4 (N° de acesso NCIMB 43086) e ART12 (N° de acesso NCIMB 43087). Em um aspecto, a presente revelação fornece uma composição que compreende uma ou mais de cepas bacterianas selecionadas do grupo que consiste em ART24 (N° de acesso NCIMB 43088), ART4 (N° de acesso NCIMB 43086), e ART12 (N° de acesso NCIMB 43087), e um conservante. Em algumas modalidades, a cepa bacteriana é ART24 (N° de acesso NCIMB 43088). Em algumas modalidades, a cepa bacteriana é ART4 (N° de acesso NCIMB 43086). Em algumas modalidades, a cepa bacteriana é ART12 (N° de acesso NCIMB 43087).

[008] Em algumas modalidades, a cepa bacteriana é liofilizada. Em algumas modalidades, a cepa bacteriana está na forma de um esporo. Em algumas modalidades, o conservante é selecionado do grupo que consiste em sacarose, trealose, ascorbato de sódio e glutationa. Em algumas modalidades, o conservante é um crioprotetor. Em algumas modalidades, o crioprotetor é selecionado do grupo que consiste em um nucleotídeo, um dissacarídeo, um poliol e um polissacarídeo. Em algumas modalidades, o crioprotetor é selecionado do grupo que consiste em inosina-5’-monofosfato (IMP), guanosina-5’- monofosfato (GMP), adenosina-5’-monofosfato (AMP), uranosina-5’-monofosfato (UMP), citidina-5’-monofosfato (CMP), adenina, guanina, uracila, citosina, guanosina, uridina, citidina, hipoxantina, xantina ou orotidina, timidina, inosina, trealose, maltose, lactose, sacarose, sorbitol, manitol, dextrina, inulina, ascorbato de sódio, glutationa, leite desnatado e crioprotetor 18. Em algumas modalidades, o crioprotetor compreende trealose.

[009] Em um aspecto, a presente revelação fornece uma composição farmacêutica que compreende uma ou mais de cepas bacterianas selecionadas do grupo que consiste em ART24 (N° de acesso NCIMB 43088), ART4 (N° de acesso NCIMB 43086), e ART12 (N° de acesso NCIMB 43087), e um carreador farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, o carreador farmaceuticamente aceitável compreende um polissacarídeo, goma de alfarroba, um polissacarídeo aniônico, um amido, uma proteína, ascorbato de sódio, glutationa, trealose, sacarose ou pectina. Em algumas modalidades, o polissacarídeo compreende uma planta, um animal, algas ou polissacarídeo microbiano. Em algumas modalidades, o polissacarídeo compreende goma guar, inulina, amilose, quitosana, sulfato de condroitina, um alginato ou dextrano. Em algumas modalidades, o amido compreende amido de arroz.

[0010] Em algumas modalidades, a composição compreende adicionalmente um antibiótico. Em algumas modalidades, o antibiótico compreende um ou mais de metronidazol, vancomicina e nitazoxanida.

[0011] Em algumas modalidades, a composição é formulada para administração entérica. Em algumas modalidades, a composição é formulada para dispensação oral, para dispensação sublingual, para dispensação retal ou para uso como um probiótico.

[0012] Em um aspecto, a presente revelação fornece um método para tratar ou prevenir uma infecção por Clostridium difficile ou uma doença associada a Clostridium difficile (CDAD) em um indivíduo em necessidade do mesmo, o método compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica que compreende uma ou mais de cepas bacterianas selecionadas do grupo que consiste em ART24 (N° de acesso NCIMB 43088), ART4 (N° de acesso NCIMB 43086), e ART12 (N° de acesso NCIMB 43087). Em algumas modalidades, a cepa bacteriana é ART24 (N° de acesso NCIMB 43088). Em algumas modalidades, a cepa bacteriana é ART4 (N° de acesso NCIMB 43086). Em algumas modalidades, a cepa bacteriana é ART12 (N° de acesso NCIMB 43087).

[0013] Em algumas modalidades, a cepa bacteriana é liofilizada. Em algumas modalidades, a cepa bacteriana está na forma de um esporo.

[0014] Em algumas modalidades, a infecção por C. difficile ou CDAD compreende uma ou mais de diarreia, perda de peso, perda de apetite, distensão abdominal, sintomas semelhantes aos da gripe, febre, dor abdominal, náusea, desidratação, colite e colite pseudomembranosa. Em algumas modalidades, a CDAD compreende diarreia associada a antibióticos (AAD).

[0015] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é administrada por via enteral. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente a administração separada, sequencial ou simultânea de um antibiótico ou mais ao indivíduo. Em algumas modalidades, um antibiótico ou mais compreende(m) um ou mais de metronidazol, vancomicina e nitazoxanida. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente a administração separada, sequencial ou simultânea de um anticorpo monoclonal antitoxina B.

[0016] Em um aspecto, a presente revelação fornece o uso de uma composição na preparação de um medicamento para tratar ou prevenir uma infecção por Clostridium difficile ou uma doença associada a Clostridium difficile (CDAD) em um indivíduo em necessidade do mesmo, em que a composição compreende uma ou mais de cepas bacterianas selecionadas do grupo que consiste em ART24 (N° de Acesso NCIMB 43088), ART4 (N° de Acesso NCIMB 43086) e ART12 (N° de Acesso NCIMB 43087). Em algumas modalidades, a cepa bacteriana é ART24 (N° de acesso NCIMB 43088). Em algumas modalidades, a cepa bacteriana é ART4 (N° de acesso NCIMB 43086). Em algumas modalidades, a cepa bacteriana é ART12 (N° de acesso NCIMB 43087).

[0017] Em algumas modalidades, a cepa bacteriana é liofilizada. Em algumas modalidades, a cepa bacteriana está na forma de um esporo.

[0018] Em algumas modalidades, a infecção por C. difficile ou CDAD compreende um ou mais de diarreia, perda de peso, perda de apetite, distensão abdominal, sintomas semelhantes aos da gripe, febre, dor abdominal, náusea, desidratação, colite e colite pseudomembranosa. Em algumas modalidades, a CDAD compreende diarreia associada a antibióticos (AAD).

[0019] Em algumas modalidades, o medicamento é formulado para ser administrado por via oral, sublingual ou retal. Em algumas modalidades, tratar ou prevenir compreende a administração separada, sequencial ou simultânea de um antibiótico ou mais ao indivíduo. Em algumas modalidades, um antibiótico ou mais compreende(m) um ou mais de metronidazol, vancomicina e nitazoxanida. Em algumas modalidades, o tratamento ou a prevenção compreende a administração separada, sequencial ou simultânea de um anticorpo monoclonal antitoxina B.

[0020] Em um aspecto, a presente revelação fornece um método para tratar ou prevenir uma infecção por Clostridium perfringens em um indivíduo em necessidade do mesmo, o método compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo uma cepa bacteriana selecionada do grupo consistindo em ART24 (N° de acesso NCIMB 43088), ART4 (NCIMB n° de acesso 43086) e ART12 (NCIMB n° de acesso 43087). Em algumas modalidades, a cepa bacteriana é ART24 (N° de acesso NCIMB 43088). Em algumas modalidades, a cepa bacteriana é ART4 (N° de acesso NCIMB 43086). Em algumas modalidades, a cepa bacteriana é ART12 (N° de acesso NCIMB 43087).

[0021] Em algumas modalidades, a cepa bacteriana é liofilizada. Em algumas modalidades, a cepa bacteriana está na forma de um esporo.

[0022] Em algumas modalidades, a infecção compreende um ou mais de dor abdominal, cólicas estomacais, diarreia e náuseas. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é administrada por via enteral. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente a administração separada, sequencial ou simultânea de um antibiótico ou mais ao indivíduo. Em algumas modalidades, um antibiótico ou mais compreende(m) um ou mais de metronidazol, vancomicina e nitazoxanida.

[0023] Em um aspecto, a presente revelação fornece o uso de uma composição na preparação de um medicamento para tratar ou prevenir uma infecção por Clostridium perfringens em um indivíduo em necessidade do mesmo, em que a composição compreende uma ou mais de cepas bacterianas selecionadas do grupo consistindo em ART24 (N° de acesso NCIMB 43088), ART4 (N° de acesso NCIMB 43086) e ART12 (N° de acesso NCIMB 43087). Em algumas modalidades, a cepa bacteriana é ART24 (N° de acesso NCIMB 43088). Em algumas modalidades, a cepa bacteriana é ART4 (N° de acesso NCIMB 43086). Em algumas modalidades, a cepa bacteriana é ART12 (N° de acesso NCIMB 43087).

[0024] Em algumas modalidades, a cepa bacteriana é liofilizada. Em algumas modalidades, a cepa bacteriana está na forma de um esporo.

[0025] Em algumas modalidades, a infecção compreende um ou mais de dor abdominal, cólicas estomacais, diarreia e náusea. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é administrada por via enteral. Em algumas modalidades, o uso compreende adicionalmente a administração separada, sequencial ou simultânea de um antibiótico ou mais ao indivíduo. Em algumas modalidades, um antibiótico ou mais compreende(m) um ou mais de metronidazol, vancomicina e nitazoxanida.

[0026] Em um aspecto, a presente revelação fornece um método para tratar ou prevenir uma infecção por Listeria monocytogenes em um indivíduo em necessidade do mesmo, o método compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo uma ou mais de cepas bacterianas selecionadas do grupo que consiste em ART24 (N° de acesso NCIMB 43088), ART4 (N° de acesso NCIMB 43086) e ART12 (N° de acesso NCIMB 43087). Em algumas modalidades, a cepa bacteriana é ART24 (N° de acesso NCIMB 43088). Em algumas modalidades, a cepa bacteriana é ART4 (N° de acesso NCIMB 43086). Em algumas modalidades, a cepa bacteriana é ART12 (N° de acesso NCIMB 43087).

[0027] Em algumas modalidades, a cepa bacteriana é liofilizada. Em algumas modalidades, a cepa bacteriana está na forma de um esporo.

[0028] Em algumas modalidades, a infecção compreende um ou mais de dor abdominal, sintomas semelhantes aos da gripe, cólicas estomacais, diarreia e náuseas. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é administrada por via enteral. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente a administração separada, sequencial ou simultânea de um antibiótico ou mais ao indivíduo. Em algumas modalidades, um antibiótico ou mais compreende(m) um ou mais de metronidazol, vancomicina e nitazoxanida.

[0029] Em um aspecto, a presente revelação fornece o uso de uma composição na preparação de um medicamento para tratar ou prevenir uma infecção por Listeria monocytogenes em um indivíduo em necessidade do mesmo, em que a composição compreende uma ou mais de cepas bacterianas selecionadas do grupo consistindo em ART24 (N° de acesso NCIMB 43088), ART4 (N° de acesso NCIMB 43086) e ART12 (N° de acesso NCIMB 43087). Em algumas modalidades, a cepa bacteriana é ART24 (N° de acesso NCIMB 43088). Em algumas modalidades, a cepa bacteriana é ART4 (N° de acesso NCIMB 43086). Em algumas modalidades, a cepa bacteriana é ART12 (N° de acesso NCIMB 43087).

[0030] Em algumas modalidades, a cepa bacteriana é liofilizada. Em algumas modalidades, a cepa bacteriana está na forma de um esporo.

[0031] Em algumas modalidades, a infecção compreende um ou mais de dor abdominal, sintomas semelhantes aos da gripe, cólicas estomacais, diarreia e náuseas. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é administrada por via enteral. Em algumas modalidades, o uso compreende adicionalmente a administração separada, sequencial ou simultânea de um antibiótico ou mais ao indivíduo. Em algumas modalidades, um antibiótico ou mais compreende(m) um ou mais de metronidazol, vancomicina e nitazoxanida.

[0032] Em um aspecto, a presente revelação fornece um método para tratar ou prevenir uma infecção por Vibrio parahaemolyticus em um indivíduo em necessidade do mesmo, o método compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo uma ou mais de cepas bacterianas selecionadas do grupo que consiste em ART24 (N° de acesso NCIMB 43088), ART4 (N° de acesso NCIMB 43086) e ART12 (N° de acesso NCIMB 43087). Em algumas modalidades, a cepa bacteriana é ART24 (N° de acesso NCIMB 43088). Em algumas modalidades, a cepa bacteriana é ART4 (N° de acesso NCIMB 43086). Em algumas modalidades, a cepa bacteriana é ART12 (N° de acesso NCIMB 43087).

[0033] Em algumas modalidades, a cepa bacteriana é liofilizada. Em algumas modalidades, a cepa bacteriana está na forma de um esporo.

[0034] Em algumas modalidades, o indivíduo é um peixe ou crustáceo. Em algumas modalidades, o peixe ou crustáceo está em um ambiente de aquicultura. Em algumas modalidades, a administração compreende o fornecimento da composição ao ambiente de aquicultura. Em algumas modalidades, a composição é formulada como uma ração para peixes ou aditivo para rações para peixes. Em algumas modalidades, a composição é formulada como um agente de tratamento por banho. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é administrada por via enteral.

[0035] Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente a administração separada, sequencial ou simultânea de um antibiótico ou mais ao indivíduo. Em algumas modalidades, um antibiótico ou mais compreende(m) um ou mais de metronidazol, vancomicina e nitazoxanida.

[0036] Em um aspecto, a presente revelação fornece o uso de uma composição na preparação de um medicamento para tratar ou prevenir uma infecção por Vibrio parahaemolyticus em um indivíduo em necessidade do mesmo, em que a composição compreende uma ou mais de cepas bacterianas selecionadas do grupo consistindo em ART24 (N° de acesso NCIMB 43088), ART4 (N° de acesso NCIMB 43086) e ART12 (N° de acesso NCIMB 43087). Em algumas modalidades, a cepa bacteriana é ART24 (N° de acesso NCIMB 43088). Em algumas modalidades, a cepa bacteriana é ART4 (N° de acesso NCIMB 43086). Em algumas modalidades, a cepa bacteriana é ART12 (N° de acesso NCIMB 43087).

[0037] Em algumas modalidades, a cepa bacteriana é liofilizada. Em algumas modalidades, a cepa bacteriana está na forma de um esporo.

[0038] Em algumas modalidades, o indivíduo é um peixe ou crustáceo. Em algumas modalidades, o peixe ou crustáceo está em um ambiente de aquicultura. Em algumas modalidades, a administração compreende o fornecimento da composição ao ambiente de aquicultura. Em algumas modalidades, a composição é formulada como uma ração para peixes ou aditivo para rações para peixes. Em algumas modalidades, a composição é formulada como um agente de tratamento por banho.

[0039] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é administrada por via enteral. Em algumas modalidades, o uso compreende adicionalmente a administração separada, sequencial ou simultânea de um antibiótico ou mais ao indivíduo. Em algumas modalidades, um antibiótico ou mais compreende(m) um ou mais de metronidazol, vancomicina e nitazoxanida.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0040] As FIGs. 1A-1B são fotografias que mostram propriedades anti-C. difficile do sobrenadante de cultura de cepas de B. amyloliquefaciens ART12, ART24 e ART4. Um ensaio de difusão em poços mostrado na FIG. 1A mostra grandes zonas de atividade anti-C. difficile para cada um dos sobrenadantes de cultura das cepas ART12, ART24 e ART4. A FIG. 1B mostra zonas de atividade anti-C. difficile de sobrenadantes de cultura de 24, 48 e 72 horas das cepas ART4, ART12 e ART24.

[0041] As FIGs. 2A-2B mostram ensaios de difusão em poços demonstrando que as cepas de B. amyloliquefaciens da presente tecnologia são resistentes a proteases digestivas. A FIG. 2A mostra que a atividade anti-C. difficile do sobrenadante da ART24 é resistente à inativação pela pepsina e tripsina. A FIG. 2B mostra que a atividade anti-C. difficile do sobrenadante da ART4 é resistente à inativação pela tripsina, quimotripsina e proteinase-K.

[0042] As FIGs. 3A-3C são cromatografias de MS MALDI-TOF de frações de HPLC de sobrenadantes de cultura de ART24 (FIG. 3A), ART4 (FIG. 3B) e DSM7T(FIG. 3C). Os espectros mostram que as frações bioativas anti-C. difficile dos sobrenadantes de cultura de ART24 (FIG. 3A) e ART4 (FIG. 3B) contêm o composto anti-C. difficile amilociclina. Como mostrado na FIG. 3D, a amilociclina não está presente no espectro de frações do sobrenadante de cultura de DSM7T.

[0043] A FIG. 4A mostra um ensaio de difusão em poços usando C. difficile como o indicador, onde a proteinase-K (ProK) foi adicionada diretamente (poço central) ou adjacente (poço à direita) a um poço contendo sobrenadante de cultura ART24. A FIG. 4B é um conjunto de cromatografias de MS MALDI-TOF mostrando que a atividade de ART24 anti-C. difficileé mantida mesmo quando o pico da amilociclina é perdido na presença de ProK.

[0044] A FIG. 5A é um gráfico que mostra os resultados de uma cocultura de 24 horas de ART24 e C. difficile. O cultivo de C. difficile diminui em mais de 2 log após a exposição à ART24. A FIG. 5B é um gráfico que mostra a inoculação de 10x de ART24 em uma cultura contínua de C. difficile em T3h e T6h, por 24 horas, resultando em uma diminuição no cultivo de C. difficile por leitura de DO.

[0045] A FIG. 6A mostra um ensaio de difusão em poços demonstrando a atividade do sobrenadante da cultura das cepas ART4, ART12 e ART24 contra vários isolados clínicos diferentes de C. difficile. A FIG. 6B mostra um ensaio de difusão em poços demonstrando a atividade de anti-C. difficile do sobrenadante da cultura de ART24 contra 28 isolados clínicos contemporâneos de C. difficile.

[0046] A FIG. 7A mostra ensaios de difusão em poços para (painel superior da esquerda para a direita): Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Staphylococcus capitis; e (painel inferior da esquerda para a direita): Bacillus thuringiensis e Clostridium difficile comparando atividades de ART4 (“A4”), ART12 (“12 Aer 1”) e ART24 (“024(2)”) contra cada uma. O ensaio mostra uma comparação de sobrenadantes de cultura de ART4, ART12 e ART24 de 24h e 48h. A FIG. 7B é um gráfico que mostra uma análise qPCR. Cepas ART 24 frescas adicionadas a amostras de microbiota colônica de humano in vitro poupam os filos colônicos humanos investigados, ou seja, proteobactérias, firmicutes, Bacteroidetes, verrucomicrobia e lactobaccilus.

[0047] A FIG. 8A mostra um projeto ilustrativo para avaliar a eficácia in vivo das cepas de B. amyloliquefaciens (B. amy) da presente tecnologia. A FIG. 8B é um gráfico que mostra a porcentagem de camundongos infectados por C. difficile exibindo sinais clínicos anormais após o tratamento diário com células vegetativas de ART24 recolocadas em suspensão em PBS (“B amy PBS”), células vegetativas de ART24 recolocadas em suspensão em meio usado (“B amy QD”), vancomicina ou PBS (“veículo”). A FIG. 8C é um gráfico que mostra a mudança de peso percentual a partir do dia 0 para cada um dos grupos de tratamento. A FIG. 8D é um gráfico que mostra a mudança percentual do peso a partir do dia 0 do grupo “B. amy PBS” e análise estatística por dia. *p<0,05; **p<0,01; ANOVA de 2 fatores com comparações múltiplas. A FIG. 8E é uma curva de sobrevivência de Kaplan- Meier que mostra a porcentagem de sobrevivência pós infecção por C. difficile em cada um dos grupos de tratamento.

[0048] A FIG. 9A mostra ensaios de difusão em poços demonstrando os efeitos inibidores de ART12, ART24 e ART4 contra 7 isolados clínicos de C. perfringens.

[0049] As FIGs. 9B-9E são cromatografias DE MS MALDI-TOF de frações de HPLC de cultura de DSM7T(FIG. 9B), ART4 (FIG. 9C), ART12 e (FIG. 9D), ART24 (FIG. 9E) contra C. perfringens. Os espectros de massa de frações ativas indicam plipastatina (fengicina) como metabólito ativo anti-C. perfringens. A plipastatina não está presente no espectro de frações do sobrenadante da cultura de DSM7T.

[0050] A FIG. 9F mostra um ensaio de difusão em poços anti-L. monocytogenes demonstrando os efeitos inibidores de ART4, ART12 e ART24 contra uma única cepa de Listeria monocytogenes.

[0051] A FIG. 10A é um gráfico que mostra o efeito do fluido gástrico simulado (pH 3) nos esporos de B. amyloliquefaciens.

[0052] A FIG. 10B é um gráfico que mostra a estabilidade dos esporos de ART4, ART12 e ART24 pré- e pós-secagem por congelamento (pré- e pós-liofilização).

[0053] A FIG. 11A é um Western blot que mostra a detecção de clivagem da toxina A de C. difficile por ART24 liofilizada reconstituída (lote CO-33-8A1).

[0054] A FIG. 11B é um Western blot que mostra a detecção de clivagem da toxina B de C. difficile por ART24 liofilizada reconstituída (lote CO-33-8A1).

[0055] A FIG. 11C é um gráfico que mostra a atividade anti-C. difficile de 1 x 107UFC de ART24 em esporos de C. difficile e contagens de células vegetativas em co-cultura líquida.

[0056] A FIG. 12 é um ensaio de difusão em poços mostrando zonas de atividade anti-V. parahaemolyticus para cada um dos sobrenadantes de cultura das cepas ART4, ART12 e ART24.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0057] Deve ser apreciado que certo(a)s aspectos, modos, modalidades, variações e recursos da presente tecnologia são descrito(a)s abaixo em vários níveis de detalhes, a fim de fornecer uma compreensão substancial da presente tecnologia. As definições de certos termos como usados nesse relatório descritivo são fornecidas abaixo. A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados nesse documento geralmente têm o mesmo significado como comumente entendido por alguém habilitado comum na técnica à qual essa presente tecnologia pertence.

I. Definições

[0058] Os seguintes termos são usados nesse documento, as definições dos quais são fornecidas para orientação.

[0059] Como usado nesse documento, as formas singulares “um”, “uma” e “a” e “o” designam tanto o singular quanto o plural, a menos que expressamente indicado para designar apenas o singular.

[0060] O termo “cerca de” e o uso de faixas em geral, sejam ou não qualificados pelo termo cerca de, significa que o número compreendido não está limitado ao número exato estabelecido nesse documento e se destina a referir-se a faixas substancialmente dentro da faixa citada, embora não se afaste do escopo da invenção. Como usado nesse documento, “cerca de” será compreendido por pessoas de habilidade comum na técnica e irá variar até certo ponto no contexto em que é usado. Se houver usos do termo que não são claros para pessoas de habilidade comum na técnica, dado o contexto em que é usado, “cerca de” significará mais ou menos 10% do termo específico.

[0061] Como usado nesse documento, a “administração” de um(a) agente, fármaco, cepa bacteriana ou esporo da mesma, ou uma composição da presente tecnologia a um indivíduo inclui qualquer via de introdução ou dispensação a um indivíduo de um composto para realizar sua função pretendida. A administração pode ser realizada por qualquer via adequada, incluindo oral, intranasal, parenteral (intravenosa, intramuscular, intraperitoneal ou subcutânea), topicamente ou por inalação. Em algumas modalidades, as composições da presente tecnologia são formuladas para administração entérica. Em algumas modalidades, as composições são formuladas para dispensação oral, sublingual ou retal. Em algumas modalidades, as composições são formuladas para uso como probiótico. Em algumas modalidades, as composições são formuladas para uso como um bioterapêutico vivo. Como usado nesse documento, a administração inclui a autoadministração e a administração por outro.

[0062] Como usado nesse documento, “ART24” ou “ART024 (2)” ou “024(2)” refere-se a uma cepa bacteriana, ou esporo da mesma, tendo sido depositada sob o N° de Acesso NCIMB 43088 ou composições que compreendem a cepa.

[0063] Como usado nesse documento, “ART4” ou “A4” refere- se a uma cepa bacteriana, ou esporo da mesma, tendo sido depositada sob o N° de Acesso NCIMB 43086, ou composições compreendendo a cepa.

[0064] Como usado nesse documento, “ART12” ou “12 Aer 1” refere-se a uma cepa bacteriana, ou esporo da mesma, tendo sido depositada sob o N° de Acesso NCIMB 43087 ou composições compreendendo a cepa.

[0065] Como usado nesse documento, os termos “quantidade eficaz” ou “quantidade terapeuticamente eficaz” e “quantidade farmaceuticamente eficaz” referem-se a uma quantidade suficiente para atingir um efeito terapêutico e/ou profilático desejado, por exemplo, uma quantidade que resulta em a prevenção de uma doença, condição e/ou sintoma(s) da mesma. No contexto de aplicações terapêuticas ou profiláticas, a quantidade de uma composição administrada ao indivíduo dependerá do tipo e da gravidade da doença e das características do indivíduo, tais como, saúde geral, idade, sexo, peso corporal e tolerância aos fármacos da composição. Dependerá também do(a) grau, gravidade e tipo de doença ou condição. O técnico habilitado será capaz de determinar as dosagens apropriadas dependendo desses e de outros fatores. Em algumas modalidades, doses múltiplas são administradas. Adicionalmente ou alternativamente, em algumas modalidades, múltipla(o)s composições ou compostos terapêutica(o)s (por exemplo, composições farmacêuticas compreendendo múltiplas cepas bacterianas sozinhas ou em combinação com agentes ativos adicionais, tais como, antibióticos ou anticorpo monoclonal antitoxina B) são administrada(o)s. Nos métodos descritos nesse documento, composições compreendendo as cepas bacterianas da presente tecnologia, ou esporos das mesmas, podem ser administradas a um indivíduo tendo um ou mais de sinais, sintomas ou fatores de risco de infecção por C. difficile (CDI) ou doença associada a Clostridium difficile (CDAD), incluindo, mas não se limitando a, diarreia, perda de peso, perda de apetite, distensão abdominal, sintomas semelhantes aos da gripe, febre, dor abdominal, náusea, desidratação, colite e colite pseudomembranosa. Por exemplo, uma “quantidade terapeuticamente eficaz” das composições da presente tecnologia inclui níveis nos quais a presença, frequência ou gravidade de um ou mais de sinais, sintomas ou fatores de risco de CDI ou CDAD são, no mínimo, melhoradas. Em algumas modalidades, uma quantidade terapeuticamente eficaz reduz ou melhora os efeitos fisiológicos de CDI ou CDAD e/ou os fatores de risco de CDI ou CDAD e/ou a probabilidade de desenvolver CDI ou CDAD. Em algumas modalidades, uma quantidade terapeuticamente eficaz é alcançada por múltiplas administrações. Em algumas modalidades, uma quantidade terapeuticamente eficaz é alcançada com uma única administração.

[0066] Como usado nesse documento, os termos “seco por congelamento” ou “secagem por congelamento” e “liofilizado” ou “liofilização” são usados indistintamente e referem-se a um processo que remove a água de um produto após ele ser congelado e colocado sob um vácuo e os produtos produzidos a partir do mesmo.

[0067] Como usado nesse documento, “carreador e/ou diluente farmaceuticamente aceitável” ou “excipiente farmaceuticamente aceitável” inclui, mas não está limitado a, solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e retardantes de absorção e semelhantes. Em algumas modalidades, o carreador farmaceuticamente aceitável compreende um polissacarídeo, goma de alfarroba, um polissacarídeo aniônico, um amido, uma proteína, ascorbato de sódio, glutationa, trealose, sacarose ou pectina. Em algumas modalidades, o polissacarídeo compreende uma planta, um animal, algas ou um polissacarídeo microbiano. Em algumas modalidades, o polissacarídeo compreende goma guar, inulina, amilose, quitosana, sulfato de condroitina, um alginato ou dextrano. Em algumas modalidades, o amido compreende amido de arroz. O uso de tais meios e agentes para substâncias biologicamente ativas é bem conhecido na técnica. Mais detalhes sobre os excipientes são fornecidos abaixo. Ingredientes ativos suplementares, tais como antimicrobianos, por exemplo, agentes antifúngicos, também podem ser incorporados nas composições.

[0068] Como usado nesse documento, “excipiente farmaceuticamente aceitável” refere-se a substâncias e composições que não produzem uma reação adversa, alérgica ou outra reação adversa quando administradas a um animal ou humano. Como usado nesse documento, o termo inclui todos as cargas inertes, não tóxicas, líquidas ou sólidas, ou diluentes que não reagem com a substância terapêutica da invenção de uma maneira negativa inadequada, solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de retardo da absorção, conservantes e semelhantes, por exemplo, carreadores farmacêuticos líquidos, por exemplo, água estéril, solução salina, soluções de açúcar, tampão Tris, etanol e/ou certos óleos.

[0069] Como usado nesse documento, “probiótico” se refere a bactérias que compreendem um componente da flora transitória ou endógena de um indivíduo administrado para conferir um efeito profilático e/ou terapêutico benéfico ao indivíduo. Os probióticos são geralmente conhecidos como seguros pelos habilitados na técnica. Embora não desejando ser limitado por qualquer mecanismo particular, é possível que o efeito profilático e/ou terapêutico de uma cepa de B. amyloliquefaciens da presente tecnologia resulte da inibição do crescimento bacteriano patogênico devido à produção de produtos extracelulares tendo atividade antimicrobiana. Em algumas modalidades, “probióticos” incluem “produtos bioterapêuticos vivos”.

[0070] Como usado nesse documento, “prevenção”, “prevenir” ou “prevenindo” de um(a) distúrbio ou condição se refere a, em uma amostra estatística, a redução na ocorrência ou recorrência do(a) distúrbio ou condição em indivíduos/amostras tratado(a)s em relação a um controle não tratado, ou refere-se a retardo do aparecimento de um ou mais de sintomas do(a) distúrbio ou condição em relação aos controles não tratados.

[0071] Como usado nesse documento, “indivíduo” e “paciente” são usados indistintamente. Em algumas modalidades, o indivíduo é um indivíduo animal. Em algumas modalidades, o indivíduo animal é um mamífero. Em algumas modalidades, o indivíduo mamífero é um humano. Em algumas modalidades, o indivíduo animal é um peixe ou crustáceo. Em algumas modalidades, o peixe ou crustáceo está em um ambiente de aquicultura.

[0072] Como usado nesse documento, o termo administração “simultânea” refere-se à administração de pelo menos dois agentes pela mesma via e ao mesmo tempo ou substancialmente ao mesmo tempo.

[0073] Como usado nesse documento, o termo administração “separada” refere-se a uma administração de pelo menos dois agentes ao mesmo tempo ou substancialmente ao mesmo tempo por vias diferentes.

[0074] Como usado nesse documento, o termo administração “sequencial” refere-se à administração de pelo menos dois agentes em momentos diferentes, a via de administração sendo idêntica ou diferente. Mais particularmente, o uso sequencial refere-se a toda a administração de um agente antes do início da administração do(s) outro(s) agente(s). Portanto, é possível administrar um dos agentes durante vários minutos, horas ou dias antes de administrar outro.

[0075] Um “efeito terapêutico sinergístico” refere-se a um efeito terapêutico maior do que aditivo que é produzido por uma combinação de pelo menos dois agentes terapêuticos e que excede aquele que de outra forma resultaria da administração individual dos agentes. Por exemplo, o uso de cepas bacterianas da presente tecnologia em conjunto com outros agentes para o tratamento de CDI ou CDAD pode resultar em um efeito terapêutico maior do que aditivo. Em algumas modalidades, o efeito sinergístico pode permitir o uso de doses mais baixas de cepas bacterianas da presente tecnologia e/ou outros agentes do que seria necessário se cada um fosse usado sozinho.

[0076] “Tratamento”, “tratar”, “tratado” ou “tratamento” de um(a) doença ou distúrbio inclui: (i) inibir a(o) doença ou distúrbio, isto é, interromper seu desenvolvimento; (ii) aliviar a(o) doença ou distúrbio, isto é, causar a sua regressão; (iii) retardar a progressão do distúrbio; e/ou (iv) inibir, aliviar ou retardar a progressão de um sintoma ou mais da(o) doença ou distúrbio.

[0077] Deve ser apreciado que os vários modos de tratamento ou prevenção de doenças e condições médicas, como descrito, pretendem significar “substancial”, que inclui tratamento ou prevenção total, mas também inferior ao total, e em que parte do resultado biologicamente ou clinicamente relevante é alcançada.

II. Infecção por Clostridium difficile (CDI)

[0078] A infecção por Clostridium difficile (CDI) ou doença associada a Clostridium difficile (CDAD) é uma infecção sintomática causada pela bactéria Gram-positiva anaeróbia, formadora de esporos, Clostridium difficile. Os sintomas de CDI incluem diarreia aquosa, febre, náuseas e dor abdominal. A CDI está na base de cerca de 20% dos casos de diarreia associada a antibióticos (DAA). As complicações da CDI podem incluir colite pseudomembranosa, megacólon tóxico, perfuração do cólon e sepse e morte.

[0079] A CDI é transmitida por esporos bacterianos. Os esporos são resistentes a muitos tipos de desinfetantes e podem persistir em superfícies contaminadas, incluindo superfícies de alimentos, por um período de meses. Os fatores de risco para CDI incluem o uso de antibióticos ou inibidores da bomba de prótons, hospitalização e idade avançada. Em indivíduos saudáveis, o crescimento de C. difficileé controlado pela microbiota normal presente no trato gastrointestinal. O uso de antibióticos e medicamentos de amplo espectro que diminuem a acidez do estômago, tais como os inibidores da bomba de prótons, pode permitir que a bactéria C. difficile se prolifere e promova a infecção. No cólon, C. difficile produz uma enterotoxina (toxina A) e uma citotoxina (toxina B). As toxinas estimulam a produção de mediadores inflamatórios, que aumentam a permeabilidade na parede intestinal levando à diarreia e causando degradação das células epiteliais do cólon. O diagnóstico de CDI é feito por cultura de fezes ou teste para a presença de DNA bacteriano ou toxinas.

[0080] Em algumas modalidades, a presente tecnologia fornece métodos e composições para o tratamento ou a prevenção da infecção por C. difficile, incluindo a redução da gravidade de uma ou mais de fatores de risco, sinais ou sintomas associados a infecções por C. difficile. Em algumas modalidades, as composições compreendem as novas cepas de Bacillus amyloliquefaciens ART24, ART4 e ART12 ou esporos das mesmas.

III. Infecção por Clostridium perfringens

[0081] Clostridium perfringensé uma bactéria patogênica Gram-positiva, anaeróbia, formadora de esporos sempre presente na natureza e encontrada no(a) solo, vegetação em decomposição, sedimento marinho e trato gastrointestinal humano. C. perfringensé uma das causas mais comuns de doenças transmitidas por alimentos nos Estados Unidos. Os sintomas da infecção por C. perfringens podem incluir dor abdominal, cólicas estomacais, diarreia e náuseas. O envenenamento por C. perfringens tipo c pode causar enterite necrótica (também conhecida como síndrome pigbel). Essa síndrome pode causar a morte das células intestinais e costuma ser fatal.

[0082] Em algumas modalidades, a presente tecnologia fornece métodos e composições para o tratamento ou a prevenção da infecção por C. perfringens, incluindo a redução da gravidade de um ou mais de fatores de risco, sinais ou sintomas associados a infecções por C. perfringens. Em algumas modalidades, as composições compreendem as novas cepas de Bacillus amyloliquefaciens ART24, ART4 e ART12 ou esporos das mesmas.

IV. Infecção por Listeria monocytogenes (listeriose)

[0083] Listeria monocytogenesé uma bactéria Gram- positiva, anaeróbia facultativa, patogênica que cresce e se reproduz em células hospedeiras. A infecção invasiva por L. monocytogenes causa a doença listeriose, é transmitida pela ingestão de alimentos contaminados, tais como laticínios não pasteurizados ou alimentos crus. A Listeria pode escapar do controle em artigos alimentícios humanos devido à sua capacidade de se multiplicar e crescer em temperaturas de refrigeração tão baixas quanto 0 °C, e é um dos patógenos mais virulentos de por alimentos. Estima-se que 1.600 pessoas desenvolvam listeriose a cada ano nos Estados Unidos e cerca de 260 mortes devido à infecção. A infecção tem maior probabilidade de adoecer mulheres grávidas e seus recém- nascidos, adultos com 65 anos ou mais e pessoas com sistema imunológico enfraquecido. Em indivíduos de alto risco, a infecção é fatal em 20-30% dos casos. A infecção pode ser limitada ao trato gastrointestinal ou pode ser invasiva ao(à)(s) cérebro, membranas espinhais ou corrente sanguínea. Em mulheres grávidas, a infecção pode levar a aborto espontâneo, parto de natimorto, parto prematuro de uma infecção com risco de vida do recém-nascido.

[0084] Em algumas modalidades, a presente tecnologia fornece métodos e composições para o tratamento ou a prevenção da infecção por L. monocytogenes, incluindo a redução da gravidade de um ou mais de fatores de risco, sinais ou sintomas associados a infecções por L. monocytogenes. Em algumas modalidades, as composições compreendem as novas cepas de Bacillus amyloliquefaciens ART24, ART4 e ART12 ou esporos das mesmas.

V. Infecção por Vibrio parahaemolyticus (vibriose)

[0085] Vibrio parahaemolyticusé um agente zoonótico aquático que pode ameaçar a saúde humana e dos animais da aquicultura. V. parahaemolyticusé uma bactéria Gram- negativa halofílica, que é amplamente distribuída e naturalmente presente em ambientes marinhos e estuarinos. Fatores ambientais influenciam seu crescimento e seus números são maiores quando a água está quente. As infecções por V. parahaemolyticus em humanos são adquiridas pela ingestão de frutos do mar contaminados ou pela exposição de uma ferida aberta à água do mar. V. parahaemolyticus foi associada a infecções esporádicas e surtos de gastroenterite. V. parahaemolyticusé o principal agente causal de gastroenterite aguda de humano após o consumo de produtos marinhos crus, mal cozidos ou mal manipulados. As características clínicas mais frequentemente associadas à infecção por V. parahaemolyticus incluem diarreia aquosa, cólicas abdominais, náuseas e vômitos; infecções de feridas e septicemia ocorrem com menos frequência. O diagnóstico laboratorial é feito pelo isolamento do organismo de amostras clínicas, incluindo sangue, fezes e amostras de feridas. Quase todos os casos de infecção por V. parahaemolyticus de origem alimentar estão associados a um histórico recente de consumo de frutos do mar. V. parahaemolyticus produz várias toxinas em doenças humanas, tais como, hemolisina direta termoestável (TDH), hemolisina relacionada a TDH (TRH) e hemolisina termoestável (TLH).

[0086] A infecção por V. parahaemolyticus em animais de aquicultura pode resultar em perdas econômicas significativas. A infecção é particularmente prejudicial em culturas de camarão onde a vibriose pode levar à Doença de Necrose Hepatopancreática Aguda (AHPND) ou Síndrome de Mortalidade Precoce (EMS) e em culturas de salmão onde a infecção pode causar hemorragia nas nadadeiras, olhos e superfície ventral com uma taxa de mortalidade muito alta. As toxinas relacionadas a insetos com Photorabdus (Pir) que consistem em PirA^vp and PirB^vpsão as toxinas associadas à AHPND em camarões. A resistência a antibióticos tornou o tratamento da infecção por V. parahaemolyticus um desafio com antibióticos e existe a necessidade de desenvolver uma terapia alternativa para controlar as infecções por V. parahaemolyticus na aquicultura.

[0087] Em algumas modalidades, a presente tecnologia fornece métodos e composições para o tratamento ou a prevenção da infecção por V. parahaemolyticus, incluindo a redução da gravidade de um ou mais de fatores de risco, sinais ou sintomas associados a infecções por V. parahaemolyticus. Em algumas modalidades, as composições compreendem as novas cepas de Bacillus amyloliquefaciens ART24, ART4 e ART12 ou esporos das mesmas. Em algumas modalidades, a presente tecnologia fornece um agente de tratamento por banho (imersão) compreendendo as novas cepas de B. amyloliquefaciens ART24, ART4 e ART12 ou esporos das mesmas para prevenir ou tratar infecções por V. parahaemolyticus na aquicultura. Em algumas modalidades, a presente tecnologia fornece uma ração para peixes ou aditivo para rações de peixes compreendendo as novas cepas de B. amyloliquefaciens ART24, ART4 e ART12, ou esporos das mesmas para prevenir ou tratar infecções por V. parahaemolyticus em aquicultura.

VI. Cepas de Bacillus amyloliquefaciens da Tecnologia Atual

[0088] A tecnologia da presente revelação se refere à verificação de várias cepas da bactéria Bacillus amyloliquefaciens, ou esporos das mesmas, tratando ou prevenindo eficazmente a infecção por C. difficile. As cepas bacterianas foram isoladas de amostras de fezes humanas e analisadas para atividade anti-C. difficile. Uma triagem primária foi feita para atividade proteolítica, com uma triagem secundária para atividade anti-C. difficile. As colônias que mostram atividade antimicrobiana contra a cepa de C. difficile foram purificadas e designadas como “ART24” (ou “ART024(2)” ou “024(2)”), “ART4” (ou “A4") e ART12 (ou “12 Aer 1”). ART24 refere-se a uma cepa bacteriana, ou esporo da mesma, caracterizada pelo N° de Acesso NCIMB 43088, ou composições que compreendem a cepa. ART4 refere-se a uma cepa bacteriana, ou esporo da mesma, caracterizada pelo N° de Acesso NCIMB 43086 ou composições que compreendem a cepa. ART12 refere-se a uma cepa bacteriana, ou esporo da mesma, caracterizada pelo N° de Acesso NCIMB 43087 ou composições que compreendem a cepa.

[0089] Em algumas modalidades, cepas bacterianas da presente tecnologia, ou esporos das mesmas, são usadas em métodos e composições para tratar ou prevenir infecções por C. difficile, C. perfringens ou L. monocytogenes. Em algumas modalidades, as cepas bacterianas compreendem um probiótico para prevenir ou controlar infecções por C. difficile, C. perfringens ou L. monocytogenes. Em algumas modalidades, as composições da presente tecnologia compreendem células bacterianas vegetativas. Em algumas modalidades, as composições da presente tecnologia compreendem esporos bacterianos. Em algumas modalidades, as composições da presente tecnologia compreendem uma combinação de células bacterianas vegetativas e esporos bacterianos.

VII. Métodos Terapêuticos e Profiláticos

[0090] A discussão a seguir é apresentada a título de exemplo apenas, e não se destina, a ser limitante.

[0091] Um aspecto da presente tecnologia inclui métodos de tratamento ou prevenção de infecção por C. difficile (CDI) em um indivíduo diagnosticado como tendo, suspeito de ter, ou em risco de ter, CDI. Em aplicações terapêuticas, composições ou medicamentos compreendendo uma cepa bacteriana, ou esporo da mesma, selecionada do grupo que consiste em ART24, ART4, ART12 e combinações das mesmas, são administradas a um indivíduo suspeito de, ou já sofrendo de, tal doença (tal como, por exemplo, indivíduos exibindo diarreia, perda de peso, perda de apetite, distensão abdominal, sintomas semelhantes aos da gripe, febre, dor abdominal, náusea, desidratação, colite ou colite pseudomembranosa), em uma quantidade suficiente para curar, ou pelo menos parar parcialmente, o sintomas da doença, incluindo suas complicações e fenótipos patológicos intermediários no desenvolvimento da doença.

[0092] Os indivíduos que sofrem de CDI podem ser identificados por qualquer um ou uma combinação de ensaios de diagnóstico ou prognóstico conhecidos na técnica. Por exemplo, os sintomas típicos de CDI incluem, mas não estão limitados a, diarreia, perda de peso, perda de apetite, distensão abdominal, sintomas semelhantes aos da gripe, febre, dor abdominal, náusea, desidratação, colite ou colite pseudomembranosa.

[0093] Em algumas modalidades, os indivíduos com CDI tratados com as cepas bacterianas da presente tecnologia, ou esporos das mesmas, apresentarão melhora ou eliminação de um ou mais dos seguintes sintomas: diarreia, perda de peso, perda de apetite, distensão abdominal, sintomas semelhantes a gripe, febre, dor abdominal, náusea, desidratação, colite ou colite pseudomembranosa.

[0094] Em um aspecto, a presente tecnologia fornece um método para prevenir ou retardar o início de CDI ou sintomas de CDI em um indivíduo em risco de ter CDI. Em algumas modalidades, as cepas bacterianas da presente tecnologia são formuladas como um probiótico útil como suplemento alimentar e para restabelecer bactérias benéficas no trato intestinal. Em algumas modalidades, as cepas bacterianas da presente tecnologia são formuladas como um produto bioterapêutico vivo útil em aplicações farmacêuticas.

[0095] Um aspecto da presente tecnologia inclui métodos de tratamento ou prevenção de infecção por C. perfringens em um indivíduo diagnosticado como tendo, suspeito de ter, ou em risco de ter infecção por C. perfringens. Em aplicações terapêuticas, composições ou medicamentos compreendendo uma cepa bacteriana, ou esporo da mesma, selecionada do grupo que consiste em ART24, ART4 e ART12, são administrados a um indivíduo suspeito de, ou já sofrendo de tal doença (tal como, por exemplo, indivíduos que exibem diarreia, perda de peso, perda de apetite, distensão abdominal, sintomas semelhantes aos da gripe, febre, dor abdominal, náusea, desidratação, colite ou colite pseudomembranosa), em uma quantidade suficiente para curar, ou pelo menos parar parcialmente, os sintomas da doença, incluindo suas complicações e fenótipos patológicos intermediários no desenvolvimento da doença.

[0096] Os indivíduos que sofrem de infecção por C. perfringens podem ser identificados por qualquer ou uma combinação de ensaios de diagnóstico ou prognóstico conhecidos na técnica. Por exemplo, os sintomas típicos de infecção por C. perfringens incluem, mas não estão limitados a, diarreia, perda de peso, perda de apetite, distensão abdominal, sintomas semelhantes aos da gripe, febre, dor abdominal, náusea, desidratação, colite ou colite pseudomembranosa.

[0097] Em algumas modalidades, a infecção por C. perfringensé tratada com as cepas bacterianas da presente tecnologia, ou esporos das mesmas, com indivíduos mostrando melhora ou eliminação de um ou mais dos seguintes sintomas: diarreia, perda de peso, perda de apetite, distensão abdominal, sintomas semelhantes aos da gripe, febre, dor abdominal, náuseas, desidratação, colite ou colite pseudomembranosa.

[0098] Em um aspecto, a presente tecnologia fornece um método para prevenir ou retardar o início da infecção por C. perfringens ou sintomas de infecção por C. perfringens em um indivíduo em risco de ter infecção por C. perfringens. Em algumas modalidades, as cepas bacterianas da presente tecnologia são formuladas como um probiótico útil como suplemento alimentar e para restabelecer bactérias benéficas no trato intestinal. Em algumas modalidades, as cepas bacterianas da presente tecnologia são formuladas como um produto bioterapêutico vivo útil em aplicações farmacêuticas.

[0099] Um aspecto da presente tecnologia inclui métodos de tratamento ou prevenção de infecção por L. monocytogenes em um indivíduo diagnosticado como tendo, suspeito de ter, ou em risco de ter infecção por L. monocytogenes. Em aplicações terapêuticas, composições ou medicamentos compreendendo uma cepa bacteriana, ou esporo da mesma, selecionada do grupo que consiste em ART24, ART4 e ART12, são administrados a um indivíduo suspeito de, ou já sofrendo de tal doença (tal como, por exemplo, indivíduos que exibem diarreia, perda de peso, perda de apetite, distensão abdominal, sintomas semelhantes aos da gripe, febre, dor abdominal, náusea, desidratação, colite ou colite pseudomembranosa), em uma quantidade suficiente para curar, ou pelo menos interromper parcialmente, os sintomas da doença, incluindo suas complicações e fenótipos patológicos intermediários no desenvolvimento da doença.

[00100] Os indivíduos que sofrem de infecção por L. monocytogenes podem ser identificados por qualquer ou uma combinação de ensaios de diagnóstico ou prognóstico conhecidos na técnica. Por exemplo, os sintomas típicos de L. monocytogenes incluem, mas não estão limitados a, diarreia, perda de peso, perda de apetite, distensão abdominal, sintomas semelhantes aos da gripe, febre, dor abdominal, náusea, desidratação, colite ou colite pseudomembranosa.

[00101] Em algumas modalidades, a infecção por L. monocytogenesé tratada com as cepas bacterianas da presente tecnologia, ou esporos das mesmas, com indivíduos mostrando melhora ou eliminação de um ou mais dos seguintes sintomas: diarreia, perda de peso, perda de apetite, distensão abdominal, sintomas semelhantes aos da gripe, febre, dor abdominal, náuseas, desidratação, colite ou colite pseudomembranosa.

[00102] Em um aspecto, a presente tecnologia fornece um método para prevenir ou retardar o início da infecção por C. perfringens ou sintomas de infecção por C. perfringens em um indivíduo em risco de ter infecção por C. perfringens. Em algumas modalidades, as cepas bacterianas da presente tecnologia são formuladas como um probiótico útil como suplemento alimentar e para restabelecer bactérias benéficas no trato intestinal. Em algumas modalidades, as cepas bacterianas da presente tecnologia são formuladas como um produto bioterapêutico vivo útil em aplicações farmacêuticas.

[00103] Um aspecto da presente tecnologia inclui métodos de tratamento ou prevenção da infecção por V. parahaemolyticus em um indivíduo diagnosticado como tendo, suspeito de ter, ou em risco de infecção por V. parahaemolyticus. Em aplicações terapêuticas, composições ou medicamentos compreendendo uma cepa bacteriana, ou esporo da mesma, selecionada do grupo que consiste em ART24, ART4 e ART12, são administrada(o)s a um indivíduo suspeito de, ou já sofrendo de, tal doença (tais como, por exemplo, indivíduos humanos exibindo gastroenterite, diarreia, cólicas abdominais, náuseas, vômitos ou infecções de feridas; camarão exibindo Doença de Necrose Hepatopancreática Aguda (AHPND) ou Síndrome de Mortalidade Precoce (EMS); ou salmão exibindo hemorragia nas nadadeiras, olhos e superfície ventral), em uma quantidade suficiente para curar, ou pelo menos interromper parcialmente, os sintomas da doença, incluindo suas complicações e fenótipos patológicos intermediários no desenvolvimento da doença.

[00104] Os indivíduos que sofrem de infecção por V. parahaemolyticus podem ser identificados por qualquer um ou uma combinação de ensaios de diagnóstico ou prognóstico conhecidos na técnica. Por exemplo, os sintomas típicos de V. parahaemolyticus incluem, mas não estão limitados a, diarreia aquosa, cólicas abdominais, náuseas, vômitos ou infecções de feridas após entrar em contato com frutos do mar contaminados, tal como camarão ou salmão contaminado.

[00105] Em algumas modalidades, a infecção por V. parahaemolyticusé tratada com as cepas bacterianas da presente tecnologia, ou esporos das mesmas, com indivíduos mostrando melhora ou eliminação de um ou mais de sintomas associados à infecção por V. parahaemolyticus.

VIII. Modos de Administração e Dosagens Eficazes

[00106] Composições da presente tecnologia para uso na(o) prevenção, melhoria ou tratamento de infecções por C. difficile, C. perfringens, L. monocytogenes ou V. parahaemolyticus e/ou redução da gravidade de um ou mais de fatores de risco, sinais ou os sintomas associados à infecção incluem bactérias probióticas B. amyloliquefaciens vivas de acordo com a presente tecnologia, fornecidas na forma de células vegetativas e/ou esporos. Em algumas modalidades, a cepa bacteriana é liofilizada. As composições da presente tecnologia são administradas ao indivíduo em quantidades eficazes (isto é, quantidades que têm o efeito terapêutico desejado). A dose e o regime de dosagem dependerão do grau de infecção no indivíduo, das características da cepa de B. amyloliquefaciens usada, por exemplo, de seu índice terapêutico, do indivíduo e do histórico do indivíduo. A quantidade eficaz pode ser determinada durante ensaios pré- clínicos e ensaios clínicos por métodos familiares a médicos e cuidadores.

[00107] As composições da presente tecnologia podem ser formuladas para adição a alimentos ou usadas diretamente como um suplemento alimentar. A formulação pode incluir adicionalmente outros agentes probióticos ou nutrientes para promover a germinação de esporos e/ou crescimento bacteriano.

[00108] Componentes adicionais das composições da presente tecnologia podem incluir um conservante selecionado do grupo que consiste em sacarose, ascorbato de sódio e glutationa. Em algumas modalidades, o conservante é um crioprotetor selecionado do grupo que consiste em um nucleotídeo, um dissacarídeo, um poliol e um polissacarídeo. Em algumas modalidades, o crioprotetor é selecionado do grupo que consiste em inosina-5’-monofosfato (IMP), guanosina-5’- monofosfato (GMP), adenosina-5’-monofosfato (AMP), uranosina-5’-monofosfato (UMP), citidina-5’-monofosfato (CMP), adenina, guanina, uracila, citosina, guanosina, uridina, citidina, hipoxantina, xantina, orotidina, timidina, inosina, trealose, maltose, lactose, sacarose, sorbitol, sorbitol, manitol, dextrina, inulina, ascorbato de sódio, glutationa, leite desnatado e crioprotetor 18.

[00109] As cepas bacterianas de B. amyloliquefaciens descritas nesse documento (isto é, ART24, ART4 e ART12) podem ser incorporadas em composições farmacêuticas para administração, isoladamente ou em combinação, e dadas a um indivíduo para o tratamento ou a prevenção de um distúrbio descrito nesse documento. Essas composições incluem tipicamente o agente ativo e um carreador farmaceuticamente aceitável. Como usado nesse documento, o termo “carreador farmaceuticamente aceitável” inclui solução salina, solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e retardantes de absorção e semelhantes, compatíveis com a administração farmacêutica. Os compostos ativos suplementares também podem ser incorporados nas composições. Os carreadores podem ser materiais secos de base sólida para formulações em forma de pó, e podem ser materiais líquidos ou à base de gel para formulações em formas líquidas ou de gel, cujas formas dependem, em parte, das vias ou dos modos de administração. Em algumas modalidades, o carreador farmaceuticamente aceitável compreende um polissacarídeo, goma de alfarroba, um polissacarídeo aniônico, um amido, uma proteína, ascorbato de sódio, glutationa, trealose, sacarose ou pectina. Em algumas modalidades, o polissacarídeo compreende um(a) planta, animal, algas ou polissacarídeo microbiano. Em algumas modalidades, o polissacarídeo compreende goma guar, inulina, amilose, quitosana, sulfato de condroitina, um alginato ou dextrano. Em algumas modalidades, o amido compreende amido de arroz.

[00110] As composições farmacêuticas são tipicamente formuladas para serem compatíveis com a via de administração pretendida. Exemplos de vias de administração incluem administração entérica (por exemplo, oral, sublingual, retal). Uma composição terapêutica pode ser formulada para ser adequada para administração oral em uma variedade de maneiras, por exemplo, em um líquido, um suplemento alimentar em pó, um alimento sólido, um alimento acondicionado, uma pastilha, comprimidos, trociscos ou cápsulas, por exemplo, cápsulas de gelatina e semelhantes. Em algumas modalidades, as composições terapêuticas da presente tecnologia compreendem ART4, ART12 e/ou ART24 liofilizada(s). Em algumas modalidades, a ART4, ART12 e/ou ART24 liofilizada(s) é(são) encapsulada(s). Uma composição terapêutica pode ser formulada para ser adequada para administração retal em uma variedade de maneiras, por exemplo, em um(a) supositório, enema líquido ou espuma. Outras formulações serão facilmente evidentes para um habilitado na técnica. O pH pode ser ajustado com ácidos ou bases, tal como ácido clorídrico ou hidróxido de sódio.

[00111] Para aplicações de aquicultura, as composições farmacêuticas da presente tecnologia podem ser formuladas como uma ração para peixes ou aditivo para rações para peixes ou como um agente de tratamento por banho (imersão).

[00112] A dosagem, a toxicidade e a eficácia terapêutica de qualquer agente terapêutico podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos padrão em culturas de células ou animais experimentais. Os dados obtidos a partir dos ensaios de cultura de células e estudos em animais podem ser usados na formulação de uma faixa de dosagem para uso em humanos. A dosagem de tais compostos pode estar dentro de uma faixa de concentrações circulantes que incluem ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro dessa faixa dependendo da forma de dosagem empregada e da via de administração utilizada. Para qualquer composto usado nos métodos, a dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente a partir de ensaios de cultura de células. Uma dose pode ser formulada em modelos animais para atingir uma faixa de concentração plasmática circulante que inclui a IC50 (isto é, a concentração do composto de teste que atinge metade da inibição máxima dos sintomas) conforme determinado na cultura de células. Essas informações podem ser usadas para determinar com precisão as doses úteis em humanos.

[00113] Em algumas modalidades, as composições da presente tecnologia contêm em uma formulação de dosagem de um grama 108unidades formadoras de colônia (UFC) de bactéria B. amyloliquefaciens (isto é, ART24, ART4 e/ou ART12) (isto é, célula vegetativa) ou esporo bacteriano. Em algumas modalidades, os métodos da presente tecnologia envolvem a administração de cerca de 104a cerca de 1012bactérias ou esporos viáveis por dia. Em algumas modalidades, as composições da presente tecnologia são dispensadas como material liofilizado ou pó para ser recolocado em suspensão para dispensação oral ou acondicionado em cápsulas. O material liofilizado e as cápsulas podem ser revestidos para melhor estabilidade entérica.

[00114] Um regime de tratamento de exemplo envolve a administração uma vez por dia ou uma vez por semana. Em aplicações terapêuticas, uma dosagem relativamente alta em intervalos relativamente curtos às vezes é necessária até que a progressão da doença seja reduzida ou terminada, ou até que o indivíduo mostre melhora parcial ou completa dos sintomas da doença. Depois disso, o indivíduo pode ser administrado com um regime profilático. Em algumas modalidades, as composições da presente tecnologia são administradas a um indivíduo uma, duas ou três vezes por dia por 10 a 14 dias ou até que o indivíduo seja considerado curado da doença primária, para não estar em risco de recorrência da doença primária, ou não correr o risco de contrair a doença. Em algumas modalidades, a administração é pareada com uma exposição reduzida a agentes conhecidos na técnica para o tratamento de CDI, tal como um antibiótico (incluindo, mas não se limitando a, vancomicina, metronidazol ou fidaxomicina), seguido por uma, duas ou três vezes a dosagem diária por 10 a 14 dias ou até que o paciente seja considerado curado da doença primária ou não esteja em risco de recorrência da doença. Em algumas modalidades, os métodos de profilaxia compreendem a administração de composições da presente tecnologia uma, duas ou três vezes ao dia por 10 a 14 dias ou até que o paciente seja considerado sem risco de contrair a doença no caso de pacientes conhecidos por estar em risco de CDI (por exemplo, uso de IBP ou imunossupressão).

[00115] O técnico habilitado apreciará que certos fatores podem influenciar na dosagem e no tempo necessários para tratar eficazmente um indivíduo, incluindo, mas não se limitando a, a gravidade da(o) doença ou distúrbio, tratamentos anteriores, a saúde geral e/ou idade dos indivíduos, e outras doenças presentes. Além disso, o tratamento de um indivíduo com uma quantidade terapeuticamente eficaz das composições terapêuticas descritas nesse documento pode incluir um único tratamento ou uma série de tratamentos.

IX. Terapia Combinada com Cepas de B. amyloliquefaciens da Tecnologia Atual

[00116] Em algumas modalidades, as cepas de B. amyloliquefaciens da presente tecnologia, ou esporos das mesmas, podem ser combinadas com uma ou mais de terapias adicionais para a(o) prevenção ou tratamento de CDI. Agentes terapêuticos adicionais incluem, mas não estão limitados a, um ou mais de agentes terapêuticos adicionais selecionados do grupo que consiste em: metronidazol, fidaxomicina, vancomicina, nitazoxanida, transplante de microbiota fecal e anticorpo monoclonal antitoxina B.

[00117] Em algumas modalidades, um agente terapêutico adicional é administrado a um indivíduo em combinação com as cepas de B. amyloliquefaciens da presente tecnologia, ou esporos das mesmas, de modo que um efeito terapêutico sinergístico seja produzido. Por exemplo, a administração de ART24, ART4 e/ou ART12 com um ou mais de agentes terapêuticos adicionais para a(o) prevenção ou tratamento de CDI terá efeitos maiores do que aditivos na(o) prevenção ou tratamento da doença.

[00118] Em qualquer caso, os múltiplos agentes terapêuticos podem ser administrados em qualquer ordem ou mesmo simultaneamente. Se simultaneamente, os vários agentes terapêuticos podem ser fornecidos em uma única forma unificada ou em várias formas (a título de exemplo apenas, como uma única pílula ou como duas pílulas separadas). Um dos agentes terapêuticos pode ser administrado em doses múltiplas ou ambos podem ser administrados em doses múltiplas. Além disso, os métodos, as composições e as formulações de combinação não devem ser limitados ao uso de apenas dois agentes.

EXEMPLOS

[00119] Os seguintes exemplos são fornecidos apenas a título de ilustração e não como forma de limitação. Os habilitados na técnica reconhecerão prontamente uma variedade de parâmetros não críticos que podem ser alterados ou modificados para produzir resultados essencialmente iguais ou semelhantes. Os exemplos não devem, de forma alguma, ser interpretados como limitando o escopo da presente tecnologia, como definido pelas reivindicações anexas. Para cada um dos exemplos abaixo, qualquer cepa bacteriana descrita nesse documento pode ser usada. A título de exemplo, a cepa bacteriana usada nos exemplos abaixo pode ser ART24, ART4, ART12 ou combinações das mesmas.

Materiais e Métodos

[00120] Amostras de fezes humanas. As amostras de fezes foram coletadas de indivíduos do sexo masculino e feminino (N = 22) nas seguintes faixas etárias: 20-39 anos (N = 14); 40-59 anos (N = 3); 60-79 anos (N = 4); e 80-99 anos (N = 1). As amostras de fezes foram recebidas no laboratório e processadas frescas dentro de 8-12 h após as fezes terem sido eliminadas. No dia da análise, uma pasta fluida foi preparada usando diluente de recuperação máxima (MRD) (CM0733, Oxoid). Essas pastas fluidas foram misturadas com volumes iguais de etanol por duas horas, após o que as amostras foram diluídas em série em MRD e espalhadas na superfície de placas de ágar infusão Cérebro Coração (BHI) (1.10493.0500, Merck). Essas placas foram incubadas aerobicamente por 24 horas.

[00121] Identificação de cepas anti-Clostridium difficile (Ensaio de difusão em poços (WDA)). As cepas bacterianas foram isoladas das amostras e analisadas quanto à atividade anti-Clostridium difficile. As placas de ágar BHI com as colônias bacterianas diluídas em série das amostras de fezes foram então cobertas com ágar embebido com meio de Clostridium reforçado (RCM) (1.015410.0500 Merck) que foi inoculado com C. difficile. Colônias potenciais antiC. difficile foram identificadas pela presença de uma zona de inibição em torno de uma colônia bacteriana. C. difficile foi inoculado a 1% (v/v) em ágar RCM e as placas endureceram. Os poços foram feitos nas placas de ágar endurecidas usando pipetas Pasteur estéreis. Cepas de bactérias potenciais anti-C. difficile foram isoladas da placa de sobreposição e raiadas novamente para garantir uma colônia pura. As cepas bacterianas potenciais anti-C. difficile foram cultivadas em caldo BHI aerobicamente, agitando a 200 rpm e incubadas a 37 °C. As culturas durante a noite das cepas bacterianas foram centrifugadas e o pH dos sobrenadantes neutralizado e esterilizado por filtração com filtros de 0,22 µm para garantir sobrenadantes livres de células (CFS). Cinquenta microlitros do CFS bacterianos foram dispensados nos poços da placa com RCM anaerobicamente e a placa foi deixada incubar por 24 h. Atividade anti-C. a difficile foi avaliada examinando a presença ou ausência de zonas de inibição em torno dos poços. As colônias que mostram atividade antimicrobiana contra a cepa de C. difficile sobreposta foram purificadas e armazenadas a -80 °C e designadas como ART24, ART4 e ART12 (também designadas nesse documento como “ART024(2), “ART04-A4” e “ART012-Aer1”, respectivamente).

[00122] As cepas isoladas foram cultivadas aerobicamente a 37 °C por 24 horas, agitando a 200 rpm, em caldo infusão Cérebro Coração (BHI) e/ou estáticas em ágar.

[00123] Caracterização genotípica e identificação do nível de espécie usando iniciadores 16S de rRNA universais. Com base nos resultados do sequenciamento do gene de rRNA 16S, ART24, ART4 e ART12 foram identificados como membros da espécie de B. amyloliquefaciens. Usando a sequência de DNA da subunidade A do DNA girase (gyrA) identificada a partir de todas as sequências do genoma de cada cepa, ART24, ART4 e ART12 foram ainda identificadas como B. velezensis/B. amyloliquefaciens subsp. Plantarum e membros do grupo operacional de Bacillus amyloliquefaciens.

[00124] As cargas de glicerol (G5516, Sigma) das cepas foram armazenadas a -80 °C (800 µL de cultura cultivada em caldo BHI adicionado a 200 µL de glicerol a 100%).

Exemplo 1: Cepas de Bacillus amyloliquefaciens exibem atividade Anti-C. difficile

[00125] Esse exemplo demonstra que cepas de B. amyloliquefaciens da presente tecnologia exibem potente atividade anti-C. difficile (FIGs. 1A e 1B).

[00126] Cepas bacterianas. Usando o método de ensaio de difusão em poços (WDA) descrito acima, os sobrenadantes preparados de cada um dos três candidatos, ART24, ART4, ART12, foram testados contra um isolado clínico de C. difficile. FIGs. 1A e 1B mostram as grandes zonas de atividade alcançadas contra essa cepa.

[00127] Por conseguinte, esses resultados mostram que as cepas de B. amyloliquefaciens da presente tecnologia são úteis em métodos de inibição do crescimento de C. difficile.

Exemplo 2: Atividade Anti-C. difficiledas Cepas de B. amyloliquefaciens da Tecnologia Atual são Insensíveis às Proteases Digestivas

[00128] Esse exemplo demonstra que as cepas de B. amyloliquefaciens da presente tecnologia são insensíveis a proteases digestivas, tais como, tripsina, pepsina, quimiotripsina e proteinase-K.

[00129] Para testar a (in)sensibilidade do sobrenadante de ART24 à pepsina e tripsina, WDA foi realizado contra C. difficile, em que as preparações de cada protease foram individualmente adicionadas diretamente ao sobrenadante ou adjacente ao sobrenadante e incubadas por 24 horas a 37°C anaerobicamente. Como mostrado na FIG. 2A, não houve diminuição no tamanho da zona em comparação com o controle não tratado e, portanto, como um todo, a bioatividade antiC. difficile exibida pelo sobrenadante da cultura ART24 é insensível às proteases.

[00130] Para testar a (in)sensibilidade do sobrenadante de ART4 à tripsina, quimotripsina e proteinase-K, WDA foi realizado contra C. difficile, em que as preparações de cada protease foram individualmente adicionadas adjacentes ao sobrenadante e incubadas por 24 horas a 37°C anaerobicamente. Como mostrado na FIG. 2B, não houve diminuição no tamanho da zona em comparação com o controle não tratado e, portanto, como um todo, a bioatividade anti-C. difficile exibida pelo sobrenadante da cultura ART4 é insensível às proteases.

[00131] Como mostrado nas FIGs. 2A e 2B, nenhuma das enzimas digestivas testadas teve um efeito inibidor sobre os sobrenadantes de ART24 ou ART4. Por conseguinte, esses resultados mostram que as composições farmacêuticas compreendendo as cepas bacterianas da presente tecnologia reterão sua atividade anti-C. difficileapós administração oral.

Exemplo 3: Cepas de B. amyloliquefaciens da Presente Tecnologia Contêm Massas para Amilociclina

[00132] Esse exemplo demonstra que as cepas de B. amyloliquefaciens da presente tecnologia produzem amilociclina, uma bacteriocina tendo efeitos contra bactérias Gram-positivas, tal como C. difficile.

[00133] Como mostrado nas FIGs. 3A e 3B, a análise de espectrometria de massa (MS) dos sobrenadantes de cultura de ART24 e ART4 revelou a presença de amilociclina a m/z 6.382,17 e 6.381,34, respectivamente. No entanto, a bacteriocina estava completamente ausente na cepa DSM7T (FIG. 3C).

[00134] Resumidamente, 150 mL de sobrenadante de cultura foram centrifugados e as células foram misturadas com propan- 2-ol a 70%, TFA a 0,1% (IPA) e o sobrenadante foi aplicado a uma coluna contendo 30 g de XAD, lavado com 250 mL, etanol a 30% e a atividade antimicrobiana eluída com IPA. As amostras de células e SN XAD foram passadas por uma coluna SPE C18 de 5g e 20 mL pré-equilibrada com metanol e água. A coluna foi lavada com etanol a 15% e a atividade antimicrobiana eluída em 2-propan-2-ol a 70%, TFA a 0,1%. Os eluentes de IPA foram concentrados e 1 mL (de 3 mL) aplicado a uma coluna RP-HPLC C12 Proteo Jupiter (10 x 250 mm, 4 µ, 90Â) semipreparada executando um gradiente de acetonitrila a 27,5-85%, TFA a 0,1%, onde o tampão B é acetonitrila a 90%, TFA a 0,1%. O eluente foi monitorado a 214 nm e as frações foram coletadas em intervalos de 1 minuto. A espectrometria de massa MALDI TOF foi usada para avaliar o tamanho dos peptídeos.

[00135] As frações geradas durante a execução de HPLC foram então testadas em WDA contra C. difficile para identificar a região de atividade anti-C. difficile. As frações ativas visíveis no WDA foram, então, analisadas no espectrômetro de massa MALDI-TOF para identificar o componente ativo. Os espectros de massa para os sobrenadantes de ART24 e ART4 indicam que a amilociclina e a plipastatina são componentes potenciais anti-C. difficile dos sobrenadantes (FIGs. 3A; 3B; 9C; 9E).

[00136] Consequentemente, esses resultados mostram que as cepas de B. amyloliquefaciens da presente tecnologia produzem amilociclina tendo efeitos anti-C. difficile como mostrado pelos ensaios de difusão em poços (WDA) das FIGs. 3A e 3B.

Exemplo 4: A atividade anti-C. difficiledas Cepas de B. amyloliquefaciens da Tecnologia Atual é Insensível à Proteinase-K

[00137] Esse exemplo demonstra que os sobrenadantes livres de células de cepas de B. amyloliquefaciens da presente tecnologia são insensíveis à proteinase-K (ProK), que degrada a amilociclina.

[00138] Como mostrado na FIG. 4A, o sobrenadante coletado de culturas ART24 é ativo na presença de ProK, indicando que a amilociclina não é o único composto microbiano anti-C. difficile produzido pela cepa.

[00139] Resumidamente, um WDA foi realizado usando C. difficile como o indicador em que a proteinase-K foi adicionada diretamente ou adicionada a um poço adjacente sem qualquer diminuição ou inibição do tamanho da zona em qualquer um quando comparado a um controle não tratado. A análise de espectrometria de massa mostra que atividade antiC. difficileé mantida quando o pico da amilociclina é perdido na presença de proteinase-K (FIG. 4B).

[00140] Como mostrado na Tabela 1, com base em pesquisas realizadas no banco de dados anti-SMASH (antibiotics & Secondary Metabolite Analysis Shell), as sequências do genoma das cepas de B. amyloliquefaciens da presente tecnologia (ART4, ART12 e ART24) preveem sobreposição, mas perfis antimicrobianos não idênticos, em relação à cepa negativa anti-C. difficile DSM7T.

[00141] Os arquivos do Banco de Genes de todas as sequências do genoma de ART4, ART12 e ART24 foram carregados no banco de dados anti-SMASH com os recursos padrão selecionados e as regiões antimicrobianas nos genomas de Bacillus foram então comparadas a agrupamentos antimicrobianos conhecidos.

[00142] Por conseguinte, esses resultados mostram que as cepas de B. amyloliquefaciens da presente tecnologia possuem uma faixa diversificada de atividades antimicrobianas. Exemplo 5: As cepas de B. amyloliquefaciens da Presente Tecnologia são Cidas a C. difficileem ensaio de cocultura líquida

[00143] Como mostrado na FIG. 5A, cocultura de ART24 e C. difficile, inoculada em níveis iguais, por 24 horas resulta em uma redução de 4,1 log nas contagens de C. difficile.

[00144] Resumidamente, alíquotas de 100 µL de culturas de 18 horas de B. amyloliquefaciens ART24 e C. difficile foram coinoculadas e inoculadas separadamente em 10mL de caldo BHI pré-condicionados e incubadas anaerobicamente a 37°C por 24 horas. A enumeração de C. difficilefoi obtida por divisão em placas em ágar CCEY de Brazier (LAB160, Lab M) e foi deixado incubar por 48 horas anaerobicamente a 37°C. Observou-se uma redução de 4,1 log ao comparar a contagem de C. difficile inoculado individualmente às 24 horas e a obtida quando cocultivado com B. amyloliquefaciens ART24 por 24 horas. Se expressado como a redução nos números de C. difficile em T0, a cocultura com B. amyloliquefaciens ART24 é apenas menos do que uma redução de 2 log.

[00145] Como mostrado na FIG. 5B, a inoculação de 10x ART24 em um C. difficile em curso, cultura em T3h e T6h, por 24 horas resulta em uma diminuição no crescimento de C. difficile por leitura de OD.

[00146] Cepas bacterianas. Usando o método de cocultura anaeróbica descrito acima, a adição de uma razão de 10:1 de ART024 em uma cultura de C. difficile entrando na fase log (T3h após a inoculação inicial de C. difficile) resulta na inibição do crescimento de C. difficile em comparação com a cultura de controle não exposta.

[00147] Cepas bacterianas. Usando o método de cocultura anaeróbico descrito acima, a adição de uma razão de 10:1 de ART024 em uma cultura de C. difficile na fase log (T6h após inoculação de C. difficile) resulta na inibição do crescimento de C. difficile em comparação com a cultura de controle não exposta.

[00148] Por conseguinte, esses resultados mostram que as composições compreendendo as cepas de B. amyloliquefaciens da presente tecnologia são úteis em métodos de tratamento ou prevenção de infecção por C. difficile ou doença associada a Clostridium difficile (CDAD).

Exemplo 6: As cepas de B. amyloliquefaciens da Tecnologia Atual Demonstram Atividade Contra Isolados Clínicos de C. difficile

[00149] Como mostrado nas FIGs. 6A e 6B, os sobrenadantes de ART4, ART12 e ART24 demonstram a atividade anti-C. difficile contra um painel de vários isolados clínicos diferentes de C. difficile com uma faixa de ribotipos (DPC 6219, DPC 6220 e DPC 6350 (FIG. 6A), e ART24 contra 28 outros isolados clínicos contemporâneos (FIG. 6B; Tabela 2). ART4, ART12 e ART24 também demonstraram atividade contra os isolados de C. difficile EM304 e APC43 (dados não mostrados). Tabela 2. Painel de Clostridium difficile

[00150] Resumidamente, ensaios de difusão em poços (WDA) foram usados para examinar o efeito dos sobrenadantes de Bacillus amyloliquefaciens (das cepas e de diferentes momentos) contra isolados clínicos de C. difficile. Cinquenta microlitros de sobrenadante foram adicionados aos poços em ágar RCM inoculado (1% de v/v) com cada isolado clínico.

[00151] Esses resultados demonstram que composições compreendendo as cepas de B. amyloliquefaciens da presente tecnologia são úteis em métodos de tratamento ou prevenção de infecção por C. difficile ou doença associada a Clostridium difficile (CDAD).

Exemplo 7: As Cepas de B. amyloliquefaciens da Presente Tecnologia são Seletivas para C. difficile e B. thuringiensis

[00152] Para identificar um espectro de atividade para os sobrenadantes, um painel de organismos comensais (Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Staphylococcus capitis) e Bacillus thuringiensis foram comparados com C. difficile. Ensaios de difusão em poços (WDA) foram usados para comparar os sobrenadantes das 3 cepas e de culturas de 24h, 48h de cada. As cepas de lactobacillus foram inoculadas em ágar de Mann Rogosa Sharpe (MRS) (288130, Difco); S. capitis e B. thuringiensis foram inoculados em ágar BHI e C. difficile foi inoculado em ágar RCM, todas as cepas foram inoculadas a 1% (v/v). Nenhuma zona de inibição foi identificada contra Lb. reuteri, Lb. rhamnosus e S. capitis. Zonas de inibição foram identificadas para todas as cepas e momentos de cultura contra B. thuringiensis e C. difficile.

[00153] Como mostrado na FIG. 7A, os sobrenadantes das cepas ART4 (“A4”), ART12 (“12 Aer 1”) e ART24 (“024(2)”) são seletivamente ativos contra C. difficile e B. thuringiensis, e não contra os comensais humanos testados.

[00154] Como mostrado na FIG. 7B, cepas frescas de ART24 (“024(2)”) adicionadas a amostras de microbiota colônica de humano in vitro estão poupando os principais filos do cólon humano investigados, ou seja, proteobactérias, firmicutes, Bacteroidetes, verrucomicrobia e lactobacilos.

[00155] Esses resultados demonstram que as composições que compreendem as cepas de B. amyloliquefaciens da presente tecnologia são úteis em métodos para tratar ou prevenir seletivamente a infecção por C. difficile ou CDAD, sem esgotar as populações bacterianas comensais.

Exemplo 8: As cepas de B. amyloliquefaciens da Presente Tecnologia estão dentro das Diretrizes de Susceptibilidade a Antibióticos da EFSA e Não Contêm Fatores de Virulência ou Ilhas de Patogenicidade

[00156] Como demonstrado pela Tabela 3, as cepas de B. amyloliquefaciens da presente tecnologia (por exemplo, cepas ART4, ART12 e ART24) estão dentro das diretrizes da Autoridade Europeia para a Segurança dos Alimentos (EFSA). A concentração inibidora mínima (CIM) dos antimicrobianos listados é expressada em µg/mL. Estudos adicionais seguindo as recomendações de teste da EFSA foram realizados em ART24 liofilizados lotes CO-33-10A2 e CO-33-12A2 e Banco de Células Mestre e de Pesquisa CO-33-ART24 BHI e CO-33-ART24 SYD, e esses resultados são mostrados na Tabela 4. Tabela 3. As cepas de B. amyloliquefaciens estão dentro das diretrizes de sensibilidade aos antibióticos da EFSA Resultados médios de N = 6. *Nenhum crescimento com a concentração mais baixa na placa. Tabela 4. As cepas de B. amyloliquefaciens (ART24) estão dentro das diretrizes de sensibilidade a antibióticos da EFSA aInterpretações categóricas usando os critérios de ponto de interrupção CLSI M45 (2015), conforme disponível. As interpretações da CIM para canamicina e estreptomicina usaram os valores de corte da Autoridade Europeia para a Segurança dos Alimentos (2012).

[00157] Resumidamente, o material de 3-5 colônias de Bacillus amyloliquefaciens foi selecionado e colocado em suspensão em 4 mL de MRD para obter uma concentração de células de ~ 1x108 UFC/mL. Dessa suspensão 46 µL foram transferidos para 23 mL de Caldo Iso-Sensitest a 90% (CM0473, Oxoid) contendo caldo BHI a 10% para terminar com uma concentração de inóculo final de 5x105UFC/mL. Os poços das placas pré-fabricadas de 96 poços foram enchidos com 100 µL da suspensão final. As placas foram seladas com um filme de selagem AeraSeal (A9224, Sigma Aldrich) (para facilitar o crescimento das cepas de Bacillus aeróbicas. As placas foram então incubadas por 24 horas a 37 °C. Os resultados são registrados após 24 horas como a concentração mais baixa do antibiótico para inibir o crescimento visível. Os painéis pré-fabricados VetMIC Lact-1 e Lact-2 (SVA, Uppsala, Suécia) que compreendem os antibióticos ampicilina, vancomicina, gentamicina, canamicina, estreptomicina, eritromicina, clindamicina, tetraciclina, cloranfenicol, neomicina, penicilina, quinupristina-dalfopristina, linezolida, trimetoprima, ciprofloxacina e rifampicina foram usados.

[00158] A ausência de resistência a antibióticos nas cepas da presente tecnologia exclui o risco de transferência horizontal da resistência a antibióticos.

[00159] Além disso, as pesquisas realizadas com KEGG, RAST SEED Viewer, IslandViewer 4 e comparações ACT com espécies conhecidas de Bacillus que produzem toxinas, etc., não revelaram quaisquer fatores de virulência ou ilhas de patogenicidade nos genomas das cepas de B. amyloliquefaciens da tecnologia atual. Por conseguinte, esses resultados demonstram a segurança probiótica das cepas em que não têm a propensão para conferir resistência a comensais e/ou patógenos.

Exemplo 9:Coadministração de Cepas de B. amyloliquefaciens da Tecnologia Atual e Outros Agentes para o Tratamento De Doença Associada a Clostridium difficile (CDAD)

[00160] Esse exemplo demonstra que, como mostrado na Tabela 5, as cepas de B. amyloliquefaciens da presente tecnologia são resistentes a altos níveis de metronidazol (Met), mas são totalmente sensíveis à fidaxomicina (FDX). Tabela 5. Suscetibilidade da cepa de B. amyloliquefaciens ao metronidazol (Met) e fidaxomicina (FDX)

[00161] Método padrão de CLSI; todos triplicados. CIM de FDX contra C. difficile clinicamente isolado (0,004 - 8 µg/mL). CIM de Met contra C. difficileclinicamente isolado (0,02 - 4 µg/mL).

[00162] Resumidamente, os ensaios de concentração inibidora mínima foram realizados em triplicata usando placas de 96 poços (Sarstedt). Diluições em série de duas vezes a partir de uma concentração inicial de 512 µg/mL de cada antibiótico foram realizadas em caldo BHI (Merck). Durante a noite a cepa alvo foi subcultivada e incubada a uma OD600 nm de 0,5 antes de ser diluída para resultar em um inóculo final de 105cfu/ml em 200µL e adicionada às preparações de antibióticos. As placas foram incubadas a uma temperatura adequada e inspecionadas após 16 horas. A CIM foi determinada como a concentração mais baixa na qual nenhum crescimento era visível.

[00163] Esses resultados demonstram que as composições farmacêuticas que compreendem as cepas da presente tecnologia sozinhas ou em combinação com antibióticos, tal como metronidazol, são úteis em métodos para tratar ou prevenir infecções por C. difficile ou CDAD.

Exemplo 10: Secagem por congelamento (liofilização) para Preservar as Cepas de B. amyloliquefaciens da Tecnologia Atual

[00164] Esse exemplo demonstra que as cepas da presente tecnologia são úteis em composições e métodos em que as cepas são secas por congelamento (ou liofilizadas).

[00165] Meio de esporulação 2xSG: 16,0 g/L de caldo de nutriente Difco; 2,0 g/L de KCl; 0,5 g/L de MgSO4.7H2O. Ajuste o pH para 7,0, na autoclave. Após autoclavagem e resfriamento adicionar 1,0 ml/L de Ca(NO3)2.4H2O 1 M,; 1,0 ml/L de MnCl2.4H2O 0,1 M; 1,0 ml/L de FeSO4.7H2O 1 mM,; 2,0 ml/l de Glicose a 50% (p/v).

[00166] Método de preparação de esporos: Inocular 50 ml de meio BHI (1.10493.0500, Merck) com células de uma colônia fresca de B. amyloliquefaciens. Cultivar aerobicamente em balões de 24 horas a 37 °C com agitação (agitador de plataforma orbital) a 200 rpm. Diluir 1/200 em 1 L de meio 2xSG em um recipiente apropriado e cultivar a 37 °C com agitação a 200 rpm. Verificar as amostras para esporos diariamente usando microscopia de luz. A microscopia de contraste de fase é ideal. Após 2-3 dias,>90% da população deve ter esporulado. Sedimentar células a 9000 rpm por 20 minutos em uma centrífuga, se possível, mantendo as temperaturas baixas, caso contrário, para pequenas quantidades uma centrífuga de bancada será suficiente. Lavar e centrifugar os esporos com água gelada 2-3 vezes para remover os nutrientes residuais e lisar as células vegetativas restantes. Recolocar uma suspensão o sedimento de esporos em 10mg/ml de solução de lisozima e incubar agitando a 37 ° C por 1 hora. Lavar e centrifugar os esporos com água gelada 4-6 vezes para remover os nutrientes residuais e lisar as células vegetativas restantes. Secar por congelamento alíquotas de 3 ml de esporos por um período de 24 horas em um secador por congelamento VirTis Advantage Wizard e armazenar em frascos de liofilização selados em temperatura ambiente para armazenamento de longo prazo.

[00167] O fluido gástrico simulado foi preparado com base no SGF descrito pela ação COST do Infogest contendo 37,3g/L de KCl, 68 g/L de KH2PO4, 84g/L de NaHCO3, 117g/L de NaCl, 30,5g/L de (NH4)CO3, 44,1 g/L de CaCl2 e 2mL de uma solução de 20.000 U/mL. Como mostrado na FIG. 10A, os esporos das cepas de B. amyloliquefaciens da presente tecnologia (por exemplo, ART4, ART12 e ART24) sobrevivem quando expostos ao fluido gástrico simulado.

[00168] Como mostrado na FIG. 10B e Tabela 6, esporos das cepas de B. amyloliquefaciens da presente tecnologia (por exemplo, ART4, ART12 e ART24) atingem 100% de sobrevivência após a secagem por congelamento e recolocação em suspensão.

[00169] Para testar a robustez das células, as cepas foram secas por congelamento. Resumidamente, as culturas durante a noite de ART24, ART4 e ART12 foram cultivadas de acordo com métodos conhecidos na técnica e recolocadas em suspensão em solução de trealose a 15% p/v. As contagens de células foram realizadas.

[00170] As culturas foram secas por congelamento por 22 horas, após as quais foram recolocadas em suspensão em um volume equivalente de água perdida. As contagens de células foram realizadas. A Tabela 6 mostra os resultados de sobrevivência. Tabela 6. Sobrevivência de cepas de B. amyloliquefaciens após secagem por congelamento (liofilização)

[00171] Por conseguinte, esses resultados demonstram que as cepas da presente tecnologia são úteis em composições e métodos em que as cepas são secas por congelamento (ou liofilizadas).

Exemplo 11: Avaliação da Eficácia In Vivo

[00172] Esse exemplo irá demonstrar a eficácia in vivo da cepa de B. amyloliquefaciens ART24 em métodos para o tratamento e prevenção de infecções por C. difficile ou CDAD.

[00173] A FIG. 8A fornece um projeto ilustrativo para avaliar a eficácia in vivo das cepas de B. amyloliquefaciens (“B. amy”) da presente tecnologia. A Tabela 7 fornece uma descrição dos grupos usados no estudo descrito a seguir. Tabela 7. Projeto geral de estudos in vivo * cultura de B amy centrifugada e recolocada em suspensão no meio de cultura usado # cultura de B amy centrifugada, remover o sobrenadante tanto quanto possível, recolocada em suspensão em PBS B amy é cultivada fresca diariamente

[00174] Modelo de camundongo com C. difficile. O modelo de camundongo com infecção por C. difficile foi preparado como descrito em outro lugar (Chen, X, et al., Gastroenterology 135: 1984-1992 (2008)).

[00175] Os camundongos (fêmeas C57BL/6J) foram divididos prospectivamente em 4 grupos de tratamento de 15 animais (Tabela 7) e alojados em 5 animais por gaiola.

[00176] Os camundongos receberam um coquetel de antibióticos por oito dias consecutivos em sua água potável, começando 13 dias antes da infecção por C. difficile (dia de estudo 0). O coquetel de antibióticos foi trocado a cada três dias com antibióticos preparados na hora. O coquetel de antibióticos consistia em glicose a 1%, canamicina (0,5 mg/mL), gentamicina (0,044 mg/mL), colistina (1062,5 U/mL), metronidazol (0,269 mg/mL), ciprofloxacina (0,156 mg/mL), ampicilina (0,1 mg/mL) e vancomicina (0,056 mg/mL). Cinco dias antes da infecção por C. difficile, a água com antibiótico foi removida. Os animais foram colocados em gaiolas limpas e água potável esterilizada fornecida aos camundongos. Três dias antes da infecção, os camundongos foram administrados com clindamicina a 10 mg/kg via gavagem oral em um volume de 10 mL/kg.

[00177] Preparação do artigo de teste. B. amyloliquefaciens foi cultivado in vitro em preparação para o teste in vivo e armazenado como cargas de glicerol -80 °C.

[00178] A cepa foi aplicada a placas de ágar de TSA de cargas congeladas (3 dias antes da dosagem) e cultivada durante a noite a 37 °C. Da cultura de placa durante a noite, uma colônia foi recolocada em suspensão em 50 mL de caldo BHI e incubada durante a noite a 37 °C enquanto é agitada. A cultura durante a noite foi diluída a 1:100 em caldo BHI fresco (100 mL) e incubada por 16 horas a 37 °C com agitação. A cultura foi então centrifugada a 2.500 RPM por 20 minutos. O sobrenadante foi removido e o sedimento foi recolocado em suspensão em um total de 10 mL do meio usado ou em um total de 10 mL de PBS estéril. Diluições em série da suspensão preparada e divisão em placas em ágar TSA foram realizadas a cada dia de dosagem para confirmar a concentração de inóculo.

[00179] Preparação de C. difficile. Quatro dias antes da infecção, C. difficile ATCC 43255 foi cultivado a partir de uma carga congelada aplicada a placas TSA-II e incubada anaerobicamente por 48 horas a 37 °C. Após 48 horas, as colônias da placa foram recolocadas em suspensão em SMB (caldo de meio de esporulação) e ajustadas a um DO de 0,2 a 600 nm de comprimento de onda. A suspensão bacteriana ajustada foi diluída 1:10 em caldo SM fresco e incubada anaerobicamente por 48 horas a 37 °C. Após 48 horas de incubação, a suspensão bacteriana foi ajustada a um DO de 0,2 e subsequentemente diluída 100 vezes em solução salina para gerar o inóculo infectante. Diluições em série do inóculo foram realizadas para determinar a entrada real de UFC. Uma preparação de esporos do inóculo também foi realizada para determinar a razão de esporos para células vegetativas no inóculo.

[00180] Estabelecimento de infecção.Todos os sessenta camundongos foram infectados com 0,20 mL da suspensão bacteriana de C. difficile preparada via administração oral. Os animais foram devolvidos às suas gaiolas após a infecção. O inóculo foi dispensado aos animais no dia zero do estudo, aproximadamente 4 horas após os animais terem recebido o tratamento com B. amyloliquefaciens no dia 0.

[00181] Tratamento do artigo de teste (B. amyloliquefaciens). Os animais começaram a receber tratamento das células B. amyloliquefaciens recolocadas em suspensão em meio usado (“B amy QD”) ou recolocadas em suspensão em PBS (“B amy PBS”) um dia antes da infecção. Todos os animais foram dosados por gavagem oral em um volume de 0,2 mL/camundongo. Os camundongos de controle receberam vancomicina a 50 mg/kg e uma taxa de dose de 10 mL/kg. Os materiais de dosagem foram preparados diariamente como descrito acima na preparação do material de teste.

[00182] Observações. Os camundongos foram observados diariamente ao longo do estudo. Os pesos corporais foram coletados começando com o Dia -1 e continuando até o término do estudo (Dia 10). As observações clínicas também foram realizadas com observações adversas registradas quando apropriado. As observações incluíram ausência/presença de diarreia (cauda molhada), letargia, postura arqueada, temperatura anormal (frio ao toque), condição do pelo, desidratação e morte.

[00183] Resultados. Como mostrado na FIG. 8B os camundongos dosados uma vez por dia com células ART24 recolocadas em suspensão em PBS (“B amy PBS”) exibiram uma porcentagem muito menor de sinais clínicos anormais em comparação com o grupo dosado com “veículo” (PBS). Essa foi uma porcentagem similar à do grupo tratado com vancomicina.

[00184] Como mostrado na FIG. 8C o tratamento de camundongos infectados por C. difficile com células ART24 recolocadas em suspensão em PBS ("B. amy PBS"), mas não meio usado (“B. amy QD”) reduz a perda de peso induzida por infecção por C. difficile em comparação com o grupo tratado com veículo.

[00185] A FIG. 8D mostra os pesos médios dos animais no grupo de dose de PBS B. amy e a análise estatística por dia. *p <0,05; **p <0,01; ANOVA de 2 fatores com comparações múltiplas.

[00186] Como mostrado na FIG 8E, mais animais sobreviveram no grupo dosado com PBS B amy (14/15) e no grupo tratado com vancomicina (15/15) do que no grupo tratado com veículo (11/15) ou no grupo dosado com B. amyloliquifaciens recolocado em suspensão em meio usado (“B amy QD”; 12/15).

[00187] Por conseguinte, esses resultados demonstram que as cepas de B. amyloliquefaciens da presente tecnologia são úteis em métodos para tratar e prevenir infecções por C. difficile ou CDAD.

Exemplo 12: Cepas de Bacillus amyloliquefaciens exibem Atividade Anti-C. perfringens eAnti-L. monocytogenes

[00188] Esse exemplo demonstra que as cepas de B. amyloliquefaciens da presente tecnologia exibem atividade anti-C. perfringens e anti-L. monocytogenes.

[00189] As cepas ART4, ART12 e ART24 foram cultivadas em caldo BHI aerobicamente, agitando a 200 rpm e incubadas a 37 °C. As culturas durante a noite das cepas bacterianas foram centrifugadas e o pH dos sobrenadantes neutralizado e esterilizado por filtração com filtros de 0,22 µm para garantir sobrenadantes livres de células (CFS). Cinquenta microlitros do CFS bacteriano foram dispensados nos poços da placa RCM anaerobicamente e a placa foi deixada a incubar por 24 h. A atividade Anti-C. perfringens e L. monocytogenes foi avaliada examinando a presença ou ausência de zonas de inibição em torno dos poços.

[00190] Usando o método WDA descrito acima, os sobrenadantes preparados de cada um dos três candidatos, ART24, ART4, ART12, foram testados contra 7 isolados clínicos de C. perfringens. A FIG. 9A mostra as zonas de atividade alcançadas contra C. perfringens.

[00191] Como mostrado nas FIGs. 9B-9E, cromatogramas MALDI-TOF MS de frações de HPLC de cultura DSM7T (FIG. 9B), ART4 (FIG. 9C), ART12 (FIG. 9D) e ART24 (FIG. 9E) contra C. perfringens indicam plipastatina (fengicina) como o metabólito ativo anti-C. perfringens. A plipastatina não está presente no espectro de frações do sobrenadante de cultura DSM7T(FIG. 9B).

[00192] Como mostrado na FIG. 9F, um ensaio de difusão em poços anti-L. monocytogenes demonstra os efeitos inibidores de ART4, ART12 e ART24 contra uma única cepa de L. monocytogenes.

[00193] Por conseguinte, esses resultados mostram que as cepas de B. amyloliquefaciens da presente tecnologia são úteis em métodos de inibição de crescimento de C. perfringens e L. monocytogenes e são úteis em métodos para tratar e prevenir infecções por C. perfringens e L. monoctyogenes.

Exemplo 13: Cepasde Bacillus amyloliquefaciens liofilizadas Exibem Atividade e Enterotoxina (Toxina A) e Citotoxina (Toxina B) Anti-C. difficile e são Cidas a C. difficileem Ensaio de Cocultura Líquida Atividade Contra as Toxinas A e B

[00194] ART24 recém-cultivada em meio de infusão de cérebro coração (BHI), bem como a porção de células sedimentadas, preparada como uma fração sobrenadante extraída com isopropanol (IPA) e pó liofilizado de ART24 (substância farmacológica lote CO-33-8A1) reconstituído em PBS foram examinados para a atividade de clivagem das toxinas A e B de C. difficile. A análise de Western blot foi conduzida usando anticorpos padronizados de toxinas A e B.

[00195] Foi observado que os sobrenadantes com pH neutralizado, extraídos com IPA de ART24 recém cultivado e a preparação de de ART24 liofilizada reconstituída causaram clivagem completa da toxina A (FIG. 11A) e da toxina B (FIG. 11B) de C. difficile. A quantidade de clivagem da toxina foi dependente da quantidade de UFCs de ART24 liofilizadas reconstituídas.

Ensaio de cocultura líquida

[00196] Uma preparação de ART24 liofilizada foi adicionada a uma cultura líquida compreendendo uma mistura de células vegetativas de C. difficile ou esporos de C. difficile e incubada em meio BHI suplementado com taurocolato de sódio como uma cocultura líquida por 24 horas. A ART24 estava presente em 1 x 107UFC/mL e C. difficile estava presente em 1 x 103UFC/mL. As contagens de referência foram realizadas em duplicata e as contagens às 24 horas foram realizadas em triplicata.

[00197] Como mostrado na FIG. 11C, após 24 horas, a amostra de C. difficile cultivada na ausência de ART24 mostrou um aumento > 4 log em UFC/mL de C. difficile em comparação com a contagem no início da cultura. Em contraste, as culturas inoculadas com ART24 mostraram uma redução > 2 log nas contagens de C. difficile, abaixo do limite de detecção do ensaio. As contagens de células vegetativas e de esporos de C. difficilenão foram quantificáveis/detectáveis em amostras contendo ART24.

[00198] Em geral, esses resultados demonstram que as cepas de B. amyloliquefaciens da presente tecnologia retêm sua atividade anti-C. difficile mesmo após o processamento (por exemplo, lavagem, centrifugação, mistura com trealose/crioprotetor) e liofilização. Esses resultados também demonstram que a atividade anti-C.difficileestá presente após a reidratação do material liofilizado. Por conseguinte, esses resultados demonstram que as cepas de B. amyloliquefaciens liofilizadas da presente tecnologia são úteis em métodos para tratar ou prevenir infecções por C. difficile ou CDAD.

Exemplo 14: As cepas de B. amyloliquefaciens da Tecnologia Atual Demonstram Atividade Contra Vibrio parahaemolyticus

[00199] Esse exemplo demonstra que cepas de B. amyloliquefaciens da presente tecnologia exibem atividade anti-Vibrio parahaemolyticus (FIG. 12).

[00200] A atividade antimicrobiana de ART4, ART12 e ART24 foi testada contra V. parahaemolyticus DSM 10027 (ATCC 17802, CIP 75.2, NCMB 1902, NCTC 10903, WDCM 00037). V. parahaemolyticus foi cultivado em LB + 3% de meio líquido de sal agitando a 170 rpm durante a noite em um balão a 37 °C e, em seguida, adicionado como um inóculo de 1% para LB temperado + 3% de ágar de sal. As placas de LB + ágar 3% foram deixadas esfriar e, uma vez resfriadas, os poços foram feitos no ágar usando pipetas. No tempo de 24 horas (T24) e no tempo de 48 horas (T48) sobrenadantes livres de células de ART4, ART12 e ART24 foram adicionados aos poços e as placas foram incubadas a 37 °C e, em seguida, examinadas quanto à formação de zonas.

[00201] Um ensaio de difusão em poços mostrado na FIG. 12 mostra zonas de atividade anti-V. parahaemolyticus para cada um dos sobrenadantes de cultura das cepas ART4, ART12 e ART24.

[00202] Consequentemente, esses resultados mostram que as cepas de B. amyloliquefaciens da presente tecnologia são úteis em métodos de inibição do crescimento de V. parahaemolyticus e são úteis em métodos para o tratamento de infecção por V. parahaemolyticus.

Claims (8)

1. Composição caracterizadapelo fato de que compreende: (a) a cepa bacteriana ART12 (N° de Acesso NCIMB 43087), que é um membro do grupo operacional de B. amyloliquefaciens; e (b) um conservante.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que a cepa bacteriana é liofilizada.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que a cepa bacteriana está na forma de um esporo.

4. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizadapelo fato de que o conservante é selecionado do grupo que consiste em sacarose, trealose, ascorbato de sódio e glutationa.

5. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que o conservante é um crioprotetor.

6. Composição, de acordo com a reivindicação 5, caracterizadapelo fato de que o crioprotetor é selecionado do grupo que consiste em um nucleotídeo, um dissacarídeo, um poliol e um polissacarídeo.

7. Composição, de acordo com a reivindicação 5, caracterizadapelo fato de que o crioprotetor é selecionado do grupo que consiste em inosina-5’-monofosfato (IMP), guanosina-5’-monofosfato (GMP), adenosina-5’-monofosfato (AMP), uranosina-5’-monofosfato (UMP), citidina-5’- monofosfato (CMP), adenina, guanina, uracila, citosina, guanosina, uridina, citidina, hipoxantina, xantina ou orotidina, timidina, inosina, trealose, maltose, lactose, sacarose, sorbitol, manitol, dextrina, inulina, ascorbato de sódio, glutationa e leite desnatado.

8. Composição, de acordo com a reivindicação 7, caracterizadapelo fato de que o crioprotetor compreende trealose.