BRPI0619364A2 - métodos para a profilaxia de uma condição intestinal e para o tratamento de uma condição intestinal, e, cepa bacteriana isolada - Google Patents

Abstract

METODOS PARA A PROFILAXIA DE UMA CONDIçãO INTESTINAL E PARA O TRATAMENTO DE UMA CONDIçãO INTESTINAL, E, CEPA BACTERIANA ISOLADA Bactérias da espécie Bacilius, que produzem um lipopeptídeo, são constatadas serem eficazes no tratamento e profilaxia de doença gastrintestinal, quando administradas como um probiótico. Em particular, uma cepa das bactérias Bacilius, idêntica a PB6, é útil para o tratamento de diarréia associada com antibiótico (AAD) ou a condição mais séria Clostridium difficile associated diarrhea (CDAD), quando administrada como um probiótico. Adicionalmente, estas bactérias têm sido constatadas eficientes para o tratamento de doenças imunorrelacionadas, tais como doença inflamatório do intestino (IBD).

Description

"MÉTODOS PARA A PROFILAXIA DE UMA CONDIÇÃO INTESTINAL E PARA O TRATAMENTO DE UMA CONDIÇÃO INTESTINAL, E, CEPA BACTERIANA ISOLADA"

Este pedido reivindica prioridade para o Pedido de Patente dos Estados Unidos No. de Série 60/740.518, depositado em 29 de novembro de 2005.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

A invenção refere-se genericamente à administração de bactérias para tratar doença gastrintestinal e, mais especificamente, à administração de bactérias de uma cepa de Bacillus amyloliquefaciens, para tratar diarréia associada com antibiótico (AAD) e doença associada com Clostridium difficile (CDAD).

A expressão diarréia associada com antibiótico refere-se a uma diarréia benigna, auto-limitada, em seguida ao uso de antimicrobianos. Tipicamente, não são identificados patógenos e a diarréia é devida a mudanças na composição e função da flora intestinal. A maioria dos pacientes responde a medidas suportivas e descontinuação de antibióticos.

O uso prolongado de múltiplos antibióticos, especialmente agentes de largo espectro com fraca absorção intestinal ou elevada excreção biliar, induz uma mudança na composição e função da flora intestinal e, portanto, resulta em uma incidência mais elevada de AAD.1'2 O grau de alteração será influenciado pela capacidade da flora normal resistir à colonização e pelo tipo de antibiótico usado. Uma diminuição da fora anaeróbica colônica interfere com o carboidrato e o metabolismo do ácido biliar. Pode ocorrer diarréia osmótica ou secretória. Supercrescimento de patógenos oportunistas ocorre como resultado de alterações microbiológicas e metabólicas.

C difficile, um bastonete gram-positivo anaeróbico, é responsável por 15% a 20% de todos os casos de AAD. Em particular, este organismo pode ser isolado em um grande número de casos de AAD com evidência de colite e em todos aqueles com pseudomembranas. E largamente presente no meio-ambiente, pode sobreviver por um considerável tempo e é transmitido pela via fecal-oral a indivíduos susceptíveis. E considerado parte da flora normal de infantes e pode ser isolado em cerca de 5% de adultos saudáveis e em até um terço de pacientes assintomáticos ou colonizados, hospitalizados.

As manifestações clínicas de AAD podem variar de diarréia suave a colite fulminante. A severidade da colite de C. difficile parece ser influenciada por uma miríade de fatores, incluindo idade, comorbidez, resposta imune do hospedeiro e ao uso de agentes antiperistálticos. Interessantemente, a produção de genótipo e toxina bacterianos parece representar papéis mínimos. O sintoma cardinal da doença é diarréia, que comumente se desenvolve durante tratamento, porém pode aparecer tão tarde quanto 8 semanas após descontinuação de antibióticos. Na maioria dos casos de AAD, os pacientes apresentam evacuações soltas, sinais mínimos de colite e nenhum sintoma constitucional. A diarréia responde prontamente a medidas de proteção e retirada do agente antimicrobiano.

Clostridium difficile foi primeiro descrito em 19355, porém não foi associado com a diarréia relacionada com antibiótico até fins dos anos 70. Clostridium difficile é um Bacillus aneróbico gram-positivo, formador de esporos, que produz pelo menos duas exotoxinas: toxina A, principalmente uma enterotoxina, e toxina B, uma citotoxina. O organismo provoca infecções gastrintestinais em humanos, que variam de severidade de colonização assintomática a diarréia severa, colite pseudomembranosa (PMC), megacólon tóxico, perfuração colônica e morte6'7'8 . A primeira etapa no desenvolvimento de colonização de Clostridium difficile é o rompimento da flora normal do cólon, usualmente causado por antibióticos ou, em casos incomuns, por medicamentos antineoplásticos ou imunossupressivos9'10. A colonização ocorre pela via fecal-oral; esporos ingeridos de Clostridium difficile sobrevivem à barreira de ácido gástrico e germinam no cólon11,12. Sintomas de CDAD podem começar no primeiro dia de terapia antibiótica ou até diversas semanas após a terapia antibiótica ser parada13. Os seguintes dois fatores mostraram recentemente aumentar a probabilidade de doença sintomática em pacientes que adquirem colonização de Clostridium difficile em hospital; a severidade de outras doenças e os níveis reduzidos de anticorpo IgG de soro para toxina A14. Estes resultados sugerem que o anticorpo anti- toxina A pré-existente podem melhorar a severidade da doença e que a imunização pode ser eficaz na prevenção e controle da CDAD nosocomial.

Para clareza, definimos os pacientes como tendo doença associada com Clostridium difficile (CDAD) se eles exibirem doença sintomática causada por Clostridium difficile. A detecção da presença de uma toxina Clostridium difficile na evacuação de pacientes com diarréia tem sido o método de diagnóstico mais genericamente aceito.

O Clostriaium difficile é a causa de aproximadamente 25% de todos os casos de diarréia associada com antibiótico15. A maioria dos casos de doença associada com Clostridium difficile ocorre em hospitais ou instalações de cuidados de longo termo (taxa de 25 - 60 para 100.000 leitos-dias ocupados), provocando mais do que 300.000 casos por ano nos US e taxas similares estimadas para muitos países europeus. Podem ser acrescentadas até duas semanas à extensão da hospitalização, em um custo adicional de $6.000 - $10.000 por caso16'17'18'19'20'21

A diarréia pode resolver espontaneamente em pacientes com CDAD, uma vez o antibiótico incitante tenha sido retirado e, para alguns pacientes com doença suave, nenhuma terapia específica pode ser necessária22,23. Entretanto, a prática padrão é tratar quase todos os pacientes sintomáticos com os antibióticos vancomicina ou metronidazol. Embora o metronidazol não seja atualmente aprovado pela FDA para o tratamento de CDAD5 ele é largamente usado como uma terapia de primeira linha, devido ao custo mais elevado da vancomicina e a preocupações em relação à emergência de bactérias resistentes à vancomicina. Em razão do metronidazol efetivamente rompa a flora entérica normal, ele também predispõe os pacientes a colonização com enterococus resistentes a metronidazol24 O metronidazol oral (250 mg 4 vezes por dia ou 500 mg 3 vezes por dia) por 10 - 14 d é usualmente adequado. O cloridreto de vancomicina oral (125 mg 4 vezes por dia) por 10 - 14 d é indicado para aqueles que não podem tolerar o metronidazol oral, aqueles em quem a terapia com metronidazol falha, pacientes grávidas e, talvez, pacientes severamente doentes. A primeira recaída/recorrência de colite por Clostridium difficile pode ser tratada com outro curso de 10 a 14 d de metronidazol ou vacomicina oral.

O tratamento de CDAD com vancomicina ou metronidazol propaga um ciclo vicioso, pela alteração da flora protetora normal do intestino. Conseqüentemente, 20% dos pacientes tratados com um episódio inicial têm recorrência de CDAD, usualmente dentro de duas semanas após descontinuação da terapia 25,26,27,28. Um outro benefício da remoção de antibióticos do regime de tratamento de CDAD é uma redução da pressão seletiva para resistência bacteriana. A vancomicina e metronidazol têm sido claramente mostrados selecionarem os cocos gram-positivos resistentes, tais como VRE. Estudos epidemiológicos retrospectivos ligaram a colonização VRE intestinal com o uso de antibióticos de largo-espectro, tais como as cefalosporinas, fluoroquinolonas e metronidazol . A colonização de VRE intestinal fornece um reservatório para este patógeno dentro do hospital. Muitas cepas de VRE são multi-resistentes, deixando poucas opções para tratamento de infecções sistêmicas ameaçadoras da vida. Os pacientes com Clostridium difficile, talvez por causa de sua pré-disposição antibiótica anterior, parecem ser especialmente susceptíveis a colonização e infecção por VRE30'31. O controle da colonização por VRE é um componente crítico de práticas de controle de infecção hospitalar. Portanto, estratégias terapêuticas que reduzam o risco de colonização por VRE, tanto na população de paciente geral como em paciente com Clostridium difficile, são altamente desejáveis.

A emergência potencial de Clostridium difficile resistente a vancomicina e metronidazol apresenta um risco adicional para o uso de antibióticos para tratar esta doença. Atualmente, a ocorrência de Clostridium difficile resistente a antibiótico é esporádica, porém tem sido relatada em até 12% de isolados clínicos32.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A invenção refere-se à profilaxia de uma condição intestinal, tal como diarréia associada com antibiótico, diarréia adquirida por Clostridium difficile, doença inflamatória do intestino e doença gastrintestinal, pela administração de uma quantidade eficaz de bactérias Bacillus, que produzem lipopetídeos. As bactérias Bacillus podem ser administradas como um probiótico e podem ser combinadas com outros probióticos, tais como inulina.

Empregando-se métodos bioquímicos e especificamente API 50 CBH/L, um Bacillus preferido foi putativãmente identificado como Bacillus subtilis. Empregando-se 16S rNA, o Bacillus preferido foi também putativamente identificado como Bacillus subtilis. Empregando-se gyrA, o Bacillus preferido foi putativamente identificado como Bacillus amyloliquefaciens. Antes do ensaio de gyrA, o Bacillus preferido foi depositado na ATCC e identificado como Bacillus subtilis.

A invenção também refere-se a uma cepa de bactéria isolada, tendo a seqüência 16S rNA da SEQ ID NO: 1, a uma cepa bacteriana isolada tendo 90% de homologia, 80% de homologia, 70% de homologia, 60% de homologia e 50% de homologia com a SEQ ID NO: 1.

A invenção também refere-se a uma cepa de bactérias isoladas, tendo a seqüência gyrA parcial da SEQ ID NO: 2, a uma cepa bacteriana isolada tendo 90% de homologia, 80% de homologia, 70% de homologia, 60% de homologia e 50% de homologia com a SEQ ID NO: 2.

A invenção também refere-se a uma cepa de bactérias isoladas, tendo a seqüência gyrA parcial da SEQ ID NO: 3, a uma cepa bacteriana isolada tendo 90% de homologia, 80% de homologia, 70% de homologia, 60% de homologia e 50% de homologia com a SEQ ID NO: 3.

A invenção refere-se ainda a bactérias Bacillus da cepa identificada como cepa ATCC PTA-6737.

O Bacillus PB6 preferido pode ser posicionado para diversas necessidades médicas não satisfeitas, devido a suas características versáteis e únicas.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A Fig. 1 é uma fotografia do efeito antagônico do Bacillus PB6 (1) contra C. perfringens ATCC13124 (2) e Clostridium difficile ATCC9689 (3).

A Fig. 2 é uma fotografia do efeito antagônico do Bacillus PB6 sobre Clostridium difficile NAP1/027.

A Fig. 3 é uma fotografia do efeito antagônico do Bacillus PB6 sobre Campylobaeter jejum ATCC55918.

A Fig. 4 é um desenho da estrutura química da surfactina.

A Fig. 5 é uma diagrama da % sobrevivência de hamsters sofrendo de CDAD com diferentes tratamentos.

A Fig. 6 é a seqüência genética 1466-bp 16S rNA (posição de nucleotídeo de 27-1492) do Bacillus PB6.

A Fig. 7 é a seqüência gyrA parcial de 1023-pb (posição do nucleotídeo de 43 - 1065) do Bacillus PB6.

A Fig. 8 é a seqüência de consenso de 801-pb, obtida do seqüenciamento parcial de gyrA do Bacillus PB6. A Fig. 9 é um gel da detecção de um produto PCR (1650-pb) codificando para hemolisina BL; Alameda 1, as escadas de massa GeneRuler™ (3000, 2000, 1500, 1200-pb); Alameda 2, Bacillus PB6; Alameda 3, Escherichia coli ATCC 25922; Alameda 4, B. eereus ATCC 49064; Alameda 5, B. cereus ATCC 11778. Nenhuma faixa amplificada, correspondendo a um produto PCR de 1650-pb, foi detectada em qualquer uma das alamedas, exceto quanto às alamedas 4 e 5.

A Fig. 10 é um gel da detecção de um produto PCR (1437-pb) codificando para enterotoxina não-hemolítica (Nhe). A alameda 1, as escadas de massa GeneRuler™ (3000, 2000, 1500, 120-pb); Alameda 2, Bacillus PB6; Alameda 3, Eseheriehia eoli ATCC 25922; Alameda 4, B. eereus ATCC 49064; Alameda 5, B. eereus ATCC 11778. Nenhuma faixa amplificada, correspondendo a um produto PCR de 1437-pb, foi detectada em qualquer uma das alamedas.

A Fig. 11 é um gel da detecção de um produto PCR (1400-pb) codificando para enterotoxina K (EntK); Alameda 1, BaciUus PBo; Alameda 3, Eseherichia coli ATCC 25922; Alameda 4, B. cereus ATCC 49064; A.ameda 5, B. eereus ATCC 11778; Alameda 6, escadas de massa GeneRuler™ (3000, 2000, 1500, 1200-pb); nenhuma faixa amplificada, correspondendo a produto PCR de 1400-pb, foi detectada em qualquer uma das alamedas.

A Fig. 12 é uma fotografia mostrando a falta de efeito antagonista do Bacillus cereus (1) contra C. perfringens ATCC13124 (2) e Clostridium difficile ATCC9689 (3).

A Fig. 13 é uma fotografia do efeito antagonista do Bacillus PB 6 contra Campylobacter jejuni ATCC 33291.

A Fig. 14 é uma fotografia mostrando a falta de efeito antagonista do Bacillus eereus contra Campylobaeter jejuni ATCC 33291.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO PREFERIDAS

PB6 é uma cepa bacteriana patenteada, que foi isolada da natureza e não foi geneticamente modificada. Usando-se uma técnica de ribotipagem, esta bactéria foi identificada como sendo uma cepa do Bacillus subtilis. Estudos de hibridização de DNA:DNA indicam que a cepa do Bacillus PB6 pode mais provavelmente ser um Bacillus amyloliquefaciens, que será ainda descrito abaixo.

Como usado neste relatório, o termo profilaxia significa um procedimento de saúde médica ou pública, cuja finalidade é evitar em vez de tratar ou curar uma condição. Como usado neste relatório, o termo tratamento significa um procedimento médico ou público, cuja finalidade é tratar ou curar uma condição. Como usado nesta especificação, o termo composto sinérgico significa um composto que aumenta a eficácia do efeito ou tratamento profilático de uma bactéria Bacillus administrada para a profilaxia ou tratamento de uma condição doentia ou de saúda. Como usado neste relatório, lipopeptídeos são moléculas que contêm diversos aminoácidos e um ou mais ácidos graxos. Surfactinas, iturinas, micossubtilinas, bailomicinas, bacilopeptinas, fengicinas e plipastatinas são exemplos de lipopeptídeos.

EXEMPLO 1 - EFICÁCIA DO BACILLUS PB36 CONTRA C. DIFFICILE, AAD E CDAD

As propriedades antagonistas do Bacillus PB6 foram testadas contra C. perfringens ATCC13124 e Clostridium diffieile ATCC9689.

O Baeillus PB6 tinha efeito antagonista contra C. perfringens ATCC13124 e Clostridium diffieile ATCC9689. Uma zona transparente foi observada nas interseções das linhas evanescentes sobre a placa para ambas as espécies. Um exemplo da placa de teste é representado na Fig. 1.

O Bacillus PB6 também teve efeito antagonista contra Clostridium diffieile NAP1/027. Esta cepa Clostridium diffieile é ligada a diversas erupções altamente perigosas e apresenta resistência a antibióticos. Um exemplo da placa de teste é representada na Fig. 2.

A fim de determinar o efeito antimicrobiario dos metabólitos secundários do Bacillus PB6, as bactérias foram fermentadas e o produto de fermentação foi extraído por dietil éter. A camada orgânica foi separada, concentrada in vácuo e redissolvida em DMSO para triagem.

A concentração inibitória mínima (MIC) do extrato foi de 2,5 - 5 μg/ml contra C. perfringens e 5 - 10 μg/ml contra Clostridium difficile (Tabela 1).

Tabela 1: Resultados da triagem com o extrato bruto de Bacillus PB6 contra C. perfringens, Clostridium difficile e C. jejuni

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Foi provado também que o Bacillus PB6 inibe o crescimento do Campylobaeter jejuni in vitro. Um exemplo da placa de teste é mostrado na Fig. 3. A MIC de um extrato de éter do produto de fermentação do Bacillus PB6 contra Campylobaeter jejuni foi de 25- 100 μg/ml.

O Campylobaeter jejuni e o Helicobaeter pylori são muito estreitamente relacionados e, portanto, é provável que o Bacillus PB6 seja também ativo contra o Helicobaeter pylori. Além disso, na literatura pode ser encontrado que as bactérias Bacillus (p. ex., Bacillus subtilis) possui atividade contra Helicobaeter pylori33 .

Mais pesquisa do extrato bruto mostrou que a molécula responsável pela atividade contra Clostridium foi a surfactina lipopeptídica cíclica (Fig. 4).

Quando a atividade da surfactina pura (purificada de nossa fermentação ou comprada da Sigma) foi determinada contra Clostridium, uma MIC mais elevada foi constatada. A MIC contra C. perfringens provou ser de 10-25 μg/ml. E notável que o composto ativo puro seja menos ativo do que o extrato de fermentação bruto. Isto é provavelmente devido a co-fator(es) presentes no extrato que aumenta(m) a atividade da surfactina. Isto foi mostrado por experimentos em que a MIC da surfactina foi comparada com a MIC da surfactina, em combinação com um composto inativo. Este composto inativo foi isolado do mesmo extrato de que isolamos a surfactina. A MIC desta combinação foi entre IelO μ§/ιη1.

Experimentos mostraram que, quando os filtrados do Bacillus PB6 foram tratados com pepsina e tripsina, a atividade contra Clostridium sp. diminuiu significativamente. Uma vez que a pepsina e tripsina são enzimas produzidas no revestimento mucoso do estômago e do pâncreas, é óbvio que a administração oral da surfactina resultará em uma significativa perda da atividade. Outros experimentos, em que a surfactina foi incubada a 37 0C por 30, 60 e 90 minutos com 0,1 N HCl, mostraram que as condições ácidas (como no estômago) resultaram em uma perda de atividade (Tabela 2). Portanto, a administração do Bacillus PB6 (eventualmente como esporos) é mais eficaz para obterem-se concentrações eficazes de surfactina ou outros lipopeptídeos no intestino.

Tabela 2: Resultados da influência de incubação ácida na atividade antibacteriana da surfactina contra Clostridium perfringens

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Além da produção dos metabólitos secundários antimicrobianos, os esporos do Bacillus PB6 são capazes de germinarem no intestino e, assim, podem suprimir patógenos por exclusão competitiva.

O Baeillus, mais especificamente Bacillus subtilis, permanece uma das mais potentes e benéficas de todas as bactérias promotoras da saúda e imune-estimulantes. De acordo com diversos estudos clínicos documentados nos relatórios de pesquisa médica, os componentes da parede celular do Baeillus ingerido são capazes de ativar quase todos os sistemas da defesa imune humana, incluindo a ativação de pelo menos três anticorpos específicos (IgM, IgG e IgA), que são altamente eficazes contra muitos dos vírus, fungos e patógenos bacterianos nocivos, que regularmente tentam invadir e infectar o sistema humano. O Bacillus subtilis tem também mostrado estimular os linfócitos e macrófagos BeT. Foi também fornecida evidência de que os esporos do Bacillus subtilis podem exercer uma efeito imunomodulador in vivo. E uma resposta aumentada das células formadores de placa aos antígenos dependentes de T foi descrita após exposição a esporos, bem como uma intensificação de diferentes funções de fagócitos.34,35,36,37,38,39,40,41

Em um estudo (Tabela 3), um elevado grau de fagocitose foi observado em aves a serem grelhadas, alimentadas com diferentes níveis de B. amiloliquefaciens PB6, em comparação com os controles de antibiótico e negativos.

Por isto podemos concluir que também o Bacillus amyloliquefaciens possui propriedades imuno-estimulantes.

Tabela 3. Influência do Bacillus PB6 sobre a resposta imune em aves a serem grelhadas machos

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Os filtrados do Bacillus PB6 foram avaliados quanto à presença de enterotoxinas hemolíticas, não-hemolíticas e enterotoxina K, empregando-se ensaios imunológicos comercialmente disponíveis (TECRA e Oxoide). Os mesmos filtrados foram ainda submetidos a testes de citotoxicidade em linhagens de célula Vero e Hep-1. Finalmente, métodos baseados em PCR foram usados para confirmar a presença de genes com possível capacidade enterotoxigênica em Bacillus PB6. Não houve reatividade imuno-cruzada observada com enterotoxinas e anticorpos Hbl ou Nhe nos dois imunoensaios comerciais. Nenhuma citotoxicidade foi também observada com os ensaios de células Vero e HEp-2. A cepa do Bacillus PB 6 não produz as enterotoxinas hemolíticas, não-hemolíticas e enterotoxina K sob as mesmas condições que permitiram a detecção de uma cepa toxigênica conhecida de B. cereus.

A toxicidade in vivo do Bacillus PB 6 foi também testada. Portanto, um produto secado por pulverização contendo IO10 cfu/g de Bacillus PB6 foi produzido do produto de fermentação.

Estudo de Toxicidade de Bacillus amyloliquefaciens secado por pulverização em Ratos Wistar

Um primeiro estudo foi projetado e conduzido para determinar a toxicidade oral aguda do produto Bacillus PB6 secado por pulverização (IO10 cfu/g) em ratos Wistar. Um total de 5 animais machos e 5 fêmeas foram administrados uma dose oral de 5000 mg/kg (como uma suspensão em água duplamente destilada e usando-se um volume de dose de 10 ml/kg). O segundo grupo de controle consistiu de 5 animais machos e 5 fêmeas, que receberam água duplamente destilada em uma dose de 10 ml/kg. Nenhuma mortalidade foi observada nos animais tratados com 5000 mg/kg. 50% dos animais recebendo o produto Bacillus PB6 eram mais ativos em comparação com o grupo de controle. Nenhum dos animais tratados com Bacillus PB6 sofreu diarréia. Após necroscopia, não foram vistas mudanças patológicas em qualquer órgão de ambos os grupos. Assim, a dose máxima não-letal (LD0) e LD5O do produto Bacillus PB6 administrado oralmente em ratos Wistar foram constatadas serem maiores do que 5000 mg/kg.

Conclusão: Dose não-letal máxima (LD0) e LD50 de Β. PB6 seco (IO10 cfu/g) em rato Wistar por via oral foram constatadas serem maiores do que 5000 mg/kg.

Dose Repetido 28-dias Toxicidade Oral de Β. P6 em Ratos Wistar

Este estudo foi projetado e conduzido para determinar dose repetido (28 dias) de toxicidade oral de Β. PB6 (IO10 cfu/g) em ratos Wistar. Em cada grupo 6 animais machos e 6 fêmeas receberam doses orais de 250, 500 ou 1000 mg/kg por 28 dias. O grupo de veículo de controle também consistiu de 6 animais machos e 6 fêmeas, que receberam água duplamente destilada em uma dose de 10 mg/kg por 28 dias. Estes grupos foram sacrificados no dia 29.

O estudo também consistiu de dois grupos reversíveis para veículo de controle e alta dose, que tinham 6 animais machos e 6 fêmeas. O grupo de alta dose recebeu medicação até o dia 28 e ficou sem tratamento do dia 29 ao 42 e sacrificado no dia 43. O grupo de veículo de controle recebeu água destilada em uma dose de 10 ml/kg até o dia 28 e ficou sem tratamento do dia 29 ao dia 42 e foi sacrificado no dia 43. Conclusão: Nenhum nível de evento adverso observado (NOAEL) para Β. PB6 (IO10 cfu/g) em experimentos de toxicidade de 28 dias em ratos é constatado ser maior do que 1000 mg/kg.

Estudo de Irritação Local (Dérmica e Olhos) de Β. PB6 em Coelho Branco da Nova Zelândia

Um total de 3 Coelhos Brancos da Nova Zelândia (um ou outro seco) - Os mesmos coelhos foram usados para irritação dérmica e dos olhos neste estudo. Um intervalo mínimo de 5 dias foi mantido entre ambos os estudos. 1 g de Β. PB6 (IO10 cfu/g) foi aplicado como uma pasta na pele para irritação dérmica e 100 μΐ de 10% de suspensão de Β. PB6 instilados dentro do olho esquerdo para irritação do olho.

Pasta de item de teste PB6 foi aplicada na pele em área dorso- lateral após remoção dos cabelos em 3 coelhos. Suspensão de 10% de PB6 foi instilada no olho de 3 coelhos. O item de teste foi removido da pele dos animais 4 horas pós-aplicação. Após instilação do item de teste no olho esquerdo, as pálpebras foram mantidas juntas por 2-3 segundos.

Os coelhos foram observados e classificados quanto à irritação dérmica a 1, 24, 48 e 72 horas, após remoção do item de teste PB6. Para irritação do olho a classificação foi realizada ao mesmo tempo nos pontos pós-instilação da suspensão de PB6.

Conclusões: Dérmica: não foi observada nenhuma irritação, quando 1 g de B. PB6 (10"10 cfu/g) foi aplicado como uma pasta.

Olho: Nenhuma irritação foi observada quando 100 μl de 10% de suspensão de Β. PB6 (10"10 cfu/g) foram instilados.

Ensaio de Micronúcleo de Eritrócito de Bacillus amyloliquefaciens PB6 em Camundongos

Este estudo foi projetado e conduzido para detectar a avaria induzida pela substância de teste nos cromossomas ou no aparelho mitótico de camundongos albinos suíços. Um total de 5 animais machos e 5 fêmeas receberam dose oral de 2500 e 5000 mg/kg, o grupo de veículo de controle consistiu de 5 camundongos machos e 5 fêmeas, que receberam água duplamente destilada em uma dose de 10 ml/kg oralmente. O grupo de controle positivo (5 machos + 5 fêmeas) receberam ciclofosfamida oralmente, em uma dose de 40 mg/kg.

Os animais foram sacrificados por excesso de CO2 nos respectivos pontos de tempo (grupo de controle, 2500 mg/kg PB6 ciclofosfamida a 24 h e 5000 mg/kg PB6 a 24 h e 5000 mg/kg PB6 a tanto 24 como 48 h) e ambos os fêmures foram removidos e esfregaços da medula óssea colocados em lâminas, tingidos com tinta Giemsa e May-Greunwald, visualizados sob microscópio quanto à incidência de micronúcleos por contagem de 2000 eritrócitos imaturos.

A percentagem de imaturos entre os eritrócitos totais (imaturos + maduros) é também determinada para cada animal por contagem de pelo menos 200 eritrócitos.

Conclusão: B. PB6 (10"10 cfu/g) em uma dose de 2500 & 5000 mg/kg não induziu significativamente eritrócitos policromáticos micro nucleados em camundongos. Determinação da eficácia in vivo de Bacillus PB6 oralmente administrado no tratamento de hamsters Golden Svrian sofrendo de CDAD. Projeto de Estudo

Quarenta e dois hamsters Golden Syrian foram obtidos do National Centre for Laboratory Animal Sciences, NIN (Hyderabad, índia). No início do período de tratamento, os animais tinham 12 a 14 semanas de idade. Na sua chegada na instalação de teste, os animais receberam um exame clínico completo sob a supervisão de um veterinário, para assegurar que estivessem em boas condições. Os animais foram aclimatizados às condições do estudo por um período de pelo menos 7 dias. Os pesos corporais foram registrados antes da alocação dos animais dentro dos grupos de estudo no início do experimento. Os animais foram alojados individualmente em gaiolas de policarbonato (290 χ 22 χ 140 mm, LxWxH). As condições do recinto do animal e recinto de teste foram ajustadas como segue: temperatura : 22 ± 4 °C, umidade relativa: 50 ± 20%, ciclo de luz/escuro: 12 h / 12 h (luz 07,00 - 19,00 ) e ventilação: aproximadamente 7 ciclos/hora de ar filtrado não-reciclado. Todos os animais tiveram livre acesso a Hamster Pellet Feed (NIN, Hyderabad) e água purificada por Aquaguard ad libitum.

Os animais foram alocados a um dos sete grupos de estudo (A a G). Nos grupos AaE diarréia associada com Clostridium difficile foi induzida administrando-se 10000 CFU's de Clostridium difficile ATCC 9689 oralmente no dia 0, seguido por uma injeção subcutânea na região do tronco, logo atrás das orelhas, de clindamicina 100 mg/kg no dia 1. O Grupo A não recebeu mais tratamento.

O Grupo B foi tratado uma vez diariamente dos dias 2 a 6 com vancomicina 50 mg/kg por gavagem oral. Os Grupos C, D e E foram tratados com PB6 em uma dose de 1,5 χ 108, 1,5 χ 107 e 1,5 χ 106 CFU/Kg, respectivamente, 3 vezes diariamente com 4 horas interdose (primeira dose a 9,30 am do dia 1 a 6 por gavagem oral. No dia 1 a primeira dose de PB6 foi dada 1 hora após a injeção de clindamicina. Nos grupos F e G os animais receberam PB6 em uma dose de 1,5 χ IO9 CFU/Kg, 3 vezes diariamente com 4 horas de interdose (primeira dose a 9,30 am) do dia 1 a 6 por gavagem oral.

O dia 6 foi o último dia de tratamento. Duas vezes diariamente, até o dia 15, foram feitas observações quanto a sinais clínicos e mortalidade. Sinais de diarréia foram classificados como sendo suaves, moderados ou severos. Os pesos corporais doa animais foram registrados no dia 0, 7 e 14. Para os grupos A a E, as fezes foram testadas nos dias 1, 2 e 7 quanto à presença de Clostridium toxina AeB, empregando-se Immunocards (Meridian Iife sciences). No dia 1 amostras fecais foram retiradas antes da administração da clindamicina. Nos dias 2 e 7, amostras fecais foram tiradas entre a segunda e terceira dose de tratamento. Preparações de teste

Um Culti-Ioop (Oxoid, Basingstoke, Inglaterra) contendo Clostridhim difficile ATCC 9689 foi inoculado de acordo com as instruções dos fabricantes e o caldo foi diluído com solução salina para obter-se 10000 CFU/ml. Cloridreto de clindamicina (Pharmacia, Puurs - Bélgica) e vancomicina (Neon Laboratories, Bombay, Indica) foram suspensos em água duplamente destilada a uma concentração de 10 e 50 mg/ml respectivamente. Os volumes de dose foram de 10 e 1 ml/kg de peso corporal para clindamicina e vancomicina, respectivamente. PB6 Dry (Kemin Consumer Care, Des Moines, USA), um caldo de fermentação de Bacillus ' PB6' secado em um veículo de malto e ciclodextrina, foi suspensa em água duplamente destilada em concentrações de 1,5E8, 1,5E6 e 1,5E5 CFU/ml. O volume da dose foi de 10 ml/kg de peso corporal. Preparações frescas foram feitas antes de cada administração. Clindamicina, vancomicina e PB6 foram administrados com base no último peso corporal individual tomado. As preparações foram agitadas vigorosamente antes cada dosagem. Resultados e exame

Cerca de 6 horas após clindamicina ter sido administrada, foi observada diarréia suave em 3 animais do grupo de tratamento e em 1 animal do grupo a ser tratado com cancomicina. Nos grupos C, D, E, em que os animais receberam sua primeira dose de PB6 cerca de 1 hora após a administração de clindamicina, nenhum dos animais mostrou qualquer sinal de diarréia naquela mesmo dia. O número de animais sofrendo de diarréia e a severidade da diarréia evoluíram diferentemente entre os grupos de tratamento nos seguintes 2 dias (Tabela 4). Todos os grupos em que diarréia associada com Clostridium difficile foi induzida mostram sinais de diarréia. A intensidade da diarréia foi menor no grupo tratado com vancomicina e no grupo tratado com a alta dose de PB6. No grupo de tratamento, bem como nos grupos de baixa e média dose de PB6, a evacuação era muito aquosa e a inteira área abdominal estava úmida.

Tabela 4. Número de animais com diarréia e sua classificação para os dias 1 a 3, nos grupos em que CDAD foi induzida

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+: suave ++: moderada +++: severa

No final do dia 3, todos os animais dos grupos em que CDAD foi induzida estavam ainda vivos, porém diversos deles estavam mostrando sinais de severa diarréia. No dia 4, três dias após a administração de clindamicina, os primeiros animais morreram. No final do período de tratamento, no dia 6, todos os hamsters do grupo de não tratamento tinham morrido. A sobrevivência foi mais elevada nos grupos de tratamento de elevada dose de vancomicina e PB6, onde 4 de cada 6 sobreviveram (Fig. 5).

No dia 7, um peso corporal médio diminuído foi observado em todos os grupos em que CDAD foi induzida. Houve uma clara relação de resposta de dose inversa com PB6 concernente a esta diminuição de peso (Tabela 5). Os animais recebendo baixa dose de PB6 em média perderam 3 vezes mais peso do que os animais que receberam a alta dose. A perda de dose foi a menor com tratamento com vancomicina. O peso corporal médio nos dois grupos em que CDAD não foi induzida tinha ligeiramente aumentado durante o mesmo período de tempo.

Tabela 5. Peso corporal médio (g) e ganho de peso corporal (%)

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* sem dados, todos os animais morreram

a,b,c,d,e valores dentro da mesma coluna não contendo um sobrescrito comum são significativamente diferentes (P < 0,05, Diferença Menos Significativa).

A presença de toxina de clostridium A e B em amostras fecais dos animais em que CDAD foi induzida foi verificada nos dias 1, 2 e 7. Como esperado, grupos mostrando alta mortalidade e elevada diminuição de peso corporal médio também tinham uma alta percentagem de animais testados positivos para estas toxinas com novamente uma relação de resposta de dose inversa com PB6.

Tabela 6. Número de animais testados positivos quanto à presença de toxinas A ou B de Clostridium difficile em suas fezes

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* sem dados, todos os animais morreram

Conclusão

Este estudo foi projetado e conduzido para avaliar a eficácia de B. PB 6 no tratamento de CDÁD no modelo de hamster da CDAD induzida por clindamicina, um modelo bem estabelecido e altamente sensível para esta infecção. Os hamsters que não foram tratados após indução de CDAD obtiveram todos severa diarréia, peso perdido e morreram dentro de cinco dias. O tratamento com PB6 resultou em uma resposta relacionada com a dose. Diarréia, redução de peso corporal e mortalidade foram mínimas com a dose mais elevada de PB6. Na parada do tratamento, a dose mais elevada de PB6 mostrou ter sido igualmente eficiente como a vancomicina em ajudar os hamsters a sobreviver a CDAD induzida por clindamicina.

Avaliação dos Componentes Eficazes do Bacillus PB6 Oralmente Administrado

A nova concepção dietética dos probióticos (tais como inulina) está ganhando popularidade entre os nutricionistas, médicos, fabricantes de alimentos e consumidores. A definição mais largamente aceita de um alimento probiótico é: "Um probiótico é um ingrediente seletivamente fermentados que permitem mudanças específicas, tanto na composição como atividade da microflora gastrintestinal, que confere benefícios ao bem estar e saúde do hospedeiro". Para ser classificado como um ingrediente probiótico em produtos alimentícios, esse ingrediente deve 1) resistir à digestão (hidrólise) pelas enzimas alimentares do estômago e intestino delgado; 2) penetrar no cólon quimicamente intacto e, subseqüentemente, sofrer parcial ou completa fermentação; e 3) estimular o crescimento ativo e/ou atividade das bactérias intestinais estimuladoras da saúde. Os benefícios de saúde do crescimento das bactérias estimuladas por probiótico são de larga faixa e incluem tais benefícios como efeitos positivos sobre o câncer do cólon e patógenos, diminuídos triacilgliceróis, absorção aumentada de Ca e Mg e aumentadas freqüência de evacuação e peso fecal. A inulina é um β(2~> 1) frutano polidisperso com comprimentos de cadeia variando de 2 a 60 unidades. A ligação única entre as moléculas de frutose da inulina e a oligofrutose distingue-as dos carboidratos típicos. Eles resistem à digestão por enzimas alimentares humanas e absorção no intestino delgado, porém são hidrolisados e fermentados pela microflora colônica e, portanto, classificados como fibra dietética probiótica.42,43'44'45'46

O fato de que os probióticos estimulam o crescimento ativo e/ou atividade das bactérias intestinais estimulantes da saúde torna-os produtos muito interessantes para serem administrados junto com probióticos, tais como Bacillus PB6.

Além disso, o Bacillus amyloliquefaciens PB6 não inibe o crescimento de bactérias "saudáveis" da flora intestinal, tais como LactoBacillus spp. e Bifidobaeterium spp.

Materiais e Métodos

Identificação de bactérias PB6 isoladas

A cepa PB6 Bacillus isolada é um bastonete Gram-positivo e possui catalase. O fingimento de Malachite Green confirmou que este microorganismo possui endosporos e é um formador de esporos. Este microorganismo é também um "enxameador", visto que, no período de incubação prolongada, ele tende a espalhar-se sobre a inteira superfície de ágar. Em termos de relacionamento com o conhecido Bacillus spp., a cepa de Bacillus isolada tem 92,0 % ID. Com base nos perfis bioquímicos API, a cepa PB6 Bacillus foi putativamente identificada como Bacillus subtilis. A cepa PB6 Bacillus foi, portanto, depositada como ATCC - PTA 6737 e chamada lá Bacillus subtilis. O pedido de patente dos EStados Unidos No. de Série 10/306.365, depositado em 27 de novembro de 2002, é incorporado aqui por referência. Seqüenciamento de gene 16 rRNA

A seqüência 16 rRNa quase completa do Bacillus PB6 foi completada e alinhada (SEQ ID NO:l, Fig. 6). Seqüenciamento de GyrA

As seqüências de gyrA parciais de PB6, obtidas por dois diferentes grupos, são mostradas na Fig. 7 (SEQ ID NO:2) e Fig. 8 (SEQ ID NO: 3).

Hibridizações DNA:DNA

As hibridizações foram realizadas sob condições rigorosas (a 40 °C) de acordo com uma modificação do método descrito por Ezaki et al.47. As percentagens de homologia do DNA são a média de no mínimo 4 hibridizações. O valor dado entre parênteses é a diferença entre os valores recíprocos. Com esta técnica, o desvio padrão médio é de 14 unidades.48 Os resultados são apresentados na Tabela 7.

Tabela 7 - % homologia DNA

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Uma homologia de DNA acima de 70%, o limite geralmente aceito para delineação da espécie,49 é encontrada entre o Bacillus PB6, LMG 98A4T e LMG 22478T. Por estes resultados parece que B. velezensis e B. amyloliquefaciens pertencem à mesma genoespécie e são, portanto, sinônimos subjetivos, de modo que, ao aplicar a regra nomenclatural 42, o nome legítimo mais velho deve ser mantido, isto é, Bacillus amyloliquefaciens-, e aquele Bacillus PB6 (ATCC - PTA 6737) pode mais propriamente ser categorizado para a espécie Bacillus amyloliquefaciens. Teste de propriedades antagonistas do Bacillus amyloliquefaciens pelo ensaio de linha de estria

O Bacillus amyloliquefaciens PB6 foi inoculado como uma linhagem direta em placas de sangue Tryptone Soy (Oxoid, Bégica), após 24 horas de incubação a 37 0C em condições aeróbicas, as diferentes cepas indicadoras foram inoculadas perpendicularmente à cultura de Bacillus PB6. As placas inoculadas com Clostridia species foram incubadas em condições anaeróbicas, utilizando-se Anaerogen Pak (Oxoid, Bélgica). Após incubação durante a noite a 37 ºC, efeitos antagonistas foram avaliados pela aparência das zonas transparentes circundando as junções das linhagens em estria, indicando os efeitos inibitórios de um organismo contra o outro. Extração e triagem antimicrobiana dos metabólitos secundários do Bacillus PB6.

O Bacillus PB6 foi cultivado em placas Trypton Soya Agar suplementadas com 5% de sangue de carneiro (Oxoid, Bélgica) por 24 h a 37 ºC. Esta cultura foi usada para inocular 100 ml de caldo Tryptic Soy, suplementada com 0,6% de extrato de levedura (Oxoid, Bélgica). Após incubação por 24 h em um incubador agitando (100 rpm) a 37 ºC, o caldo foi misturado (3 vezes) com iguais quantidades de dietil éter (Acros, Bélgica). Após extração dos metabólitos, ambas as camadas foram separadas e a fração de éter foi coletada e centrifugada a 4000 rpm por 5 min.

Em seguida, o solvente foi removido in vácuo, utilizando-se um evaporador rotativo. O resíduo foi pesado e dissolvido em dimetilsulfóxido (Acros, Bélgica), resultando em uma concentração final de 10000 μg de extrato bruto. Mais diluições (500, 250, 100, 50, 25 e 10 μg/ml) fora feitas em uma mistura de DMSO/água com relação 1/11. Finalmente, 25 μl de cada diluição foram pipetados dentro dos poços das placas de microtitulação (Labsystems, Finlândia).

As cepas bacterianas Clostridium perfringens ATCC13124 (Cl6001, Oxoid, Bélgica) e Clostridium difficile ATCC9689 (C16101, Oxoid, Bélgica) foram compradas como culti-lupes secados por congelamento e trazidas para dentro da cultura, de acordo com as instruções do fabricante. De ambas as culturas, um padrão McFarland (A62Snm = 0,100) foi preparado em caldo Basal Anaeróbica (Oxoid, Bélgica). 250 μl deste padrão foram adicionados a 10 ml de caldo Basal Anaeróbica fresca e 225 μl deste meio foram pipetados dentro dos poços. Produzindo-se uma densidade de célula final de 5 x 10^5 cfu/ml em cada poço. As placas de microtitulação foram incubadas em condições anaeróbicas por 18 horas (C.perfringens) e 48 horas (C. difficile), empregando-se Anaerogen Compact (Oxoid, Bélgica) em um saco plástico impermeável a ar. Antes e após o período de incubação, a densidade óptica (OD) foi medida usando-se o analisador Bioscreen C (Labsystems, Finlândia). Luz branca (Banda Larga) foi usada para medir a OD. Os testes foram realizados em duplicata e também controle do meio, meio mais inóculo (controle negativo) e um controle positivo; vancomicina (Fluka, Bélgica) em três concentrações (0,1, 0,5 e 1,0 μg/ml) foi incluída na batelada de teste. A concentração de inibição mínima foi definida como a mais baixa concentração em que nenhum crescimento ocorreu ou onde nenhum aumento da OD foi detectado.

Determinação do efeito de aumento de um co-fator sobre a atividade da surfactina

O extrato de éter do produto de fermentação do Bacillus amyloliquefaciens PB6 foi separado por TLC preparativa (Kieselgel 60, 20 x 20 cm, 2 mm espessura de camada). O eluente usado foi hexano/acetona (30/70). As surfactinas foram isoladas na zona com Rf 0 a 0,33. A MIC contra C. perfringens das surfactinas isoladas desta zona foi entre 10 e 25 μ§/ηι1. Em outra zona (Rf 0,33 a 0,76) um ou mais produtos foram encontrados que não eram ativos contra C. perfringens (MIC >100 μ£/ιη1). Quando uma combinação foi testada dos produtos de ambas as zonas, com uma concentração final de ambos os extratos de 10 μ^ηιΐ cada, não houve crescimento de C. perfringens. A MIC das surfactinas diminuiu a abaixo de 10 μ§/ιη1 quando combinada com estes produtos, que não eram ativos por iniciativa própria.

Determinação do efeito do tratamento ácido sobre a atividade antimicrobiana da surfactina

Uma solução foi preparada de 750 μ§/πι1 de surfactina (Sigma) em acetonitrila/ 0,1 N HCl (1/1; v/v). 0,5 ml desta solução foram incubados a 37 °C por 30', 60' ou 90', após o que 0,25 ml de uma solução 0,1 N de NaHCOs foram adicionados e a mistura foi misturada usanao-se um agitador de vórtice. Todas as soluções foram tríadas quanto à atividade contra Clostridium perfringens.

Determinação da produção de enterotoxina por Bacillus PB6

Condições das cepas e cultura bacteriana. Bacillus PB6 foi cultivado em volume de 100 ml de Tryptic Soy Broth (Becton Dickenson and Company, Cockeysville, MD), suplementado com 0,6% de extrato de levedura (Oxoid Limited, Inglaterra) (TSBYE) e incubado a 37 0C em um incubador agitador ajustado a 100 rpm. Uma cepa produtora de toxina de B. cereus ATC 11778 foi também cultivada em TSBYE a 37 0C em um incubador agitador. Similarmente, cepas não produtoras de toxina de B. cereus ATCC 49064 e Eseherichia eoli ATCC 25922 foram também cultivadas em TSBYE a 37 0C sob condições aeróbicas. Todas as cepas bacterianas usadas neste estudo foram transferidas semanalmente para TSBYE fresco e então mantidas em um refrigerador a 4 0C, como cultura de trabalho. Cepas recentemente cultivadas foram re-suspensas em 40% de glicerol e mantidas em freezer a 80 0C para armazenagem de longo termo.

Produção de enterotoxina. Um volume de 1 ml de cultura de teste durante a noite foi inoculado dentro de 50 ml de Brain Heart Infusion (BHI), suplementados com 1% de glicose (BHIG) e incubada em um incubador agitando (100 rpm) pro 6 h a 32 0C31. Células bacterianas foram

precipitadas por centrifugação a 5000 Xg por 10 min e o sobrenadante foi coletado para estudos de citotoxicidade de células Vero . As proteínas do sobrenadante foram então concentradas dez-vezes usando-se até 80% de solução de sulfato de amônio saturada (561 g por litro)33. Após centrifugação a 10000 X g por 20 min, o sobrenadante foi decantado e a pelota de proteína foi ressuspensa em 2,5 ml de tampão de fosfato (20 mM; pH 6,8). Sais residuais de sulfato de amônio foram removidos por diálise contra o mesmo tampão a 4 0C por 6 h. O volume final da solução de proteína dialisada foi ajustado a um-décimo do volume original (5 ml) usando-se o tampão de fosfato (20 mM; pH 6,8)31.

Produção de toxina emética. Um volume de 1 ml de cultura de teste durante a noite foi inoculado em 50 ml de Brain Heart Infusion (BHI) suplementado com 1% de glicose (BHIG) e incubado por 6 h a 32 0C em um incubador agitador ajustado a 250 rpm. As células bacterianas foram precipitadas por centrifugação a 2000 X g por 10 min a 4°C31. O sobrenadante foi coletado e então autoclavado a 121 °C por 15 min para remover enterotoxinas instáveis ao calor .

O filtrado tratado por calor, com possivelmente a toxina emética estável ao calor, foi coletado para o ensaio de vacuolação em células HEp-220.

Preparação de células Vero e HEp-2. Células de rins de macaco verde africano (Vero) ou HEp-2 (carcinoma humano da laringe) foram mantidas como culturas de monocamada em 30 ml de Meio 199 com sais modificados de Earle (MEM) contendo 2 mM L-glutamina, 10 mM bicarbonato de sódio, 1% de aminoácidos não essenciais, 100 Ul/ml de penicilina, 0,1 mg/ml de estreptomicina e 3 ml de soro de bezerro fetai (10%).

O meio livre de leucina (MEM) foi preparado com base no meio essencial mínimo (Gibco), que também continha 1,8 mM CaCl2, 0,4 mM MgCl2, 5,0 mM KCl, 0,12 M NaCl, 3,2 mM NaH2PO4 e 20 mM Hepes (pH 7,7). As células Vero ou HEp-2 foram incubadas em MEM a 5% CO2 a 37 0C. Culturas de monocamada confluentes de células Vero ou HEp-2 foram subcultivadas descarregando-se os meios antes de lavar com 5 ml de PBS (pH 7,7). As células Vero ou HEp-2 foram então separadas do frasco de cultura pela adição de 2 ml de solução de tripsina (0,25% tripsina; 0,025% EDTA). Os níveis de células Vero ou HEp-2 soltas foram determinados microscopicamente antes da adição do meio MEM (8 ml) para evitar mais efeito da tripsina. Uma alíquota de 5 ml de células Vero ou HEp-2 recentemente tripsinadas foi então transferida para novo frasco de cultura contendo 15 ml de MEM para incubação a 37°C sob 5% CO2.

Imunoensaio Visual de Enterotoxina Diarréica do Bacillus TECRA®. Todos os componentes do kit de teste (TECRA International Pte Ltd, Chatswood, NSW, Austrália) foram mantidos a 20 - 25°C antes do teste das amostras quanto a BDE. Como dito pelo fabricante, os poços de microtítulo contendo anticorpos de alta afinidade, específicos para BDE, foram pré-embebidos com solução de lavagem provida dentro do kit e permitidos repousar por 10 min a 20 - 25°C. Os poços foram esvaziados antes das alíquotas contendo volume de 200 μΐ das amostras de teste e controles (positivo e negativo) fossem transferidas para poços individuais. Os poços foram incubados a 37°C por 2 h. Os poços foram lavados 4 vezes antes de uma alíquota de 200 μl de conjugado fosse adicionada a cada poço e incubada a 25°C por 1 h. Cada poço foi lavado 5 vezes antes de 200 μl de substrato fossem adicionados a cada poço e incubados a 25 °C por 30 min. Após 30 min, o desenvolvimento colorimétrico para cada poço foi comparado com TECRA Color Card provido no kit de teste.

Aglutinação de Látex Passivo Reverso da Enterotoxina de Bacillus cereus Oxoid (BCET-RPLA). O teste foi desenvolvido para a detecção de enterotoxina diarréica do Bacillus cereus por aglutinação passiva reversa (RPLA) (Unipath, Basingstoke, UK). Partícula de látex de poliestireno são sensibilizadas com antissoro purificado de coelhos imunizados com enterotoxina diarréica de B. cereus. O kit também forneceu os controles tanto positivo (enterotoxina) como negativo (partículas de látex sem anti-enterotoxina B. cereus específica). Alíquotas contendo 25 μΐ de diluente e amostras de teste ou controle (positivo e negativo) foram distribuídas sucessivamente dentro de 2 diferentes jogos de placas de microtítulo de poço-V. Soluções contendo 25 μΐ de látex sensibilizado e controle de látex foram então distribuídos dentro do primeiro e do segundo jogo de placas de microtítulo de poço-V, respectivamente. Cada poço foi examinado quanto à aglutinação após 20 - 24 h de incubação a 25 °C.

Medição da citotoxicidade. Células Vero recentemente tripsinizadas foram re-suspensas em 30 ml de meio livre de leucina (MEM). Um mililitro da suspensão de células Vero foi transferido para cada um dos 24 poços (~5 x 10"4 células por poço). As células foram lavadas uma vez com 1 ml de MEM livre de leucina e incubadas por 2 h a 37 °C sob 5% CO2. Após 2 h, o meio de crescimento foi removido e cada poço foi lavado uma vez com 1 ml de MEM livre de leucina. Um volume de 1 ml de MEM livre de leucina pré-aquecida (37 °C) foi adicionado em cada poço, seguido por 50 μΐ de sobrenadante ou filtrado de Bacillus amyloliquefaeiens PB6, B. cereus ATCC 11778, B. cereus ATCC 49064 e E. coli ATCC 25922 imediatamente em seguida. Os poços inoculados foram incubados a 37 °C com 5% de CO2 por 2 h. Após 2 h de incubação, as células Vero do sobrenadante ou tratadas com filtrado foram lavadas uma vez com 1 ml de MEM livre de leucina pré- aquecido (37 °C). Um volume de 300 μl de solução contendo isótopo rotulado radioativo (16 μl 14C-Ieucina em 8 ml de MEM livre de leucina) (Perkin Elmer Asia, Singapore) foi adicionado em cada poço. Células Vero rotuladas 14C-leucina foram incubadas a 37 °C sem CO2 por lhe em seguida o meio de crescimento foi descartado. Subseqüentemente, alíquotas de 1 ml de solução contendo 5% de ácido tricloroacético foram adicionadas em cada poço contendo células Vero rotuladas 14C-leucina antes da incubação a 25 °C por 10 min. Após 10 min de incubação, o conteúdo de cada poço foi lavado duas vezes com 1 ml de 5% de solução de ácido tricloroacético. Um volume de 300 μl de 0,1 M KOH foi então adicionado a cada poço e incubado a 25 °C por outros 10 min. Após 10 min de incubação, um volume de 2 ml de líquido de cintilação foi adicionado em cada poço. Finalmente, todo o conteúdo de cada poço foi transferido para dentro de tubos de cintilação. Todos os tubos de cintilação foram agitados por 1 min antes de realizar as contagens de radioatividade. A inibição percentual de 14C leucina absorvida pelas células Vero é calculada utilizando-se a seguinte fórmula.

Inibição percentual de absorção de 14C leucina - [(cpm para células Vero sem toxina adicionada - cpm para amostra de teste)]/[cpm para células Vero sem toxina adicionada] x 100%. A cpm usada para calcular a inibição percentual de absorção de leucina 14C pelas células Vero tem que ser subtraída pelo valor para contagens de fundo (-30 - 60 cpm). Nenhuma toxina está presente se a inibição de absorção de 14C leucina for menor do que 20% após a concentração de dez vezes. Cada ensaio foi conduzido em duplicata. Os resultados são apresentados nas Tabelas 8 e 9. Tabela 8: Efeito do filtrado bacteriano sobre Linhagens de Células Vero e HEp-2

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Tabela 9: % Inibição de absorção de isótopo de 14C-leucina

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a A toxina da cepa testada é considerada negativa se a inibição de absorção de 14C leucina for menor do que 20% após concentração de dez-vezes. (relatório VARREDURA). b Teste microorganismos, controles cnegativo e epositivo e dcepa não produtora de toxina.

Ensaio de Vacuolação de Células HEp-2. Um volume de 25 μΐ contendo filtrados das culturas de teste e controle foi serialmente diluído (2 vezes) em solução de NaCl 0,15 M e distribuído através de poços de uma placa de cultura de tecido de 96-poços (Gibco Ltd. Uxbridge5 UK). Volumes contendo 100 μl de células HEp-2 recentemente tripsinizadas foram adicionados a cada poço e incubados por 24 h a 37 0C. Todos os ensaios de vacuolação foram realizados em duplicata. Exame microscópico quanto à presença de formação de vacúolo em células HEp foi conduzido nos intervalos de 6 e 24 h.

Métodos baseados em PCR. Iniciadores de PCR foram desenvolvidos para a enterotoxina não-emolítica (NheB-nheC)25'26, hemolisina BL (HblD-hblA)10,11 e enterotoxina K (EntK)27,28. As seqüências dos iniciadores NheB-nheC foram 5' CGGTTCATC-TGTTGCGACAGC 3' e 3'GTCCTCGTGTTCGTCTTC-AGC 5'. As seqüências iniciadoras para HblD-hblA foram 5' CGCT-CAAGAACAAAAAGTAGG 3' e 3' TCCCTAATGT-CTAAATGTTCCTC 5'. Os iniciadores para diante e reversos para EntK foram 5'GAATTACGTTGGCGAATC3' e 3'CGGG- CGGATGGGA 5', respectivamente. Tanto PCR da amostra e tubos de controle positivo contendo DNA de Bacillus amyloliquefaciens PB6 e cepas toxigênicas de B. cereus ATCC 11778 e B. cereus ATCC 49064 foram colocados dentro de um ciclizador térmico Perkin-Elmer (GeneAmp PCR System 9600, Perkin-Elmer Corp., Norwalk, CT) com temperatura de ponto de ajuste inicial de 90 0C. As condições para ciclização térmica foram 1 ciclo a 94 °C por 2 min, seguido por uma rotina de ciclização de temperatura de 38 ciclos de 94 0C por 15 s e 70 °C por 3 min. Em seguida à aMplificação, um extensão final a 72 0C por 7 min foi realizada. A etapa de amplificação PCR requereu aproximadamente 3 h para completar-se. Alíquotas (15 μl) de cada produto de reação e 15 μΐ de escada padrão de DNA (500, 1031, 2000 E 3000 pares bases) foram então eletroforesadas a 180 volts por 1 h através de um gel de 2% de agarose (Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD) contendo 0,1 jLig/ml de brometo de etídio (Sigma Chemical Co., St. Louis, IvíO). Após eletroforese, todos os géis foram vistos utilizando-se um transiluminador-UV (comprimento de onda - 302 nm) (UVP Model White/2 UV; UVP Inc., Upland, CA) e então fotografados empregando-se uma Câmera Polaroid MP- 4 (Polaroid Corp., Cambridge, MA) (Vide Fig. 9, Fig. 10 e Fig. 11).

EXEMPLO 2- DETERMINAÇÃO DAS PROPRIEDADES ANTIMICROBIANAS DE METABÓLITOS DE DIFERENTES PROBIÓCITOS E BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS PB6 EM RELAÇÃO A CLOSTRIDIUMPERFRINGENS E CLOSTRIDIUM

DIFFICILE VIA MÉTODO DE MICRODILUICÂO DE CALDO

Neste estudo investigamos as propriedades anticlostridiais dos metabólitos do Bacillus PB6 e quatro probióticos comercialmente disponíveis: Bactisubtil® (Sanofi - synthelabo), Perenterol® (Biodiphar), Bioplus 2B (Miavit GmbH) e Biosporium (Diniprofarm). Fermentações de pequena escala foram realizadas com as espécies isoladas dos diferentes probióticos. Extratos de éter do caldo de fermentação, contendo os metabólitos, foram triados em relação a C. perfringens ATCC13124 e C. difficile ATCC9689, empregando-se método de microdiluição de caldo. Os metabólitos de Β. PB6 mostraram significativas propriedades anticlostridiais. Concentrações de inibição mínimas foram situadas entre 2,5 e 5,0 μ£/ηι1 em direção a C. perfringens e entre 5,0 e 10,0 μ§/ηι1 em direção a C. difficile. Os extratos de éter da fermentação de Bactisubtil®, Perenterol®, Bioplus 2B e Biosporinum não tiveram qualquer atividade antibacteriana significativa contra ambas espécies clostridia.

Embora Clostridium species sejam ubíquas por natureza, seus principais habitats são o solo e os tratos intestinais de muitos animais e humanos. A ocorrência muito difundida de C. perfringens, incluindo seus esporos, em amostras de solo, quase garante a freqüente presença deste organismo em superfícies expostas a contaminação de poeira, incluindo muitos itens de alimento.50 C. perfringens é também a espécie mais comumente isolada dos espécimes clínicos humanos, excluindo fezes. É encontrado em uma larga variedade de cenários clínicos, variando de simples contaminação de ferimentos a mininecrose traumática, sépsis intra-abdominal, hemólise intravascular, pneumonia de aspiração, pneumonia necrosante etc.51

C. difficile é a causa principal da diarréia associada a antibiótico (AAD) e é também a causa mais freqüência identificada de diarréia adquirida em hospital. Na doença associada com C. difficile (CDAD), o evento iniciador primário envolve o rompimento da flora intestinal protetora durante tratamento com antibióticos. Quando o nível de antibiótico cai abaixo das concentrações inibitórias, patógenos nocosomiais tais como C. difficile são capazes de se desenvolver. A colonização ocorre pela rota fecal-oral, os esporos ingeridos sobrevivem à barreira do ácido gástrico e começam a germinar no cólon. ' Isolados toxigênicos bem como não-toxigênicos são capazes de formar esporos e existir no ambiente hospitalar. Como um resultado, um ou outro tipo pode infectar o cólon e utilizar os nutrientes que são disponíveis por causa da falta de competição pela flora normal. Se o organismo fixa-se à parede colônica não é claro, porém é mais provável que o organismo desenvolva-se através do lúmen do cólon. Cepas toxigênicas produzem e liberam toxinas A e/ou B à medida que as células crescem e lise. Esta atividade, juntamente com a resposta inflamatória, resulta nos eventos histopatológicos conduzindo a diarréia associada com C. difficile e colite.54'55'56

Um "probiótico" pela definição geralmente aceita é uma alimentação ou suplemento alimentar "microbiano vivo", que beneficamente afeta o hospedeiro melhorando seu equilíbrio microbiano intestinal. Porém, como funciona um probiótico ? O efeito dos probióticos sobre o ecossistema intestinal impacta de algum modo benéfico o consumidor. Numerosos benefícios potenciais surgindo de mudanças do ambiente intestinal através de probióticos foram propostos, incluindo: aumentada resistência a doenças infecciosas, particularmente do intestino, duração diminuída da diarréia, redução da pressão sangüínea, redução da concentração do colesterol do solo, redução da alergia etc.

O estudo comparativo descrito neste trabalho foi elaborado a fim de comparar as propriedades antimicrobianas de diferentes extratos de fermentação probióticos em relação à espécie clostridia. Métodos e Materiais

As cepas de Bacillus PB6 e o Bacillus cereus isoladas de Bactisubtil® (Sanofi-Synthelabo) foram cultivadas em placas Trypton Soya Agar, suplementadas com 5 % de sangue de arneiro (Oxoid, Bélgica) por 24 h a 37 °C. O probiótico de alimentação Bioplus 2B continha duas diferentes espécies, Bacillus Iieheniformis DSM5749 e Bacillus subtilis DMSM5750. Ambas as espécies foram também cultivadas em placas Trypton Soya Agar suplementadas com 5% de sangue de carneiro (Oxoid, Bélgica) por 24 h a 37 °C. Uma mistura destas culturas foi usada para inocular 100 ml de caldo Tryptic Soy suplementada com 0,6% de extrato de levedura (Oxoid, Bélgica). Biosporinum, também contém duas espécies, isto é Bacillus lícheniformis e Bacillus subtilis. Este produto é comercializado como culturas liofilizadas em frascos de vidro. O conteúdo de um frasco foi ressuspenso em caldo, esta mistura foi usada para inocular 100 ml de caldo Tryptic Soy suplementada com 0,6% de extrato de levedura (Oxoid, Bélgica). Após incubação de todos os probióticos por 24 h em um incubador agitando (100 rpm) a 37 0C, o caldo foi misturada (3 vezes) com quantidades iguais de dietil éter (Acros, Bélgica). Após extração dos metabólitos, ambas as camadas foram separadas e a fração de éter foi coletada e centrifugada a 4000 rpm por 5 min.

Em seguida, o solvente foi removido in vácuo usando-se um evaporador rotativo. O resíduo foi pesado e dissolvido em dimetilsulfóxido (Acros, Bélgica), resultando em uma concentração final de 10.000 μ§/πι1 de extrato bruto. Outras diluições (500, 250, 100, 50, 25 e 10 μg/ml) foram feitas em uma mistura de DMSO/água com relação de 1/12. Finalmente, 25 μΐ de cada diluição foram pipetados dentro dos poços das placas de microtitulação (Labsystems, Finlândia). Saccharomyces boulardii usado em Perenterol® (Biodiphar) foi cultivado em Sabouraud dextrose ágar (Oxoid, Bélgica) por 48 h a 37 °C. Esta cultura foi usada para inocular 100 ml de meio líquido de Sabouraud (Oxoid, Bélgica). Após incubação por 2 dias em um incubador agitando (100 rapamicina) a 37 °C, o mesmo procedimento foi seguido para extrair os metabólitos.

As cepas bacterianas Clostridium perfringens ATCC13124 (C1600L, Oxoid, Bélgica) e Clostridium diffieile ATCC9689 (C1610L, Oxoid, Bélgica) foram compradas como culti-lupes secados por congelamento e trazidas para dentro da cultura de acordo com instruções do fabricante. De ambas as culturas um padrão McFarland (A625 nm = 0,100) foi preparado em caldo Anaerobic Basal (Oxoid, Bélgica). 250 μl deste padrão foram adicionados a 10 ml de caldo Anaerobic Basal fresca e 225 μl deste meio foram pipetados dentro dos poços. Produzindo uma densidade de célula final de 5 χ 105 cfu/ml em cada poço. As placas de microtítulo foram incubadas em condições anaeróbicas por 18 horas (C. perfringens) e 48 h (C. difficilé) usando-se Anaerogen Compact (Oxoid, Belgium) em um saco de plástico impermeável a ar. Antes e após o período de incubação, a densidade óptica de cada poço foi medida usando-se analisador Bioscreen C (Labsystems, Finlândia). Luz branca (Banda Larga) foi usada para medir a OD. Os testes foram realizados em duplicata e também controle do meio, meio mais inóculo (controle negativo) e um controle positivo; vancomicina (Fluka, Bélgica) em três concentrações (0,1, 0,5 e 1,0 μg/ml) foi incluída na batelada de teste. A concentração de inibição mínima (MIC) foi definida como a mais baixa concentração onde nenhum crescimento ocorreu ou onde nenhum aumento de OD foi detectada.

Resultados e Exame

Forte aumento da OD foi observado nos poços de controle negativo para ambas as espécies. Nenhum crescimento ocorreu dentro dos frascos contendo 1,0 e 0,5 μg/ml de vancomicina, 0,1 μg/ml de vancomicina não inibiu o crescimento de C. perfringens. Nos poços contendo 1 e 2,5 μg/ml de extrato PB6, crescimento normal de C. perfringens ocorreu. De 5 μg/ml em diante, nenhum crescimento de C. perfringens pôde ser observado. A MIC do extrato de fermentação bruta de PB6 em relação a C. perfringens foi entre 2,5 e 5,0 μg/ml. Também para Clostridium difficilé um forte aumento da OD foi observado nos poços de controle negativo. Nenhum crescimento ocorreu nos poços contendo 1,0 e 0,5 μg/ml de vancomicina, 0,1 μg/ml de vancomicina não inibiu o crescimento. Nos poços contendo 1, 2,5 e 5 μg/ml de extrato-PB6 bruto, crescimento normal de C. difficilé ocorreu. De 10 μg/ml em diante, nenhum crescimento pôde ser detectado. A MIC do extrato de éter dos metabólitos de PB6 em relação a C.dijfieile foi entre 5,0 e 10 μ^ηιΐ. Os extratos de éter de Bactisubitil® (B. cereus), Perenterol® (S. boulardii), Bioplus 2B Bacillus lichenformis DSM5749 e Bacillus subtilis DSM5750) e Biosporinum (Baeillus lieheniformis sp. e Bacillus subtilis sp.) não tiveram qualquer atividade bacteriana significativa para todas as concentrações testadas. A MIC foi acima de 50 μ§/ηι1 para ambas as espécies clostridia testadas. Estes resultados podem ser encontrados na Tabela 10.

Tabela 10: Resultados da triagem com os extratos brutos em relação a C. perfringens e C.difficile

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Conclusão

Investigamos as propriedades anticlostridiais dos extratos de éter de Β. PB6, Bactisubitil® (B. cereus), Perenterol® (S. boulardii), Bioplus 2B (B. lieheniformis DSM5749 e Bacillus subtilis DSM5750) e Biosporinum (Bacillus lieheniformes sp. e Bacillus subtilis sp.). Fermentações em escala de laboratório com estas espécies foram estabelecidas e os extratos de éter foram triados contra Clostridium perfringens ATCC13124 e C.difficile ATCC9689, usando-se técnicas de microdiluição de caldo. Os metabólitos de Β. PB6 possuem fortes propriedades anticlostridiais, as MIC são situadas entre 2,5 e 5,0 μg/ml em relação a Clostridium perfringens e entre 5,0 e 10,0 μg/ml em relação a C.difficile. Os extratos de éter de fermentações de Bactisubitil®, Perenterol®, Bioplus 2B e Biosporinum não tiveram qualquer efeito significante contra C. perfringens ATCC13124 e C.difficile ATCC9689.

EXEMPLO 3 - EFICÁCIA DO BACILLUS PB6 CONTRA IBD

Sabe-se que a surfactina inibe a atividade da PLA2 citosólica, uma enzima centralmente envolvida em muitos processos inflamatórios. A inibição dos processos inflamatórios torna os probióticos produtores da surfactina muito interessantes para o tratamento de doenças inflamatórias, tais como doença inflamatória do intestino (EBD).

Doença inflamatória do intestino refere-se a duas doenças crônicas que provocam inflamação dos intestinos: colite ulcerativa (UC) e doença de Crohn (CD). Embora as doenças tenham alguns aspectos em comum, há algumas diferenças importantes.

A CD é uma inflamação crônica da parede intestinal, tipicamente afetando a espessura total da parede intestinal. Muitíssimo comumente, ela ocorre na parte mais inferior do intestino delgado (íleo) e do intestino grosso, porém pode ocorrer em qualquer parte do trato digestivo da boca ao ânus e da pele em torno do ânus.

Nas últimas décadas, a CD tornou-se mais comum tanto no ocidente como nos países em desenvolvimento. Ela ocorre aproximadamente de modo igual em ambos os sexos e é mais comum entre o povo judaico. A maioria dos casos começa antes da idade de 30; a maior parte começa entre as idades de 14 e 24.

Em cada pessoa, a doença afeta áreas específicas do intestino, às vezes com áreas normais (áreas puladas) intercaladas entre as zonas afetadas. Em cerca de 35% dos sofredores da CD, somente o íleo é afetado. Em cerca de 20%, somente o intestino grosso é afetado. Em cerca de 45% dos pacientes, tanto o íleo como o intestino grosso são afetados.

As causas da CD são desconhecidas. Pesquisa focalizou-se em três principais possibilidades: uma disfunção do sistema imune, infecção e dieta.

Os sintomas prematuros mais comuns de CD são diarréia crônica, dor abdominal, febre, perda de apetite e perda de peso. Os sintomas diferem entre os pacientes com CD, porém há quatro padrões comuns:

• inflamação com dor e sensibilidade na parte inferior direita do abdome;

• obstruções intestinais agudas recorrentes, que provocam diversos espasmos dolorosos da parede intestinal, intumescimento do abdome, constipação e vômitos;

• inflamação e obstrução intestinal parcial crônica, provocando má-nutrição e debilidade crônica;

• fístulas e abscessos anormais, que com freqüência provocam febre, massas dolorosas no abdome e severa perda de peso.

A UC é uma doença crônica em que o intestino grosso torna-se inflamado e ulcerado, resultando em episódios de diarréia sangrenta, câimbras abdominais e febre. A doença pode começar em qualquer idade, porém usualmente começa entre as idades de 15 e 30.

Diferente de CD, a UC não afeta usualmente a espessura total do intestino e não afeta o intestino delgado. A doença usualmente começa no reto ou no cólon sigmóide e eventualmente espalha-se parcial ou completamente através do intestino grosso. Em alguns pacientes, a maior parte do intestino grosso é afetada cedo.

Cerca de 10% dos pacientes que parecem ter UC somente sofrem um único ataque. Entretanto, uma proporção de tais pacientes pode realmente estar sofrendo de uma infecção indetectada, em vez de UC verdadeira. Para a maior parte dos pacientes, a UC é uma doença crônica, que aumenta e diminui durante o tempo. As causas da UC permanecem desconhecidas. Hereditariedade e respostas imunes super-ativas no intestino pensa-se serem fatores contribuintes.

Determinação da eficácia in vivo de Bacillus PB6 oralmente administrado no tratamento de colite induzida por TNBS em ratos (um modelo para colite em humanos).

Neste experimento, a eficácia de PB6 foi estudada em relação à colite em ratos induzida pela administração retal de ácido 2,4,5- trinitrobenzeno sulfônico (TNBS).

Projeto de estudo

Dois consecutivos experimentos foram realizados. Ratos Wistar machos foram obtidos do National Centre for Laboratory Animal Sciences (Hyderabad, Indica) (experimento 1) ou do Department of Animal Medicine, TANUVAS (Chennai, índia) (experimento 2). No início do período de tratamento, os animais tinham 10 a 12 semanas de idade. Na sua chegada na instalação de teste, os animais receberam um exame clínico completo sob a supervisão de um veterinário, para assegurar que eles estivessem em boas condições. Os animais foram aclimatizados às condições de estudo por um período de pelo menos 7 dias. Por experimento, os animais foram aleatorizados e alocados a um dos grupos de estudo. Os animais foram alojados por grupo de estudo em gaiolas de policarbonato (421x290 χ 190 mm, LxWxH). As condições do recinto do animal e do recinto de teste foram ajustadas como segue: temperatura : 22 ± 3 °C, umidade relativa: 50 ± 20%, ciclo de luz/escuro: 12 h/12 h (luz 07,00=19,00) e ventilação: aproximadamente 7 ciclos/hora de ar não reciclado filtrado. Todos os animais tiveram acesso livre (exceto para o jejum durante a noite antes da administração de TNBS) a alimentação de pelotas de rato do National Institute of Nutrition (NIN, Hyderabad, índia) e água purificada Aquaguard ad libitum. Em ambos os experimentos o dia de indução de colite foi determinado como dia 1. A colite foi induzida, após um jejum durante a noite, utilizando-se uma administração intra-retal única de TNBS a 100 mg/kg peso corporal, 8 cm proximal ao ânus. Os grupos de controle negativo-colite receberam solução salina intra-retalmente (0,5 ml por animal uma vez) no dia 1. Os grupos de controle negativo-colite e positivo-colite receberam água destilada oralmente a 10 ml/kg, 3 vezes diariamente com 4 h interdosagem, começando no dia 1 e até e incluindo o dia 7. No primeiro experimento, os grupos com colite induzida por TNBS foram tratados com PB6 (1,5 108 CFU/Kg ou 1,5 10^9 CFU/kg respectivamente), 3 vezes diariamente com 4 h interdosagem, começando no dia 1 e até e incluindo o dia 7; com mesalazina (250 mg/kg/dia), começando no dia 1 e até e incluindo o dia 7; ou com infliximab (3 mg/kg) como uma única dose no dia 1. O segundo experimento parcialmente repetiu o primeiro com respeito a tratamentos com PB6 (1,5 10^8 CFU/kg), mesalazina e infliximab e incluído um tratamento adicional com S. boulardii (1,5 10^8 CFU/kg), 3 vezes diariamente com 4 h de interdosagem, começando no dia 1 e até e incluindo o dia 7. A primeira ou única (no caso de infliximab) dose de tratamento foi dada dentro de 2 horas (água destilada, PB6, S. boulardii e meslazina) ou 3 (infliximab) após administração de TNBS. Exceto para infliximab, que foi injetada intravenosamente59, todos os tratamentos foram administrados por gavagem. Foram feitas observações duas vezes diariamente quanto a sinais clínicos e mortalidade. Os pesos corporais dos animais foram registrados nos dias 1, 4 e 7. No dia 8, os animais foram sacrificados e um segmento com o comprimento de 5 cm do cólon (de 10 a 5 em proximal ao anus) foi excisado. Estes segmentos foram abertos longitudinalmente. O conteúdo foi removido por lavagem com seu sal alcalino e morfologia volumosa foi classificada utilizando-se a seguinte escala: 0 — sem úlceras ou inflamação, 1 — sem úlceras somente hiperemia local, 2 - ulceração sem hiperemia, 3 - ulceração e inflamação em um sítio somente, 4 - dois ou mais sítios de ulceração e inflamação, e 5 - ulceração estendendo-se mais do que 2 cm. O peso de cada segmento colônico de 5 cm foi também registrado para avaliar o edema induzido inflamatório. Preparações de teste

TNBS 5% (p/v) em água (Sigma-aldrich, St. Louis, USA) foi diluído em uma solução de 2,5% com 50% de etanol. O volume da dose foi de 4 ml/kg de peso corporal. PB6 seco (Kemin Health, Des moines, USA), um caldo de fermentação de Bacillus PB6, secado em um veículo de malto e ciclodextrina, foi suspensa em água destilada a concentrações de 1,5 10 e 1,5 108 CFU/ml. O volume da dose foi de 10 ml/kg peso corporal. Saccharomyces boulardii (Enterol®, Biodiphar, Brussel, Bélgica) foi suspenso em água destilada a uma concentração de 1,5 IO7 CFU/ml. O volume dose foi de 10 ml/kg de peso corporal. Tabletes de Mesalazina (Mesacol®, Sun Pharmaceutical Ind. Ltd., Mumbai, índia) foram pulverizados usando-se almofariz e pilão e uma solução de água destilada foi preparada contendo 25 mg de ácido 5-aminossalicílico por ml. O volume da dose foi de 10 ml/kg de peso corporal. Remicade® (Infliximab) (Centocor Β. V., Leiden, Países Baixos) foi primeiro reonstituído com 10 ml de água para injeção e foi ainda diluído a 2 μg/ml de concentração usando-se solução salina. O volume da dose empregado foi de 1,5 ml/kg peso corporal. Todas as doses dependentes do peso corporal foram administradas com base no último peso corporal individual tomado. Preparações frescas foram feitas antes de cada administração. As preparações foram agitadas vigorosamente antes de cada dosagem.

No primeiro experimento, um dos ratos tratados com Infliximab morreu no dia 2. Este animal tinha recebido uma segunda injeção no dia 1 porque na primeira uma solução de medicamento exsudou. Alguns animais mostraram sinais suaves de diarréia após a indução de colite com TNB S. O número de observações de diarréia registradas (e o número de animais afetados) nos diferentes grupos de tratamento do dia 1 até e incluindo o dia 7, foram no primeiro experimento 0, 22(2), 4 (1), 0, 0 e 8 (1) para controle negativo-colite, controle positivo-colite, PB6 3 x 1,5 10 CFU/kg/dia, PB6 3 χ 1,5 109 CFU/kg/dia, mesalazina 250 mg/kg/dia e infliximab 3 mg/kg de dose única, respectivamente; e no segundo experimento 0, 42 (4), 10 (1),34 (3), 12 (1) e 24 (2) para controle negativo- colite, controle positivo-colite, PB6 3 χ 1,5 10 CFU/kg/dia, S. boulardii 3 x 1,5 IO8 CFU/kg/dia, mesalazina 250 mg/kg/dia e infliximab 3 mg/kg dose única respectivamente. Os grupos de controle positivo-colite mostraram substancial perda de peso corporal acompanhando a colite. No experimento 1, esta perda foi mais elevada do que no experimento 2, o que poderia ser relacionado com uma diferença de idade e taxa de crescimento no momento da indução da colite. O peso corporal inferior em geral no início e o ganho de peso corporal superior em termos de percentagem em relação ao período do experimento do grupo de controle negativo-colite no experimento 1 provavelmente indica que estes animais eram, em média, um tanto mais novos do que aqueles do experimento 2. Embora tratamentos comuns do experimento 1 todos significativamente suprimissem o efeito negativo da colite no ganho de peso corporal, no experimento 2 este foi o único caso com tratamento PB6 (Tabela 11).

Tabela 11. Peso corporal médio (g) e ganho de peso corporal médio (%) com seu desvio padrão

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* significativamente diferente do grupo de controle positivo (Dunnett, P < 0,05).

O maior impacto da colite nos animais no experimento 1 provavelmente deixou mais espaço para melhoria por qualquer um dos tratamentos. PB6 e mesalazina sempre resultaram em uma classificação de peso de segmento de cólon e uma morfologia volumosa para a parede do cólon que pôde ser claramente distinguida daqueles do grupo de controle positivo-colite (Tabela 12).

Tabela 12. Classificação de morfologia volumosa média para a parede do cólon e peso úmido médio de um segmento de cólon de 5 cm

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* significativamente diferente do grupo de controle positivo (Dunnett, P < 0,05).

O status de saúde da parede do cólon em ratos com TNBS induziu colite tratada com PB6 e Mesacol foi macroscopicamente o mesmo que aquele dos ratos livres de colite. Por uma razão desconhecida^ o tratamento com mesalazina foi um tanto menos eficaz no experimento 2, resultando em algumas ulcerações. Exames visuais dos segmentos de cólon longitudinalmente abertos claramente mostram as ulcerações e áreas de tecido necrótico presentes no controle positivo, o S. boulardii, e nos grupos de tratamento com infliximab e sua ausência nos grupos PB6 e no grupo de mesalazina do experimento 1. No experimento 1, um dos ratos tratados com infliximab tinha uma contagem de morfologia volumosa 1 e um peso de segmento de cólon de 0,402 kg. Estes dados sugerem que neste animal. particular o tratamento com inflizimab foi bem sucedido ou que a indução da colite não o foi. No final do período de tratamento, o ganho de peso corporal médio e os dados de peso de segmento de cólon dos ratos tratados com infliximab foram intermediários àqueles dos grupos de controle negativo- colite e positivo-colite em ambos os experimentos. Isto provavelmente indique que houve algum efeito de infliximab, embora não estatisticamente significativo nestes experimentos. Em um experimento similar em ratos, em que infliximab foi administrado na mesma dose de 3 mg/kg i.v. 2 dias antes da indução da colite com TNBS, foi mostrado ter algum efeito sobre a morfologia volumosa do cólon, porém não para reduzir o nível de edema significativamente abaixo daquele do grupo de controle positivo-colite.19. Nos segmentos de cólon de ratos tratados com PB6 não houve ulcerações. Somente hiperemia foi observada na maior parte destes segmentos. PB6 claramente atenua a inflamação na parede do cólon de rato, quando induzida por administração intra-retal de TNBS. A eficácia de um tratamento de pós- indução de 7 dias com 3 x 1,5 10"9 CFU/kg/dia observada em um experimento anterior foi confirmada no experimento 1. Embora um tratamento de pós- indução de 7 dias com PB 6 3 x 8 10 CUF/Kg/dia do mesmo experimento anterior fosse concluído ser ineficaz, um aumento de CFU/Kg/dia a 3 x 1,5 10"8 provou em ambos experimentos atuais ser suficiente para reduzir a inflamação a uma extensão que os dados deste tratamento não puderam mais ser estatisticamente discernidos daqueles do grupo de controle negativo- colite.

Conclusão

Este estudo foi projetado e conduzido para confirmar e documentar a eficácia do Bacillus PB6 contra colite induzida por ácido 2,4,6- trinitrobenzenossulfurico (TNBS) em ratos observados em um experimento anterior, bem como comparar sua eficácia com aquela do S. boulardii (probiótico), mesalazina e infliximab (medicamentos padrão). Este modelo de rato é bem estabelecido, confiável e largamente usado para examinar a eficiência de medicamentos com objetivo de tratar IBD. Sem qualquer tratamento após indução da colite, diversos ratos apresentaram sinais suaves de diarréia e, em média, continuaram perdendo peso por todo o período de experimento restante. A morfologia volumosa da parede intestinal de seu cólon foi caracterizada por inflamação, ulceração e mesmo necrose. O tratamento PB6 3 vezes 1,5 10^8 CFU/kg/dia ou 3 vezes 1,5 10^9 CFU/kg/dia por 7 dias resultou em um status de saúde de parede de cólon que foi estatisticamente idêntico àquele do grupo de controle negativo e àquele do grupo tratado com o medicamento padrão mesalazina, um antiinflamatório.

EXEMPLO 4 - PROPRIEDADES ANTIMICROBIANAS DOS

METABÓLITOS DE PB6

Métodos e Materiais

As propriedades antagonistas do Bacillus PB6 e Bacillus cereus isolados de Bactisubitil (Sanofi - synthelabo) foram testadas contra diferentes cepas indicadoras, p. ex., Clostridium perfringens ATCC13124, C.diffieile ATCC9689 e Campylobacter jejuni ATCC 33291.

Os Bacillus cereus e Bacillus PB6 foram suspensos em 5 ml de solução salina estéril. Usando-se um chumaço uma única estria das suspensões probióticas em placas Tryptone Sou agar (Oxoid, Bélgica) foi feita e as placas foram incubadas a 37 °C por 24 horas em condições aeróbicas.

Em seguida, uma suspensão das diferentes cepas indicadoras foi inoculada perpendicularmente em ambas as culturas de Bacillus com um chumaço e incubadas por 24 horas em condições aeróbicas. As placas inoculadas com Clostridium perfringens foram incubadas por 24 horas, as placas inoculadas com C.diffieile foram incubadas por 48 horas em condições anaeróbicas, usando-se Anaerogen Pak (Oxoid, Bélgica). Uma suspensão de uma cultura de C. jejuni ATCC33291 de 48 horas foi usada para preparar 4 estrias perpendicularmente às culturas probióticas. As placas inoculadas com Campylobaeter speeies foram incubadas em condições micro-aeróbicas (CampyGen, Oxoid) a 37 °C por 48 horas. As linhas de estria não devem se tocar. Em seguida à incubação a 37 °C, efeitos antagonistas foram avaliados pela aparência das zonas transparentes circundando as junções das linhas de estria, indicando o efeito inibitório do organismo em relação ao outro. Resultados e Exame

PB6 tinha um efeito antagonista contra Clostridium perfringens ATCCl3124 e C.difficile ATCC9689. Uma zona transparente pôde ser observada mas interseções das linhas de estria da placa para ambas as espécies. O efeito antagonista contra Clostridium perfringens é claramente visível devido às características hemolíticas desta espécie. Um exemplo é representado na Fig. 1. Embora não tão claro nesta imagem, uma zona transparente significativa na interseção das culturas de PB6 e C.difficile foi também observada.

O Bacillus cereus (Bactisubtil) não teve nenhum efeito antagonista contra C. perfringens ATCC13124 e C.difficile ATCC9689. Nenhuma zona transparente pôde ser observada nas interseções das linhas de estria sobre a placa. Um exemplo da placa de teste é representado na Fig. 12.

Bacillus PB6 teve um efeito antagonista contra C. jejum ATCC 33291. Zonas transparentes podem ser observadas nas interseções das linhas de estria sobre a placa. Um exemplo da placa de teste é representado na Fig. 13.

O Bacillus cereus (Bactisubtil) não teve nenhum efeito antagonista contra C.jejuni, como pode ser observado na Fig. 14. Conclusão

O Bacillus PB6 isolado da natureza, claramente tem fortes propriedades antagonistas em relação a C. perfringens ATCCl3124, C.difficile ATCC9689 e C.jejuni ATCC 33291. Ao contrário, nenhum efeito pôde ser observado para outras bactérias patogênicas humanas testadas.

Bacillus cereus (Bactisubtil) não apresentou qualquer efeito antagonista em relação a C. perfringens ATCC13124, C.difficile ATCC9689 e outros microorganismos testados.

Células viáveis da cepa PB6 foram depositadas na American Type Culture Collection ("ATCC"), 10801 University Blvd. Manassas, Va. 20110-2209, U.S.A., em 27 de maio de 2005, foi-lhes atribuído o número de acesso PTA-6737. O depósito foi feito de acordo com 37 C.F.R. 1.801 - 1.809.

A descrição precedente e os desenhos compreendem formas de realização ilustrativas da presente invenção. As formas de realização precedente e os métodos descritos aqui podem variar com base na capacidade, experiência e preferência daqueles hábeis na técnica. Meramente listar as etapas do método em uma certa ordem não constitui qualquer limitação da ordem das etapas do método. A descrição precedente e os desenhos meramente explicam e ilustram a invenção e a invenção não é limitada a eles, exceto na medida em que as reivindicações forem assim limitadas. Aqueles hábeis na técnica que tenham a descrição perante eles serão capazes de fazer modificações e variações nela sem desvio do escopo da invenção.

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53Sharma A.K., Holder F.E. 1998. Clostridium difficile diarrhea after use of tacrolimus following renal transplantation. Clin. Infect. Dis. 27: 1540-1541.

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57Tannock G. W. 1999. Probiotics: A criticai review. Horizon Scientific Press.

58Kim, K. et al. Suppression of inflammatory responses by surfactin, a selective inhibitor of platelet cytosolic phospholipase A2. Biochem. Pharmacol. 1998; 55: 975 - 985. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> Kemin industries, inc.

<120> KEM 121

<130> Kemin / p: kem 121

<150> US 60/740,518 <151> 2005-11-29

<160> 3

<170> PatentIn versão 3.3

<210> 1 <211> 1448 <212> DNA

<213> Bacillus subtilis <400> 1

aaaggttacc tcaccgactt cgggtgttac aaactctcgt ggtgtgacgg gcggtgtgta 60

caaggcccgg gaacgtattc accgcggcat gctgatccgc gattactagc gattccagct 120

tcacgcagtc gagttgcaga ctgcgatccg aactgagaac agatttgtgg gattggctta 180

acctcgcggt ttcgctgccc tttgttctgt ccattgtagc acgtgtgtag cccaggtcat 240

aaggggcatg atgatttgac gtcatcccca ccttcctccg gtttgtcacc ggcagtcacc 300

ttagagtgcc caactgaatg ctggcaacta agatcaaggg ttgcgctcgt tgcgggactt 360

aacccaacat ctcacgacac gagctgacga caaccatgca ccacctgtca ctctgccccc 420

gaaggggacg tcctatctct aggattgtca gaggatgtca agacctggta aggttcttcg 480

cgttgcttcg aattaaacca catgctccac cgcttatgcg gacccccgtc aattcctttg 540

agtttcagtc ttgcgaccgt actccccagg cggagtgctt aatgcgttag ctgcagcact 600

aaggggcgga aaccccctaa cacttagcac tcatcgttta cggcgtggac taccagggta 660

tctaatcctg ttcgctcccc acgctttcgc tcctcagcgt cagttacaga ccagagagtc 720

gccttcgcca ctggtgttcc tccacatctc tacgcatttc accgctacac gtggaattcc 780

actctcctct tctgcactca agttccccag tttccaatga ccctccccgg ttgagccggg 840

ggctttcaca tcagacttaa gaaaccgcct gcgagccctt tacgcccaat aattccggac 900

aacgcttgcc acctacgtat taccgcggct gctggcacgt agttagccgt ggctttctgg 960

ttaggtaccg tcaaggtgcc gccctatttg aacggcactt gttcttccct aacaacagag 1020

ctttacgatc cgaaaacctt catcactcac gcggcgttgc tccgtcagac tttcgtccat 1080

tgcggaagat tccctactgc tgcctcccgt aggagtctgg gccgtgtctc agtcccagtg 1140

tggccgatca ccctctcagg tcggctacgc atcgtcgcct tggtgagccg tgacctcacc 1200

aactagctaa tgcgccgcgg gtccatctgt aagtggtagc cgaagccacc ttttatgtct 1260 gaaccatgcg gttcaaacaa ccatccggta ttagccccgg tttcccggag ttatcccagt 1320 cttacaggca ggttacccac gtgttactca cccgtccgcc gctaacatca gggagcaagc 1380 tcccatctgt ccgctcgact tgcatgtatt aggcacgccg ccagcgttcg tcctgagcca 1440 tggatcaa 1448 <210> 2 <211> 1016 <212> DNA <213> Bacillus subtiIis <400> 2 gtcaggaaat gcgtacgtcc ttcctggact atgcaatgag cgttatcgta tcccgggcgc 60 ttccggatgt gcgtgacggt ctgaagccgg ttcacagacg gattttgtac gcaatgaatg 120 atttaggcat gaccagtgac aaaccatata aaaaatctgc ccgtatcgtc ggtgaagtta 180 tcggtaagta ccacccgcac ggtgactcag cggtttacga atcaatggtc agaatggcgc 240 aggattttaa ctaccgctac atgcttgttg acggacacgg caacttcggt tcggttgacg 300 gcgactcagc ggccgcga.tg cgttacacag aagcgagaat gtcaaaaatc gcaatggaaa 360 ttctgcgtga cattacgaaa gacacgattg actatcaaga taactatgac ggttcagaaa 420 gagagcctgc cgtcatgcct tcgagatttc cgaatctgct cgtaaacggg gctgccggta 480 ttgcggtcgg aatggcgaca aacattcccc cgcatcagct tggagaagtc attgaaggcg 540 tgcttgccgt aagtgagaat cctgagatta caaaccagga gctgatggag tacatcccgg 600 gcccggattt tccgactgca ggtcagattt tgggccggag cggcatccgc aaggcgtatg 660 aatccggacg gggatcaatc acaatccggg ctaaggctga aatcgaagag acttcatcgg 720 gaaâagãaaQ aattattgtc acggaacttc nnf v. w wavvavj^ «- naaraaanrn anaf-taattn ?80 aaaaaatcgc ggatcttgtc cgggacaaaa aaatcgaagg aattaccgat ctgcgagacg 840 aatccgaccg taacggaatg agaatcgtca ttgagatccg ccgtgacgcc aatgctcacg I 900 tcattttgaa taacctgtac aaacaaacgg ccctgcagac gtctttcggg atcaacctgc 960 tggcgctcgt tgacggacag ccgaaggtac taagcctgaa gcaatgcctg gagcat 1016 <210> 3 <210> 801 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400> 3 ataaaaaatc tgcccgtatc gtcggrtgaag ttatcggtaa gtaccacccg cacggtgact 60 cagcggttta cgaatcaatg gtcagaatgg cgcaggattt taactaccgc tacatgcttg 120 ttgacggaca cggcaacttc ggttcggttg acggcgactc agcggccgcg atgcgttaca 180 cagaagcgag aatgtcaaaa atcgcaatgg aaattctgcg tgacattacg aaagacacga 240 ttgactatca agataactat gacggttcag aaagagagcc tgccgtcatg ccttcgagat 300 ttccgaatct gctcgtaaac ggggctgccg gtattgcggt cggaatggcg acaaacattc 360 ccccgcatca gcttggagaa gtcattgaag gcgtgcttgc cgtáagtgag aatcctgaga 420 ttacaaacca ggagctgatg gagtacatcc cgggcccgga ttttccgact gcaggtcaga 480 ttttgggccg gagcggcatc cgcaaggcgt atgaatccgg acggggatca atcacaatcc 540 gggctaaggc tgaaatcgaa gagacttcat cgggaaaaga aagaattatt gtcacggaac 600 ttccttatca ggtgaacaaa gcgagattaa ttgaaaaaat cgcggatctt gtccgggaca 660 aaaaaatcga aggaattacc gatctgcgag acgaatccga ccgtaacgga atgagaatcg 720 tcattgagat ccgccgkgac gccaatgctc acgtcatttt gaataacctg tacaamcaaa 780 cggccctgca gaystctttc g 801

Claims (20)

1. Método para a profilaxia de uma condição intestinal, caracterizado pelo fato de que compreende a administração, como um probiótico, de uma quantidade eficaz de bactérias Bacillus, que produz lipopetídeos.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a condição intestinal ser selecionada do grupo consistindo de diarréia associada com antibiótico, diarréias adquirida de Clostridium difficile, doença inflamatória do intestino, doença gastrintestinal.

3. Método para o tratamento de uma condição intestinal, caracterizado pelo fato de compreender a etapa de administrar, como um probiótico, uma quantidade eficaz de bactérias Bacillus, que produz lipopeptídeos.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de a condição intestinal ser selecionada do grupo consistindo de diarréia associada com antibiótico, diarréia adquirida de Clostridium difficile, doença inflamatória do intestino e doença gastrintestinal.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender ainda a administração de uma inulina combinada com as bactérias Bacillus.

6. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de compreender a administração de inulina combinada com as bactérias Bacillus.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender ainda a administração de um probiótico combinado com as bactérias Bacillus.

8. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a administração de um probiótico combinado com as bactérias Bacillus.

9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de as bactérias serem selecionadas do grupo consistindo de Bacillus amyloliquefaciens e Bacillus subtilis.

10. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de as bactérias serem selecionadas do grupo consistindo e Bacillus amyloliquefaciens e Bacillus subtilis.

11. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de as bactérias Bacillus produzirem um composto sinérgico na administração.

12. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de as bactérias Bacillus produzirem um composto sinérgico na administração.

13. Cepa bacteriana isolada, caracterizada pelo fato de que tem a seqüência 16S rRNA da SEQ ID NO: 1.

14. Cepa bacteriana isolada de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de ter pelo menos 90% de homologia com a seqüência 16S rRNA da SEQ ID NO: 1.

15. Cepa bacteriana isolada, caracterizada pelo fato de ter a seqüência gyrA parcial da SEQ ID NO: 2.

16. Cepa bacteriana isolada de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de ter pelo menos 90% de homologia com a seqüência gyrA parcial da SEQ ID NO: 2.

17. Cepa bacteriana isolada, caracterizada pelo fato de ter a seqüência gyrA parcial da SEQ ID NO: 3.

18. Cepa bacteriana isolada de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de ter pelo menos 90% de homologia com a seqüência gyrA parcial da SEQ ID NO: 3.

19. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de as bactérias Bacillus consistirem de bactérias da cepa identificada como cepa ATCC PTA-6737.

20. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de as bactérias Bacillus consistirem de bactérias da cepa identificada como cepa ATCC PTA-6737.