PL207930B1 - Zastosowanie wyizolowanego probiotycznego szczepu bakterii kwasu mlekowego o aktywności probiotycznej, kompozycja pokarmowa i izolowany szczep bakterii kwasu mlekowego - Google Patents

Zastosowanie wyizolowanego probiotycznego szczepu bakterii kwasu mlekowego o aktywności probiotycznej, kompozycja pokarmowa i izolowany szczep bakterii kwasu mlekowego

Info

Publication number
PL207930B1
PL207930B1 PL359182A PL35918201A PL207930B1 PL 207930 B1 PL207930 B1 PL 207930B1 PL 359182 A PL359182 A PL 359182A PL 35918201 A PL35918201 A PL 35918201A PL 207930 B1 PL207930 B1 PL 207930B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
lactobacillus
cncm
composition
strain
dog
Prior art date
Application number
PL359182A
Other languages
English (en)
Other versions
PL359182A1 (pl
Inventor
Roberto Reniero
Jalil Benyacoub
Virginie Rousseau
Original Assignee
Nestle Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nestle Sa filed Critical Nestle Sa
Publication of PL359182A1 publication Critical patent/PL359182A1/pl
Publication of PL207930B1 publication Critical patent/PL207930B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K10/00—Animal feeding-stuffs
    • A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
    • A23K10/16—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions
    • A23K10/18—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions of live microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
    • A23K50/40—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for carnivorous animals, e.g. cats or dogs
    • A23K50/42—Dry feed
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
    • A23K50/40—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for carnivorous animals, e.g. cats or dogs
    • A23K50/48—Moist feed
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A61K35/745—Bifidobacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A61K35/747—Lactobacilli, e.g. L. acidophilus or L. brevis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus
    • C12R2001/23—Lactobacillus acidophilus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/46—Streptococcus ; Enterococcus; Lactococcus
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S426/00—Food or edible material: processes, compositions, and products
    • Y10S426/805—Pet food for dog, cat, bird, or fish

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Fodder In General (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie wyizolowanego szczepu bakterii kwasu mlekowego o aktywności probiotycznej, kompozycja pokarmowa i izolowany szczep bakterii kwasu mlekowego.
Niniejszy wynalazek dotyczy zastosowania nowych bakterii kwasu mlekowego rodzaju Lactobacillus, Bifidobacterium i Streptococcus (Enterococcus), do wytwarzania kompozycji dla domowych zwierząt poprawiającej ich stan zdrowia, oraz kompozycji je zawierających. Niniejszy wynalazek dotyczy również nowych mikroorganizmów z rodzaju Lactobacillus które wyizolowano i wyselekcjonowano ze względu na ich probiotyczny potencjał.
Dobre samopoczucie zwierząt domowych jest ściśle związane z ich odżywianiem.
W wyniku prawidłowego odżywiania uzyskuje się sprawność fizyczną i zdrowie zwierząt.
Skład pożywienia oprócz dostarczania wartości odżywczych, dodatkowo wpływa na równowagę mikroflory jelitowej i może prowadzić do/lub zapobiegać zaburzeniom żołądkowo-jelitowym. Zatem, wiedza na temat przewodu pokarmowego i procesów trawiennych u zdrowych zwierząt jest nieodłączna dla zrozumienia praktycznych sposobów karmienia. Koty i psy, jako zwierzęta mięsożerne, charakteryzują się krótkim przewodem trawiennym i szybkim przepływem przełkniętego pożywienia.
Spośród składników mikroflory żołądkowo-jelitowej kotów i psów można odzyskać Bacteroides sp., Clostridium sp., Enterobacteriaceae, Bifidobacterium sp., Lactobacillus sp., Streptococcus sp., Staphylococcus sp. i drożdże.
Ilość i skład tej endogennej flory dąży raczej do stabilności, chociaż wiek i w mniejszym stopniu pokarm mogą ją modyfikować. Kwasowość żołądkowa, żółć, perystaltyka jelitowa i odporność miejscowa są czynnikami uważanymi za ważne w regulowaniu flory bakteryjnej w jelicie cienkim u człowieka i różnych innych ssaków.
Psie i kocie zaburzenia żołądkowo-jelitowe są często połączone z przerostem bakteryjnym i produkcją enterotoksyn wytwarzanych przez patogenne bakterie.
Podczas ostatnich kilku lat badania naukowe skupiały się na niektórych wartościowych szczepach bakterii kwasu mlekowego i ich potencjalnym zastosowaniu, jako czynników probiotycznych. Probiotyki są brane pod uwagę jako zdolne do życia drobnoustrojowe preparaty, które poprawiają zdrowie ssaków przez ochronę ich naturalnej mikroflory w jelicie. Probiotyki uważa się za zdolne do przylegania do śluzówki jelita, kolonizowania przewodu jelitowego i przez to zapobiegania przywieraniu do niego szkodliwych mikroorganizmów. Podstawowy dla ich działania warunek polega na tym, że muszą one osiągnąć śluzówkę jelita we właściwej, zdolnej do życia postaci i nie ulegać zniszczeniu, przede wszystkim, pod wpływem niskiego pH panującego w żołądku. W szczególności, fizjologia przewodu trawiennego kotów i psów różni się od ludzkiej. Na przykład, przeciętne pH w żołądku psów wynosi około 3,4, a kotów 4,2.
Chociaż w opisie patentowym USA nr 5968569 ujawniono zawartość probiotycznych mikroorganizmów w zbożowym pożywieniu domowych zwierząt, to ani ten opis ani cała pozostała dostępna wiedza nie dostarczają informacji dotyczących szczepów szczególnie przeznaczonych dla zdrowia domowych zwierząt.
Dlatego też, istnieje potrzeba dostarczenia nowych bakteryjnych szczepów, które są szczególnie przystosowane do zwierząt domowych, i które wyselekcjonowano ze względu na ich wysoce probiotyczne właściwości korzystne dla zdrowia tych zwierząt i włączenia tych szczepów do kompozycji pokarmowych dla zwierząt.
Niniejszy wynalazek dotyczy zastosowania wyizolowanego probiotycznego szczepu bakterii kwasu mlekowego wybranego z rodzajów Lactobacillus, Bifidobacterium lub Enterococcus do wytwarzania kompozycji przeznaczonej do poprawy stanu zdrowia lub utrzymania w dobrym stanie zdrowia psa i kota, w tym ich układu pokarmowego, skóry, sierści, zębów, kości i układu odpornościowego.
Korzystnie szczep ma zdolność do wzrostu produkując przynajmniej 1,0E+06 cfu/ml w obecności do 2% soli żółci.
Korzystnie szczep ma zdolność do wytwarzania co najmniej 1,0E+06 cfu/ml po 2 godzinach przy zakresie pH 3,4 do 4,2.
Korzystnie szczep jest wybrany z grupy składającej się z Lactobacillus reuteri, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus animalis, Lactobacillus ruminis, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus fermentum, Bifidobacterium sp. Enterococcus faecium, Enterococcus sp, korzystniej szczep jest Lactobacillus reuteri NCC2581 (CNCM I-2448), Lactobacillus reuteri NCC2592 (CNCM I-2450), Lactobacillus rhamnosus NCC2583 (CNCM I-2449),
PL 207 930 B1
Lactobacillus reuteri NCC2603 (CNCM I-2451), Lactobacillus reuteri NCC2613 (CNCM I-2452, Lactobacillus acidophilus NCC2628 (CNCM I-2453) lub Enterococcus faecium SF 68 (NCIMB 10415).
Korzystnie szczep jest zawarty w kompozycji w ilości od 1,0E±04 cfu/zwierzę i dzień do 1,0 E±12 cfu/zwierzę i dzień, a kompozycja jest przeznaczona do leczenia i/lub profilaktyki zaburzeń związanych z kolonizacją przewodu pokarmowego kotów i/lub psów przez patogenne mikroorganizmy, a zwłaszcza szczepy Salmonella typhimurium, Escherichia coli, Schigella dysenteriaea lub inne patogenne enterobakterie kolonizujące koty i/lub psy lub pasożyty, takie jak glisty (Toxocara spp.), pierwotniaki (Cryptosporidium spp., Glardia spp., Pentatrichomonas hominis, Entamoeba histolytica, Toxoplasma gonidii) lub drożdże.
Korzystnie kompozycja jest przeznaczona do regulacji układu odpornościowego kota lub psa, a bardziej korzystnie kompozycja jest przeznaczona do leczenia zaburzeń immunologicznych, takich jak alergia lub choroba zapalna jelit.
Korzystnie kompozycja jest również przeznaczona do utrzymania lub poprawy stanu zdrowia skóry i/lub sierści kotów lub psów.
Korzystnie kompozycja jest przeznaczona do łagodzenia lub zmniejszania objawów starzenia się kota lub psa.
W zakres wynalazku wchodzi również kompozycja pokarmowa dla zwierząt domowych zawierająca przynajmniej jeden wyizolowany szczep bakterii kwasu mlekowego wybrany z grupy składającej się z Lactobacillus animals, Lactobacillus ruminie, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus reuteri NCC2581 (CNCM I-2448), Lactobacillus reuteri NCC2592 (CNCM2592 (CNCM I-2450), Lactobacillus rhamnosus NCC2583 (CNCM I-2449), Lactobacillus reuteri NCC2603 (CNCM I-2451), Lactobacillus reutheri NCC2613 (CNCM I-2452) i Lactobacillus acidophilus NCC2628 (CNCM I-2453 związany z nadającym się do spożycia nośnikiem.
Korzystnie kompozycja zachowuje lub poprawia funkcje układu pokarmowego kota lub psa lub zachowuje lub poprawia stan zdrowia skóry i/lub sierści kota lub psa.
Korzystnie kompozycja reguluje układ odpornościowy kota lub psa.
Korzystnie kompozycja łagodzi lub zmniejsza objawy starzenia się kota lub psa.
Korzystnie w kompozycji wyizolowany szczep jest w ilości od około 1,0E+04 cfu/zwierzę i dzień do 1,0E+12cfu/zwierzę i dzień.
Korzystnie kompozycja dodatkowo zawiera prebiotyk.
Korzystnie kompozycja występuje w postaci:
i) kompletnego odżywczo pokarmu dla domowych zwierząt w sproszkowanej, suchej lub wilgotnej postaci, schłodzonej lub nadającej się do przechowywania lub, ii) w postaci dietetycznego dodatku lub suplementu.
Ponadto wynalazek dotyczy izolowanego szczepu bakterii kwasu mlekowego, który jest wybrany z grupy składającej się z Lactobacillus reuteri NCC2581 (CNCM I-2448), Lactobacillus reuteri NCC2592 (CNCM I-2450), Lactobacillus rhamnosus NCC2583 (CNCM I-2449), Lactobacillus reuteri NCC2603 (CNCM I-2451), Lactobacillus reuteri NCC2613 (CNCM I-2452) i Lactobacillus acidophilus NCC2628 (CNCM I-2453).
Jeśli tylko kontekst jasno nie wskazuje inaczej, odnoszenie się do „szczepu powinno być rozumiane, jako obejmujące supernatant z jego hodowli i /lub jego metabolit.
Przez określenie „regulowanie odpowiedzi odpornościowej rozumie się, że szczepy bakteryjne opisane powyżej mają zdolności do stymulowania pewnych funkcji odpornościowych ważnych dla zdrowia zwierząt albo modulowania innych odpornościowych funkcji, które potencjalnie mogłyby mieć znaczenie dla zaburzeń immunologicznych, takich jak zapalenie, alergia itp. Stymulację lub modulację tych funkcji odpornościowych można osiągnąć przez zastosowanie różnych kombinacji szczepów bakteryjnych opisanych powyżej.
Te wyselekcjonowane mikroorganizmy mają szczególnie korzystny wpływ na przewód pokarmowy zwierząt, na ich skórę i/lub sierść, na ich układ odpornościowy i na efekty starzenia.
Mają one szczególnie korzystny wpływ na zahamowanie rozwoju patogenów jelitowych, takich jak: szczepy Salmonella thyphimurium, Escherichia coli, Shigella dysenteriaea lub innych patogennych enterobakterii zasiedlających zwierzęta lub pasożyty, takie jak pasożyt jelitowy (Toxocara spp.), pierwotniaki (Cryptosporidium spp, Giardia spp., Pentatrichomonas hominis, Enteamoeba histolytica, Toxoplasma gondii) lub drożdże.
W połączeniu z pożywieniem, mikroorganizmy te wywierają szczególnie korzystne probiotyczne działanie na walory smakowe, trawienie i stan zdrowia jelita, funkcje odpornościowe i warunki sanitar4
PL 207 930 B1 ne, te ostatnie przez wkład w zmniejszenie objętości kału i przynajmniej częściowe odwonnienie psiego kału.
Zgodnie z innym wykonaniem wynalazku, kompozycja pokarmowa dla zwierząt domowych zawiera mikroorganizm mający wysoką probiotyczną aktywność dla zwierząt i zdolny do przeżywania i kolonizacji przewodu pokarmowego przyjmujących go zwierząt.
Zgodnie z powyższym, wynalazek dotyczy kompozycji pokarmowej dla zwierząt przeznaczonej do poprawy stanu zdrowia przewodu pokarmowego zwierząt, zawierającej przynajmniej jeden probiotyczny szczep wyizolowany jak opisano powyżej związany z nadającym się do spożycia nośnikiem lub matrycą farmaceutyczną.
W jednej postaci wykonania, nadający się do spożycia nośnik zawiera zrównoważoną pod względem odżywczym kompozycję pokarmową dla zwierząt domowych. Niniejsza kompozycja korzystnie zawiera wystarczającą ilość izolowanego szczepu, skuteczną w dostarczaniu profilaktycznych efektów, gdy kompozycja jest podawana zwierzęciu jako kompletny posiłek.
W następującym opisie, skrót cfu („jednostka tworząca kolonie) oznacza liczbę komórek bakteryjnych, jaką wykazano przez mikrobiologiczne liczenie na płytkach agarowych.
„NCC oznacza Kolekcję Kultur w Nestle (Nestle Research Center, Vers-chez-les-Blanc, Lozanna, Szwajcaria).
laktobacillusów i 18 bifidobakterii wyizolowanych z kałów kotów i psów, przebadano i wyselekcjonowano w odniesieniu do ich technologicznych i fizjologicznych parametrów.
Pierwsze badanie przesiewowe na potencjalnie probiotyczne zastosowania przeprowadzono in vitro (patrz przykład 1 i 2): dotyczyło ono charakterystyki wzrostu, tolerancji na kwasowość żołądkową przy różnych pH i różnych stężeniach soli żółciowych obecnych w dwunastnicy, podobnie jak to ma miejsce u kotów i psów.
Ponadto, dobre przeżycie komórek liofilizowanych w dwóch różnych krioochronnych podłożach było wyraźnie wykazane w 4°C i 20°C, jak pokazano w teście przyspieszonego przechowywania.
Szczepy te mogą charakteryzować się krótkim czasem generacji, dużą ilością bakterii (więcej niż 1,0E+08 cfu/ml) podczas ich fazy stacjonarnej i stabilnością ilości bakterii po 8 i 24 godzinach po inokulacji, odpornością na liofilizację, po której następują różne warunki przechowywania, odpornością na fizjologiczne stężenie żółci znalezionej w dwunastnicy (2% żółci) i ich niewielkim zahamowaniem w obecności do 4% żółci. Ponadto, aby wyselekcjonować bakterie reprezentatywne dla badanej różnorodności, wzięto pod uwagę wyniki analizy DNA.
Szczepy wpływające na kocie i psie zdrowie były zdolne do wzrostu do przynajmniej 1,0E+ 06 cfu/ml w obecności do 2% soli żółciowych. Szczepy te mogą również rosnąć do przynajmniej 1,0E = 06 cfu/ml po około 2 godzinach w zakresie pH od 3,4 do około 4,2.
Szczepy bakteryjne według wynalazku są wyselekcjonowane z grupy składającej się z Lactobacillus reuteri, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus rhamnosus,.
Następujące szczepy Lactobacillus reuteri NCC2581, Lactobacillus rhamnosus NCC2583, Lactobacillus reuteri NCC2592, Lactobacillus reuteri NCC2603, Lactobacillus reuteri NCC2613 i Lactobacillus acidophilus NCC2628 zdeponowano, jako przykład, zgodnie z Traktatem Budapesztańskim w Narodowych Zbiorach Kultur Mikroorganizmów, 25 rue du docteur Roux, 75724 Paryż, Francja w dniu 19 kwietnia 2000 pod następującymi numerami CNCM I-2448, CNCM I-2449, CNCM I-2450, CNCM I-2451, CNCM I-2452 i CNCM I-2453 odpowiednio.
Wszelkie ograniczenia dotyczące dostępności tych depozytów będą wycofane po pierwszej publikacji niniejszego zgłoszenia lub innego zgłoszenia, korzystającego z pierwszeństwa niniejszego zgłoszenia.
Biochemiczna charakterystyka wybranych szczepów Lactobacillus reuteri CNCM 1-2448
- Gram-dodatni mikroorganizm, nieruchliwy, niezarodnikujący,
- dość grube małe pałeczki
- mikroaerofliny mikroorganizm z hetero fermentacyjnym metabolizmem, produkcja L(+) i D(-) kwasu mlekowego
- katalaza (-), produkcja CO2 z glukozy, hydroliza argininy, =produkcja NH3
- wzrost w 5% i 10% NaCl
- fermentacja cukrów: L-arabinozy, galaktozy, D-glukozy, laktozy, sacharozy, D-rafinozy
Lactobacillus rhamnosus CNCM 1-2449
- Gram-dodatni mikroorganizm, nieruchliwy, niezarodnikujący,
- dość grube małe pałeczki
PL 207 930 B1
- mikroaerofliny mikroorganizm z hetero fermentacyjnym metabolizmem, produkcja L(+) kwasu mlekowego
- katalaza (-),
- fermentacja wszystkich cukrów typowych dla Lb. rhamnosus
Lactobacillus reuteri CNCM 1-2450
Gram-dodatni mikroorganizm, nieruchliwy, niezarodnikujący,
- dość grube małe pałeczki
- mikroaerofilny mikroorganizm z heterofermentacyjnym metabolizmem, produkcja L(+) i D(-) kwasu mlekowego
- katalaza (-), produkcja CO2 z glukozy, hydroliza argininy, = produkcja NH3
- wzrost w 5% i 10% NaCl
- fermentacja cukrów: L-arabinozy, galaktozy, D-glukozy, D-ksylozy, laktozy, sacharozy, D-rafinozy
Lactobacillus reuteri CNCM 1-2451
Gram-dodatni mikroorganizm, nieruchliwy, niezarodnikujący
- dość grube małe pałeczki
- mikroaerofilny mikroorganizm z hetero fermentacyjnym metabolizmem, produkcja L(+) i D(-) kwasu mlekowego
- katalaza (-), produkcja CO2 z glukozy, hydroliza argininy = produkcja NH3
- wzrost w 5% i 10% NaCl
- fermentacja wszystkich cukrów typowych dla Lb. reuteri Lactobacillus reuteri CNCM I-2452
- Gram-dodatni mikroorganizm, nieruchliwy, niezarodnikujący,
- dość grube małe pałeczki
- mikroaerofilny mikroorganizm z heterofermentacyjnym metabolizmem, produkcja L(+) i D(-) kwasu mlekowego
- katalaza (-), produkcja CO2 z glukozy, hydroliza argininy, =produkcja NH3
- wzrost w 5% i 10% NaCl
- fermentacja cukrów: L-arabinozy, D-glukozy, laktozy, sacharozy, D-rafinozy
Lactobacillus reuteri CNCM 1-2453
Gram-dodatni mikroorganizm, nieruchliwy, niezarodnikujący
- dość grube małe pałeczki
- mikroaerofilny mikroorganizm z heterofermentacyjnym metabolizmem, produkcja L(+) i D(-) kwasu mlekowego
- katalaza (-),
- fermentacja cukrów; D-glukozy, laktozy, sacharozy, D-rafinozy
Trzy laktobacillusy wyizolowane od kotów (NCC2581, NCC2592, NCC2583), trzy laktobacillusy wyizolowane od psów (NCC2603, NCC2613, NCC2628), jedną bifidobakterię od kotów (NCC2627) i jedną bifidobakterię od psów (NCC2657) testowano dalej na ich aktywność potencjału probiotycznego na zwierzętach domowych (patrz przykład 3 i 4).
Szczepy bakteryjne mogą być stosowane w postaci zdolnej do życia, postaci inaktywowanej, jako supernatant z ich hodowli lub frakcji np. ścian komórkowych, peptydoglikanu, cytoplazmy, oczyszczonych białek, funkcjonalnych metabolitów, cząsteczek bioaktywnych.
Korzystnie stosowane są w ilości od około 1,0E+04 cfu/g do około 1,0E+11cfu/g, korzystniej od 1,0E+05 cfu/g do około 1,0E+10 cfu/g, najbardziej korzystnie od 1,0E+06 cfu/g do około 1,0E+09 cfu/g.
W korzystnym wykonaniu mogą być stosowane jako dodatki dietetyczne w celu poprawienia jakości pożywienia dla zwierząt i mogą być dodawane w ilości od około 1,0E+04 cfu/g do około 1,0E+11 cfu/g. Jako dodatki dietetyczne mogą być w postaci suchej bądź uwodnionej, zakapsułkowane, lub podawane w formie proszku, i pakowane w połączeniu z głównym pokarmem, bądź osobno. Dla przykładu, proszek zawierający wyselekcjonowane mikroorganizmy według wynalazku lub komponenty lub reszty supernatantów z ich hodowli lub wyselekcjonowane metabolity, może być pakowany w saszetki w postaci sproszkowanej lub do żelu, lub lipidu, lub innego odpowiedniego nośnika. Te oddzielnie pakowane porcje mogą być podawane razem z głównym posiłkiem lub w wieloporcjowych opakowaniach do stosowania z głównym posiłkiem lub przekąską, zgodnie z instrukcją użytkownika. W innym przykładzie, probiotyczne szczepy mogą być dostarczane w wielokomorowych opakowaniach razem z drugim spożywanym składnikiem, na przykład, jako mieszanka mokrej lub średnio wilgotnej zbrylonej karmy lub stała porcja suchych granulek w elastycznej torbie. Pierwsza komora w torbie powinna zawierać szczep probiotyku, a druga, oddzielnie uszczelniona komora, drugi składnik jadalny.
PL 207 930 B1
Te wyselekcjonowane mikroorganizmy mają szczególnie korzystny wpływ na domowe zwierzęta, na ich przewód pokarmowy, na ich skórę i/lub sierść, na ich układ odpornościowy, stan zdrowia jamy gębowej i zębów, na ich kości i na proces starzenia.
Stwierdzono również, że poprawiają one smak pożywienia, trawienie, funkcje odpornościowe i stan sanitarny zwierzęcia (zmniejszają ilości fekaliów i częściowo odwadniają psi kał).
Niniejszy wynalazek dotyczy także kompozycji pokarmowej dla zwierząt poprawiającej lub podtrzymującej stan zdrowia zwierząt, zawierającej przynajmniej jeden probiotyczny szczep mający powyższe cechy połączone z nadającym się do spożycia nośnikiem lub matrycą farmaceutyczną.
Co najmniej jeden szczep bakteryjny mający powyższe cechy i/lub supernatant z jego hodowli, lub jego frakcji, i/lub jego metabolitów, może być podawany zwierzęciu jako uzupełnienie jego normalnej diety, lub jako składnik pełnego pod względem odżywczym pokarmu dla zwierząt.
Pełne pod względem odżywczym kompozycje pokarmowe dla zwierząt według wynalazku mogą być w sproszkowanej, wysuszonej postaci lub w postaci wilgotnego, chłodzonego i nadającego się do składowania produktu żywnościowego dla zwierząt. Te pokarmy dla zwierząt mogą być wytwarzane w sposób znany w stanie techniki pod warunkiem, że w przypadku gdy wymagana jest aktywność mikroorganizmów dokłada się szczególnej staranności dla zabezpieczenia ich przeżywalności. Oprócz szczepów bakteryjnych i/lub ich sfermentowanego podłoża, te zwierzęce pokarmy mogą zawierać jakiekolwiek jedno lub więcej źródło skrobi, źródło białka i źródło tłuszczu.
Odpowiednimi źródłami skrobi są, na przykład, zboża i rośliny strączkowe, takie jak kukurydza, ryż, pszenica, jęczmień, owies, soja i ich mieszanki.
Odpowiednie źródła białka mogą być wybrane z dowolnego odpowiedniego zwierzęcego lub warzywnego źródła białka, na przykład, mięsa i mąki, mączki drobiowej, mączki rybnej, białkowych koncentratów soi, białek mleka, glutenu itp. Dla starszych zwierząt zaleca się, aby źródło białka zawierało białka wysokiej jakości.
Odpowiednie źródła lipidów zawierają mięsa, tłuszcze zwierzęce i tłuszcze roślinne.
Wybór źródeł skrobi, białka i lipidów będzie w dużym stopniu określony przez pokarmowe potrzeby zwierzęcia, preferencje smakowe i typ zastosowanych produktów. Dla starszych zwierząt, pokarm zawiera proporcjonalnie mniej tłuszczu niż karma dla młodszych zwierząt. Co więcej, źródła skrobi mogą obejmować ryż, jęczmień, pszenicę i kukurydzę, pojedynczo lub razem.
Dodatkowo, różne inne składniki, na przykład, cukier, sól, przyprawy korzenne, przyprawy, witaminy, minerały, substancje zapachowe, tłuszcze itp. mogą być także dodawane do pokarmu zwierzęcego zgodnie z potrzebami.
Dla suchych pokarmów zwierzęcych odpowiednim procesem jest wytłaczanie, chociaż pieczenie i inne odpowiednie sposoby mogą być również zastosowane. Podczas wytłaczania sucha karma dla zwierząt domowych jest dostarczana w postaci śruty. Przy zastosowaniu prebiotycznego węglowodanu, prebiotyk przed przetwarzaniem może być zmieszany z innymi składnikami suchej karmy. Odpowiedni proces opisano w europejskim zgłoszeniu patentowym nr 0850569. Jeśli probiotyczny mikroorganizm jest stosowany i w produkcie końcowym wymagana jest jego aktywność, najlepiej gdy organizm ten jest otoczkowany lub wkładany do suchej karmy dla zwierząt. Odpowiedni proces jest opisany w europejskim zgłoszeniu patentowym nr 0862863. Gdy przeżycie mikroorganizmów nie jest wymagane, mogą one być dodane do mieszaniny przed wytłaczaniem, podobnie jak supernatant z ich hodowli lub metabolit, jeśli jest to celowe.
Dla mokrej karmy, procesy opisane w opisach patentowych USA nr 4,781,939 i 5,132,137 mogą być wykorzystane do wytwarzania naśladujących mięso produktów. Inne procedury dla wytwarzania produktów w formie brykietów mogą być również stosowane; na przykład, gotowanie w piecyku parowym. Alternatywnie, produkty w kształcie bochenka mogą być wytwarzane przez emulgowanie odpowiedniego materiału mięsnego w celu wytworzenia emulsji mięsnej, z dodatkiem odpowiedniego czynnika żelującego, i podgrzewanie mięsnej emulsji przed napełnieniem puszek lub innych pojemników. W przypadku wytwarzania suchej karmy dla zwierząt, gdzie przeżycie wybranych probiotycznych gatunków nie jest istotne, mogą one być dodawane do mieszanki pokarmowej przed gotowaniem lub ogrzewaniem, lub podczas jakiegokolwiek stosownego lub wygodnego etapu w procesie wytwarzania. Ilość probiotyku w pokarmie dla zwierząt domowych jest korzystnie mniejsza niż około 20% wagowych i dodatkowo, korzystnie mniejsza niż około 10% wagowych. Przykładowo probiotyk może obejmować od około 0,1% do około 5% wagowych pokarmu dla zwierząt. Do pokarmów zwierzęcych, w których zastosowano cykorię jako probiotyk, cykoria może być włączona w ilości od około 0,5% do 10% wagowych mieszanki pokarmowej; bardziej korzystnie od około 1% do około 5% wagowych.
PL 207 930 B1
Pokarmy dla zwierząt domowych mogą zawierać inne aktywne czynniki, takie jak długołańcuchowe kwasy tłuszczowe. Odpowiednie długołańcuchowe kwasy tłuszczowe zawierają kwas alfalinolowy, gamma linolowy, kwas linolowy, kwas eikozapentanowy, i kwas dokozaheksanowy. Oleje z ryb są odpowiednim źródłem kwasu eikozapentanowego, i dokozaheksanowego. Olej z ogórecznika, olej z nasion czarnej porzeczki i olej z wiesiołka dwuletniego są odpowiednim źródłem kwasu gammalinolowego. Olej z szafranu łąkowego, olej ze słonecznika, olej z kukurydzy i olej sojowy są odpowiednimi źródłami kwasu linolowego.
Jeśli potrzeba, pokarmy dla zwierząt uzupełnia się minerałami i witaminami, dlatego są one kompletne pod względem odżywczym.
Co więcej, jeżeli trzeba szczep bakteryjny może być zakapsułkowany, na przykład, w matrycy z cukru, tłuszczu lub polisacharydu. Może być także powleczony jak opisano w EP 862 863.
Nowy probiotyczny szczep korzystnie stosuje się w taki sposób, aby karma dla zwierząt zawierała około 1,0E+0,4 do około 1,0E+10 komórek probiotycznego mikroorganizmu na gram karmy zwierzęcej; bardziej korzystnie około 1,0E+06 do około 1,0E+08 komórek probiotycznego mikroorganizmu na gram. Pokarm dla zwierząt może zawierać od około 0,005% do około 10% wagowych mieszanki probiotycznego mikroorganizmu. Korzystnie zawiera on około 0,02% do około 6% wagowych, najbardziej korzystnie około 1% do około 6% wagowych. Ilość pokarmu do spożycia przez zwierzę w celu uzyskania korzystnego efektu będzie zależała od wielkości zwierzęcia, jego typu i wieku. Jednakże, ilość pokarmu dla dostarczenia dziennej ilości około 1,0E+03-1,0E+14 cfu co najmniej jednego szczepu bakterii kwasu mlekowego i/lub równoważnej pożywki fermentacyjnej byłaby zazwyczaj odpowiednia. Korzystnie około 1,0E+09 do 1,0E+11 cfu/dzień podaje się psom lub 1,0E+07 do 1,0E+10 cfu/dzień kotom.
Kompozycja według wynalazku ma wysoką probiotyczną aktywność i/lub jest postrzegana jako szczególnie skuteczna dla poprawy stanu zdrowia zwierząt domowych i/lub utrzymania funkcji trawiennych zwierząt w stanie zdrowia, poprawy i utrzymania przewodu pokarmowego, skóry i/lub sierści, i/lub układu odpornościowego. Kompozycja ta ma także korzystny wpływ na proces starzenia psów i kotów.
Poniższe przykłady ilustrują niniejszy wynalazek bez ograniczenia jego zakresu. Przykłady są poprzedzone krótkim opisem figur rysunku.
Figury
Figura 1: Proliferacja limfocytów jednojądrzastych komórek psiej krwi obwodowej (PMBC) pod wpływem stymulacji mitogenami lub estrami forbolu. PMBC od dorosłych psów karmionych przez 4 tygodnie z (Czarne słupki) lub bez (Białe słupki) L. acidophilus NCC2628 stymulowano różnymi mitogenami w dawkach (pg/ml) wskazanych na wykresie. Mitogenami są PHA (fitohemaglutynina,) ConA (konkawalina A), PWM (mitogen szkarłatki) i ester forbolu są to PMA/iono (Octan mirystylowy forbolu i jonomycyna). *=P<0.05, t-Test Studenta
Figura 2: Cytokiny produkowane przez psie leukocyty stymulowano różnymi szczepami probiotyków. Leukocyty od normalnego dorosłego psa stymulowano przez 18 godzin różnymi szczepami laktobacillusów wyizolowanych od zwierząt. Kultury kontrolne zawierały samą pożywkę (kontrola ujemna) lub izolaty ludzkich laktobacillusów STU (kontrola dodatnia). Identyfikacji cytokin dokonano przez RT-PCR. Ich określenie ilościowe przeprowadzono przez skanowanie barwionych bromkiem etydyny żeli agarozowych i określanie odpowiednim pikselem każdego prążka z zastosowaniem przetwarzania obrazu NIH Image software. Wyniki są wyrażone w dowolnych jednostkach, jako średnie z dwóch niezależnych eksperymentów (A) IL-12, (B) IL-10, (C) IFNy, (D) TGF3.
P r z y k ł a d y
P r z y k ł a d 1: Szczepy i warunki kultury
Liczne szczepy (z Kolekcji Kultur w Nestle = NCC) przeszukiwano pod kątem ich potencjalnego probiotycznego zastosowania u kotów i psów. W szczególności oceniono 20 laktobacillusów i 18 bifidobakterii wyizolowanych z kałów kotów i psów ze względu na ich potencjały wzrostowe, odporność na liofilizację z późniejszym przechowywaniem, tolerancję na kwasowość żołądkową i różne stężenia soli żółciowych występujących w przewodzie pokarmowym tych zwierząt, wyniki przedstawiono w tabeli 1.
PL 207 930 B1
T a b e l a 1:
Kody i charakterystyki bakterii wyselekcjonowanych do badań Laktobacillusy:
Kod NCC Kod CNCM Kod Pochodzenie gatunkowe zwierząt Typ przyjmowanej diety NH3 z argininy Kwas mlekowy Identyfikowane z API50CH
2578 LB1-1 Kot Mieszana L L. animalis/ruminis
2581 I-2448 LB-2 Kot Mieszana + D/L L. reuteri
2583 I-2449 LK1-1 Kot Mieszana - D/L L. rhamnosus
2586 LK1-2 Kot Mieszana + D/L L. reuteri
2590 LH2-1 Kot Sucha D/L L. acidophilus
2592 I-2450 LR1-1 Kot Mieszana + D/L L. reuteri
2594 - LS1-1 Kot Mieszana L L. animalis/ruminis
2597 - LA2-5 Pies Mokra L L. animalis
2600 - LC2-5 Pies Mokra D/L L. fermentum/reuteri
2603 I-2451 LE2-5 Pies Mokra L L. reuteri
2606 LF2-6 Pies Sucha + D/L L. reuteri
2609 LH2-6 Pies Sucha + D/L L. reuteri
2613 I-2452 LH2-7 Pies Sucha + D/L L. reuteri
2616 L1-1-1 Pies Mieszana + D/L L. reuteri/ferment tum
2619 L1-1-2 Pies Mieszana D/L L. acidophilus
2621 L3-1-2 Pies Mieszana L L. animals/ruminis
2625 L7-1-3 Pies Mieszana L L. animals/ruminis
2628 I-2453 LA1-5 Pies Mieszana D/L L. acidophilus
2632 LA1-6 Pies Mieszana + D/L L. reuteri/fermentum
2536 LB1-5 Pies Mieszana L L. animalis/ruminis
Bifidobakterie:
Kod NCC Kod Pochodzenie gatunkowe zwierząt Typ przyjmowanej diety Identyfikowane z API50CH
1 2 3 4 5
2623 CO2-5 Kot Sucha Bifidobacterium
2627 CG2-5 Kot Sucha Bif. adolescentis
2630 CH2-5 Kot Sucha Bif. adolescentis
2633 CE3-1 Kot Sucha Bif. adolescentis
2635 CC1-5 Kot Mieszana Bif. longum/suis
2637 CE4-1 Kot Sucha Bif. adolescentis
2640 CB3-5 Kot Sucha Bif. adolescentis
2643 CJ2-6 Kot Sucha Bif. adolescentis
2647 D5-3-5 Pies Mokra Bif. adolescentis
2651 D8-3-6 Pies Sucha Bif. animalis/lactis
2654 D9-3-7 Pies Sucha Bif. animalis/lactis
PL 207 930 B1 cd. tabeli
1 2 3 4 5
2657 D6-3-6 Pies Sucha Bifidobacterium
2660 D7-3-5 Pies Sucha Bifidobacterium
2663 DB3-1 Pies Sucha Bifidobacterium
2667 DC3-1 Pies Sucha Bifidobacterium
2671 DA1-3 Pies Mieszana Bif. animalis/lactis
2674 DA3-1 Pies Sucha Bifidobacterium
2677 5DD3-1 Pies Sucha Bif. adolescentis
Wszystkie 20 laktobacillusów i 18 bifidobakterii wyizolowano od kotów i psów trzymanych na różnych dietach, jak pokazano w tabeli 1. Początkową identyfikację określono za pomocą cech morfologicznych i fizjologicznych. Posłużono się systemami API-50CH i Rapid-ID32A (BioMerieux) odpowiednio dla laktobacillusów i bifidobakterii. Czyste szczepy zamrożono i zdeponowano w temperaturze -80°C w Nestec Culture Collection (NCC)
Wszystkie bakterie do testów hodowano w pożywce bulionowej. Próbkę każdego reaktywowanego szczepu przechowywano w temperaturze -80°C w 1 ml pożywki krioochronnej (40% glicerolu+60%LL). Kultury utrzymywano przez prowadzenie subkultury na słabo zasadowym 1% inokulum w 10 ml pożywki wzrostowej i w warunkach beztlenowej inkubacji w 37°C.
Laktobacillusy hodowano w pożywce MRS przez 18 godzin. Bifidobakterię hodowano albo w podłożu MRS+0,05% (wag./obj.) chlorowodorku L-cysteiny (MRS-C) przez 32 godziny lub w pożywce BHI+ 0,05% chlorowodorku L-cysteiny (BHI-C) przez 48 godzin rozpoczynając od 5% inokulum.
Między różnymi pasażami wszystkie kultury przechowywano w +4°C. Beztlenowość uzyskiwano stosując głównie układ wodór - ditlenek węgla (GasPak, Becton Dickinson, USA). Bifidobakterię podczas przechowywania były zawsze trzymane w tych słojach.
P r z y k ł a d 2: Wybór szczepów bakteryjnych
To badanie przesiewowe in vitro opierano na produkcyjnych cechach charakterystycznych dla zastosowań przemysłowych zdolnych do życia komórek, ich zdolności do przeżycia hamujących lub szkodliwych warunków żołądkowo-jelitowych i ich genomowej różnorodności. Różnorodność szczepową lub genomowe podobieństwo tych niescharakteryzowanych szczepów brano pod uwagę stosując RAPD i badanie różnic we wzorze restrykcyjnym genów rRNA (rybotypowanie ang. ribotyping).
Materiały i metody
Bakteryjny wzrost
Szczepy, które są zdolne do szybkiego wytwarzania dużej liczby komórek muszą być zidentyfikowane. Ich bakteryjny cykl wzrostowy można scharakteryzować krótką fazą przygotowawczą (zastoju), krótkim czasem namnażania się, wysoką maksymalną liczbą i długą fazą stacjonarną. Dlatego szczepy te porównano przez rozważanie trzech zmiennych,: długości ich faz przygotowawczych, ich czasu namnażania (w godzinach) i ich maksymalnej liczby, które odpowiadają najważniejszym parametrom.
Dla Laktobacillusów:
200 ml pożywki MRS wcześniej inkubowanej w 37°C zainokulowano 1% świeżej subkultury. Co godzinę przez 8 godzin po inokulacji pobierano 1 - mililitrowe próbki. Próbkę końcową pobrano po 24 godzinach. Jeden mililitr każdej próbki był 10-krotnie kolejno rozcieńczany w TS w celu policzenia. Hodowle rosły beztlenowe w 37°C, przez 48 godzin na agarze MRS (metodą płytek lanych). Wszystkie płytki z liczbą kolonii między 30 a 350 zarejestrowano jako jednostki tworzące kolonie (cfu) na ml hodowli i brano pod uwagę w celu wyliczenia.
Dla Bifidobakterii w (MRS-C):
We wstępnych testach wszystkie szczepy wyliczano po 24 godzinach wzrostu w pożywkach bulionowych MRS-C i TPYG. Wyniki wyrażano w cfu/ml. Krzywe wzrostowe ustalano przez określenie liczby komórek rosnących w MRS-C po 0, 4, 12, 24, 32, i 48 godzinach według protokołu opisanego dla laktobacillusów. Test ten przeprowadzono, aby określić wpływ pożywki subkultury i optymalizację odgazowania pożywki wzrostowej:
PL 207 930 B1 • z subkultury, w BHI-C przechowywanej przez 48 godzin w 4°C i inokulowanej w MRS-C.
• z subkultury, w BHI-C przechowywanej 48 godzin w 4°C i zainokulowanej w MRS-C dobrze odgazowanej (usuwanie tlenu optymalizowano przez dwukrotnie autoklawowanie pożywki i przechowywanie jej bezpośrednio w beztlenowych słojach).
• ze świeżej subkultury, w MRS, i zainokulowanej w MRS-C dobrze odgazowanej i przechowywanej w warunkach beztlenowych przed doświadczeniem.
T a b e l a 2:
Pożywki testowe do bakteryjnego wzrostu
Dla laktobacillusów
Substrat Skład pH Odnośniki
MRS MRS bez cukru (Difco) 35 g l-1 6,5 De Man i wsp. (1960)
Glukoza 20 g l-1
Woda destylowana 1000 ml
Dla bifidobakterii
Substrat Skład PH Odnośniki
MRS-C MRS bez cukru 35 g l-1 6,0 Pacher i Kneifel (1996)
Glukoza 20 g l-1
Chlorowodorek L-cysteiny (Fluka) 0,5 g l-1
Woda destylowana 1000 ml
TPYG (Tryptikazowy Peptonowy Wyciąg drożdżowy) Tryptykaza (BBL) 50 g l-1 7,0
Pepton (Difco) 5 g l-1
Wyciąg drożdżowy (Difco) 20 g l-1
Glukoza 4 g l-1
(Merck)
Chlorowodorek L-cysteiny (Fluka) 1 g l-1
Woda destylowana 1000 ml
Pożywkę stałą uzyskiwano przez dodanie Difco Bactoagar (15 g/l-1). Pożywki autoklawowano w 121°C przez 15 min. Pożywki ciekłe dla bifidobakterii albo przechowywano w warunkach beztlenowych albo odgazowywano przed wykorzystaniem.
Odporność na pH żołądkowe i żółć
Po spożyciu, aby utrzymać zdolność do wywierania korzystnej aktywności w przewodzie pokarmowym zwierzęcia, mikroorganizmy muszą przetrwać warunki żołądkowe i dwunastnicze. Głównymi składnikami odpowiedzialnymi za regulację flory bakteryjnej są pH żołądka i sole żółciowe. Dlatego musiał być przetestowany też stopień odporności szczepów na kwasowość żołądkową i żółć.
Fizjologia przewodu trawiennego kotów i psów różni się od ludzkiej. Przeciętne pH wynosiło odpowiednio 3,4 u psów i 4,2 u kotów. Do testów polecono zrekonstytuowaną żółć zwierząt domowych (tabela 4). Stężenie żółci w jelicie cienkim w trakcie trawienia pokarmu jest w zakresie od 0,5 do 2%.
PL 207 930 B1
Stosownie do wartości ekstremalnego pH znalezionego u kotów i u psów, liczba zdolnych do życia bakterii po 10 minutach w pH 2,6 i po dwóch godzinach w pH 3,4 (szczepy izolowane od psów) albo w pH 4,2 (szczepy izolowane od kotów) nie powinna wynosić poniżej 1,0E+06 cfu/ml.
Odporność na pH żołądkowe
Wszystkie laktobacillusy inokulowano w ilości 1% w podłożu MRS i hodowano beztlenowo w 37°C przez noc. Bifidobakterię zainokulowane w ilości 5% w BHI-C hodowano w warunkach beztlenowych przez 48 godzin w 37°C. Hodowle rozdzielano do dwumililitrowych probówek reakcyjnych (Eppendorf) i wirowano przy 3500 xg/10 min/20°C. Komórki przemywano trzy razy płynem Ringera. Odporność na kwasowe warunki żołądka testowano in vitro w trzech symulowanych sokach żołądkowych o poziomach pH 2,6; 3,4; i 4,2 doprowadzanych kwasem solnym (Merck). Do wszystkich sterylizacji przez filtrowanie stosowano jednorazowe filtry (Nalgene). Przeżywalność każdej zawiesiny bakteryjnej badano przez dodanie 1 ml do pięciomililitrowych serii symulowanego soku żołądkowego (różne pH) uzupełnionych 1,5 ml 0,5% roztworu NaCl. Próbki inkubowano w 37°C i zdolne do życia organizmy obliczano po:
• 0, 1,5, 10 minutach w pH 2,6 soku żołądkowego • 0, 1, 30, 60, 120, 180 minutach, gdy sok żołądkowy miał pH albo 3,4 (dla szczepów izolowanych od psów) albo 4,2 (dla szczepów izolowanych od kotów).
Próbki rozcieńczano buforem fosforanowym (pH 7,0), wysiewano na agar MRS-C i określano ich liczbę.
T a b e l a 3
Symulowany sok żołądkowy
Nazwa substratu Skład PH
Sok żołądkowy 0,3% wag./obj. świńskiej pepsyny (Sigma) 2,1; 3,4 lub 4,2
0,5% wag./obj. NaCl
HCl (Merck): do doprowadzania pH
Odporność na sole żółciowe
Określano liczby zdolnych do życia laktobacillusów hodowanych przez 18 godzin w obecności różnych stężeń rekonstytuowanej żółci zwierzęcej.
Dwie liczby zdolnych do życia bakterii uważano za istotnie różne, gdy odchylenie ich log10, wynosiło powyżej 0,25. Każdy szczep scharakteryzowano dwiema zmiennymi:
• maksymalnym stężeniem testowanych soli żółci, przy którym nie znaleziono istotnej różnicy z kontrolą • szybkością spadku żywotności przy zwiększeniu stężenia żółci w podłożu.
Szczepy charakteryzowane utratą przewagi log10 ich liczby zdolnych do życia bakterii, gdy stężenie żółci rosło w 1% etapach były uważane za wrażliwe. Przyjmowano za akceptowalne, jeżeli zmniejszenie między komórkami rosnącymi w obecności 0 i 2% żółci przewyższało jeden log10, i wynosiło do jednego log10 przy dodatkowym procencie żółci (powyżej 2%). Ponadto, należy wybrać tylko szczepy wytwarzające więcej niż 1,0E+06 cfu/ml w trakcie wzrostu w obecności do 2% soli żółci, wyselekcjonowane w celu wywołania działania w przewodzie pokarmowym.
Rekonstytuowaną żółć zwierzęcą kotów lub psów spreparowano jak pokazano w tabeli 4, i przed użyciem wysterylizowano metodą filtracji. W pierwszym teście, laktobacillusy rosły beztlenowe przez 24 godziny w podłożu MRS w 37°C i były przenoszone do świeżego bulionu MRS z dodatkiem 0, 0,1; 0,3; 0,5; 1;2; 4% sterylnie rekonstytuowanej żółci zwierzęcej na dodatkowe 18 godzin. Próbki 10-krotnie kolejno rozcieńczano w TS w celu przeliczenia. Rozcieńczenia 1,0E-03 i 1,0E-05 wysiewano na agar MRS używając WASP (Whitley Automatic Spiral Plater); Don Whitney Scientific Limited, England). Podczas suszenia płytki odwracano i inkubowano 48 godzin w temperaturze 37°C w beztlenowych słojach.
Floch i wsp. (1972) określili zahamowanie jako znaczące, gdy w teście występowało zmniejszenie wzrostu o przynajmniej 2 logarytmy w porównaniu ze wzrostem w probówce kontrolnej. Opierając się na tym wszystkie laktobacillusy wrażliwe na stężenia żółci w pierwszym teście i dwa laktobacillusy odporne na 4% żółć testowano podobnie w obecności 0; 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 4% żółci. Następny test przeprowadzono dla zmierzenia powtarzalności i ustalenia, czy liczba żywotnych bakterii spadła dramatycznie ze wzrostem stężenia żółci.
PL 207 930 B1
Z drugiej strony, wykazano, że szczepy te są żółcio-oporne podczas tego 18-godzinnego okresu. Krzywe wzrostu ustalano w obecności soli żółci, aby określić, czy faza przygotowawcza i tempo wzrostu oddziałują na nie czy nie. Testy przeprowadzono z laktobacillusami rosnącymi w bulionie MRS wzbogaconym 1% rekonstutuowaną żółcią zwierząt, według protokołu opisanego dla wcześniejszych pomiarów wzrostu.
Prowadzono subkultury Bifidobakterii, które rosły beztlenowo 32 godziny/37°C, z zastosowaniem bulionu MRS-C z 0; 1; 2; 3 i 4% rekonstytuowanej żółci zwierząt. Zastosowano tę samą metodę wyliczania przy rozcieńczeniach 1,0E-03, 1,0E-04 i 1,0E-05 jak dla laktobacillusów.
T a b e l a 4
Rekonstytuowana żółć zwierząt
Składniki ąmol/ml mg/ml % całkowity
Taurodeoksycholan (Sigma) 14,00 7,00 18,00
Taurocholan (Sigma) 59,00 30,40 74,0
Cholan (Fulka) 0,14 0,06 0,2
Taurachenodeoksycholan (Sigma) 6,90 3,45 8,0
Przeżywalność przez szczepy Lactobacillus liofilizacji i następującego po niej przechowywania
Wyliczano ewolucję przeżywania. Liczba zdolnych do życia komórek niższa niż 10E+05 CFU/ml uważana była za zbyt niską.
Dla każdego szczepu, 200 ml MRS pożywki inokulowano 3% świeżej subkultury. Hodowle rosły przez 16 godzin w 37°C. Warunki nienatlenienia (szczelne pojemniki) przyjmowano za zasadniczo beztlenowe. Zdolne do życia komórki obliczano stosując metodę lanych płytek opisaną wcześniej.
Kultury zbierano przez odwirowanie w 3500 xg/+7°C/20 minut (RC3C Sorvall Instrument Centrifuge) i zawieszano w 10 ml dwóch różnych pożywek krioochronnych. Każdy szczep był ponownie zawieszany w dwóch różnych pożywkach krioochronnych. Stężone zawiesiny bakteryjne wyliczano (metodą lanych płytek) i rozlewano do fiolek (0,5 ml na ampułkę). Próbki mrożono w temperaturze -196°C w ciekłym azocie i suszono pod ciśnieniem przez 18 godzin. Po liofilizacji azot wprowadzano przez zawór powietrzny dopuszczeniowy w liofilizatorze wszystkie ampułki zatapiano. Wszystkie fiolki przechowywano w temperaturze +4 i +20°C przez sześć miesięcy. Co miesiąc określano (dla każdej bakterii i pożywki zawieszającej) liczbę zdolnych do życia komórek w ampułce.
WYNIKI
W ramach selekcji potencjalnych probiotyków dla kotów i psów wyniki z badań przesiewowych in vitro 20 laktobacillusów i 18 bifidobakterii, oparte na ich potencjałach wzrostowych, odporności na liofilizację z późniejszym przechowywaniem, odporności na pH żołądka i stężenie żółci znalezione w przewodzie pokarmowym kotów i psów przedstawiono w tabeli 5.
Dwadzieścia Lactobacillusów sklasyfikowano w odniesieniu do kryteriów, które spełniły w aktualnym badaniu. Cztery szczepy wykazały dobre wyniki dotyczące ich cech wzrostu, odporności na pH żołądka, odporności na żółć i zdolność przeżycia podczas przechowywania po liofilizacji: L. reuteri NCC2581 (CNCM I-2448), L. reuteri NCC2592 (CNCM I-2450), L. reuteri NCC2603 (CNCM I-2451) i L. reuteri NCC2613 (CNCM I-2452). Zestawiono następujące cechy:
- okres namnażania się bakterii był mniejszy niż jedna godzina, kiedy rosły w MRS
- faza przygotowawcza była krótka (mniejsza niż dwie godziny)
- liczba bakterii była wysoka (więcej niż 1,0E+08 CFU/ml) w stacjonarnej fazie cyklu wzrostu i stabilna w 8 i 24 godzinie po inokulacji
- szczepy były stabilne podczas liofilizacji i późniejszego sześciomiesięcznego przechowywania w temperaturze 4°C i 20°C
- szczepy były odporne na ekstremalne stężenie żółci możliwe do znalezienia w przewodzie pokarmowym kotów i psów (2%)
- żadnego znaczącego zahamowania w obecności do 4% żółci w pożywce
- szczepy wykazały tolerancję pH 2,6 przez co najmniej 10 minut i mogłyby pozostawać na poziomie wyższym niż 1,0E+08 CFU/ml
- szczepy były odporne na średnie pH żołądka przez co najmniej dwie godziny.
PL 207 930 B1
Dlatego też, dwa laktobacillusy wyizolowane od kotów (L. reuteri NCC2581 i L. reuteri NCC2592) i dwa wyizolowane od psów (L. reuteri NCC2603 i L. reuteri NCC2613J wyselekcjonowano dla zbadania ich potencjalnej probiotycznej aktywności. Szczepy NCC2581, NCC2592, NCC2603 i NCC2613 zidentyfikowano jako L. reuteri dzięki identyfikacji API 50CH.
Jednak badanie różnic we wzorze restrykcyjnym w genach rRNA (rybotypowanie ang. ribotyping) ujawniło, że NCC2581 i NCC2592 miały bardzo podobne wzory, tak samo jak NCC2603 i NCC2613, tym samym wskazując prawdopodobne bliskie pokrewieństwo. Szczep NCC2581 miał bardzo dobre charakterystyki wzrostu, a NCC2603 miał lepszą odporność na żółć niż NCC2613.
Wyniki dotyczące ośmiu bifidobakterii wyizolowanych z kociego kału umożliwiały ich selekcję w oparciu o ich parametry wzrostowe, odporności na pH żołądka i wrażliwości na żółć. Szczep NCC2623 wcale nie miał żadnej z pożądanych cech i dlatego nie byłby zalecany do dalszych badań. Z drugiej strony szczep NCC2627 spełniał wszystkie kryteria:
- jego okres podwajania wynosił mniej niż jedną godzinę podczas wzrostu w MRS-C
- faza przygotowawcza była tak krótka jak dla laktobacillusów
- liczebność była wysoka i stabilna podczas stacjonarnej fazy cyklu wzrostu
- szczep był odporny na ekstremalne stężenie żółci podobne do znalezionej w przewodzie pokarmowym kotów i psów (2%)
- nie występowało żadne znaczące zahamowanie w obecności do 4% żółci w pożywce
- szczep wykazywał tolerancję na pH 2,6 przez co najmniej 10 minut i mógł pozostawać na poziomie wyższym niż 1,0E+0,6 CFU/ml
- szczepy były odporne na średnie pH żołądka przez co najmniej dwie godziny
Szczep NCC2627 był znacznie bardziej odporny niż NCC2623 i NCC2635, podczas gdy te trzy szczepy miały bliski wzór w rybotypowaniu, wskazując tym samym prawdopodobne bliskie pokrewieństwo (trawienie dwoma restrykcyjnymi enzymami: EcoRl i EcoRV).
Dziesięć bifidobakterii wyizolowanych od psów wykazywało tylko dwa różne wzory podczas charakteryzowania przez rybotypowanie. Dlatego też, próby odporności na żółć przeprowadzono tylko z czterema szczepami (po dwa z każdej grupy): NCC2657, NCC2660, NCC2671 i NCC2677. Te wszystkie cztery szczepy były odporne na maksymalne stężenie żółci mogącej występować in vivo (2% żółci), a szczepy NCC2660 i NCC2657 nie wykazywały żadnego spadku żywotności, gdy traktowano je maksymalną wartością 4% żółci. W następstwie czego, wszystkie bifidobacterie wyizolowane z psiego kału są raczej odporne na wysokie stężenia żółci.
Odnośnie do charakterystyk wzrostu, te dziesięć bakterii można by podzielić na dwie grupy:
- szczepy odporne na żółć i z dobrymi charakterystykami wzrostu: NCC2657, NCC2651, NCC2663 i NCC2667
- szczepy odporne na żółć, ale z charakterystykami wzrostu, które muszą być zoptymalizowane do produkcji przemysłowej: NCC2660, NCC2671, NCC2677, NCC2647, NCC2654 i NCC2674
Pełne wyniki odporności na ekstremalne pH żołądka znalezione podczas trawienia u kotów i psów powinny umożliwić lepsze określenie szczepów wybranych do dalszych badań. Tylko szczep NCC2651 nie spełnił kryteriów selekcji na odporność na pH.
T a b e l a 5 Podsumowanie
Kod NCC Kod Kryteria wzrostu Odporność na sok żołądkowy Odporność na żółć Stabilność po liofilizacji
1 2 3 4 5 6
2578 LB1-1 + + -
2581 LB1-2 + + + +
2583 LK1-1 + + + -
2586 LK1-2 - + - -
2590 LH2-1 + + + -
2592 LR1-1 + + + +
2594 LS1-1 - + - -
2597 LA2-5 - + + +
PL 207 930 B1 cd. tabeli
1 2 3 4 5 6
2600 LC2-5 - - + -
2603 LE2-5 + + + +
2606 LF2-6 - + + -
2609 LH2-6 + + + -
2613 LH2-7 + + + +
2616 L1-M - + + -
2619 L1-1-2 - + + -
2621 L3-1-2 + + - +
2625 L7-1-3 + + - +
2628 LA1-5 + + + -
2632 LA1-6 - + + -
2636 LB1-5 + + +
Nawiązując do obecnych wyników jeden bifidobakteryjny szczep wyizolowany od kotów i trzy bifidobakterię wyizolowane od psów (odpowiednio NCC2627, NCC2657, NCC2663, NCC2667) mogły by być wyselekcjonowane.
T a b e l a 6 Podłoża rozcieńczające
Substrat Skład PH
Bufor fosforanowy K2PO4 KH2PO4 Woda destylowana 72 g l-1 48 g l-1 7,0
Roztwór Ringera NaCl Woda destylowana 9 g l-1 1000 ml 7,0
TS (Trypton w roztworze soli fizjologicznej) NaCl Trypton Woda destylowana 8.5 g l-1 1 g l-1 1000 ml 7,0
W probówkach przygotowano 9-cio mililitrowe porcje i autoklawowano w 121°C przez 15 minut
Ostatecznie, do dalszych badań wyselekcjonowano 8 z 38 szczepów (patrz przykład 3): trzy laktobacillusy wyizolowane od kotów (NCC2581, NCC2592, NCC2583), trzy laktobacillusy od psów (NCC2603, NCC2613, NCC2628), jedna bifidobakteria od kotów (NCC2627), jedna bifidobakteria od psów (NCC2657),
Szczepy te charakteryzują się krótkim okresem namnażania, dużą liczebnością (więcej niż 1,0E+08 cfu/ml) podczas ich fazy stacjonarnej i wysoką liczebną stabilnością po 8 i 24 godzinach od inokulacji, trwałością po liofilizacji, po której następowało przechowywanie, odpornością na ekstremalne stężenia żółci znalezionej w dwunastnicy (2% żółci) i słabym zahamowaniem podczas wzrostu w obecności do 4% żółci. Ponadto, przy selekcjonowaniu reprezentatywnych bakterii spośród badanej różnorodności brano pod uwagę wyniki analiz DNA.
P r z y k ł a d 3: Skuteczność kolonizacji u kotów
L. reuteri NCC2581, L. reuteri NCC2592, L. rhamnosus NCC2583 i Bifidohacterium sp. NCC2627 testowano w próbach żywieniowych w celu oszacowania ich zdolności do przetrwania w czasie przemieszczania się w przewodzie żołądkowo-jelitowym kota. 16 samców i samic kotów, możliwie podobnych, poddawano 3-dniowej adaptacji z „Friskies Grand Menu boeuf. Protokół żywieniowy składał się w ciągu 7 dni testów z „Friskies Grand Menu i 7 dni testów z „Friskies Grand Menu zawierającym jeden z wyżej wymienionych szczepów:
L. reuteri NCC 2581 (dieta A), L. reuteri NCC 2592 (dieta B) L. rhamnosus NCC2583 (dieta C) i Bifidobacterium sp. NCC2627 (dieta D). Oznaczenie diet było następujące:
PL 207 930 B1
Koty nr 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Okres 1 A D C B D A A C B A B C B D C D
Okres 2 B A D A C C D A C B C D D A B B
Szczepy te wytworzono w dostatecznej ilości i w stabilnej liofilizowanej formie w celu stosowania tych ośmiu różnych bakterii z uwzględnieniem ich szczepowej przeżywalności w układzie pokarmowym testowanych zwierząt. Wszystkie szczepy mieszano z 4 g trehalozy w celu dodania dostatecznej objętości nośnika do zmiksowania wytworzonych szczepów z matrycą pokarmową dla zwierząt. Szczepy bakterii przygotowuje się w pojedynczych plastikowych probówkach (1,0E+09 cfu/dzień) i codziennie dodaje do porcji pokarmu, tak aby mieć pewność, że całość bakterii zostanie zjedzona.
Świeże próbki kału otrzymuje się do analizy liczby populacji bakteryjnej i porównuje z linią podstawową (bez dodanych bakterii)
Fekalia zbiera się 7 i 8 dnia (linia podstawowa) 14 i 15 dnia i 22 (linia podstawowa) i 29 dnia
Sterylną sondę doodbytniczą stosuje się do otrzymania co najmniej 0,1 g próbki kału.
Tę próbkę waży się dokładnie i 0,1 g miesza się z 10 ml fizjologicznego roztworu (Ringer) zawierającego 10% glicerolu. Roztwór ten następnie przenosi się do 1 ml krioprobówek i zamraża w ciekłym azocie. Następnie wszystkie próbki przechowuje się w -80°C aż do analiz.
Policzono endogenne populacje Lactobacillus, Bacteroides, Enterobacteriaceae, enterokoków, bifidobakterii i Clostridium perfringens. Bakterie wykrywano na selektywnej lub półselektywnej pożywce. Stukrotne seryjne rozcieńczenia wykonano w roztworze Ringera zawierającym 0,5% cysteiny, od rozcieńczeń w zakresie -2 do -8. Szalki Petriego z różnymi selektywnymi pożywkami zainokulowano i inkubowano (patrz tabela poniżej).
Bakterie Pożywka T (°C) Czas (godz.) Atmosfera
Enterobacteriaceae Drigalski (Sanofi) Diagnostics Pasteur, 37 24 Tlenowa
Bifidobacterie Francja Eugon Tomato* 37 48 Beztlenowa
Laktobacillusy MRS (Difco, MI.USA)+ antybiotyki** 37 48 Beztlenowa
Cl.perfringens NNAgar*** 37 48 Beztlenowa
Bacteroides Schedler Neo-Vanco (BioMerieux, MarcyL'Etoile, Francja 37 48 Beztlenowa
*: Wadsworth Anaerobic Bacteriology Manual, V. Suter, D. Citron i S. Finegold Third ed. **: fosfomycyna (79,5 mg/l) + Sulfametoksazol (0,93 mg/l + Trimetoprim (5 mg/l) ***NN agar z Lowbury i Lilly, 1995
Wyniki: Liczebności bakterii są wyrażone jako logarytm dziesiętny i przedstawione w tabeli 7.
T a b e l a 7
Liczebność bakterii w kale kocim (średnia± odch. St, n=8)
NCC2581 NCC 2592 NCC 2583 NCC 2627
przed podczas przed podczas przed podczas przed podczas
Laktobacillusy 6,38 7,63 6,12 7,62 5,31 7,47 6,69 7,65
±2,25 ±1,23 ±2,45 ±1,58 ±2,04 ±1,23 ±1,44 ±1,45
Bifidobakterie 7,17 7,64 7,57 6,31 6,43 6,80 8,04 6,07
±1,82 ±0,42 ±1,68 ±2,26 ±2,25 ±2,19 ±1,03 ±2,32
Enterobacteria- 4,25 4,27 4,37 4,58 5,09 4,40 4,59 3,64
ceae ±1,71 ±1,20 ±1,35 ±1,45 ±1,50 ±0,63 ±1,42 ±0,64
Bacteroides 6,05 5,54 5,94 6,15 6,19 5,52 6,00 5,48
±1,38 ±0,49 ±0,99 ±1,43 ±0,97 ±0,46 ±1,11 ±0,50
C. perfr. 4,09 3,84 3,61 3,30 4,16 3,34 3,84 3,57
±1,22 ±1,00 ±0,57 ±0,00 ±1,64 ±0,11 ±0,89 ±0,56
PL 207 930 B1
Podczas traktowania obserwujemy wzrost liczebności laktobacillusów w kale z powodu spożycia wspomnianej probiotycznej bakterii. Nie zaobserwowaliśmy żadnego drastycznego wzrostu liczebności Enterobacteriaceae odzwierciedlającego, iż nie ma żadnego uszkodzenia w ekosystemie jelitowym w związku z zastosowaniem wyselekcjonowanych probiotyków.
P r z y k ł a d 4: Skuteczność kolonizacji u psów
L. reuteri NCC2603, L. reuteri NCC2613, L. acidophilus NCC2628 i Bifidobacterium sp. NCC2657 testowano w próbach pokarmowych, ażeby oszacować ich zdolność do przeżycia w trakcie przechodzenia przez układ pokarmowy psa.
psów, 5 samców i 5 samic w wieku od 4 do 7 lat poddano tym specyficznym próbom. Protokół karmienia składał się z 5 dni adaptacji z „Friskies Vitality z/bez cykorii i 5 dni testu z „Friskies Vitality z/bez cykorii i 3 dni adaptacji, 5 dni testu z „Friskies Vitality z/bez cykorii + bakterie: L. reuteri NCC2603 (dieta E), L. reuteri KTCC2 613 (dieta F), L. acidophilus NCC2 62 8 (dieta G) i Bifidobacterium sp. NCC2657 (dieta H).
Oznaczenie diet było następujące:
pies nr° 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
okres 1 E E E E E F F F F F
okres 2 G G G G G H H H H H
Szczepy wytwarzano w dostatecznych ilościach i w stabilnej liofilizowanej formie w celu zastosowania tych ośmiu różnych bakterii z uwzględnieniem szczepowej przeżywalności w układzie pokarmowym testowanych zwierząt. Wszystkie szczepy mieszano z 4 g trehalozy w celu dodania dostatecznej objętości nośnika do zmieszania wytworzonych szczepów bakteryjnych z matrycą pokarmową dla zwierząt. Szczepy bakteryjne wytwarza się w pojedynczych plastikowych probówkach (5,0E +09 cfu/dzień) i codziennie dodaje do części pokarmu dla pewności, że całość bakterii zostanie zjedzona.
Otrzymuje się świeże próbki kału do analizy liczebności bakteryjnych populacji i porównuje z linią podstawową (bez dodanych bakterii). Kały zbiera się w 7 i 8 dniu (linia podstawowa) i 15 dni i 22 (linia podstawowa) i 29 dni.
Do otrzymania co najmniej 0,1 g próbki kału stosuje się sterylną doodbytniczą sondę. Tę próbkę waży się dokładnie i 0,1 g miesza z 10 ml roztworu fizjologicznego (Ringer) zawierającego 10% glicerolu. Roztwór ten następnie przenosi się do 1 ml kriprobówek i zamraża w ciekłym azocie. Wszystkie próbki następnie przechowuje się w - 80°C aż do analiz. Bakterie liczono na tej samej pożywce jaką opisano w przykładzie 3.
Wyniki: Liczebności bakterii, wyrażone jako logarytm dziesiętny, przedstawiono w tabeli 8.
T a b e l a 8
NCC 2603 NCC 2613 NCC 2628 NCC 2657
przed podczas przed podczas przed podczas przed podczas
Laktobacillusy 5,25 3,92 4,0 3,40 7,93 8,30 6,47 7,00
±1,34 ±1,5 ±1,56 ±0,21 ±1,75 ±0,99 ±1,27 ±1,35
Bifidobakterie 7,32 4,48 6,09 4,55 7,70 7,20 5,72 6,78
±2,06 ±2,64 ±2,10 ±2,79 ±2,57 ±1,88 ±2,51 ±2,39
Enterobacteria- 4,10 4,62 3,62 4,34 4,58 4,04 4,51 4,85
ceae ±0,89 ±0,61 ±0,72 ±0,94 ±1,54 ±0,76 ±1,51 ±1,45
Bacteroides 7,82 6,70 6,92 6,69 7,88 7,53 7,92 7,66
±0,53 ±1,25 ±1,37 ±1,19 ±1,13 ±0,61 ±0,63 ±0,86
C.perfr. 3,70 3,84 3,50 3,30 3,70 3,30 3,93 3,70
±0,89 ±0,87 ±0,45 ±0 ±0,62 ±0 ±1,25 ±0,89
PL 207 930 B1
Podczas podawania nie obserwowaliśmy znaczących zmian w liczebności laktobacillusów w kale, związanych ze spożywanymi wyselekcjonowanymi probiotycznymi bakteriami z wyjątkiem przypadku szczepu L. acidophlilus NCC2628. W testowanych warunkach efekt hamowania C. perfringens nie był istotny, ponieważ podstawowy poziom C. perfringens był bardzo niski. Nie obserwujemy znacznego wzrostu liczby Enterobacteriaceae odzwierciedlającego, że nie występują żadne zakłócenia ekosystemu jelitowego wynikające z użycia wyselekcjonowanych probiotyków.
P r z y k ł a d 5: Wpływ laktobacillusów i ich metabolitów na żywotność Giardia intestinalis
Badaliśmy działanie filtrowanych supernatantów szczepów Lactobacillusów wyizolowanych od kotów i psów.
Materiał i metody
Szczepy i kultury bakteryjne: Mikroorganizmy należące do rodzaju Lactobacillus pochodziły ze Zbiorów Kultur Nestle. Bakterie rosły na pożywce MTYI. Supernatanty zawierające metabolity laktobacillusów neutralizowano przy pH 6 i wyjaławiano przez filtrację.
Kontrole przeprowadzano przez zakwaszanie pożywki MTYI kwasem mlekowym do tego samego pH, jak jedna z kultur bakteryjnych. Oprócz tego, pH doprowadzano 0,1 N NaOH do pH o wartości 6. Pochodzenie badanych szczepów i pH supernatantów i kontroli przedstawia tabela 9.
T a b e l a 9
Szczep Pochodzenie pH supernatantu pH kontroli
L .reuteri NCC2581 Kot 6,63 6,63
L .rhamnosus NCC2583 Kot 6,50 5,97
L. reuteri CC2592 Kot 6,04 5,98
L. reuteri NCC2603 Pies 6,04 5,99
L. reuteri NCC2613 Pies 6,07 5,95
L. acidophilus NCC2628 Pies 6,01 5,93
Pasożyty: Szczep Giardia intestinalis WB (ATCC 30957) nabyto w American Type Culture Collection (Rockville, USA). Trofozoity rosły w pożywce TYI- S-33 zmodyfikowanej przez Keistera zawierającej w litrze: strawioną kazeinę (Difco) 20g; wyciąg z drożdży (BBL) 10 g; dekstrozę (Merck) 10 g; żółć wołową (Difco) 0.75 g; NaCl (Merck) 2g; L-cysteinę HCl (Sigma) 2g; sól sodową kwasu askorbinowego (Fluka) 0,2 g; K2HPO4 (Merck) 0,6 g; cytrynian amonowo-żelazowy (Sigma) 22,8g; surowicę wołową dorosłego zwierzęcia (Sigma) 100 ml; penicylinę/streptomycynę (Gibco, 100 IU/ml,1000 ąg/ml) 15 ml. Przed sterylizacją przez filtrowanie (wielkość porów 0,22 /ąm) pH doprowadzono 5N NaOH do wartości 6,9.
Pasożyty hodowano w polistyrenowych kolbach przeznaczonych dla kultur tkankowych(LUX, Miles Laboratories, Inc. Naperville IL 60540) wypełnionych 40 ml podłoża hodowlanego.
Subkultury prowadzono przez odrzucenie supernatantu z nieprzylegającymi pasożytami, dodając 5 ml chłodzonej lodem pożywki hodowlanej, inkubowano w łaźni lodowej przez 10 min, aby odłączyć przylegające trofozoity i zainokuluowano świeżą pożywkę 0,2 ml powstałej zawiesiny. Inkubacje przeprowadzano w ciemności w 37°C.
5
Analizy proliferacji komórek: Dwieście mikrolitrów zawiesiny trofozoitów (1,4 X 105 pasoży3 tów/ml) wymieszano ze 100 ąl supernatantów lub kontroli i dodano 1 ąCi 3H tymidyny. Próbki inkubowano w 37°C przez 24 godziny w 96-studzienkowych płytkach dla kultur tkankowych (Nunc Brand Products). Następnie pasożyty zbierano i oceniano włączenie tymidyny.
Wyniki
Przyłączanie tymidyny pokazane jest w tabeli 10. Szczep NCC 2628 wyizolowany od psów powodował silne hamowanie proliferacji szczepu WB (91%). Inne badane szczepy nie hamowały wzrostu trofozoitów.
PL 207 930 B1
T a b e l a 10
Wpływ supernatantów uzyskanych po filtracji hodowli na proliferację szczepu Giardia intestinalis
Szczep Proliferacja Giardia intestinalis wCMP
L. reuteri NCC 2581 1720
Kontrola 2000
L. rhamnosus NCC 2583 2500
Kontrola 1720
L. reuteri NCC 2592 1800
Kontrola 1970
L. reuteri NCC 2603 2100
Kontrola 1900
L. reuteri NCC 2613 2510
Kontrola 1950
L. acidophilus NCC 2628 150
Kontrola 1610
MTYI 1870
W tym doświadczeniu można było dowieść, że funkcjonalne metabolity wytwarzane w trakcie wzrostu L. acidophilus NCC 2628 mają bardzo silny wpływ hamujący na wzrost Giardia intestinalis.
P r z y k ł a d y 6 do 8: Efekty hamowania patogennych bakterii jelitowych przez szczepy Laktobacillus według wynalazku
Aby zidentyfikować szczepy o silnych antagonistycznych właściwościach wobec patogenów jelita cienkiego, przeprowadzono eksperymenty kohodowli w modelowym układzie symulującym warunki psiego jelita cienkiego (pH, skład i stężenie żółci, śluz, pankreatyna) Symulowany sok jelita cienkiego psa zawierał rekonstytuowaną żółć (0,345 g/l taurochenodeoksycholanu. Sigma, Niemcy; 0,7 g/l taurodeoksycholanu. Sigma, Niemcy; 3,04 g/l taurocholanu. Sigma Niemcy; 0,006 g/l cholanu Fulka, Szwajcaria), świńskiego śluzu (1,9 g/l Sigma, Niemcy), świńską pankreatynę (2,42 g/l. Sigma, Niemcy) i roztwór elektrolitowy (5 g/l NaCl, 0,6 g/l KCl, 0,25 g/l CaCl2 wszystkie Merck, Niemcy). pH soku doprowadzano 0,1 N NaOH do wartości 6,5 ± 0,5.
Szczepy i warunki hodowli
Patogeny jelita cienkiego
Wyselekcjonowano cztery potencjalnie patogenne szczepy: S. typhimurium SLI344, E. coli 08:H9 i E. coli 0149:K88 (patogenne psie izolaty) i kliniczne izolaty Sh. dysenteriae (pochodzenia ludzkiego, uzyskane dzięki uprzejmości Centre Hospitalier Universitaire Vaudoise - CHUV Lozanna, Szwajcaria) Za wyjątkiem S. typhimurium SLI344 namnażanej w bulionie Luria Bertani (Difco, USA), wszystkie Enterobacteriaceae rosły w bulionie Brain Heart Infusion (Difco, USA) wstrząsane (240 obr./min) w temp. 37°C.
Bakterie kwasu mlekowego
Szeroki zakres laktobacillusów pochodzenia psiego i kociego włączając L. acidophilus NCC2628 (CNCN I-2453J; L. rhamnosus NCC2583 (CNCMI-2449) L. reuteri NCC2581 (CNCM I-2448), L. reuteri NCC2592 (CNCM I-2450) wybrano z Kolekcji Kultur w Nestle (NCC, Nestec, Szwajcaria) i przebadano w modelu psiego jelita cienkiego na przeżycie, aktywność fizjologiczną i działanie hamujące na wyżej wspomniane patogeny jelita cienkiego. Laktobacillusy hodowano beztlenowe (anaerokult, Oxoid, Anglia) w bulionie Man Rogosa Sharp (Difco, USA) w 37°C.
Określanie liczby zdolnych do życia bakterii
Próbki rozcieńczano w sterylnym buforze (NaH2PO4, pH 7,0,2 M) i wysiewano powierzchniowo w dziesięciokrotnych rozcieńczeniach na płytki agarowe: MRS agar (Difco, USA) dla laktobacillusów, Salmonella-Shigella agar (Oxoid, Anglia) dla S. typhimurium i Sh. dysenteriae, i agar Sorbitol Mac Conkey (Oxoid, Anglia) dla E. coli. Płytki agarowe z laktobacillusami inkubowano beztlenowe przez 48 godzin w temperaturze 37°C, a z Enterobacteriaceae przez 24 godziny w 37°C.
Dla prób kohodowli, wzrost Enterobakteriaceae na agarze MRS hamowano przez dodatek polimyksyny (Oxoid, Anglia)
Doświadczenia kohodowli między bakteriami kwasu mlekowego (LAB) i patogenami
Doświadczenia kohodowli z potencjalnie probiotycznymi LAB i patogennymi szczepami prowadzono w 37°C w 20 ml (probówki Palcon) symulowanego soku jelita cienkiego psa wzbogaconego
PL 207 930 B1 różnymi źródłami węgla (cukier, pokarm zwierzęcy), aby sprzyjać metabolicznej aktywności kultur. LAB inokulowano przy 10E+08 cfu/ml, patogeny przy 10E+02 cfu/ml, 10E+04 cfu/ml i 10E+06 cfu/ml.
Próbki pobierano w różnych punktach czasowych w przedziale do 8 godzin i określano ilość zdolnych do życia komórek przez wysiewanie 10-krotnych rozcieńczeń na powierzchnię odpowiednich pożywek.
Próby kohodowli przeprowadzono w różnych warunkach obejmujących wzbogacenie symulowanego soku jelita cienkiego psa dekstrozą (5 g/ml) i różnymi stężeniami handlowo dostępnego prażonego suchego psiego pokarmu (5,25 lub 100 g/l); Friskies ALPO Complete, USA) Ten ostatni homogenizowano (Stomacher Lab Blender) i zawieszano w roztworze elektrolitowym. Wszystkie doświadczenia wykonano podwójnie.
P r z y k ł a d 6
Doświadczenia kohodowli między laktobacillusami i czterema potencjalnie patogennymi szczepami E. coli ETEC 08:H9, E. coli 0149:K88, S. typhimurium SLI344 i Sh. dysenteriae przeprowadzono w symulowanym psim soku dwunastniczym wzbogaconym 5 g/l dekstrozy (Difco). Laktobacillusy inokulowano przy 10E+08 cfu/ml, a Gram-ujemne szczepy wskaźnikowe przy 10E+02 cfu/ml. Wyniki są zebrane w tabeli 11.
T a b e l a 11
Kohodowla między LAB i potencjalnie patogennymi bakteriami w symulowanym soku psiego jelita cienkiego wzbogaconego dekstrozą
Patogen E. coli ETEC 08:H9 E. coli 0149:K88 S typhimurium SL1344 Sh. dysenteriae
PROBIOTYK
L. acidophilus NCC2628 +++ +++ -H-+ +++
L. rhamnosus NCC2583 (CNCM I-2449) +-H- +-H- +++ +++
L. ratferi NCC2581 (CNCM I-2448) Brak zahamowania ++ Brak zahamowania +++
L. reutheri NCC2592 (I-2450) Brak zahamowani ++ Brak zahamowania +
+ zahamowanie wzrostu ++ zahamowanie wzrostu i częściowa inaktywacja +++ zahamowanie wzrostu i całkowita inaktywacja
Wszystkie cztery badane laktobacillusy wykazywały aktywność przeciwdrobnoustrojową, ale tylko L. acidophilus NCC2628 (CNCM I-2453) i L. rhamnosus NCC2583 (CNCM I-2449) wykazały wysoką aktywność wobec wszystkich testowanych patogenów. Oba szczepy były nie tylko zdolne do hamowania wzrostu, ale także były zdolne do zupełnej inaktywacji patogenów zawartych w układzie testowym (brak pozostałych zdolnych do życia bakterii).
P r z y k ł a d 7
Doświadczenia z kohodowlą przeprowadzono między laktobacillusami (L. acidophilus NCC2628(CNCM 1-2453), L. rhamnosus NCC2583 (CNCM I-2449)) i S. typhimurium SLI344 w symulowanym psim dwunastniczym soku wzbogaconym w dostępny w handlu wysuszony przez prażenie pokarm zwierzęcy (5,25 lub 100g/l Friskies ALPO Complete, USA). Laktobacillusy inokulowano przy 10E+08 cfu/ml, a Gram-ujemne szczepy wskaźnikowe przy 10E+02 cfu/ml. Wyniki zebrano w tabeli 12.
T a b e l a 12
Kohodowla między LAB i potencjalnie patogennymi bakteriami w symulowanym soku psiego jelita cienkiego wzbogaconego suchym pokarmem zwierząt domowych
Patogen Wzbogacenie zwierzęcym pokarmem S. typhimurium SL1344
Probiotyk
L. acidophilus NCC2628 5 g/l -H-+
(CNCM I-2453) 25 g/l -H-+
100 g/l +-H-
L. rhamnosus NCC25S3 5 g/l Brak zahamowania
(CNCM I-2449) 25 g/l +
100 g/l ++
+ Zahamowanie wzrostu ++ zahamowanie i częściowa inaktywacja +++ Zahamowanie wzrostu i całkowita inaktywacja
PL 207 930 B1
Wyniki przedstawiają wysoki potencjał szczególnie L. acidophilus NCC2628 (CNCM I-2453) do hamowania wzrostu i nawet do całkowitej inaktywacji patogenów jelita cienkiego w bardzo praktycznych warunkach, takich jak mieszanina symulowanego soku jelita cienkiego i zwierzęcego pokarmu. Aktywność przeciwdrobnoustrojowa L. acidophilus NCC2628 była bardzo wysoka nawet przy niskich poziomach wzbogacania handlowym pokarmem zwierzęcym służącym organizmowi jako źródło fermentujących cukrów. W przeciwieństwie, do obserwacji zrobionej dla L. acidophilus, efektywność L. rhamnosus NCC2583 (CNCM I-2449) zależała od poziomu wzbogacenia pokarmem zwierzęcym, w taki sposób, że wzrastanie aktywności przeciwdrobnoustrojowej obserwowano wraz ze wzrostem ilości zwierzęcego pokarmu dodawanego do systemu testowego.
P r z y k ł a d 8
Doświadczenia kohodowli między L. acidophilus NCC2628 (CNCM I-24 53) i różnymi poziomami inokulacji S. typhimurium SL1344 przeprowadzono w symulowanym psim soku dwunastniczym wzbogaconym dekstrozą (5g/l, Difco). L. acidophilus NCC2628 (CNCM I-2453) inokulowano przy 10E+08 cfu/ml, S. typhimurium SL1344 inokulowano przy 10E+04 cfu/ml i 10E+06 cfu/ml. Wyniki zebrano w tabeli 13.
T a b e l a 13
Kohodowla L. acidophilus NCC2628 (CNCM 1-2453) i różnych poziomów inokulacji S. typhimurium SL1344
Patogen Poziom inokulacji patogena S. typhimurium SL1344
Probiotyk
L. acidophilus NCC2628 (CNCM I-2453) 10E+02 cfu/ml +++
10E+04 cfu./ml +++-
10E+06 cfu/ml +++-
+ zahamowanie wzrostu ++ zahamowanie i częściowa inaktywacja +++ Zahamowanie wzrostu i całkowita inaktywacja
Aktywność przeciwdrobnoustrojowa L. acidophilus NCC2628 (CNCM I-2453) była wystarczająco wysoka, aby całkowicie inaktywować nawet wysokie początkowe stężenia S. typhimurium SL1344.
P r z y k ł a d 9: Imunostymulacja in vivo u psów
Potencjał immunostymulacyjny szczepów probiotycznych izolowanych od zwierząt testowano w próbach klinicznych stosując szczep L. acidophilus NCC2628.
Metody:
Proliferacja jednojądrzastych komórek psiej krwi obwodowej (PBMC) pod wpływem stymulacji różnymi mitogenami:
Próbom tym poddano 20 psów 4- do 7 - letnich. Protokół żywieniowy polegał na jednotygodniowej adaptacji z Friskies Vitality z/bez cykorii i 4- tygodniowych testach z Friskies Vitality z/bez cykorii plus bakterie L. acidophilus NCC2628 L. acidophilus NCC2628 przygotowano w dostatecznej ilości i stabilnej liofilizowanej postaci w związku ze szczepową przeżywalnością w przewodzie pokarmowym testowanych zwierząt.
Bakterie mieszano z 4g trehalozy w celu dodania odpowiedniej objętości nośnika do miksowania przygotowanych bakterii z matrycą pokarmową dla zwierząt. Bakterie przygotowywano w oddzielnych plastikowych probówkach (5,0E+09 cfu/dzień) i codziennie dodawano do części pokarmu, aby być pewnym, że wszystkie bakterie zostaną spożyte.
Krew pobierano od psów po czterech tygodniach od podania probiotyku. Krew frakcjonowano na kolumnie Vaccutainer ™ (Becton Dickinson, Mountain View, CA), PBMC odzyskiwano zgodnie z zaleceniami wytwórcy.
Komórki stymulowano różnymi mitogenami lub estrami forbolu, które indukują silną proliferację limfocytów T (konkanawalina A (con A), fitohemaglutynina (PHA)), limfocytów B (mitogen szkarłatki) (PWM)), i wszystkich komórek (octan mirystylowy forbolu /Jonomycyna (PMA/Iono)). Z mitogenami i estrami forbolu (odpowiednie dawki wskazano na figurze 1) w końcowej objętości 200 μ! RPMI-1640 pożywki hodowlanej uzupełnionej 10% cielęcej surowicy płodowej i antybiotykami inkubowano 105 komórek na studzienkę w 96-studziankowych płaskodennych płytkach do prowadzenia kultur. (Nunc)
Komórki utrzymywano w atmosferze wilgotnego 5% CO2 w 37°C przez 48 godzin. Komórki znakowano pulsowo 1 uCi 3H tymidyny (Amersham Pharmacia Biotech, Switzerland) przez dalsze 18 godzin.
PL 207 930 B1 3
Następnie komórki zbierano na mikrocelulozowych filtrach (Packard) i mierzono związanie z [3H]tymidyną za pomocą liczenia scyntylacyjnego (Top Count; Packard, Szwajcaria). Proliferację komórek obliczano jako średnią (impulsów/minutę (c.p.m.) (±SD) z trzech pomiarów.
Wyniki
Figura 1: Był wyraźny wzrost proliferacji komórek w odpowiedzi na wszystkie mitogeny w grupie psów karmionych L. acidophilus NCC2628 w porównaniu z grupą kontrolną. Ten wzrost był znaczący w kulturach stymulowanych estrami forbolu PMA+ jonomycyna. Wyniki te pokazują, że limfatyczne komórki u psów karmionych probiotycznie były bardziej reaktywne na aktywację in vitro i sugeruje to stymulację odporności u psów karmionych probiotycznie.
P r z y k ł a d 10: Modulowanie in vitro funkcji immunologicznych przez wyizolowane od zwierząt domowych szczepy laktobacillusów
Przeszukiwanie in vitro różnych szczepów laktobacillusów izolowanych od zwierząt opisane powyżej zainicjowano, aby określić ich potencjał modulacji odporności. Na końcu mierzyliśmy ich zdolność do indukowania prozapalnych cytokin (IL-12, IFNy) i/lub przeciwzapalnych cytokin (IL-10, TGF-(3) (Anand A.C. Adya CM. 1999, Trop. Gastroenterol, 20 (3): 97-106; Spelleberg B., Edwards J.E.Jr 2001, Clin. Infect, Dis.:32 (1): 76-102). To zmierza do selekcjonowania szczepów potencjalnych kandydatów do silnych funkcji odpornościowych przeciwpatogennych lub antyrakowych, jak również antagonistycznych funkcji w stosunku do patologii psiego jelita cienkiego, takich jak alergia i zapalenie (zapalne choroby jelit). Dodatkowo kultury są umieszczone z samą pożywką (kontrola ujemna) lub z Enterococcus faecium szczep SF68 (NCIMB10415, Cerbios-Pharma, Szwajcaria) i z ludzkim izolatem laktobacillusa STU(NCC2461,CNCM I-2116) (kontrola dodatnia)
Metoda:
Profile cytokin w psich leukocytach indukowane przez różne szczepy probiotyczne
Krew uzyskaną od normalnych dorosłych psów traktowano przez 5 minut w temperaturze pokojowej buforem lizującym ACK (150 mM NH4CI, 1 mM KHCO3 i 0,1 mM NA2EDTA w wodzie, pH -7,4). Leukocyty dwukrotnie przemywano pożywką RPMI (bez antybiotyków) i wysiewano przy 2-106 komórek/ml do 24-studzienkowych płytek do kultur tkankowych. Do każdej studzienki dodawano 1 ml zawiesiny bakteryjnej (opisanej poniżej) zawierającej 106CFU.
Jako kontrolę do leukocytów dodawano samą pożywkę. Próbki inkubowano przez 18 godzin w temperaturze 37°C i 5% CO2. Następnie leukocyty pobierano, przemywano PBS i wirowano. Osad komórkowy zlizowano w 500 ul odczynnika Trizol (Gibco BRL). RNA ekstrahowano z lizatów komórkowych używając zestawu RNA Nucleospin (Macherey-Nagel). RT-PCR dla amplifikacji psich cytokin przeprowadzono używając zestawu genu AB (Merck). Referencje starterów (wszystkie wytwarzane przez Microsynth) wskazano poniżej. Analizę densytometryczną prążków PCR ujawnionych na żelu agarozowym barwionym bromkiem etydyny przeprowadzono stosując przetwarzanie obrazu NIH Image software. Wszystkie prążki normalizowano z odpowiednim prążkiem β-aktyny, produktem PCR, otrzymanym w każdej próbce (kontrola wewnętrzna) i wyniki przedstawiono jako jednostki arbitralne odzwierciedlające piksel gęstości każdego prążka będącego produktem PCR dla cytokiny (figura 2). - Preparatyka bakterii: różne szczepy laktobacillusów rosły w pożywce MRS w przybliżeniu przez 8 godzin, dopóki nie osiągnęły identycznej gęstości. Bakterie rozcieńczano pożywką RPMI bez antybiotyków do końcowego stężenia 106 CFU/ml.
Startery użyte dla cytokin -RT-PCR:
Cytokiny Referencje
IL-12p40 Buttner M., i wsp. 1998, Cytokine;10(4); 241-248
IFNy Buttner M., i wsp. 1998, Cytokine;10(4); 241-248
TGFβ-1 Grone A., i wsp. 1998, Vet, Immunol, Immunopathol,;65:11-27
IL-10 Pinelli E., i wsp. 1999, Vet. Immunol, lmmunopathol,;69:121-126.
Wyniki:
Figura 2: Wyniki pokazują, że profile cytokinowe indukowane przez laktobacillusy są zależne od szczepu. Na przykład, szczep NCC2628 indukował wysoki poziom IL-10 i TGF-β, podkreślając potencjał tego szczególnego szczepu dla modulacji odporności zapalnych zaburzeń, takich jak alergia i choroby zapalne jelit. Przeciwnie, szczep NCC2583 indukował silne poziomy IFNy i IL-12, co sprawia, że ten szczep jest dobrym kandydatem dla antypatogennej lub antyrakowej aktywności.
PL 207 930 B1
P r z y k ł a d 11
Do tego badania użyto trzech suchych zwierzęcych pokarmów. Będą one określane jako „A, B, C. Zwierzęcy pokarm „A jest kompletnym odżywczym suchym zwierzęcym pokarmem dostępnym pod znakiem firmowym ALPO (ALPO jest zarejestrowaną szwajcarską marką handlową SOCITE DES PRODUITS NESTLE S.A).
Pokarm zwierzęcy B jest tak samo kompletnym odżywczo suchym pokarmem jak zwierzęcy pokarm A, lecz jest uzupełniony sproszkowaną mieszaniną wyselekcjonowanych probiotycznych mikroorganizmów w saszetkach. Mieszanina obejmuje zasadniczo równe ilości L. acidophilus NCC2628 i Bifidobacterium sp. NCC2657. Jest ona rozpryskiwana nad pokarmem przy każdym podawanym posiłku, stosowana dawka wynosiła 1,0E8 cfu/dzień.
Pokarm zwierzęcy C jest odżywczo kompletnym suchym pokarmem, który jest identyczny ze zwierzęcym pokarmem A, lecz zawiera 1,2% wagowych suchego supernatantu hodowli Enterococcus faecium SF68(NCIMB 10415).
Do tego badania użyto 30 psów. Psy wstępnie karmiono przez 8 tygodni zwierzęcym pokarmem A. Następnie psy podzielono na trzy grupy po 10 psów w każdej, grupy oznaczono A, B, C i karmiono odpowiednio nazwanymi dietami przez 8 tygodni.
Psy miały wolny dostęp do wody i karmiono je raz dziennie. Rozprzestrzenienie łupieżu w sierści określano przy pomocy składu sędziowskiego obejmującego 30 członków, oceny dokonano na początku, a następnie po 7 tygodniach.
Psy zostały przygotowywane przed oceną przez zespół i członkowie zespołu nie porównywali notatek w czasie oceny.
W tej ocenie psy są prezentowane każdemu z indywidualnych członków zespołu w 20 różnych parach. Członkowie zespołu są proszeni o wskazanie w notatkach, który pies z prezentowanych par wyróżniał się (1) mniejszym łupieżem, (2) większym połyskiem sierści (3) mniejszym zapachem sierści.
Przeciętna kondycja sierści wszystkich psów jest wizualnie i dotykowo dobra, jak można się spodziewać u normalnych, zdrowych psów. Jednakże u psów karmionych dietą C stwierdzono zauważalnie mniej łupieżu, niż u tych, które były na diecie kontrolnej A. Te, karmione dietą B miały zauważalnie bardziej połyskliwą sierść i wykazywały mniej zauważalny odór sierści, niż te na diecie A. Nie stwierdza się, aby te charakterystyki różniły się w statystycznie znaczący sposób, gdy się je porównuje z charakterystyką dla psów grupy B.
P r z y k ł a d 12
Mieszankę żywieniową wytwarza się z około 58% wagowych ziarna, około 6% wagowych glutenu z ziarna, około 23% wagowych mięsa i mąki, a sole, witaminy i minerały stanowią pozostałość
Mieszankę żywieniową dostarcza się do wstępnego mieszalnika fluktuacyjnego i nawilża. Do tej mieszanki dodaje się proszek zawierający mieszaninę następujących szczepów Lactobacillus: Lactobacillus rhamnosus NCC2583 (CNCM I-2449), Lactobacillus acidophilus NCC2628 (CNCM I-2453) i Enterococcus faecium SF68 (NCIMB 10415) Proszek jest jednorodnie zawieszany w całej mieszance. Ta nawilżona pokarmowa mieszanina jest następnie dostarczana do wytłaczarki na gorąco i żelowana. Żelowana matryca opuszczająca wytłaczarkę jest wypychana przez dyszę i wytłaczana. Półwyrób jest cięty na kawałki odpowiednie do karmienia psów, suszony w około 110°C przez około 20 minut, schładzany w celu uformowania kulek. Wytłoczone kawałki sprawdzano na bakteryjną aktywność dodanych szczepów. Żadnych nie wykryto.
P r z y k ł a d 13
To badanie przeprowadzono na 24 psach. Grupa obejmowała młodsze i starsze psy, te drugie w wieku od 8 do 12 lat. Wybrane starsze psy wykazywały zewnętrzne oznaki zapalenia stawów proporcjonalne do ich wieku i czasami wydawało się, że mają trudności w poruszaniu się. Pewne ruchy wyglądały na bolesne. Symptomy te są często obserwowane u starszych psów i przypuszcza się, że wiążą się ze stanem artretycznym.
W badaniach stosuje się trzy suche zwierzęce pokarmy oznaczone A, B i C. Zwierzęca karma A jest kompletnym odżywczo suchym pokarmem (ALPO Beefy Dinner). Jest to pokarm kontrolny.
Wszystkich wybranych 24 członków wstępnie karmi się przez 8 tygodni stosując Psi Pokarm A. Następnie psy dzieli się na trzy grupy: A, B i C, każda po 8 psów młodszych i starszych w tej samej proporcji w obrębie grupy. Następnie każdą grupę karmi się przez 8 tygodni następującymi odpowiednimi dietami:
PL 207 930 B1
Grupa Zwierzęcy pokarm
A A
B B
C C
Zwierzęca karma B jest odżywczo kompletnym suchym pokarmem, zasadniczo identycznym z pokarmem zwierzęcym A, lecz który dodatkowo zawiera warstwę stanowiącą do 2% jego wagi. Warstwa ta obejmuje mikroorganizmy Enterococcus faecium SF68 (NCIMB 10415). Ilość pokarmu dostarczaną dziennie każdemu psu oblicza się zależnie od indywidualnego ciężaru ciała, pod warunkiem, że dawka wynosi 1,0E+09cfu/dzień.
Dieta C obejmuje wytłaczane granulki wytwarzane powyżej w przykładzie 12. Ilość pokarmu dostarczaną dziennie każdemu psu oblicza się zależnie od indywidualnego ciężaru ciała, tak aby dawka mikroorganizmu wynosiła 1,0E+llcfu/dzień.
Psy mają wolny dostęp do wody i są karmione raz dziennie. Licznik aktywności jest przywiązywany każdemu psu do obroży i codziennie dokonuje się pomiaru. Aktywność psów jest także oceniana wizualnie przez opiekujący się nimi personel.
Stan wszystkich psów jest wizualnie i dotykowo dobry, jak można się spodziewać po normalnych, zdrowych psach. Chociaż psy w grupach, które otrzymują psi pokarm B i C są zauważalnie bardziej aktywne niż ich odpowiedniki na diecie A. Odczyty licznika potwierdzają te obserwacje.
Dodatkowo, starsze psy w grupach B i C po dostarczaniu diety B i C przez próbny okres, wydają się wykazywać nieliczne oznaki miejscowego stanu zapalnego. Ponadto, wydaje się, że psy odczuwają niższy poziom bólu przy fizycznym ruchu i poruszają się swobodniej niż wcześniej. Można wnioskować, że diety B i C dostarczają ulgi w odniesieniu do pewnych oznak starzenia i polepszają ruchliwość starszych zwierząt.
P r z y k ł a d 14: Suchy pokarm koci
Mieszankę pokarmową wytwarza się z około 58% wagowych zboża, około 6% wagowych zbożowego glutenu, około 23% wagowych mięsa kurcząt, a sole, witaminy i minerały stanowią pozostałość
Mieszanka pokarmowa jest dostarczana do wstępnego mieszalnika fluktuacyjnego i nawilżana. Następnie nawilżona karma jest dostarczana do wytłaczarki na gorąco i żelowana. Żelowana matryca opuszczająca wytłaczarkę jest wypychana przez dyszę i wytłaczana. Półprodukt jest cięty na kawałki odpowiednie do karmienia kotów, suszony w około 110°C i oziębiany w celu uformowania kulek. Na tym etapie do kulek dodaje się jeden lub więcej szczepów Lactobacillus: Lactobacillus rhamnosus NCC2583 (CNCM I-2449), Lactobacillus acidophilus NCC2628 (CNCM I-2453) lub Enterococcus faecium SF68 (NCIMB 10415). Następnie odpowiedni proszek dostarczany jest w taki sposób, aby ilość właściwego dietetycznego dopływu wynosiła od 1,0E+07-1,0E+9 cfu/dzień. Trochę proszku miesza się z pierwszą masą kulek i wsypuje do worka. Dodatkową ilość proszku odmierza się i miksuje z nośnikiem lipidowym, którym następnie opryskuje się pozostałą masę granulek. Kulki po pokryciu są workowane i suszone w 50-60°C przez kilka minut.
P r z y k ł a d 15: Puszkowany pokarm zwierzęcy i suplement
Mieszankę wytwarza się z 73% zanieczyszczonej padliny, płuc świńskich i wątroby wołowej (podstawa), 16% mąki pszennej, 2% barwników, witamin i soli nieorganicznych. Taką mieszaninę emulguje się w 12°C i wypraża w formie puddingu, który wypieka się w temperaturze 90°C. Oziębia się do 30°C i tnie na kawałki. 45% kawałków miksuje się z 55% dodatków smakowych przygotowanych z 98% wody, 1% barwnika i 1% gumy guar. Puszki z blachy ocynowanej wypełnia się i sterylizuje w 125°C przez 40 minut. Jako probiotyczny dodatek do zmieszania z pokarmem zwierzęcym przed podaniem, dostarcza się opakowanie w formie saszetki ze szczepami następujących gatunków Lactobacillus: podaje się Lactobacillus rhamnosus NCC2583 (CNCM I-244 9), Lactobacillus acidophilus NCC2628 (CNCM I-2453) lub Enterococcus faecium SF68 (NCIMB 10415). Odpowiednia ilość dla zwierząt wynosi od około 106-1012 cfu/dzień, w zależności od tego, czy jest to kot czy pies i od czynników fizycznych, takich jak masa ciała. Jest to dostarczane jako dodatek w sposób usuwalny przymocowany do puszki, zgodnie z zaleceniami karmienia.

Claims (21)

1. Zastosowanie wyizolowanego probiotycznego szczepu bakterii kwasu mlekowego wybranego z rodzajów Lactobacillus, Bifidobacterium lub Enterococcus do wytwarzania kompozycji przeznaczonej do poprawy stanu zdrowia lub utrzymania w dobrym stanie zdrowia psa i kota, w tym ich układu pokarmowego, skóry, sierści, zębów, kości i układu odpornościowego.
2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że szczep ma zdolność do wzrostu produkując przynajmniej 1,0E+06 cfu/ml w obecności do 2% soli żółci.
3. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że szczep ma zdolność do wytwarzania co najmniej 1,0E+06 cfu/ml po 2 godzinach przy zakresie pH 3,4 do 4,2.
4. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że szczep jest wybrany z grupy składającej się z Lactobacillus reuteri, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus animalis, Lactobacillus ruminis, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus fermentum, Bifidobacterium sp. Enterococcus faecium, Enterococcus sp.
5. Zastosowanie według zastrz. 4, znamienne tym, że szczep jest Lactobacillus reuteri NCC2581 (CNCM I-244 8), Lactobacillus reuteri NCC2592 (CNCM I-2450), Lactobacillus rhamnosus NCC2583 (CNCM I-2449), Lactobacillus reuteri NCC2603 (CNCM I-2451), Lactobacillus reuteri NCC2613 (CNCM I-2452, Lactobacillus acidophilus NCC2628 (CNCM I-2453) lub Enterococcus faecium SF 68 (NCIMB 10415).
6. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że szczep jest zawarty w kompozycji w ilości od 1,0 E±04cfu/zwierzę i dzień do 1,0 E± 12 cfu/zwierzę i dzień.
7. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że kompozycja jest przeznaczona do leczenia i/lub profilaktyki zaburzeń związanych z kolonizacją przewodu pokarmowego kotów i/lub psów przez patogenne mikroorganizmy.
8. Zastosowanie według zastrz. 7, znamienne tym, że patogenne mikroorganizmy są szczepami Salmonella typhimurium, Escherichia coli, Schigella dysenteriaea lub innymi patogennymi enterobakteriami kolonizującymi koty i/lub psy lub pasożytami, takimi jak glisty (Toxocara spp.), pierwotniaki (Cryptosporidium spp., Giardia spp., Pentatrichomonas hominis, Entamoeba histolytica, Toxoplasma gonidii) lub drożdżami.
9. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że kompozycja jest przeznaczona do regulacji układu odpornościowego kota lub psa.
10. Zastosowanie według zastrz. 9, znamienne tym, że kompozycja jest przeznaczona do leczenia zaburzeń immunologicznych, takich jak alergia lub choroba zapalna jelit.
11. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że kompozycja jest przeznaczona do utrzymania lub poprawy stanu zdrowia skóry i/lub sierści kotów lub psów.
12. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że kompozycja jest przeznaczona do łagodzenia lub zmniejszania objawów starzenia się kota lub psa.
13. Kompozycja pokarmowa dla zwierząt domowych, znamienna tym, że zawiera przynajmniej jeden wyizolowany szczep bakterii kwasu mlekowego wybrany z grupy składającej się z Lactobacillus animals, Lactobacillus ruminie, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus reuteri NCC2581 (CNCM I-2448), Lactobacillus reuteri NCC2592 (CNCM2592 (CNCM I-2450), Lactobacillus rhamnosus NCC2583 (CNCM I-2449), Lactobacillus reuteri NCC2603 (CNCM I-2451), Lactobacillus reutheri NCC2613 (CNCM I-2452) i Lactobacillus acidophilus NCC2628 (CNCM I-2453) związany z nadającym się do spożycia nośnikiem.
14. Kompozycja pokarmowa według zastrz. 13, znamienna tym, że zachowuje lub poprawia funkcje układu pokarmowego kota lub psa.
15. Kompozycja pokarmowa według zastrz. 13, znamienna tym, że zachowuje lub poprawia stan zdrowia skóry i/lub sierści kota lub psa.
16. Kompozycja pokarmowa według zastrz. 13, znamienna tym, że reguluje układ odpornościowy kota lub psa.
17. Kompozycja pokarmowa według zastrz. 13, znamienna tym, że łagodzi lub zmniejsza objawy starzenia się kota lub psa.
18. Kompozycja według zastrz. 13-17, znamienna tym, że wyizolowany szczep jest w ilości od około 1,0E+04 cfu/zwierzę i dzień do 1,0E+12cfu/zwierzę i dzień.
19. Kompozycja pokarmowa według zastrz. 13-18, znamienna tym, że dodatkowo zawiera prebiotyk.
PL 207 930 B1
20. Kompozycja pokarmowa według zastrz. 13-19, znamienna tym, że występuje w postaci:
i) kompletnego odżywczo pokarmu dla domowych zwierząt w sproszkowanej, suchej lub wilgotnej postaci, schłodzonej lub nadającej się do przechowywania lub, ii) w postaci dietetycznego dodatku lub suplementu.
21. Izolowany szczep bakterii kwasu mlekowego, znamienny tym, że jest wybrany z grupy składającej się z Lactobacillus reuteri NCC2581 (CNCM I-2448), Lactobacillus reuteri NCC2592 (CNCM I-2450), Lactobacillus rhamnosus NCC2583 (CNCM I-2449), Lactobacillus reuteri NCC2603 (CNCM I-2451), Lactobacillus reuteri NCC2613 (CNCM I-2452) i Lactobacillus acidophilus NCC2628 (CNCM I-2453).
PL359182A 2000-05-25 2001-05-22 Zastosowanie wyizolowanego probiotycznego szczepu bakterii kwasu mlekowego o aktywności probiotycznej, kompozycja pokarmowa i izolowany szczep bakterii kwasu mlekowego PL207930B1 (pl)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP00201867 2000-05-25
EP01201503 2001-04-25
PCT/EP2001/006039 WO2001090311A1 (en) 2000-05-25 2001-05-22 Novel probiotics for pet food applications

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL359182A1 PL359182A1 (pl) 2004-08-23
PL207930B1 true PL207930B1 (pl) 2011-02-28

Family

ID=26072297

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL359182A PL207930B1 (pl) 2000-05-25 2001-05-22 Zastosowanie wyizolowanego probiotycznego szczepu bakterii kwasu mlekowego o aktywności probiotycznej, kompozycja pokarmowa i izolowany szczep bakterii kwasu mlekowego

Country Status (24)

Country Link
US (5) US7189390B2 (pl)
EP (2) EP1541673B1 (pl)
JP (2) JP4343477B2 (pl)
KR (1) KR100796963B1 (pl)
CN (1) CN100396769C (pl)
AR (1) AR029100A1 (pl)
AT (1) ATE325864T1 (pl)
AU (2) AU2001278432B2 (pl)
BR (1) BR0111275B1 (pl)
CA (1) CA2409286C (pl)
DE (2) DE60127731T2 (pl)
EA (1) EA006428B1 (pl)
ES (2) ES2284089T3 (pl)
HU (1) HU230800B1 (pl)
IL (2) IL152695A0 (pl)
MX (1) MXPA02011595A (pl)
MY (1) MY138070A (pl)
NO (1) NO330276B1 (pl)
NZ (1) NZ523010A (pl)
PE (1) PE20020232A1 (pl)
PL (1) PL207930B1 (pl)
UY (1) UY26734A1 (pl)
WO (1) WO2001090311A1 (pl)
ZA (1) ZA200210302B (pl)

Families Citing this family (123)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020035071A1 (en) * 1997-07-08 2002-03-21 Josef Pitha Mimicking the metabolic effects of caloric restriction by administration of glucose antimetabolites
US8563522B2 (en) * 1997-07-08 2013-10-22 The Iams Company Method of maintaining and/or attenuating a decline in quality of life
US20060116330A1 (en) * 1997-07-08 2006-06-01 The Iams Company Methods of mimicking the metabolic effects of caloric restriction by administration of mannoheptulose
US7608291B2 (en) * 2000-03-10 2009-10-27 Mars, Inc. Treatment of infection in animals
CN100396769C (zh) * 2000-05-25 2008-06-25 雀巢制品公司 宠物食物使用的新益生菌
US20040028665A1 (en) 2002-01-08 2004-02-12 Garner Bryan E. Compositions and methods for inhibiting pathogenic growth
US7291326B2 (en) 2003-01-06 2007-11-06 Nutrition Physiology Corporation Compositions and methods for reducing the pathogen content of meat and meat products
GB0212975D0 (en) * 2002-06-06 2002-07-17 Mars Uk Ltd Mammalian animal composition
US8168170B2 (en) * 2002-10-03 2012-05-01 The Procter And Gamble Company Compositions having an inner core and at least three surrounding layers
US20040197304A1 (en) * 2003-04-01 2004-10-07 The Procter & Gamble Company And Alimentary Health, Ltd. Methods of determining efficacy of treatments of inflammatory diseases of the bowel
US8877232B2 (en) 2003-06-20 2014-11-04 Nutrinia Ltd. Bioactive compounds protection method and compositions containing the same
US20050100559A1 (en) * 2003-11-07 2005-05-12 The Procter & Gamble Company Stabilized compositions comprising a probiotic
US20050118234A1 (en) * 2003-12-01 2005-06-02 The Iams Company Methods and kits related to administration of a fructooligosaccharide
US20050119222A1 (en) 2003-12-01 2005-06-02 The Iams Company Compositions comprising fermentable fiber which are adapted for use by a companion animal and kits and methods of their use
CN101001635A (zh) * 2003-12-04 2007-07-18 生物膜策略公司 预防生物膜形成、减少现有生物膜和减少细菌群的方法和组合物
US8894991B2 (en) 2003-12-19 2014-11-25 The Iams Company Canine probiotic Lactobacilli
US7785635B1 (en) * 2003-12-19 2010-08-31 The Procter & Gamble Company Methods of use of probiotic lactobacilli for companion animals
US20050152884A1 (en) * 2003-12-19 2005-07-14 The Procter & Gamble Company Canine probiotic Bifidobacteria globosum
US20050158294A1 (en) 2003-12-19 2005-07-21 The Procter & Gamble Company Canine probiotic Bifidobacteria pseudolongum
US8877178B2 (en) * 2003-12-19 2014-11-04 The Iams Company Methods of use of probiotic bifidobacteria for companion animals
JP2005224108A (ja) * 2004-02-10 2005-08-25 Yamahisa:Kk ペット用スナックフード
GB0406654D0 (en) * 2004-03-24 2004-04-28 Mars Inc Foodstuff
WO2005115473A2 (en) * 2004-05-24 2005-12-08 Nutrinia Ltd. Nutritional food and feed, composition, processing and method of use
KR100595528B1 (ko) * 2004-08-21 2006-07-03 전덕영 내산성, 내산소성 및 내염성이 우수한 비피도박테리움 아니말리스 ｄｙ－６４ 및 이를 함유한 식품
EP1634948A1 (en) 2004-09-10 2006-03-15 Basf Aktiengesellschaft Means and methods for preventing and/or treating caries
EP1952701B2 (en) * 2004-09-21 2020-03-04 Société des Produits Nestlé S.A. Improving weight control of elderly pets
US20060228448A1 (en) * 2005-04-11 2006-10-12 The Iams Company Pet food compositions comprising two components
US20100233312A9 (en) * 2005-04-11 2010-09-16 The Procter & Gamble Company Compositions comprising probiotic and sweetener components
BRPI0611492B1 (pt) * 2005-05-31 2021-10-13 Mars, Incorporated Bifidobactéria probiótica felina
AU2011202947B2 (en) * 2005-05-31 2011-11-03 Alimentary Health Ltd Feline probiotic lactobacilli
CA2609617C (en) * 2005-05-31 2014-07-08 The Iams Company Feline probiotic lactobacilli
ITMI20051137A1 (it) * 2005-06-17 2006-12-18 Ista S P A Metodo per prevenire l'inattivazione da parte di batteriofagi specifici di miscele di ceppi probiotici utilizzati negli allevamenti animali
KR100720025B1 (ko) * 2005-09-27 2007-05-21 (주)바이오토피아 프로바이오틱 유산균 및 이를 포함하는 조성물
US20070280964A1 (en) * 2005-10-06 2007-12-06 Ruth Knorr Compositions and methods useful for modulating immunity, enhancing vaccine efficacy, decreasing morbidity associated with chronic FHV-1 infections, and preventing or treating conjunctivitis
ES2346693T3 (es) * 2005-10-06 2010-10-19 Nestec S.A. Enterococos probioticos que permiten mejorar la unidad.
JP4897426B2 (ja) * 2005-10-18 2012-03-14 花王株式会社 ペットフード
AU2006304913A1 (en) * 2005-10-19 2007-04-26 Hill's Pet Nutrition, Inc. Methods and compositions for improving gastrointestinal health
EP1978821B2 (en) * 2005-12-29 2019-02-06 Hill's Pet Nutrition, Inc. Method for modifying gut flora in animals
PL2004201T3 (pl) * 2006-03-29 2019-02-28 Nestec S.A. Suplementy diety zawierające probiotyki
WO2007138993A1 (ja) * 2006-05-31 2007-12-06 Meiji Dairies Corporation 免疫調節活性の高い乳酸菌の培養法
FR2903574B1 (fr) * 2006-07-13 2008-09-05 Gervais Danone Sa Granules de cysteine et leurs utilisations a titre d'activateurs de croissance de bifidobacterium animalis lactis.
KR100720024B1 (ko) * 2006-12-20 2007-05-18 (주)바이오토피아 프로바이오틱 비피도박테리움 보움 ｒ5 균주 및 이를포함하는 조성물
PL2124966T3 (pl) 2007-02-01 2016-01-29 Iams Europe B V Sposób zmniejszania reakcji zapalnej i stresu u ssaków za pomocą antymetabolitów glukozy, awokado lub ekstraktów awokado
US7910127B2 (en) * 2007-03-02 2011-03-22 Biogaia Ab Use of lactic acid bacteria for improving food lysine absorption of pet animals
CN101820773A (zh) * 2007-08-29 2010-09-01 马斯公司 单包猫粮产品及其制造方法
US9771199B2 (en) 2008-07-07 2017-09-26 Mars, Incorporated Probiotic supplement, process for making, and packaging
US9232813B2 (en) * 2008-07-07 2016-01-12 The Iams Company Probiotic supplement, process for making, and packaging
AU2009333807B2 (en) 2009-01-02 2015-07-30 Société des Produits Nestlé S.A. Food compositions having a realistic meat-like appearance, feel and texture
US9474773B2 (en) 2009-02-18 2016-10-25 University Of Florida Research Foundation, Inc. Lactobacillus supplement for alleviating type 1 diabetes
US20100233347A1 (en) 2009-03-13 2010-09-16 Uhrhan Richard B Food compositions having a realistic meat-like appearance, feel, and texture
DE102009032712A1 (de) * 2009-05-22 2010-11-25 Growth Finance Plus Ag Tierfutter
US10104903B2 (en) 2009-07-31 2018-10-23 Mars, Incorporated Animal food and its appearance
US20110027420A1 (en) * 2009-07-31 2011-02-03 Haile Mehansho Moisture migration reduction layer for a food product
US8691303B2 (en) * 2009-07-31 2014-04-08 The Iams Company Dusted animal food
US9173423B2 (en) * 2009-07-31 2015-11-03 The Iams Company Animal food kibble with electrostatically adhered dusting
US20110027417A1 (en) 2009-07-31 2011-02-03 Patrick Joseph Corrigan Process for Dusting Animal Food
US9210945B2 (en) * 2009-07-31 2015-12-15 The Iams Company Animal food having low water activity
FI122247B (fi) 2009-08-12 2011-10-31 Vetcare Oy Probioottinen valmiste koiran maha- ja suolistokanavassa ilmenevien häiriöiden ennaltaehkäisemiseksi tai hoitamiseksi
MX2012005449A (es) 2009-11-11 2012-09-07 Iams Company Una cepa de bifidobacterium.
CN102651973A (zh) 2009-12-18 2012-08-29 希尔氏宠物营养品公司 包含益生菌的宠物食物组合物及其制造和使用方法
EP2575474B1 (en) 2010-05-26 2017-04-26 Nestec S.A. Methods for increasing the production or activity of catalase
WO2012039745A1 (en) * 2010-09-23 2012-03-29 Nestec S.A. Methods and compositions for preventing or treating osteoarthritis
WO2012060884A1 (en) * 2010-11-04 2012-05-10 Nestec S.A. Methods and compositions for preventing and treating osteoarthritis
ES2565407T3 (es) * 2010-11-05 2016-04-04 Nestec S.A. Procedimiento para la preparación de un producto alimenticio para animales de compañía, el cual contiene microorganismos probióticos
EP2449890A1 (en) * 2010-11-05 2012-05-09 Nestec S.A. Powdered cereal compositions comprising non-replicating probiotic microorganisms
EP2452576A1 (en) * 2010-11-11 2012-05-16 Nestec S.A. Extruded non-replicating probiotic micro-organisms and their health benefits
US20140205569A1 (en) * 2010-12-21 2014-07-24 Nierissa NIELSEN Methods and compositions for preventing and treating osteoarthritis
JP2014504605A (ja) 2011-01-25 2014-02-24 ネステク ソシエテ アノニム 動物の視覚系の劣化を治療、緩和又は予防するための方法及び組成物
AU2012231351B2 (en) 2011-03-18 2016-03-10 Société des Produits Nestlé S.A. Compositions and methods useful for ameliorating age related maladies
MX2013011996A (es) 2011-04-15 2013-11-01 Nestec Sa Metodos para regular la expresion de genes de sirtuina.
CN102250799B (zh) * 2011-06-22 2013-09-11 南京农业大学 草酸降解菌njode1及其应用
US20130045185A1 (en) * 2011-08-18 2013-02-21 Dupont Nutrition Biosciences Aps Strains and methods useful for mycotoxins
US9113653B2 (en) 2011-08-19 2015-08-25 Steven J Maranz Methods of administering probiotic organisms that synthesize carotenoid compounds in situ to enhance human health and nutrition
CN102399733B (zh) * 2011-12-14 2014-07-09 北京大北农科技集团股份有限公司 约氏乳杆菌及其菌剂、应用和预混料
CN102578415B (zh) * 2012-02-23 2016-01-20 北京大北农科技集团股份有限公司 约氏乳杆菌在制备提高禽类产蛋性能和蛋品质饲料中的应用
US9585925B1 (en) * 2012-05-04 2017-03-07 Vetnique Labs LLC Pet food supplement
EP2900805B1 (en) * 2012-09-25 2022-11-23 Aquilón Cyl S.L. Probiotic and prebiotic compositions
US10413577B2 (en) * 2013-02-22 2019-09-17 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for promoting growth of beneficial microbes to treat or prevent disease or prolong life
CN104286408B (zh) * 2014-06-13 2017-10-24 杨雄 一种嗜酸乳杆菌xd13r制备的生物制剂在减少宠物体内抗药性细菌比例的应用方法
EP3223633A1 (en) 2014-11-25 2017-10-04 Nestec S.A. Methods and compositions for promoting lean body mass and minimize body fat gain and managing weight
RU2693659C2 (ru) 2014-11-25 2019-07-03 Нестек Са Способы и композиции для сохранения безжировой массы тела и стимулирования потери жира во время потери массы
US9675667B2 (en) * 2015-02-10 2017-06-13 Massachusetts Institute Of Technology Isolated mucins and different microorganisms, and methods of use
CA2975217C (en) 2015-02-13 2023-08-15 Mars, Incorporated Pet food feeding system
US11304428B2 (en) 2015-02-16 2022-04-19 Mars, Incorporated Interlocking kibble
EP3288394A4 (en) 2015-04-28 2019-01-23 Mars, Incorporated PROCESS FOR THE PREPARATION OF A STERILIZED WASTE FOOD PRODUCT
GB201520497D0 (en) * 2015-11-20 2016-01-06 4D Pharma Res Ltd Compositions comprising bacterial strains
RS57471B1 (sr) 2015-12-17 2018-09-28 Institut Za Molekularnu Genetiku I Geneticko Inzenjerstvo Univerzitet U Beogradu Nova probiotička starter kultura za humanu i animalnu primenu
US20170173138A1 (en) * 2015-12-22 2017-06-22 Nestec Sa Immune health for companion animals
BR112018013052A2 (pt) * 2015-12-24 2018-12-04 Dairy A Day Inc composições e métodos de uso de novas cepas de lactobacillus fermentum
AU2017237164A1 (en) 2016-03-24 2018-10-11 Nutrinia Ltd. Use of insulin for promoting gastric emptying
EP3596223B1 (en) * 2017-03-15 2023-06-07 Société des Produits Nestlé S.A. Branched alpha glucans
US11357803B2 (en) 2017-09-22 2022-06-14 Iowa State University Research Foundation, Inc. Probiotic compositions for production of dopamine
CN107821753A (zh) * 2017-11-20 2018-03-23 江苏雅博动物健康科技有限责任公司 一种宠物用益生菌颗粒制剂及其制备方法
WO2019118843A1 (en) * 2017-12-14 2019-06-20 Pure Cultures, Inc. Probiotics and fermentation metabolites for the prevention and treatment of disease conditions in animals
FI128916B (en) 2018-02-05 2021-03-15 Vetcare Oy Health-promoting composition and method for its preparation
KR102079794B1 (ko) * 2018-09-18 2020-02-20 전북대학교산학협력단 신규한 엔테로코커스 패시움 균주 및 이의 용도
MX2021004361A (es) 2018-10-18 2021-05-28 Hills Pet Nutrition Inc Composiciones alimenticias para mascotas.
WO2020121145A1 (en) 2018-12-13 2020-06-18 Societe Des Produits Nestle Sa Methods for enhancing metabolic health in an animal
CA3122205A1 (en) 2018-12-13 2020-06-18 Societe Des Produits Nestle Sa Methods for increasing fat oxidation or energy expenditure or satiety in an animal
CN111172055B (zh) * 2019-03-14 2022-06-10 南京农业大学 副干酪乳杆菌lhz-1及其在去除脱氧雪腐镰刀菌烯醇中的应用
US20220305063A1 (en) * 2019-05-30 2022-09-29 New York University Probiotic compositions and methods of use
WO2020243676A1 (en) * 2019-05-31 2020-12-03 South Dakota Board Of Regents Technology Transfer Office Probiotics to inhibit enteric pathogens
US20230063695A1 (en) * 2019-09-13 2023-03-02 Aquilon Cyl S.L. Fermented milk product for administration in canids such as dogs, and uses thereof
CL2019003739A1 (es) * 2019-12-18 2020-06-19 Univ Concepcion Cepas probióticas de lactobacillus sp. y de pediococcus sp. y su uso en la elaboración de una formulación probiótica para prevención de diarreas causadas por patógenos bacterianos que afectan a perros y gatos.
BR112022009857A2 (pt) 2019-12-19 2022-08-02 Nestle Sa Composições e métodos para fornecer um benefício de saúde a um animal em crescimento
JP2021136951A (ja) * 2020-03-06 2021-09-16 学校法人麻布獣医学園 乳酸菌含有組成物
EP4125412A1 (en) * 2020-05-29 2023-02-08 Société des Produits Nestlé S.A. Compositions and methods for digestive health in an animal
JP2023540019A (ja) 2020-09-03 2023-09-21 ソシエテ・デ・プロデュイ・ネスレ・エス・アー 動物において健康上の利益をもたらすための組成物及び方法
JP2023541120A (ja) 2020-09-04 2023-09-28 ソシエテ・デ・プロデュイ・ネスレ・エス・アー 動物において健康上の利益を提供するための組成物及び方法
CN112266876A (zh) * 2020-11-02 2021-01-26 湖南海路生物科技有限公司 用于分离粪便中菌群的智能分离系统
KR102554078B1 (ko) * 2020-12-08 2023-07-10 건국대학교 산학협력단 애완동물을 위한 대사체 전환능 기반 유산균 조합 정보 제공 장치 및 방법
WO2022123358A1 (en) 2020-12-11 2022-06-16 Societe Des Produits Nestle Sa Compositions and methods for pet food
CN114437959B (zh) * 2021-11-29 2022-11-18 内蒙古普泽动保生物技术有限公司 一种动物双歧杆菌及其在抗氧化和提升免疫中的应用
US20230165277A1 (en) 2021-11-29 2023-06-01 Société des Produits Nestlé S.A. Methods and compositions for providing a health benefit in an animal
US20230165281A1 (en) 2021-11-29 2023-06-01 Société des Produits Nestlé S.A. Methods and compositions for providing a health benefit in an animal
WO2023104887A1 (en) * 2021-12-09 2023-06-15 Société des Produits Nestlé S.A. Lactobacillus acidophilus to increase agmatine production by microbiota
CN114292779A (zh) * 2021-12-22 2022-04-08 清远西周生物医药科技有限公司 一种副干酪乳杆菌冻干粉、其应用及制备方法
WO2023247472A1 (en) * 2022-06-22 2023-12-28 Cerbios-Pharma Sa Probiotic for use in the treatment of inflammatory alterations of the intestinal mucosa, particularly obesity
WO2024057113A1 (en) 2022-09-13 2024-03-21 Societe Des Produits Nestle Sa Methods for providing and determining an efficacious weight loss diet for a canine
US20240081374A1 (en) 2022-09-14 2024-03-14 Société des Produits Nestlé S.A. Compositions and methods utilizing southern ocean mackerel oil for providing health benefits in an animal
KR102554206B1 (ko) * 2022-12-01 2023-07-13 (주)에이앤바이오 구강 항산화 증진을 통한 반려동물 치석 제거, 구취 개선, 잇몸 보호에 도움을 주는 카탈라아제 함유 반려동물 구강 건강 증진용 조성물
CN116333922A (zh) * 2023-02-10 2023-06-27 宁波希诺亚海洋生物科技有限公司 一株来源于深海大鱿鱼的鼠李糖乳杆菌菌株及其应用
KR102625196B1 (ko) * 2023-04-19 2024-01-15 박종호 기호도가 우수한 반려동물용 유산균 영양제 조성물

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4160038A (en) * 1976-08-09 1979-07-03 Microlife Technics, Inc. Lactic acid fermentate flavored pet food
JPH07194317A (ja) * 1993-12-29 1995-08-01 Nichinichi Seiyaku Kk ペットフード
AUPM823094A0 (en) * 1994-09-16 1994-10-13 Goodman Fielder Limited Probiotic compositions
PT862863E (pt) * 1997-01-09 2002-04-29 Nestle Sa Produto cerealifero contendo probioticos
US5986569A (en) * 1997-03-20 1999-11-16 Micron Communications, Inc. Radio frequency identification system, radio frequency identification device package, and method of use of radio frequency identification device
WO1999017788A1 (en) * 1997-10-06 1999-04-15 Abbott Laboratories Composition of treatment of candidiasis
US5902743A (en) 1998-03-20 1999-05-11 Wisconsin Alumni Research Foundation Probiotic bifidobacterium strain
JP4227690B2 (ja) * 1998-10-29 2009-02-18 株式会社バイオテックジャパン ペットフード
CN1244684C (zh) * 1999-03-11 2006-03-08 雀巢制品公司 能够预防病原细菌和轮状病毒引起的腹泻的乳杆菌菌株
EP1034787A1 (en) * 1999-03-11 2000-09-13 Société des Produits Nestlé S.A. Lactobacillus strains preventing diarrhea caused by pathogenic bacteria
CN100396769C (zh) * 2000-05-25 2008-06-25 雀巢制品公司 宠物食物使用的新益生菌

Also Published As

Publication number Publication date
ES2284089T3 (es) 2007-11-01
KR100796963B1 (ko) 2008-01-22
JP4343477B2 (ja) 2009-10-14
MXPA02011595A (es) 2003-03-27
JP2003534003A (ja) 2003-11-18
US20100266549A1 (en) 2010-10-21
US7189390B2 (en) 2007-03-13
UY26734A1 (es) 2001-11-30
IL152695A (en) 2010-02-17
CN100396769C (zh) 2008-06-25
NO330276B1 (no) 2011-03-21
DE60127731D1 (de) 2007-05-16
US20050106133A1 (en) 2005-05-19
BR0111275A (pt) 2003-06-10
US20070178079A1 (en) 2007-08-02
EP1541673B1 (en) 2007-04-04
US20080171106A1 (en) 2008-07-17
IL152695A0 (en) 2003-06-24
EA006428B1 (ru) 2005-12-29
DE60119515T2 (de) 2007-05-24
US8771675B2 (en) 2014-07-08
PE20020232A1 (es) 2002-04-16
CN1444647A (zh) 2003-09-24
EP1290136B1 (en) 2006-05-10
HUP0301939A2 (hu) 2003-09-29
DE60119515D1 (de) 2006-06-14
US20030190309A1 (en) 2003-10-09
BR0111275B1 (pt) 2013-06-18
CA2409286C (en) 2012-05-15
AR029100A1 (es) 2003-06-04
HUP0301939A3 (en) 2004-04-28
CA2409286A1 (en) 2001-11-29
ATE325864T1 (de) 2006-06-15
NZ523010A (en) 2004-06-25
US7771982B2 (en) 2010-08-10
PL359182A1 (pl) 2004-08-23
AU2001278432B2 (en) 2007-08-30
ES2262667T3 (es) 2006-12-01
ZA200210302B (en) 2004-03-19
DE60127731T2 (de) 2007-08-16
HU230800B1 (hu) 2018-06-28
AU7843201A (en) 2001-12-03
WO2001090311A1 (en) 2001-11-29
NO20025528D0 (no) 2002-11-18
JP4456649B2 (ja) 2010-04-28
EA200201284A1 (ru) 2003-06-26
KR20030010633A (ko) 2003-02-05
NO20025528L (no) 2002-12-18
US7381406B2 (en) 2008-06-03
EP1290136A1 (en) 2003-03-12
JP2009096811A (ja) 2009-05-07
US8124070B2 (en) 2012-02-28
MY138070A (en) 2009-04-30
EP1541673A1 (en) 2005-06-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7189390B2 (en) Probiotics for pet food applications
CA2607949C (en) Feline probiotic bifidobacteria
US7998473B2 (en) Methods of treatment or prevention of gastrointestinal disorders using canine probiotic bifidobacterium
ES2366542T3 (es) Lactobacillus probióticos caninos.
EP1880001B1 (en) Feline probiotic lactobacilli
AU2001278432A1 (en) Novel probiotics for pet food applications
CA2550307C (en) Canine probiotic bifidobacteria globosum
AU2011202947B2 (en) Feline probiotic lactobacilli

Legal Events

Date Code Title Description
RECP Rectifications of patent specification