NO330276B1 - Probiotisk stamme og ernaeringssammensetning for hunder og katter inneholdende denne nye probiotika til anvendelse i kjaeledyrfôr - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår nye melkesyrebakterier og spesielt mikroorganismer av arten Lactobacillus, som er isolert og selektert for sitt probiotiske potensiale. Foreliggende oppfinnelse angår også en ernæringssammensetning inneholdende en slik stamme med hensikt å forbedre helsen til kjæledyr. Det kan derved oppnås opprettholdelse eller forbedring av kjæledyrs helse ved mating av et kjæledyr med slike ernæringssammen-setninger.

O ppfinnelsens bakgrunn

Husdyrs trivsel er nært knyttet til matingen av dem. Riktig mating bør resultere i et friskt og sunt kjæledyr. I tillegg til å sørge for næringsverdi, virker forsammensetningen inn på tarmens mikroflora-likevekt og kan føre til eller forebygge mage-tarm forstyrrelser. Derfor er kunnskap om mage-tarm kanalen og fordøyelsesprosesser hos friske dyr vesentlig for forståelsen av en praktisk foringspraksis. Som kjøttetere kjennetegnes katter og hunder av en kort fordøyelseskanal og en hurtig flythastighet av for-bolus.

Blant bestanddelene i mage-tarm mikrofloraen hos katter og hunder kan Bacteroides sp., Clostridium sp., Enterobacteriaceae, Bifidobacterium sp., Lactobacillus sp., Strep-tococcus sp., Staphylococcus sp. og gjær gjenvinnes.

Antallet og sammensetningen til denne endogene floraen har en tilbøyelighet til å være svært stabil selv om alder, og i mindre grad for, kan modifisere det. Magesyre, galle, tarmperistaltikk og lokal immunitet er faktorer som antas å være viktige i reguleringen av bakterieflora i tynntarmen hos mennesker og ulike andre pattedyr.

Ofte er mage-tarm forstyrrelser hos dyr som tilhører hunde- og katteslekten knyttet til kraftig vekst av bakterier og produksjonen av enterotoksiner som produseres av patogene bakterier.

I løpet av de siste årene har forskere fokusert på noen verdifulle stammer av melkesyrebakterier og deres potensielle anvendelse som probiotiske midler. Probiotika anses for å være levende mikrobielle preparater som fremmer helsen hos pattedyr ved å bevare den naturlige mikrofloraen i tarmen. Probiotika tenkes å angripe slimhinnen i tarmen, kolonisere tarmkanalen og derved forhindre angrep ved skadelige mikroorganismer på den. En betingelse for deres virkning ligger i at de må nå slimhinnen i tarmen i en riktig og levedyktig form og spesielt ikke bli ødelagt ved innvirkningen av den lave pH som er vanlig i magen. Spesielt er fysiologien i fordøyelseskanalen hos katter og hunder for skjellig fra den hos mennesker. For eksempel er den gjennomsnittlige pH-verdien i magen omkring 3.4 hos hunder og 4.2 hos katter.

Selv om US 5968569 beskriver innbefatning av en probiotisk mikroorganisme i en kornblanding til kjæledyr, tilveiebringer verken den eller den resterende tilgjengelige teknikk informasjon som angår stammer som er spesifikt ment for kjæledyrs helse.

WO 8905849 beskriver Lactobacillus- stammer isolert fra mage-tarm-kanalen hos små griser. Disse stammene kan kolonisere vertsorganismen som er de isolert fra.

Fujisawa et al, J. Vet.Med. Sei., vol.58, nr.6,1996, s. 591-593, beskriver at visse Lactobacillus- stammer kan isoleres fra hunde-faeces og er meget species-spesifikke. Selv om hunde-faeces er en kilde for Lactobacillus- stammer finnes det ingen antydning i publi-kasjonen om at disse mikroorganismene kan anvendes som probiotikum.

Som en konsekvens av dette, er det et behov for å tilveiebringe nye bakteriestammer som er spesielt egnet for kjæledyr og som er selektert for sine sterke probiotiske egenskaper som er fordelaktige for kjæledyrs helse, og for å inkorporere disse stammene i en forsammensetning til kjæledyr.

O ppsummering av oppfinnelsen

Det første aspekt ved oppfinnelsen er en probiotisk stamme , kjennetegnet ved at den er Lactobacillus reuteri NCC2581 (CNCM 1-2448), Lactobacillus reuteri NCC2592 (CNCM1-2450), Lactobacillus rhamnosus NCC2583 (CNCM 1-2449), Lactobacillus reuteri NCC2603 (CNCM 1-2451), Lactobacillus reuteri NCC2613(CNN 1-2452), Lactobacillus acidophilus NCC2628 (CNCM 1-2453)

Den nye bakteriestammen kan anvendes i hvilken som helst mengde fra omkring 1.0E+04 til omkring l.OE+11 cfu/dyr og dag og fortrinnsvis fra 1.0E+05 til omkring l.OE+11 cfu/dyr og dag og mest foretrukket fra 1.0E+07 til omkring l.OE+10 cfu/dyr og dag.

I et aspekt angår oppfinnelsen en ernæringssammensetning for hunder og katter, inneholdende minst en probiotisk stamme som omtalt ovenfor, assosiert med en spiselig bærer eller en farmasøytisk matriks.

Sammensetningen ifølge oppfinnelsen kan anvendes for regulering av immunresponsen hos kjæledyr. Med betegnelsen "regulere" immunresponsen er det ment at bakteriestammene som er beskrevet over har kapasitet enten til å stimulere visse immunfunksjoner som er viktige for kjæledyrenes helse, eller modulere andre immunfunksjoner som potensielt kan være implikert i forstyrrelser i immunforsvaret, slik som inflammasjon, allergi etc. Stimuleringen eller moduleringen av disse immunfunksjonene kan oppnås ved anvendelse av ulike kombinasjoner av bakteriestammene som er beskrevet over og/eller deres kultursupernatant og/eller metabolitter.

Stammene ifølge oppfinnelsen kan anvendes i en fremgangsmåte for å bevare eller forbedre helsen i mage-tarmkanalen, huden og/eller pelssystemet eller immunsystemet hos et kjæledyr, og som omfatter trinnet å mate kjæledyret med en kjæledyrfor-sammensetning som inneholder minst en isolert stamme, slik som beskrevet over.

I tillegg tilveiebringer kan stammene ifølge oppfinnelsen anvendes i en fremgangsmåte for behandling og/eller profylakse av forstyrrelser som er forbundet med patogene mik-roorganismers kolonisering i mage-tarmkanalen hos kjæledyr og som omfatter trinnet med å mate kjæledyret med en kjæledyrfor-sammensetning som inneholder minst en isolert stamme ifølge foreliggende oppfinnelse.

Stammen ifølge oppfinnelsen kan også anvendes i en fremgangsmåte til regulering av immunresponsen i kjæledyr som omfatter trinnet med å mate kjæledyret med en kjæledyrfor-sammensetning som inneholder minst en isolert stamme ifølge foreliggende oppfinnelse.

Videre kan stammene anvendes i en fremgangsmåte til forbedring eller reduksjon av effektene av aldring i et kjæledyr, som omfatter trinnet med å mate kjæledyret med en kjæledyrfor-sammensetning som inneholder minst en isolert stamme ifølge foreliggende oppfinnelse.

Disse selekterte mikroorganismene har en spesielt gunstig virkning på kjæledyr i mage-tarmkanalen, huden og/eller pelsen deres, på immunsystemet og på effektene av aldring.

De har en spesielt fordelaktig virkning på tarmpatogener, slik som stammer Salmonella typhimurium, Escherichia coli, Shigella dysenteriaea eller andre patogene enterobakte-rieceae som koloniserer kjæledyr eller parasitter slik som innvollsormer ( Toxocara spp.), protozoer { Cryptosporidium spp, Giardia spp., Pentatrichomonas hominis, Enta-moeba histolytica, Toxoplasma gondii, ...) eller gjær.

Kombinert med for, utøver disse mikroorganismene spesielt sine probiotiske gunstige effekter på palatabilitet, fordøyelse og tarmhelse, immunfunksjon og sanitærforhold, sistnevnte ved å bidra til en reduksjon av avføringsvolumet og minst en delvis deodorisering av avføringen til dyr av hundeslekten. En ernæringssammensetning ifølge oppfinnelsen omfatter følgelig en mikroorganisme som har høy probiotisk aktivitet i kjæledyr og som er istand til å overleve og kolonisere mage-tarmkanalen hos et kjæledyr som inntar den.

Som en følge av dette, er ernæringssammensetningen i følge oppfinnelsen gunstig for mage-tarmkanalhelsen hos kjæledyr, idet den inneholder minst en probiotikastamme som er isolert slik som beskrevet over som er forbundet med en inntagbar bærer ("ingestible support") eller en farmasøytisk matriks.

Ernæringssammensetningen ifølge oppfinnelsen er videre gunstig for regulering av immunresponsen hos kjæledyr.

Endelig påvirker ernæringssammensetningen ifølge oppfinnelsen helsen til huden og/eller pelsen hos kjæledyr.

Nevnte sammensetning inneholder fortrinnsvis tilstrekkelig mengde av den isolerte stammen, til å være effektiv i å tilveiebringe nevnte profylaktiske effekt når sammensetningen gis til et kjæledyr som et komplett måltid.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

I følgende beskrivelse betegner forkortelsen cfu ("koloni-dannende-enhet", "colony-forming-unit") antall bakterieceller som fremkommer ved mikrobiologiske tellinger på agarplater.

Dessuten betegner "NCC" Nestlé Culture Collection (Nestlé Research Center, Vers-chez-les-Blanc, Lausanne, Sveits).

Med hensyn til den første gjenstanden for foreliggende oppfinnelse, ble 20 laktobacilli og 18 bifidobakterier isolert fra katte- og hundeavføring, screenet og selektert med hensyn til deres teknologiske og fysiologiske parametre.

En første screening for potensielle probiotiske anvendelser ble utført in vitro (se eksempler 1 og 2): vekstkarakteristikker, toleranse for magesyre ved ulike pH-verdier og ulike konsentrasjoner av gallesalter som er tilstede i tolvfingertarmen og som er sannsynlig å finne i katter og hunder.

Dessuten ble den gode overlevelsen av frysetørkede celler i to ulike cryoprotektive me-dier tydelig demonstrert ved 4°C og 20°C, slik som indikert ved en akselerert oppbeva-ringstest.

Disse stammene kjennetegnes av korte generasjonstider, høye tellinger (mer enn 1.0E+08 cfu/ml) i løpet av stasjonærfasen og stabilitet i høye tall 8 og 24 timer post-inokkulering, stabilitet ved frysetørking etterfulgt av enten oppbevaringsforhold, resistens mot fysiologiske gallekonsentrasjoner funnet i tolvfingertarmen (2 % galle) og deres lave inhibering når de dyrkes i nærvær av opp til 4 % galle. Dessuten ble resultater fra DNA-analyser tatt med i beregningen for å selektere bakterier som er representative for den undersøkte diversiteten.

Stammene som er ment for katter og hunders helse kan vokse opp til minst 1 .OE+06 cfu/ml i nærvær av opp til 2.0 % gallesalter. Stammene kan også vokse opp til minst 1.OE+06 cfu/ml etter omkring 2 timer i et pH-område fra omkring 3.4 til 4.2.

Bakteriestammene ifølge oppfinnelsen kan selekteres fra gruppen som består av Lactobacillus reuteri, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus rhamnosus.

Følgende stammer Lactobacillus reuteri NCC2581, Lactobacillus rhamnosus NCC2583, Lactobacillus reuteri NCC2592, Lactobacillus reuteri NCC2603, Lactobacillus reuteri NCC2613 og Lactobacillus acidophilus NCC2628 er deponert i henhold til Budapest Avtalen hos Collection National de Culture de Micro-organismes, 25 rue du docteur Roux, 75724 Paris, Frankrike 19. april 2000, med følgende referanser CNCM 1-2448, CNCM 1-2449, CNCM 1-2450, CNCM 1-2451, CNCM 1-2452 og CNCM 1-2453. Alle begrensninger med hensyn til tilgjengeligheten av disse depone-ringene vil bli fjernet ved første publisering av denne søknaden eller en annen søknad som krever prioritet fra denne søknaden.

BIOKJEMISK KARAKTERISERING AV SELEKTERTE STAMMER

Lactobacillus reuteri CNCM 1-2448

- Gram positiv mikroorganisme, ikke-motil, ikke-sporedannende

- Ganske korte og tykke staver

Mikroaerofil mikroorganisme med heterofermentativ metabolisme, produksjon av

L(+) og D(-) melkesyre.

- Katalase (-), produksjon av CO2fra glukose, hydrolyse av arginin = NH3 produksjon

- Vekst med 5% og 10% NaCl

- Fermentering av sukkere: L-arabinose, galaktose, D-glukose, laktose, sakkarose, D-raffinose

Lactobacillus rhamnosus CNCM 1-2449

- Gram positiv mikroorganisme, ikke-motil, ikke-sporedannende

- Ganske korte og tykke staver

- Mikroaerofil mikroorganisme med heterofermentativ metabolisme, produksjon av

L(+) melkesyre.

- Katalase (-)

- Fermentering av alle sukkere typisk for Lb. rhamnosus

Lactobacillus reuteri CNCM 1-2450

- Gram positiv mikroorganisme, ikke-motil, ikke-sporedannende

- Ganske korte og tykke staver

- Mikroaerofil mikroorganisme med heterofermentativ metabolisme, produksjon av

L(+) og D(-) melkesyre.

- Katalase (-), produksjon av CO2fra glukose, hydrolyse av arginin = NH3 produksjon

- Vekst med 5% og 10% NaCl

- Fermentering av sukkere: L-arabinose, galaktose, D-glukose, D-xylose, laktose, sakkarose, D-raffinose

Lactobacillus reuteri CNCM 1-2451

Gram positiv mikroorganisme, ikke-motil, ikke-sporedannende

- Ganske korte og tykke staver

Mikroaerofil mikroorganisme med heterofermentativ metabolisme, produksjon av L(+) og D(-) melkesyre. - Katalase (-), produksjon av CO2fra glukose, hydrolyse av arginin = NH3 produksjon

- Vekst med 5% og 10% NaCl

- Fermentering av alle sukkere som er typisk for Lb. reuteri

Lactobacillus reuteri CNCM 1-2452

Gram positiv mikroorganisme, ikke-motil, ikke-sporedannende

- Ganske korte og tykke staver

- Mikroaerofil mikroorganisme med heterofermentativ metabolisme, produksjon av

L(+) og D(-) melkesyre.

- Katalase (-), produksjon av CO2fra glukose, hydrolyse av arginin = NH3 produksjon

- Vekst med 5% og 10% NaCl

Fermentering av sukkere: L-arabinose, D-glukose, laktose, sakkarose, D-raffinose

Lactobacillus reuteri CNCM 1-2453

- Gram positiv mikroorganisme, ikke-motil, ikke-sporedannende Ganske korte og tykke staver - Mikroaerofil mikroorganisme med heterofermentativ metabolisme, produksjon av

L(+) og D(-) melkesyre.

- Katalase (-),

Fermentering av sukkere: D-glukose, laktose, sakkarose, D-raffinose

Tre laktobacilli som er isolert fra katter (NCC2581, NCC2592, NCC2583), tre lactoba-cilli fra hunder (reuteri NCC2603, NCC2613 NCC2628) en bifidobakterie fra katter (NCC2627) og en bifidobakterie fra hunder (NCC2657) ble videre testet for sin probiotiske potensielle aktivitet i kjæledyr (se eksempler 3 og 4).

Bakteriestammer slik som beskrevet over, kan følgelig anvendes til fremstilling av en forsammensetning som er istand til å forbedre eller opprettholde helsen hos kjæledyr.

De kan anvendes i sin levedyktige form, inaktivert form, som en kultursupernatant eller fraksjoner derav, f. eks. cellevegger, peptidoglykan, cytoplasma, rensede proteiner, funksjonelle metabolitter, bioaktive molekyler.

De anvendes fortrinnsvis i en mengde fra omkring 1.0E+04 cfu/g til omkring l.OE+11 cfu/g og fortrinnsvis fra omkring 1.0E+05 cfu/g til omkring l.OE+10 cfu/g, mest foretrukket fra omkring 1.OE+06 cfu/g til omkring 1.0E+09 cfu/g.

De kan også anvendes som kostsupplementer for å forbedre kvaliteten på kjæledyrfor og kan være tilstede i en mengde på fra omkring 1.0E+04 cfu/g til omkring l.OE+11 cfu/g. Som kostsupplementer kan de innkapsles eller være i pulverform og pakkes sammen med, eller være separat fra, et hovedmåltid, tørt eller vått. Eksempelvis kan et pulver som inneholder utvalgte mikroorganismer ifølge oppfinnelsen, være pakket i lukteposer ("sachets") i en pulverform eller i en gele eller lipid eller annen egent bærer. Disse separat pakkede enhetene kan gis sammen med et hovedmåltid eller i multien-hetspakker til anvendelse sammen med et hovedmåltid eller behandling ifølge bruksan-visning. I et annet eksempel kan probiotikastammen(e) finnes i en multikammers for-pakningsenhet sammen med en andre inntagbar komponent, for eksempel et vått måltid eller et grovt måltid med middels fuktighetsinnhold eller tørkede godbiter i en porsjon av måltidsstørrelse, i en fleksibel lomme konfigurasjon. Et første kammer i lommen vil inneholde den probiotiske stammen og et andre separat forseglet kammer, den andre inntagbare komponenten.

Disse selekterte mikroorganismene har en spesielt fordelaktig virkning på mage-tarmkanalen hos kjæledyr, på huden og/eller pelsen, på immunsystemet, på tann- eller munnhelse, på bena og på effektene av aldring.

Det er også funnet at de forbedrer for-palatabiliteten, fordøyelsen, immunfunksjon og sanitærforhold (reduksjon av avføringsvolum og delvis deodorisering av avføring fra dyr i hundeslekten) hos kjæledyr.

Minst en bakteriestamme med de ovennevnte trekkene og/eller dets kultursupernatant eller en fraksjon derav og/eller dets metabolitter, kan administreres til kjæledyret som et supplement til dets normale diett eller som en komponent i et ernæringsmessig komplett kjæledyrfor.

Den komplette ernæringssammensetningen ifølge oppfinnelsen, kan være knust, tørket form eller en våt, avkjølt eller et holdbart kjæledyr-for produkt. Disse ernæringssam-mensetningene kan fremstilles ved fremgangsmåter som er kjent innen fagområdet, fo-rutsatt at det tas hensyn til å sikre overlevelsen av mikroorganismene der hvor mikroor ganisme-aktivitet er ønskelig. Bortsett fra bakteriestammene og/eller dets fermenterte medium, kan disse kjæledyrforene omfatte hvilket som helst eller flere stivelseskilder, en proteinkilde og lipidkilde.

Stabile stivelseskilder er for eksempel korn og belgfrukter, slik som mais, ris, hvete, bygg, havre, soya og blandinger derav.

Egnede proteinkilder kan selekteres fra hvilken som helst egnet animalsk eller vegetabilsk proteinkilde, for eksempel kjøtt og mel, fjærfemel, fiskemel, soyaproteinkonsent-rater, melkeproteiner, gluten og liknende. For eldre dyr er det foretrukket at proteinkil-den inneholder et høykvalitetsprotein.

Egnede lipidkilder omfatter kjøtt, animalsk og vegetabilsk fett.

Valg av stivelse, protein og lipidkilder vil stort sett bestemmes av næringsbehovene til dyret, palatabilitetshensyn og type produkt som anvendes. Til eldre kjæledyr inneholder kjæledyrforet fortrinnsvis proporsjonalt mindre fett enn kjæledyrfor til yngre kjæledyr. Dessuten kan stivelseskilden omfatte en eller flere av ris, bygg, hvete og mais.

Videre kan ulike andre bestanddeler for eksempel sukker, salt, krydder, vitaminer, mineraler, smaksmidler, fett og liknende også inkorporeres i kjæledyrforet etter ønske.

En egnet prosess for tørr ern ernæringssammensetning er ekstrusjonskoking selv om baking og andre egnede prosesser kan anvendes. Når kjæledyrforet ekstrusjonskokes, tilveiebringes det tørre kjæledyrforet i form av en "godbit". Dersom et prebiotisk karbo-hydrat anvendes, kan prebiotikumet blandes med de andre bestanddelene i det tørre kjæledyrforet før prosessering. En egnet fremgangsmåte er beskrevet i Europeisk patentpublikasjon 0850569. Dersom en probiotisk mikroorganisme anvendes og aktivitet er ønskelig i det ferdige produktet, er det best at organismen er belagt på, eller fylt i, det tørre kjæledyrforet. En egnet fremgangsmåte er beskrevet i Europeisk patentpublikasjon 0862863. Når det ikke kreves at mikroorganismen overlever, kan den settes til pre-ekstrusjonsblandingen, etter ønske.

Til våtfor kan fremgangsmåten som er beskrevet i US patenter 4781939 og 5132137 anvendes for å fremstille simulerte kjøttprodukter. Andre fremgangsmåter til fremstilling av grov type produkter kan også anvendes, for eksempel koking i en dampovn. Al-ternativt kan gratengtype produkter fremstilles ved emulgering av et egnet kjøttmateria- le for å fremstille en kjøttemulsjon, tilsette et egnet gelaterende middel og varme kjøtt-emulsjonen før den fylles i hermetikkbokser eller andre beholdere. Som i tilfellet med fremstilling av tørket kjæledyrfor der overlevelse av de utvalgte probiotiske artene ikke er vesentlig, kan de settes til forblandingen før koking eller oppvarming eller på hvilket som helst hensiktsmessig eller passende trinn i fremstillingsprosessen.

Mengden prebiotika i kjæledyrforet er fortrinnsvis mindre enn omkring 20 vekt% og

videre fortrinnsvis mindre enn omkringlO vekt%. For eksempel kan prebiotikumet omfatte fra omkring 0.1% til omkring 5 vekt% av kjæledyrforet. I kjæledyrfor som anven-der sikori som prebiotikum, kan sikorien tilsettes for å utgjøre fra omkring 0.5% til omkring 10 vekt% av ernæringsblandingen, mer foretrukket fra omkring 1 % til omkring 5 vekt%.

Kjæledyrforet kan inneholde andre aktive midler slik som langkjedede fettsyrer. Egnede langkjedede fettsyrer inkluderer alfa-linolsyre, gamma-linolsyre, linolsyre, eicosapentanonsyre og dokosaheksansyre. Fiskeoljer er en egnet kilde til eicosapentanonsyre og dokosaheksansyre. Agurkurtolje, solbærfrøolje og kveldskusymre er egnede kilder for gamma-linolsyre. Safloroljer, solsikkeoljer, maisoljer og soyabønneoljer er egnede kilder for linolsyre.

Dersom nødvendig, suppleres kjæledyrforene med mineraler og vitaminer slik at de er ernæringsmessig komplette.

Dessuten dersom ønskelig, kan bakteriestammen innkapsles, for eksempel i en sukker-matriks, fettmatriks eller polysakkairdmatriks. Det kan også belegges slik som beskrevet i EP 862 863.

Den nye probiotiske stammen anvendes fortrinnsvis slik at ernæringssammensetningen fortrinnsvis inneholder omkring 1.0E+04 til omkring l.OE+10 celler av den probiotiske mikroorganismen pr. gram kjæledyrfor, mer foretrukket omkring 1.OE+06 til omkring 1.0E+08 celler probiotisk mikroorganisme pr. gram. Ernæringssammensetningen kan inneholde omkring 0.005 % til omkring 10 vekt% av blandingen av den probiotiske mikroorganismen. Det inneholder fortrinnsvis omkring 0.02 % til omkring 6 vekt% og mest foretrukket omkring 1 % til omkring 6 vekt%.

Mengden kjæledyrfor som skal konsumeres av kjæledyret for å oppnå en gunstig effekt vil avhenge på kjæledyrets størrelse, type og alder. En mengde kjæledyrfor som sørger for en mengde på omring 1.0E+03-1.0E+04 cfu av minst en melkesyrebakteriestamme og/eller det ekvivalente fermenteringsmediumet vil imidlertid vanligvis være adekvat. Fortrinnsvis administreres omkring 1.0E+09 til l.OE+011 cfu/dag for hunder eller 1.0E+07-1.0E+010 cfu/dag for katter.

Sammensetningen ifølge oppfinnelsen har en høy probiotisk aktivitet og/eller er funnet å være spesielt effektiv til forbedring og/eller opprettholdelse av sunn fordøyelsesfunk-sjon i kjæledyr og forbedring og opprettholdelse av funksjonen av mage-tarmkanalen, hud og/eller pels og/eller immunsystem, hos kjæledyr. Denne sammensetningen har også gunstig virkning på effekter av aldring i katter og hunder.

En kort beskrivelse av figurene følger før eksemplene.

Figurer

Figur 1: Lymfocyttproliferering av perifere blod mononukleære celler (PMBC) fra dyr i hundeslekten ved stimulering med mitogener eller forbolestere. PMBC fra voksne hunder som ble matet 4 uker med (fylte stolper) eller uten (hvite stolper) L. acidophilus NCC2628, ble stimulert med forskjellige mitogener i doser (ug/ml) som indikert i den grafiske fremstillingen. Mitogener er PHA (Phytohemaglutinin), ConA (Concanavalin A), PWM (Pokeweed mitogen) og forbolester er PMA/iono (forbol myristatacetat og ionomycin).<*>= P < 0.05, Studenfs t-test. Figur 2: Cytokiner som er produsert av leukocytter fra hunderaser som er stimulert med forskjellige probiotiske stammer. Leukocytter fra normale voksne hunder ble stimulert i 18 timer med forskjellige laktobacillusstammer som er isolert fra kjæledyr. Kontrollkul-turer inneholdt kun medium (negativ kontroll) eller et humant laktobacillus isolat STI 1 (positiv kontroll). Identifisering av cytokiner ble gjort med RT-PCR. Kvantifiseringen av dem ble utført ved scanning av etidiumbromid-fargede agarosegeler og bestemmelse av den relative "pixel" av hvert bånd ved anvendelse av NIH Image software. Resultatene er uttrykt som gjennomsnittet av to uavhengige forsøk i vilkårlige enheter. (A) IL-12, (B) IL-10, (C) IFNy, (D) TGFp\

Eksempler

Eksempel 1: Stammer og kulturbetingelser

Uttallige stammer (fra Nestlé culture collection = NCC) ble screenet for sin potensielle probiotiske anvendelse til katter og hunder. Spesielt vekstpotensialer, resistens mot fry-setørking med påfølgende oppbevaring, toleranse for magesyre og forskjellige konsentrasjoner av gallesalter som finnes i mage-tarmkanalen hos katter og hunder ble fastsatt for de 20 laktobacilliene og 18 bifidobakteriene som er isolert fra katte og hundeavfø-ring, og er presentert i tabell 1.

Bifidobakteria:

Alle 20 laktobacilliene og 18 bifidobakteriene ble isolert fra katter og hunder som var holdt på forskjellige dietter, som vist i tabell 1. Initiell påvisning ble bestemt ved morfo-logiske og fysiologiske kjennetegn. API-50CH og Rapid-ID32A systemer (BioMérieux) ble anvendt til henholdsvis laktobacilli og bifidobakterier. Rene stammer ble fryst og deponert ved -80°C i Nestlé Culture Collection (NCC).

Alle bakteriene ble dyrket i næringsmedium for målingene. En prøve fra hver reaktiver-te stamme ble oppbevart ved -80°C i 1 ml-kryoprotektivt medium (40 % glycerol + 60 % LL). Kulturene ble opprettholdt ved ukentlig subkultivering med et 1% inokkulum i 10 ml dyrkningsmedium og anaerob inkubering ved 37°C.

Laktobacilli ble dyrket i MRS i 18 timer. Bifidobakteria ble enten dyrket i MRS + 0.05 % (w/v) L-cystein hydroklorid (MRS-C) i 32 timer eller i BHI + 0.05 % L-cystein hydroklorid (BHI-C) i 48 timer, med start ved et 5 % inokkulum.

Alle kulturene ble oppbevart ved +4°C mellom de ulike overføringene. Anaerobiose ble generelt oppnådd ved anvendelse av et hydrogen-karbondioksid anaerobt system (GasPak, Becton Dickinson, USA). Bifidobakteria ble alltid holdt i disse glassene i oppbevaringsperioden.

Eksempel 2: Seleksjon av bakteriestammer

Denne in vitro screeningen er basert på produksjonskjennetegn for en industriell anvendelse av levedyktige celler, deres evne til å overleve inhiberende eller ugunstige mage-tarmforhold og deres genomiske diversitet. Stammediversitet eller genomisk likhet i de ikke-karakteriserte stammene ble tatt i betraktning, ved anvendelse av RAPD og ribotyping.

Materialer og fremgangsmåter

Bakteriedyrking

Stammene som er istand til hurtig å produsere et høyt antall celler, må påvises. Deres bakterievekstsyklus kjennetegnes av en kort lag-fase, en kort generasjonstid, høye maksimale tellinger og en lang stasjonærfase. Derfor ble stammer sammenlignet ved å vur-dere tre variabler: lag-fasens lengde, generasjonstid (i timer) og deres maksimale tellinger som korresponderer til de viktigste kjennetegnene.

For laktobacilli:

200 ml MRS næringsmedium som er preinkubert ved 37°C ble inokkulert med 1 % frisk subkultur. 1 ml-prøver ble samlet hver time post inokkulering i 8 timer. En siste prøve ble tatt etter 24 timer. 1 ml av hver prøve ble 10-ganger seriefortynnet i TS for telling. Kulturer ble dyrket i MRS agar (tømme-plate teknikk), anaerobt ved 37°C i 48 timer. Alle platene med kolonitall mellom 30 og 350 ble registrert som kolonidannende enheter (cfu) pr. ml kultur og ble derfor tatt i betraktning ved opptelling.

For bifidobakteria i ( MRS- C) :

I preliminære målinger ble alle stammene opptelt etter 24 timers dyrkning i MRS-C og TPYG medium. Resultater ble uttrykt i cfu/ml. Vekstkurvene ble etablert ved bestemmelse av celletallene etter dyrking i MRS-C etter 0,4,12,24,32 og 48 timer i følge protokollen som er beskrevet for laktobacilli. For å bestemme subkulturmediumets inn-virkning og for optimalisering av avgassing av dyrkningsmediumet, ble følgende måling gjennomført: • fra en subkultur, i BHI-C oppbevart 48 timer ved 4°C og inokkulert i MRS-C • fra en subkultur, i BHI-C oppbevart 48 timer ved 4°C og inokkulert i godt avgasset MRS-C (fjerning av oksygen var optimalisert ved autoklavering av mediumet to ganger og direkte oppbevaring av det i anaerobe glass) • fra en fersk subkultur, i MRS og inokkulert i MRS-C som er godt avgasset og oppbevart ved anaerobe forhold før forsøket

Fast medium ble oppnådd ved tilsetting av Difco Bacto agar (15 g.l"^. Mediumet ble autoklavert ved 121°C i 15 minutter. Flytende medium for bifidobakteria ble enten oppbevart ved anaerobe betingelser eller avgasset før anvendelse.

Resistens mot mage pH og galle

Når mikroorganismene inntas, må de kunne overleve forholdene i mage og tolvfinger-tarm for å være istand til å utøve en gunstig aktivitet i mage-tarmkanalen hos dyret. Mage pH og gallesalter er hovedkomponentene som er ansvarlige for regulering av bakterieflora. Derfor må stammens resistensgrad for syre og galle måles.

Fysiologien i fordøyelseskanalen hos katter og hunder er forskjellig fra menneskers. Gjennomsnittlig pH er 3.4 og 4.2 i henholdsvis hunder og katter. En rekonstituert kjæ ledyr galle ble anbefalt til disse målingene (tabell 4). Gallekonsentrasjonen i tynntarmen varierer i et område på 0.5 til 2 % når mat inntas.

På grunn av ekstreme pH-verdier som er funnet i katter og hunder, bør levedyktige tellinger etter 10 minutter ved pH 2.6 og etter 2 timer enten ved pH 3.4 (stammer som er isolert fra hunder) eller pH 4.2 (stammer som er isolert fra katter) ikke være under 1.OE+06 cfu/ml.

Resistens mot mage pH

Alle laktobacilli ble inokkulert ved 1 % i MRS næringsmedium og dyrket anaerobt ved 37°C over natten. Bifidobakteria som er inokkulert ved 5 % i BHI-C ble dyrket 48 timer ved 37°C under anaerobe betingelser. Kulturene ble fordelt i 2 ml reaksjonsrør (Eppen-dorf) og sentrifugert ved 3500 x g/10 min/20°C. Cellene ble vasket 3 ganger med Ringers-løsning. Resistensen mot magesyreforhold ble målt in vitro i 3 simulerte magesafter med pH nivåer på 2.6, 3.4 og 4.2 justert med HC1 (Merck). Disponibel filtervare (Nal-gene) ble anvendt til alle sterilfiltreringer. Overlevelsen av hver bakteriesuspensjon ble studert ved tilsetting av 1 ml i en serie på 5 ml simulert magesaft (forskjellige pH) sup-plert med 1.5 ml av en 0.5 % NaCl løsning.

Prøvene ble inkubert ved 37°C og de levende organismene opptelt ved:

• 0,1,5,10 minutter med pH 2.6 magesaften

• 0, 1, 30, 60, 120, 180 minutter når magesaften har en pH på enten 3.4 (for stammer som er isolert fra hunder) eller 4.2 (for stammer som er isolert fra katter)

Prøver ble fortynnet i fosfatbuffer (pH 7.0), platet ut på MRS-C agar og opptelt.

Resistens mot gallesalter

Utviklingen av de levedyktige tellingene av laktobacillus som er dyrket i 18 timer i nærvær av ulike konsentrasjoner rekonstituert kjæledyrgalle ble bestemt.

To levedyktige tellinger betraktes som signifikant forskjellig når avviket i logioer over 0.25. Hver stamme er kjennetegnet av to variabler: • den maksimale gallesaltkonsentrasjonen testet hvor ingen signifikant for-skjell fra kontrollen ble funnet • hastigheten til nedgangen i levedyktighet når gallekonsentrasjon i dyrkningsmediumet øker

Stammene som er kjennetegnet av et tap høyere enn en logioav deres levedyktige tellinger når gallekonsentrasjoner stiger i 1 % trinn, ble vurdert å være sensitive for galle. En reduksjon høyere enn en logiomellom celler som er dyrket i nærvær av 0 og 2 % galle og til en logiopr. tilleggsprosent galle (over 2 %), ble vurdert å være akseptabelt. Dessuten bør kun stammer som produserer mer enn 1 .OE+06 cfu/ml når de dyrkes i nærvær av opp til 2 % gallesalter selekteres, for å produsere en effekt i mage-tarmkanalen.

Rekonstituert kjæledyr-galle fra katter eller hunder ble fremstilt slik som indikert i tabell 4 og filterne ble sterilisert før anvendelse. I en første måling ble laktobacilli dyrket anaerobt i 24 timer i MRS næringsmedium ved 37°C og overført til fersk MRS næringsmedium pluss 0, 0.1, 0.3, 0.5, 1,2, 4 % steril rekonstituert kjæledyr-galle i ytterligere 18 timer. Prøver ble 10-ganger seriefortynnet i TS for telling. Fortynninger 1.0E-03 og 1.0E-05 ble platet på MRS-agar ved anvendelse av en WASP ("Whitley Automa-tic Spiral Plater"; Don Whitley Scientific Limited, England). Når platene er tørket, snus de og inkuberes 48 timer ved 37°C i anaerobe glass.

Floch et al. (1972) definerte en inhibering som signifikant når minst 2 log i testen, sammenlignet med veksten i kontrollrøret, ble redusert. Basert på dette, ble alle laktobacilli som var sensitive for gallekonsentrasjoner i den første målingen og 2 laktobacilli som var resistente til 4 % galle, testet på liknende måte i nærvær av 0,1,1.5,2,2.5,3,4 % galle. Den andre testen siktet mot repeterbarhet og påviste om antallet levedyktige bakterier sank dramatisk med økende gallekonsentrasjon.

På den annen side understreket det at disse stammene er galle-resistente i løpet av denne 18 timers perioden. Vekstkurver ble påvist i nærvær av gallesalter for å bestemme om lag-fasen og veksthastigheten ble påvirket eller ikke. Målinger ble foretatt med laktobacilli dyrket i MRS næringsmedium tilsatt 1 % rekonstituert kjæledyr-galle i henhold til protokollen som er beskrevet i tidligere vekstmålinger.

Bifidobakterien ble subkultivert og dyrket 32 timer/37°C/anaerobt ved anvendelse av MRS-C næringsmedium med 0, 1,2, 3 og 4 % rekonstituert kjæledyr-galle. Samme tellingsmetoder ved fortynninger 1.0E-03, 1.0E-04 og 1.0E-05 ble anvendt slik som for laktobacilli.

Overlevelse av frysetørking og påfølgende lagring av Laktobacillusstammene Utviklingen av overlevelse ble evaluert. Levedyktige tellinger under 10E+05 CFU/ml ble vurdert til å være for lave.

For hver stamme ble 200 ml MRS næringsmedium inokkulert med 3 % med en fersk subkultur. Kulturene ble dyrket i 16 timer ved 37°C. Forhold uten lufting (lukkede beholdere) ble antatt å være vesentlig anaerobt. Levedyktige celler ble telt ved anvendelse av tømme-platings fremgangsmåter som er beskrevet tidligere.

Kulturene ble høstet ved sentrifugering ved 3500 x g/+7°C/20 minutter (RC3C Sorvall Instrument sentrifuge) og resuspendert i 10 ml av to ulike kryobeskyttende midler. Kon-sentrerte bakteriesuspensjoner ble telt (tømme-platingsfremgangsmåte) og fordelt i flas-ker (0.5 ml pr. ampulle). Prøvene ble frosset ved -196°C i flytende nitrogen og vaku-umtørket i 18 timer. Etter frysetørking ble nitrogen tilsatt gjennom frysetørkerens luft-adgangsventilen og alle ampullene ble forseglet. Alle flaskene ble lagret ved +4°C og +20°C i 6 måneder. Antall levedyktige celler pr. ampulle (for hver bakterie og suspen-sjonsmedium) ble bestemt månedlig.

Resultater

I seleksjonsrammen av potensielle probiotika til katter og hunder, er resultatene av denne in vitro screeningen av 20 laktobacilli og 18 bifidobakteria, basert på deres vekstpotensialer, resistens mot frysetørking med påfølgende oppbevaring, resistens til mage pH og galle konsentrasjoner som finnes i mage-tarmkanalen hos katter og hunder, pre-sentrert i tabell 5.

De 20 laktobacilliene ble klassifisert med hensyn til kriteriene de oppfyller i gjeldende studie. Fire stammer viste gode resultater angående vekstkarakteristikkene, resistens mot pH i magen, galle-resistens og overlevelse under oppbevaring etter frysetørking: L. reuteri NCC2581 (CNCM 1-2448), L. reuteri NCC2592 (CNCM 1-2450), L. reuteri NCC2603 (CNCM 1-2451), L. reuteri NCC2613 (CNCM 1-2452). Følgende trekk er fremkommet:

• generasjonstiden var mindre enn 1 time ved dyrking i MRS

• lag-fasen var kort (mindre enn 2 timer)

• bakterietallene var høye (mer enn 1.0E+08 CFU/ml) i stasjonærfasen i vekstsyklusen og stabil ved 8 og 24 timer post-inokkulering • stammene var stabile gjennom frysetørking og påfølgende 6 måneders oppbevaring ved 4°C og 20°C • stammene var resistente til ekstreme gallekonsentrasjoner som er sannsynlig å finne i mage-tarmkanalen hos katter og hunder (2 %)

• ingen signifikant inhibering i nærvær av opp til 4 % galle i mediumet

• stammene ble vist å tolerere pH 2.6 i minst 10 minutter og kan forbli på nivåer som er høyere enn 1.0E+08 CFU/ml • stammene var resistente mot en gjennomsnittlig mage pH i minst 2 timer

Derfor ble 2 laktobacilli som er isolert fra katter ( L. reuteri NCC2581 og L. reuteri NCC2592) og 2 isolert fra hunder ( L. reuteri NCC2603 og I. reuteri NCC2613) selektert til å studeres for potensiell probiotisk aktivitet. Stammer NCC2581, NCC2592, NCC2603 og NCC2613 ble påvist som L. reuteri ved API 50CH-identifisering. Ribotyping avslørte imidlertid at NCC2581 og NCC2592 har svært like mønstre, så vel som NCC2603 og NCC2613, og indikerer derved et mulig nært slektskap. Stamme NCC2581 har svært gode vektskarakteristikker og NCC2603 har bedre resistens mot galle enn NCC2613.

Resultater som angår de 8 Bifidobakteria som er isolert fra avføring hos katter, mulig-gjorde en seleksjon som funksjon av deres vekstkarakteristikker, resistens til mage pH og gallesensitivitet. Stamme NCC2623 hadde ingen av de ønskede kjennetegnene og vil derfor ikke anbefales til videre studier. På den annen side oppfylte NCC2627 alle kriteriene:

• generasjonstiden var mindre enn 1 time ved dyrking i MRS-C

• lag-fasen var like kort som for laktobacilli

• tallene var høye og stabile under stasjonærfasen i vekstsyklusen

• stammene var resistent for ekstreme gallekonsentrasjoner som er sannsynlig å finne i mage-tarmkanalen hos katter og hunder (2 %)

• ingen signifikant inhibering i nærvær av opp til 4 % galle i mediumet

• stammene ble vist å tolerere pH 2.6 i minst 10 minutter og kan forbli på nivåer som er høyere enn 1.OE+06 CFU/ml • stammene var resistente mot en gjennomsnittlig mage pH i minst 2 timer

Stammen NCC2627 var langt mer resistent enn NCC2623 og NCC2635, mens disse 3 stammene har nære mønstre ved ribotyping som derfor indikerer et mulig nært slektskap (fordøying med 2 restriksjonsenzymer: EcoRI og EcoRV).

De 10 bifidobakteria som er isolert fra hunder viste kun to forskjellige mønstre når de blekarakterisert vedribotyping. Derfor ble galleresistensmålinger gjennomført med kun 4 stammer (2 fra hver gruppe): NCC2657, NCC2660, NCC2671 og NCC2677. Disse 4 stammene var alle resistente mot maksimal gallekonsentrasjon som finnes in vivo (2 % galle) og stammer NCC2660 og NCC2657 har ingen nedgang i levedyktige tellinger når de utsettes for en maksimalverdi på 4 % galle. Som en konsekvens er alle bifidobakterier som er isolert fra avføring hos hunder ganske resistente mot høye konsentrasjoner av galle.

Med hensyn til vekstkarakteristikker, kan disse 10 bakteriene derved deles i 2 grupper: • stammer som er resistente mot galle og med gode vekstkarakteristikker: NCC2657, NCC2651, NCC2663 og NCC2667 • stammer som er resistente mot galle, men med vekstkarakteristikker som trenger å optimaliseres for industriell produksjon: NCC2660, NCC2671, NCC2677, NCC2647, NCC2654 og NCC2674.

De fullstendige resultatene av resistens mot ekstrem mage pH i løpet av fordøyingen i katter og hunder, bør tillate en bedre bestemmelse av stammene som skal selekteres til videre studier. Kun stamme NCC2651 oppfylte ikke seleksjonskriteriene for pH-resistens.

Med hensyn til gjeldende resultater, kan 1 bifidobakteriestamme som er isolert fra katter og 3 bifidobakterier som er isolert fra hunder (henholdsvis NCC2627, NCC2657, NCC2663 ogNCC2667) selekteres.

9 ml porsjoner ble overført til rør og autoklavert ved 121°C i 15 minutter.

Til slutt ble 8 av de 38 stammene selektert for videre studier (se eksempel 3): 3 laktobacilli som er isolert fra katter (NCC2581, NCC2592, NCC2583), 3 laktobacilli fra hunder (NCC2603, NCC2613, NCC2628) 1 bifidobakterie fra katter (NCC 2627) og 1 bifidobakterie fra hunder (NCC2657).

Disse stammene kjennetegnes av korte generasjonstider, høye tellinger (mer enn 1.0E+08 cfu/ml) i stasjonærfasen og stabilitet i høye tall ved 8 og 24 timer post-inokkulering, stabilitet ved frysetørking etterfulgt av hvilke som helst oppbevaringsbe-tingelser, resistens mot ekstreme galle-konsentrasjoner som finnes i tolvfingertarmen (2 % galle) og sin lave inhibering når de dyrkes i nærvær av opp til 4 % galle. Dessuten ble resultater fra DNA-analyser tatt i betraktning for å selektere bakterier som er representative for den undersøkte diversitet.

Eksempel 3: Koloniseringsvirksomhet i katter

L. reuteri NCC2581,/,. reuteri NCC2592, L. rhamnosus NCC2583 og Bifidobakterium sp. NCC2627 ble testet i matingsforsøk for å evaluere evnen til å overleve passeringen gjennom mage-tarmkanalen hos katt.

16 hann- og hunnkatter som er så like som mulig utsettes for 3 dagers tilpasning med

Friskies Grand meny boeuf. Matingsprotokollen består av 7 dagers testing med "Friskies Grand Menu" som inneholder en av de ovenfornevnte stammene: L. reuteri NCC2581 (diett A), L. reuteri NCC2592 (diett B), L. rhamnosus NCC2583 (diett C) og Bifidobakterium sp. NCC2627 (diett D). Diettfastsettelsen er følgende:

Nevnte stammer fremstilles i en tilstrekkelig mengde og i en stabil lyofilisert form for å anvende disse 8 forskjellige bakteriene med hensyn til stammeoverlevelse i mage-tarmkanalen i disse forsøksdyrene. Alle stammene blandes med 4 g trehalose for å tilsette et tilstrekkelig volum av bæreren ved blanding av de fremstilte stammene med formatriksen til dyrene. Bakteriestammer fremstilles i individuelle plastrør (1.0E+09 cfu/dag) og settes daglig til en del av foret for å være sikker på at alle bakterier blir spist.

Ferske avføringsprøver skaffes for å analysere bakteriepopulasjonstall sammenlignet med grunnlinje (uten bakterier tilsatt).

Avføring samles på dag 7 og 8 (grunnlinje)

14 og 15

21 og 22 (grunnlinje)

28 og 29

En steril rektalprobe anvendes for å oppnå en avføringsprøve på minst 0.1 g. Denne prøven veies nøyaktig og 0.1 g blandes med 10 ml fysiologisk løsning (Ringer) som inneholder 10 % glycerol. Denne løsningen overføres deretter til 1 ml kryorør og fryses i flytende nitrogen. Alle prøver oppbevares ved -80°C til de skal analyseres.

De endogene populasjonene av Laktobacilli, Bacteroides, Enterobacteriaceae, Entero-cocci, Bifidobakteria og Clostridium perfringens telles. Bakterier påvises på selektive eller semiselektive media. Hundregangers seriefortynninger utføres i Ringers løsning som inneholder 0.5 % cystein, fra fortynningene i området -2 til -8. Petriskåler med ulike seleksjonsmedia inokkuleres og inkuberes (se tabell nedenfor).

Resultater: Bakterietellingene er uttrykt som log base 10 og presentert i tabell 7.

I løpet av behandling observerer vi en økning i tellinger i avføringen av laktobacilli, på grunn av inntak av den angitte probiotiske bakterien. Det ble ikke observert noen drastisk økning i tellinger av Enterobacteriaceae som reflekterer at det ikke er skader i tarm-økosystmet relatert til anvendelsen av de selekterte probiotika.

Eksempel 4: Koloniseringsvirksomhet i hunder

L. reuteri NCC2603, L. reuteri NCC2613, L. acidophilus NCC2628 og Bifldobakterium sp. NCC2657 ble testet i matingsforsøk for å evaluere deres kapasitet til å overleve passeringen gjennom mage-tarmkanalen hos hunden. 10 hunder, 5 hanner og 5 hunner, 4 til 7 år blir utsatt for disse spesifikke forsøkene. Matingsprotokollen består av 5 dagers tilpasning med "Friskies Vitality" m/u sikori og 5 dagers test med "Friskies Vitality" m/u sikori og 3 dager tilpasning, 5 dagers test med "Friskies Vitality" m/u sikori + bakterier: L. reuteri NCC2603 (diett E), L. reuteri NCC2613 (diett F), L. acidophilus NCC2628 (diett G) og Bifldobakterium sp. NCC2657 (diett H). Diettfastsettelsen er følgende:

Nevnte stammer fremstilles i en tilstrekkelig mengde og i en stabil lyofilisert form til å anvende disse 8 forskjellige bakteriene med hensyn til stammeoverlevelse i mage-tarmkanalen i disse forsøksdyrene. Alle stammene blandes med 4 g trehalose for å tilsette et tilstrekkelig volum av bæreren ved blanding av de fremstilte stammene med formatriksen til dyrene. Bakteriestammer fremstilles i individuelle plastrør (5.0E+09 cfu/dag) og settes daglig til en del av foret for å være sikker på at alle bakterier blir spist.

Ferske avføringsprøver skaffes for å analysere bakteriepopulasjonstall sammenlignet med grunnlinje (uten bakterier tilsatt).

Avføring samles på dag 7 og 8 (grunnlinje)

14 og 15.

21 og 22 (grunnlinje)

28 og 29.

En steril rektalprobe anvendes for å oppnå en avføringsprøve på minst 0.1 g. Denne prøven veies nøyaktig og 0.1 g blandes med 10 ml fysiologisk løsning (Ringer) som inneholder 10 % glycerol. Denne løsningen overføres deretter til 1 ml kryorør og fryses i flytende nitrogen. Alle prøver oppbevares deretter ved -80°C til de skal analyseres. Bakteriene telles på samme medium som er beskrevet i eksempel 3.

Resultater: Bakterietallene uttrykt som log base 10, er presentert i tabell 8.

I løpet av behandling observerer vi ingen store endringer i tall i avføringen av laktobacilli som en følge av inntak av den utvalgte probiotiske bakterien, unntatt i tilfellet med stammen L. acidophilus NCC2628. Under de testede forholdene var den inhibitoriske effekten på C. perfringens ikke signifikant, da basalnivået til C. perfringens var svært lavt. Vi observerte ingen drastisk økning i tellinger av Enterobacteriaceae som reflekterer at det ikke er skader i tarmøkosystmet relatert til anvendelsen av de selekterte probiotika.

Eksempel 5: Effekter av laktobacilli og deres metabolitter på levedyktigheten til Giar - dia intestinalis

Vi studerte effekten av kulturfiltratsupernatanter av laktobacilli-stammer som er isolert fra katter og hunder.

Materialer og fremgangsmåter

Bakteriestammer og kulturer: Mikroorganismer som hører til slekten laktobacillus er fra Nestlé Culture Collection. Bakteriene dyrkes i MTYI-medium. Supernatanter som inneholder metabolitter fra laktobacilli nøytraliseres ved pH 6 og sterilfitreres.

Kontroller utføres ved surgjøring av MTYI-mediumet med melkesyre til samme pH som den i bakteriekulturene. Etterpå ble pH justert til pH 6 med 0.1 N NaOH. Opprinnelse til stammen som studeres og pH til supernatantene og kontrollene er vist i tabell 9. Parasitter: Giardia intestinalis stamme WB (ATCC 30957) ble innkjøpt fra American Type Culture Collection (Rockville, USA). Trofozoitter dyrkes i Keister's modifiserte TYI-S-33 medium som inneholder pr. liter: 20 g casein fordøying (Difco), 10 g gjær-ekstrakt (BBL), 10 g dekstrose (Merck), 0.75 g bovin galle (Difco), 2 g NaCl (Merck), 2 g L-cystein.HCl (Sigma), 0.2 g askorbinsyrenatriumsalt (Fluka), 0.6 g K2HPO4(Merck), 22.8 mg jernammoniumcitrat (Sigma), 100 ml voksen bovin serum (Sigma), 15 ml pe-nicillin/streptomycin (Gibco, 1000 IU/ml, 1000 ug/ml). pH ble justert til 6.9 med NaOH 5N før sterilfiltrering (0.22 nm porestørrelse).

Parasitter dyrkes i polystyren vevskulturflasker (LUX, Miles Laboratories, Inc. Naper-ville IL 60540) fylt med 40 ml kulturmedium. Subkulturer lages ved å frasortere supernatanter som ikke har parasitter festet, tilsette 5 ml iskaldt kulturmedium, inkubere på et isbad i 10 minutter for å løse fasthengte trofozoitter og inkubere 0.2 ml av den resulte-rende suspensjonen i ferskt medium. Inkubasjonene utføres ved 37°C i mørke.

Prolifereringsmålinger: 200 (il trofozoitt-suspensjoner (1.4 x 10<5>parasitter/ml) blandes med 100 ul supernatanter eller kontroller og 1 uCi<3>H-tymidin tilsettes. Prøver inkuberes ved 37°C i 24 timer på en 96-brønners vevskulturplate (Nunc Brand Products). Deretter høstes parasitter og tymidin-inkorporering evalueres.

Resultater

Thymidin-inkorporering er vist i tabell 10. Stammen NCC2628 som er isolert fra en hund, produserte en sterk inhibering av prolifereringen av WB-stamme (91 %). Andre stammer som er studert inhiberte ikke trofozoittvekst.

I dette forsøket kan det demonstreres at funksjonelle metabolitter som er produsert i løpet av dyrking av L. acidophilus NCC2628 har en svært sterk inhibitorisk effekt på veksten av Giardia intestinalis.

Eksempler 6 til 8: Inhibitoriske effekter av laktobacillus stammer ifølge oppfinnelsen på tarmpatogene bakterier

For å påvise stammer med sterkt antagonistiske egenskaper mot patogener i tynntarmen, ble ko-kultiveirngsforsøk utført i et modellsystem som simulerer tynntarmforhold hos dyr i hundeslekten (pH, gallesammensetning og konsentrasjon, mucin, pancreatin). Simulert tynntarmsaft fra dyr i hundeslekten inneholdt rekonstituert galle fra dyr av hundeslekten (0.345 g/l taurochenodeoksicholat, Sigma, Tyskland, 0.7 g/l taurodeoksicho-lat, Sigma, Tyskland, 3.04 g/l taurocholat, Sigma, Tyskland, 0.006 g/l cholat, Fluka, Sveits), porcint mucin (1.9 g/l Sigma, Tyskland) porcint pancreatin (2.42 g/l Sigma, Tyskland) og elektrolyttløsning (5 g/l NaCl, 0.6 g/l KC1, 0.25 g/l CaCl2, alle fra Merck, Tyskland). pH i saften ble justert til pH 6.5 ± 0.5 med 0.1 N NaOH.

Stammer og dvrkningsbetingelser

Tvnntarmpatogener

4 potensielt patogene stammer ble selektert: S. typhimurium SLI 344, E. coli ETEC 08:H9 o% E. coli 0149:K88 (patogent isolat fra dyr av hundeslekten) og et klinisk isolat av Sh. Dysentriae (human opprinnelse, tilveiebragt av Centre Hospitalier Universitaire Vaudoise - CHUV Lausanne, Sveits). Med unntak av S. typhimurium SLI 344, som er propagert i Luria Bertani næringsmedium (Difco, USA), er alle enterobacteriaceae dyrket i Hjerne Hjerte Infusjons næringsmedium (Difco, USA) ved 37°C ved risting (240 rpm).

Melkesvrebakterier

Et bredt område laktobacilli med opprinnelse fra dyr av hundeslekten og katteslekten, inkludert L. acidophilus NCC2628 (CNCM 1-2453), L. rhamnosus NCC2583 (CNCM I-2449), L. reuteri NCC2581 (CNCM 1-2448), L. reuteri NCC2592 (CNCM 1-2450) ble selektert fra Nestlé Culture Collection (NCC, Nestec, Sveits) og screenet i hundeslekt-tynntarmsmodellen for overlevelse, fysiologisk aktivitet og inhibitoriske effekter på ovenfornevnte tynntarmspatogener. Laktobacilli ble dyrket anaerobt (anaerocult, Oxoid, England) i Man Rogosa Sharp næringsmedium (Difco, USA) ved 37°C.

Bestemmelse av levedyktige celletellinger

Prøver ble fortynnet i steril fosfatbuffer (NaH2P04, pH 7, 0.2 M) og overflate-platet med 10-ganger fortynninger på agarplater: MRS agar (Difco, USA) til laktobacilli, Salmonella-Shigella agar (Oxoid, England) til S. typhimurium og Sh. Dysenteriae, og Sorbitol Mac Conkey agar (Oxoid, England) til E. coli. Agarplatene inkuberes anaerobt i 48 timer ved 37°C for laktobacilli og 24 timer ved 37°C for enterobacteriaceae. Til ko-kultiveringsforsøk ble veksten av enterobactericacea på MRS agar inhibert ved tilsetting av polymixin (Oxoid, England).

Ko- kultiveringsforsøk mellom melkesvrebakterier ( LAB) og patogener Ko-kultiveringsforsøk med potensielle probiotiske LAB og patogene stammer ble utført ved 37°C i 20 ml (Falconrør) simulert tynntarmssaft fra dyr av hundeslekten som var anriket med forskjellige karbonkilder (sukker, kjæledyrfor) for å favorisere metabolsk aktivitet i kulturene. LAB ble inokkulert ved 10E+08 cfu/ml, patogener ved 10E+02 cfu/ml, 10E+04 cfu/ml og 1 OE+06 cfu/ml. Prøver ble tatt ved ulike tidspunkt opp til 8 timer og levedyktige celletellinger ble bestemt ved overflate-plating av 10-ganger fortynninger på respektive media.

Ko-kultiveirngsforsøk ble utført under ulike betingelser, inkludert anriking av simulert tynntarmssaft fra dyr av hundeslekten med dekstrose (5 g/l) og forskjellige konsentrasjoner av kommersielt tilgjengelig ekstrudert tørt kjæledyrfor (5, 25 eller 100 g/l, Friskies ALPO Complete, USA). Sistnevnte ble homogenisert (Stomacher Lab Blender) og suspendert i elektrolyttløsning. Alle forsøkene ble utført i duplikat.

Eksempel 6

Ko-kultiveringsforsøk mellom 4 laktobacilli og 4 potensielle patogene stammer E. coli ETEC 08:H9, E. coli 0149:K88, S. typhimurium SL1344 og Sh. dysenteriae ble utført i simulert tolvfingertarmssaft fra dyr av hundeslekten som var anriket med 5 g/l dekstrose (Difco). Laktobacilli ble inokkulert med 10E+08 cfu/ml og de Gram negative indikator-stammene med 10E+02 cfu/ml. Resultater er samlet i tabell 11.

Alle 4 undersøkte laktobacilli viste antimikrobiell aktivitet, men kun L. acidophilus NCC2628 (CNCM 1-2453) og I. rhamnosus NCC2583 (CNCM 1-2449) viste høy aktivitet mot alle testede patogener. Begge stammene var ikke bare istand til å inhibere veksten, men var også istand til fullstendig å inaktivere patogenene som finnes i testsys-temet (ingen gjenværende levedyktige celler).

Eksempel 7

Ko-kultiveringsforsøk ble utført mellom laktobacilli [{ L. acidophilus NCC2628 (CNCM 1-2453), L. rhamnosus NCC2583 (CNCM 1-2449)] og S. typhimurium SLI344 i simulert tolvfingertarmssaft fra dyr av hundeslekten som var anriket med kommersielt tilgjengelig ekstrudert tørt kjæledyrfor (5, 25 eller 100 g/l, Friskies ALPO Complete, USA). Laktobacilli inokkuleres med 10E+08 cfu/ml og de gram-negative indikator-stammene med 10E+02 cfu/ml. Resultatene er samlet i tabell 12.

Resultatene viste det høye potensialet spesielt til L. acidophilus NCC2628 (CNCM I-2453) til inhibering av veksten og til og med til fullstendig å inaktivere tynntarmspatogener under svært faktiske forhold, slik som en blanding av simulert tynntarmssaft og

kjæledyrfor. Den antimikrobielle aktiviteten til L. acidophilus NCC2628 var svært høy selv ved lave anrikningsnivåer av kommersielt kjæledyrfor som fungerte som en kilde til fermenterbare sukkere for organismen. I motsetning til denne observasjonen som er gjort for L. acidophilus NCC2628, er effektiviteten till. rhamnosus NCC2583 (CNCM

1-2449) avhengig av anrikningsnivået med kjæledyrfor på den måten at en økende antimikrobiell aktivitet observeres med økende mengder kjæledyrfor som er satt til testsys-temet.

Eksempel 8

Ko-kultiveringsforsøk med L. acidophilus NCC2628 (CNCM 1-2453) og ulike inokku-leringsnivåer av S. typhimurium SL1344 ble utført i simulert tolvfingertarmssaft fra dyr av hundeslekten som var anriket med dekstrose (5 g/l, Difco). L. acidophilus NCC2628 (CNCM 1-2453) ble inokkulert med 10E+08 cfu/ml, S. typhimurium SL1344 ble inokkulert med 10E+04 cfu/ml og 1 OE+06 cfu/ml. Resultatene er samlet i tabell 13.

Den antimikrobielle aktiviteten til L. acidophilus NCC2628 (CNCM 1-2453) var tilstrekkelig høy til fullstendig å inaktivere selv høy initiell konsentrasjon av S. typhimurium SLI 344.

Eksempel 9: In vivo immunstimulering i hunder

Immunstimuleringspotensialet i kjæledyr-isolerte probiotiske stammer ble testet i kli-niske forsøk ved anvendelse av L. acidophilus NCC2628-stammen.

Fremgangsmåter:

Proliferering av perifere blodmononukleære celler ( PBMQ fra dyr i hundeslekten ved stimulering med ulike mitogener: 20 hunder; 4 til 7 år gamle, gikk gjennom disse forsøkene. Matingsprotokollen bestod i 1 uke tilpasning med "Friskies Vitality" m/u sikori og 4 ukers forsøk med "Friskies Vitality" m/u sikori + L. acidophilus NCC2628 bakterien. L. acidophilus NCC2628 ble fremstilt i en tilstrekkelig mengde og i en stabil lyofilisert form med hensyn til overlevelse av stammen i mage-tarmkanalen hos forsøksdyrene. Bakterien ble blandet med 4 g trehalose for å tilsette et tilstrekkelig volum av bærer ved blanding av den fremstilte bakterien med formatriksen til dyrene. Bakteriene ble fremstilt i individuelle plastrør (5.0E+09 cfu/dag) og daglig satt til en del av maten for å være sikker på at alle bakteriene ble spist.

Blodprøver ble tatt fra hundene etter 4uker med probiotisk administrering. Blodet ble fraksjonert gjennom en Vaccutainer™-kolonne (Becton Dickinson, Mountain View, CA). PBMC ble gjenvunnet i henhold til produsentens anbefalinger.

Celler ble stimulert med ulike mitogener eller forbolestere som induserer en sterk proliferering av T-celler (concanavalin A (conA), Phytohemaglutinin (PHA)), B-celler (Pokeweed mitogen (PWM)) og av alle celler (Phorbol-Myristat-Acetat/ionomycin (PMA/Iono)). IO<5>celler pr. brønn inkuberes med mitogener eller forbolesterne (de respektive doser er indikert i figur 1) i et sluttvolum på 200 ul RPMI-1640 kulturmedium som er tilsatt 10 % fetalt kalveserum og antibiotika i 96-brønners flatbunnete kul-turplater (Nunc).

Celler ble opprettholdt i fuktet 5 % CO2atmosfære ved 37°C i 48 timer. Cellene puls-merkes med 1 uCi [<3>H]tymidin (Amersham Pharmacia Biotech, Sveits) i ytterligere 18 timer. Cellene ble deretter høstet på nitrocellulosefiltre (Packard) og bundet [<3>H]tymidin måles ved scintillasjonstelling (TopCount, Packard, Sveits). Celleproliferering ble beregnet som gjennomsnittet (tellinger pr. minutt (c. p. m) (± SD)) fra triplikater.

Resultater:

Figur 1: Det er en klar økning i celleproliferering som respons på alle mitogener i

gruppen av hunder som er matet med L. acidophilus NCC2628 sammenlignet med kont-rollgruppen. Denne økningen var signifikant i kulturer som er stimulert med forbolestere PMA + ionomycin. Disse data viser at lymfoide celler fra probiotisk-matete hunder er mer reaktive ved aktivering in vitro og tyder på at immunsystemet hos probiotisk-matete hunder er stimulert.

Eksempel 10: In vitro modulering av immunfunksjoner med kjæledyr- isolerte laktobacillus stammer

En in v/Vro-screening av de ulike kjæledyr-isolerte laktobacillus stammene som er beskrevet over, ble satt opp for å bestemme deres immunmoduleringspotensiale. For dette formålet målte vi deres evne til å indusere pro-inflammatoriske cytokiner (IL-12, IFNy) og/eller anti-inflammatoriske cytokiner (IL-10, TGF-fJ) (Anand A.C., Adya C. M., 1999, Trop. Gastroenterol, 20 (3):97-106, Spellberg B., Edwards J.E.Jr 2001, Clin. Infect. Dis., 32(1): 76-102). Dette var beregnet for selektering av potensielle kandi-datstammer for sterk anti-patogen eller anti-cancer immunfunksjoner, så vel som antagonistiske funksjoner mot tarmpatologier hos dyr av hundeslekten, slik som allergi og inflammasjon (inflammatoriske tarmsykdommer).Ytterligere kulturer ble satt opp med medium alene (negativ kontroll), med Enterococcus faecium stamme SF68 (NCIMB 10415, Cerbios-Pharma, Sveits) og med et humant laktobacillus isolat STI 1 (NCC 2461, CNCM 1-2116) (positiv kontroll).

Fremgangsmåte:

Cytokinprofiler som er indusert av ulike probiotiske stammer i leukocytter fra dyr i hundeslekten

Blod fra normale voksne hunder ble behandlet 5 minutter ved romtemperatur med ACK lyseringsbuffer (150 mM NH4C1, 1 mM KHCO3og 0.1 mM Na2EDTA i H20, pH = 7.4). Leukocyttene ble vasket to ganger med RPMI-medium (uten antibiotika) og sådd med 2. IO6 celler/ml i 24-brønners vevskulturplater. 1 ml av en bakteriesuspensjon (beskrevet nedenfor) som inneholder IO<6>CFU ble satt til hver brønn.

Til kontrollbehandling ble medium alene satt til leukocyttene. Prøvene ble inkubert 18 timer ved 37°C og 5 % C02. Deretter ble leukocyttene samlet, vasket i PBS og sentrifugert. Cellepelletten ble lysert med 500 ul Trizolreagens (Gibco BRL). RNA ble ekstra-hert fra cellulære lysater ved anvendelse av Nucleospin RNA kittet (Macherey-Nagel). RT-PCR for amplifisering av cytokin fra dyr av hundeslekten ble utført ved anvendelse av AB genkittet (Merck). Primerreferansene (som alle er fremstilt av Microsynth) er indikert nedenfor. Densitometrisk analyse av PCR-båndene som viste seg i de ethi-diumbromid-fargede agarosegelene, ble utført ved anvendelse av NIH Image software. Alle båndene ble normalisert med det respektive p-aktin PCR-produktbåndet som ble oppnådd med hver prøve (intern kontroll) og resultatene er uttykt som vilkårlige enheter som reflekterer pixel tettheter av hvert cytokin PCR-produktbånd (figur 2).

Fremstilling av bakterien: ulike laktobacilli-stammer ble dyrket i MRS-medium i tilnærmet 8 timer til de nådde identisk tetthet. Bakterien ble fortynnet i RPMI-medium uten antibiotika til endelig konsentrasjoner på IO<6>CFU/ml

Primere som anvendes til cytokin -RT-PCR:

Resultater:

Figur 2: Data viser at cytokinprofiler som er indusert av laktobacilli er stamme-avhengig. For eksempel induserte stammen NCC2628 høye nivåer av IL-10 og TGF-p, hvilket fremhever potensialet for denne spesielle stammen for immunmoduleringen av inflammatoriske forstyrrelser, slik som allergi og inflammatoriske tarmsykdommer. I motsetning induserte stammen NCC2583 sterke nivåer av IFNy og IL-12, som gjør stammen til en god kandidat for antipatogen eller anti-cancer aktivitet.

Eksempel 11

3 tørre kjæledyrfor anvendes i studien. Disse vil refereres til som "A", "B" og "C". Kjæledyrfor "A" er et ernæringsmessig komplett tørt kjæledyrfor som er tilgjengelig under merkenavnet ALPO (ALPO er et registrert varemerke for SOCIETE DES PRODUITS NESTLE S.A fra Sveits).

Kjæledyrfor B er det samme komplette tørre kjæledyrforet som kjæledyrfor A, men det er tilsatt en pulverblanding av utvalgte probiotiske mikroorganismer som mates fra en luktepose. Blandingen omfatter vesentlig like mengder L. acidophilus NCC2628 og bifldobakterium sp. NCC2657.

Det drysses over maten ved hvert måltid som serveres, dosen som gis er omkring 1.0E8 cfu/dag.

Kjæledyrfor C er et ernæringsmessig komplett tørt kjæledyrforet som er vesentlig identisk med kjæledyrfor A, men inneholder 1.2 vekt% av en tørket kultursupernatant av Enterococcus faecium SF68 (NCIMB 10415).

30 hunder anvendes i studien. Hundene er pre-foret i 8 uker med Kjæledyrfor A. Hundene deles så i 3 grupper, hver på 10 hunder, betegnet gruppe A, B og C og mates med dietten med korresponderende navn i 8 uker: Hundene har fri tilgang til vann og mates en gang daglig. Forekomsten av flass i pelsen bestemmes av et 30-medlemmers evalueringspanel i begynnelsen og 7 uker senere.

Hundene strigles før de evalueres av panelet, og panelmedlemmene sammenligner ikke notater under evalueringen.

I denne evalueringen presenteres hundene for hvert av panelemedlemmene i 20 forskjellige paringer. Panelmedlemmene bes om å indikere på poengskjemaet hvilken hund i paret som er presentert, som viser (1) minst flass (2) høyest glans i pelsen og (3) minst lukt fra pelsen.

Den totale pelstilstanden til alle hundene er visuelt og følbart god, slik det kan forventes av normale, friske hunder. Hundene som gis diett C ble imidlertid funnet å ha merkbart mindre flass enn de som ble matet med kontrolldiett A. De som ble matet med diett B hadde merkbart blankere pels og hadde merkbart mindre lukt fra pelsen enn de som fikk A. Disse kjennetegnene er funnet ikke å være statistisk signifikant forskjellige når de sammenlignes med dyrene i gruppe B.

Eksempel 12:

En forblanding lages av omkring 58 vekt% mais, omkring 6 vekt% maisgluten, omkring 23 vekt% kjøtt og mel, salter, vitaminer og mineraler utgjør det resterende.

Forblandingen has i en forkondisjoneringsinnretning og fuktes. Et pulver som inneholder en blanding av følgende Laktobacillus stammer settes til blandingen: Laktobacillus rhamnosus NCC2583 (CNCM 1-2449), Laktobacillus acidophilus NCC2628 (CNCM I-2453) og Entervcoccus faecium SF68 (NCIMB 10415). Pulveret er vesentlig homogent fordelt i hele blandingen. Den fuktige forblandingen has deretter i en ekstruderkoker og gelatiniseres. Gelantinmatriksen som forlater ekstruderen tvinges gjennom en stansering og ekstruderes. Ekstrudatet kuttes i stykker som er egnet til mating av hunder, tørket ved omkring 110°C i omkring 20 minutter og avkjøles for å danne pelletter. Ekstru-datstykkene sjekkes for bakterieaktivitet til de tilsatte stammene. Ingen påvises.

Eksempel 13

24 hunder anvendes i denne studien. De omfatter yngre og eldre hunder, sistnevnte er fra 8 til 12 år gamle. De eldre hundene som er valgt viser ytre tegn på inflammatoriske ledd i samsvar med alderen og synes å oppleve noen vanskeligheter med å bevege seg til tider. Visse bevegelser viser seg å være smertefulle. Disse symptomene observeres ofte hos eldre hunder og antas å være relatert til artrittisk tilstand. 3 tørre kjæledyrfor anvendes i studien og betegnes A, B og C. Kjæledyrfor "A" er et ernæringsmessig komplett tørt kjæledyrfor (ALPO Beefy Dinner). Dette er kontroll-foret.

Alle de 24 utvalgte medlemmene pre-mates i 8 uker med Kjæledyrfor A. Hundene deles så i 3 grupper, A, B og C som hver har 8 hunder og samme andel av yngre og eldre. Hver gruppe mates med følgende respektive dietter i 8 uker:

Kjæledyrfor B er et ernæringsmessig komplett tørt kjæledyrfor som er vesentlig identisk med kjæledyrfor A, men som inneholder et belegg som utgjør 2 % av vekten, belegget omfatter mikroorganismen Enterococcus faecium SF68 (NCIMB 10415). Mengde for gitt daglig til hver hund er beregnet i henhold til individuell kroppsvekt, slik at dosen er 1.0E+09 cfu/dag.

Diett C omfatter de ekstruderte bitene som er fremstilt i eksempel 12 over. Mengden for gitt daglig til hver hund er beregnet i henhold til individuell kroppsvekt, slik at mikroorganisme-dosen er l.OE+11 cfu/dag.

Hundene har fri tilgang til vann og mates en gang daglig. En aktivitesmåler er festet til halsbåndet hos hver hund og målinger tas daglig. Hundene evalueres også visuelt mht. aktivitet av de ansatte på kennelen.

Tilstanden til alle hundene er visuelt og følbart god, slik det kan forventes av normale, friske hunder. Hundene i gruppene som får kjæledyrfordietter B og C er imidlertid merkbart mer aktive enn deres motparter på diett A. Måleravlesninger støtter disse ob-servasjonene.

Videre viser det seg at de eldre hundene i gruppene B og C har færre ytre tegn på lokal leddinflammasjon etter å ha blitt gitt diett B og C i forsøksperioden. Dessuten viser det seg at hundene utviser lavere smertenivåer ved fysisk bevegelse og beveger seg mer fritt enn tidligere. Det kan konkluderes med at diett B og C viser seg å gi lette med hensyn til visse tegn på aldring og forbedrer motiliteten hos eldre kjæledyr.

Eksempel 14: Tørtkattefor

En forblanding lages av omkring 58 vekt% mais, omkring 6 vekt% maisgluten, omkring 23 vekt% kyllingmel, salter, vitaminer og mineraler utgjør det resterende.

Forblandingen has i en forkondisjoneringsinnretning og fuktes. Det fuktede foret has deretter i en ekstruderkoker og gelatiniseres. Gelantinmatriksen som forlater ekstruderen tvinges gjennom en stansering og ekstruderes. Ekstrudatet kuttes i stykker som er egnet til mating av katter, tørkes ved omkring 110°C i omkring 20 minutter og avkjøles for å danne pelletter. På dette punktet tilveiebringes et lyofilisert pulver av en eller flere stammer av de følgende Laktobacillus artene for anvendelse på pellettene: Laktobacillus rhamnosus NCC2583 (CNCM 1-2449), Laktobacillus acidophilus NCC2628 (CNCM I-2453) eller Enterococcus faecium SF68 (NCIMB 10415). Tilstrekkelig pulver er derfor tilveiebragt slik at den korresponderende kostinntaksmengde for katten er fra omkring 1.0E+07 - 1.0E+09 cfu/dag. Noe pulver blandes i en første masse av pelletene og puttes i en pose. En andre mengde av pulveret måles opp og blandes med en lipidbærer som deretter sprayes på en andre masse av pelletter. Pellettene puttes i pose etter at belegget har tørket tilstrekkelig ved 50 - 60°C i noen minutter.

Eksempel 15: Hermetisert kjæledyrfor og supplement

En blanding fremstilles av 73 % fjærfekadavre, griselunger og okselever (malt), 16 % hvetemel, 2 % farger, vitaminer og uorganiske salter. Denne blandingen emulgeres ved 12°C og ekstruderes i form av en pudding som deretter kokes ved en temperatur på 90°C. Den avkjøles til 30°C og kuttes i skiver. 45 % av disse skivene blandes med 55 % av en saus som er fremstilt av 98 % vann, 1 % farge og 1 % guargummi. Blikkbokser fylles og steriliseres ved 125°C i 40 minutter. Som et probiotisk supplement som skal blandes med kjæled<y>rforet før servering, tilveiebringes ekstra pakninger i form av lukteposer med stammer av de følgende Laktobacillus artene: Laktobacillus rhamnosus NCC2583 (CNCM 1-2449), Laktobacillus acidophilus NCC2628 (CNCM 1-2453) eller Enterococcus faecium SF68 (NCIMB 10415). Den korresponderende mengden til kjæledyret er fra omkring 106-10<12>cfu/dag, avhengig av om det er katt eller hund og av fysiske faktorer, slik som kroppsmasse. Dette leveres som et supplement som er klistret på hermetikkboksen sammen med foringsanvisninger.

Claims (5)

1. Probiotisk stamme,karakterisert vedat den er Lactobacillus reuteri NCC2581 (CNCM 1-2448), Lactobacillus reuteri NCC2592 (CNCM I-2450), Lactobacillus rhamnosus NCC2583 (CNCM 1-2449), Lactobacillus reuteri NCC2603 (CNCM 1-2451), Lactobacillus reuteri NCC2613 (CNCM 1-2452), Lactobacillus acidophilus NCC2628 (CNCM 1-2453).

2. Ernæringssammensetning for hunder og katter, inneholdende minst en probiotisk stamme ifølge krav 1, assosiert med en spiselig bærer eller en farmasøytisk matriks.

3. Sammensetning ifølge krav 2, hvori stammen er tilstede i sammensetningen i en mengde på 1.0E+04 cfu/g til l.OE+11 cfu/g.

4. Sammensetning ifølge krav 2 eller 3, som videre inneholder en prebiotisk substans.

5. Sammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 2-4, hvor sammensetningen fore-ligger i form av a. et ernæringsmessig komplett kjæledyrfor i en knust, tørket eller våt, avkjølt eller lagringsstabil form b. i form av et kosttilskudd eller et supplement.