KR100595528B1

KR100595528B1 - 내산성, 내산소성 및 내염성이 우수한 비피도박테리움 아니말리스 ｄｙ－６４ 및 이를 함유한 식품

Info

Publication number: KR100595528B1
Application number: KR1020040066154A
Authority: KR
Inventors: 전덕영; 채명희; 명동호
Original assignee: 전덕영
Priority date: 2004-08-21
Filing date: 2004-08-21
Publication date: 2006-07-03
Also published as: KR20050007206A

Abstract

본 발명은 내산성, 내산소성 및 내염성이 우수한 비피도박테리움 아니말리스(Bifidobacterium animalis) DY-64 및 이를 함유한 식품에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 장수 노인으로부터 분리ㆍ동정된 내산성, 내산소성 및 내염성이 우수한 신규한 비피도박테리움 아니말리스 DY-64[KCCM-10583] 및 상기 균주를 함유하여 비피더스 균주(Bifidobacteria)가 가지는 여러 생리활성을 최적으로 적용한 김치, 정장제 및 요구르트 등의 식품에 관한 것이다.

내산성, 내산소성, 내염성, 비피도박테리움 아니말리스 DY-64, 김치

Description

내산성, 내산소성 및 내염성이 우수한 비피도박테리움 아니말리스 ＤＹ－６４ 및 이를 함유한 식품{Bifidobacterium animalis DY-64 and foods comprising it}

도 1은 비피도박테리움 아니말리스 DY-64의 전자현미경 사진을 나타낸 것이다.

도 2는 김치에 첨가된 비피도박테리움 아니말리스 DY-64의 생존성을 전기영동법으로 확인한 결과이다[1: 1 Kb DNA 래더 마커, 2 ∼ 5, 7 ∼ 9: 비피도박테리움 아니말리스 DY-64, 6: 락토바실러스 속, 10: 음성 대조군].

본 발명은 내산성, 내산소성 및 내염성이 우수한 비피도박테리움 아니말리스(Bifidobacterium animalis) DY-64 및 이를 함유한 식품에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 장수 노인으로부터 분리ㆍ동정된 내산성, 내산소성 및 내염성이 우수한 신규한 비피도박테리움 아니말리스 DY-64[KCCM 10583] 및 상기 균주를 함유하여 비 피더스 균주(Bifidobacteria)가 가지는 여러 생리활성을 최적으로 적용한 김치, 정장제 및 요구르트 등의 식품에 관한 것이다.

비피도박테리아(Bifidobacteria)는 혐기성 미생물로서 장내에서 유기산을 생성하여 장내부를 산성화함으로써 부패균의 증식을 억제하고, 병원성균의 감염 방지, 장관 운동의 촉진, 체내 면역기능의 증강, 항암 작용 등의 기능을 가지고 있다고 알려지고 있다. 따라서 신규한 비피도박테리아 균주들이 분리동정되어 특허 등록 및 공개되고 있다. 이러한 비피도박테리아를 이용한 유제품의 제품개발은 활발히 이루어지고 있으나 김치의 경우 그 이용이 많지 않다. 이는 비피도박테리아가 김치에 이용되기 위해서는 생물학적 특성상 내산소성, 내산성, 및 내염성을 지니고 있어야 하기 때문이다. 따라서 기존의 비피도박테리아보다 김치에의 적응력이 우수한 균주의 분리, 개발이 필요하였다.

한국 특허 등록 제82056호에서는 비피도박테리아가 첨가된 김치의 제조방법을 제시하고 있으나, 비피도박테리아는 공기가 있는 조건에서 생육하기 어렵기 때문에 진공 포장 등의 특별한 제조방법을 필요로 하고 있다. 또한, 한국 특허 출원 제2000-8938호에서는 김치 발효에 적합한 특정의 호기성 비피도박테리아와 올리고당을 선정하여 김치를 제조하는 방법을 개시하고 있으나, 호기성 비피도박테리움 균주의 특성과 선발과정이 명확하지 않고 선정한 호기성 균주를 첨가한 김치에의 비피도박테리움 생존 여부가 불확실한 문제점이 있어 특허 거절되었다.

상기의 문제점을 개선한 한국 특허 공개 제2003-31553호에서는 내산소성, 내산성 및 내염성을 지닌 비피도박테리움 락티스 DSM 10140을 김치에 적용하여 고기 능성 김치 제품을 개발하였다고는 하나, 상기 균주는 외국인 유래의 비피도박테리움이므로 그 숙주 특이성을 고려할 때 식품에 이용시 한국인의 장내 정착성에 문제점이 있을 것으로 여겨지며, 김치내에서 생존한다고는 하나 그 생존률에 대한 결과 제시가 명확하지 않은 문제점이 있다.

따라서, 한국인의 전통식품인 김치 및 유산균 첨가식품에 유용하게 사용될 수 있는 한국인 유래의 비피도박테리아를 탐색·동정하고 분리된 균주의 식품에서의 최적 생존 조건을 연구할 필요가 있다.

이에, 본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 호기 조건인 김치 제조에 이용이 가능한 내산소성, 내산성 및 내염성이 우수한 비피도박테리움 아니말리스 DY-64를 건강한 한국인으로부터 선발하고 이를 김치 등의 식품에 적용하고, 실제 김치 등의 식품에서의 장기간 생존 여부를 규명함으로써 비피도박테리아가 가지고 있는 유익한 여러 생리활성을 통해 고부가가치를 부여한 고기능성 식품을 제조함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 내산성, 내산소성 및 내염성이 우수한 한국인 유래의 비피도박테리움 아니말리스(Bifidobacterium animalis) DY-64[KCCM-10583] 및 이를 적용한 식품을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명은 내산성, 내산소성 및 내염성이 우수한 비피도박테리움 아니말리스(Bifidobacterium animalis) DY-64[KCCM-10583]를 그 특징으로 한다.

또한, 상기 비피도박테리움 아니말리스 DY-64[KCCM-10583]가 함유된 식품을 포함한다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 장수 노인으로부터 분리·동정된 내산성, 내산소성 및 내염성이 우수한 신규한 비피도박테리움 아니말리스 DY-64[KCCM-10583] 및 상기 균주를 함유하여 비피더스 균주(Bifidobacteria)가 가지는 여러 생리활성을 최적으로 적용한 김치, 정장제 및 요구르트 등의 식품에 관한 것이다.

상기 내산성, 내산소성 및 내염성이 우수한 비피도박테리움 아니말리스 DY-64의 분리 동정과정은 다음과 같다.

먼저, 전남 담양에 거주하는 95세 이상의 건강한 노인 중 개인 생활 수행능력이 가능하고 질병이 없는 자를 대상으로 분변으로부터 균주를 분리하고, 이중 내산소성을 지닌 균주를 선별하여 한국미생물보존센터(KCCM)에 16S rDNA 분석을 통해 신규한 비피도박테리움 아니말리스의 근연균으로 동정하였으며, 비피도박테리움 아니말리스 DY-64라 명명하였다.

이에, 본 발명의 신균주 비피도박테리움 아니말리스 DY-64를 한국미생물보존센터(KCCM)에 2004년 7월 2일자로 기탁하여 수탁번호 KCCM-10583를 부여받았다. 또한, 상기 비피도박테리움 아니말리스 DY-64에 대하여 위액의 산도인 pH 2 내지 3 에서 생존성을 확인한 결과, 초기 접종 농도 10⁸ cfu/ml 수준을 유지하여 우수한 내산성을 가짐을 알 수 있었으며, 2% 내지 3%의 NaCl에서의 상기 균주의 성장을 확인한 결과, 3% NaCl 조건에서도 높은 생존성을 나타내 우수한 내염성을 가짐을 알 수 있었고, 호기적인 조건에서의 생육을 확인한 결과 내산소성이 우수함을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명의 한국인 유래의 비피도박테리움 아니말리스 DY-64는 내산소성, 내산성 및 내염성이 우수하므로 김치, 정장제 또는 요구르트 등에 첨가하여 비피도박테리아균이 가지는 여러 가지 생리활성을 적용한 새로운 건강기능성 식품을 개발할 수 있다.

이하, 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 미생물 분리 및 선별

한국의 장수벨트에 포함된 전남 담양에 거주하는 95세 이상의 건강한 노인 중 개인 생활 수행능력이 가능하고 질병이 없는 자를 대상으로 분변을 채취하였다. 이때 설사중이거나 항생제를 복용하는 사람은 조사 대상에서 제외되었다. 분변 시료는 배변 후 1시간 이내에 무균적으로 실험실로 옮겨 이용하였다. 신선한 변 0.1 ∼ 0.2 g을 멸균 혐기성 희석액(0.45% KH₂PO_4,0.6% Na₂HPO _4,0.05% L-cysteine·HCl, 0.05% Tween 80, 0.1% Bacto agar)에 넣어 순차적으로 희석하였다. BS(Bifidobacteria selective) 배지에 십진 희석한 시료액을 도말하고, 가스 팩 혐기성 자 발효조(Gas Pak anaerobic jar, BBL, U.S.A)를 이용하여 37 ℃에서 48시간 동안 배양하였다.

배지에서 자란 콜로니를 염색하여 현미경으로 검경하고 전형적인 비피도박테리아 형태의 것을 선정하고 이를 MRS(0.05% 시스테인 함유) 액체 배지에서 배양한 후 프럭토오스-6-포스페이트 포스포케토라아제 효소 실험으로 2차적으로 확인하여 분리하였다.

분리된 비피도박테리움 균주들은 내산소성을 비교하기 위해 BS 아가 배지에 희석된 미생물액을 도말하여 호기적 조건에서 72시간 배양하였다. 배양 후 콜로니를 형성하는 균주를 내산소성을 지닌 균주로 판단하고 선발하였다.

전라남도 담양지역의 95세 이상의 장수노인의 장관에서 분리한 내산소성을 가진 비피도박테리움의 배양학적인 특성은 다음 표 1 및 도 1과 같이 그램 염색시 양성반응을 나타내고 전자현미경 검경 결과 간균, 곤봉형태를 나타내었으며, 호기조건에서 성장을 하고 산을 생성하였다 .

분리한 유산균의 형태학적 및 생리학적 특징

특 성	결 과	특 성	결 과
형태/그램형	간균 / +	덱스트란	-
포자	-	L-젖산	+
운동성	-	글루코스(산)	+
공기중 성장	+	15 ℃에서 성장	-
혐기성	+	45 ℃에서 성장	-
카탈라제	-	cell size	1.4∼2.5 × 0.5∼0.8 ㎛

분리한 비피도박테리움의 당 발효성을 조사한 결과는 다음 표 2와 같이 아라 비노스, 라피노스, 락토스, 말토스는 이용하였고 스타치, 셀로바이오스는 이용하지 못하였다.

신균주와 종래 유사균주의 당발효성 비교

탄소원	종래 유사 균주		신균주
탄소원	비피도박테리아 아니말리스	비피도박테리아 롱검	비피도박테리움 아니말리스 DY-64
Arabinose	+	+	+
Raffinose	+	+	+
Starch	+	-	-
Lactose	+	+	+
Cellobiose	d	-	-
Melezitose	d	+	+d
Sorbitol	-	-	-
Maltose	+	+	+
Mannose	-	d	-
* d : delayed

선발된 균주를 한국미생물보존센터(KCCM)에 의뢰하여 16S rDNA 분석[서열번호 1]을 통해 동정한 결과 신규한 비피도박테리움 아니말리스로 동정하였고, 따라서 비피도박테리움 아니말리스 DY-64로 명명하였고 한국미생물보존센터(KCCM)에 2004년 7월 2일자로 기탁하여 수탁번호 KCCM-10583을 부여받았다.

실시예 2: 내산성 시험

비피도박테리움 아니말리스의 내산성을 조사하기 위하여 0.05% 소디움 포스페이트 용액을 염산으로 보정하여 만든 pH 3.0, pH 2.5, pH 2 용액 속에 비피도박테리움 아니말리스 배양액을 10⁸cfu/ml의 초기 접종 농도로 접종하였다. 이 용액을 37 ℃에서 혐기적으로 2시간 동안 정치 배양한 후 일정량을 십진 희석 배양한 후 생존 균수를 측정하였다.

비피도박테리움 아니말리스 DY-64는 pH 3.0, pH 2.5, pH 2 조건에서도 거의 사멸하지 않고 초기 접종 농도 10 ⁸cfu/㎖를 유지하였다. 초기 미생물 수는비피도박테리움 아니말리스 DY-64는 9.6×10⁸cfu/㎖, 비피도박테리움 아니말리스 ATCC 25527은7.0×10⁸cfu/㎖이었다.

여러 pH에서 신균주와 비교균주의 생존수(cfu/㎖) 비교

균주 pH	pH 2	pH 2.5	pH 3
비피도박테리움 아니말리스 DY-64	3.4×10⁸	3.2×10⁸	3.5×10⁸
비피도박테리움 아니말리스 ATCC 25527	5.7×10⁶	4.3×10⁷	6.7×10⁷

실시예 3: 내염성 시험

MRS(0.05% L-cysteine 첨가)에 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3% NaCl을 첨가한 배지에 미생물을 배양한 후 NaCl을 첨가하지 않은 배지를 기준으로 성장도를 평가하였다. 이때의 성장도는 BS 배지를 이용하여 생균수로 측정하였다.

비피도박테리움 아니말리스 DY-64는 1% 염농도에서 10⁸ cfu/ml을 유지하였으며, 2% 염 조건에서 10⁷ cfu/ml, 3% 염농도에서도 10⁵ cfu/ml의 생균수를 나타내었다. 또한 표준 비피도박테리움 아니말리스 보다 우수한 내염성을 나타내어 김치 등 식품 첨가에 우수할 것으로 생각된다.

여러 염농도에서 신균주와 비교균주의 생존력(cfu/㎖) 비교

Strain Salt(%)	비피도박테리움 아니말리스 DY-64	비피도박테리움 아니말리스 ATCC 25527
0	3.8 ×10⁹	4.8 ×10⁹
1	2.2 ×10⁹	2.3 ×10⁸
1.5	4.6 ×10⁸	5.4 ×10⁸
2	2.8 ×10⁸	2.0 ×10⁸
2.5	2.9 ×10⁷	2.6 ×10⁷
3	8.6 ×10⁶	5.5 ×10⁶
3.5	1.2 ×10⁶	4.6 ×10⁵

실시예 4: 김치의 제조

비피도박테리움 아니말리스 DY-64를 MRS(0.05% L-시스테인 첨가) 액체 배지에 접종한 후 37 ℃에서 혐기적으로 48시간 배양하였다. 배양된 균수는 1 × 10⁹ CFU/㎖를 나타냈으며 배양된 균주는 원심분리하여 균체를 모은 후 0.85% 식염수로 2회 세척하였다.

김치 제조를 위하여 배추는 4등분하고 12% 소금물에 6시간 절인 후, 흐르는 물로 2회 헹구고 6시간 탈수시켰다. 김치 제조시 사용된 부재료의 종류 및 배합비는 다음 표 5와 같다.

상기와 같이 제조된 김치에 비피도박테리움 아니말리스 DY-64 배양액을 김치 1 g당 10 ⁸cfu/g 수준으로 첨가하고 밀폐 용기에 1/4포기씩 김치를 넣은 후 포장하여 4 ℃에 보관하면서 실험하였다.

김치 제조의 주요 재료

재 료	함 량(g)
배추	100
무	10
파	2
생강	0.6
마늘	1.4
마른 고추	2
고추가루	1
까나리 액젓	2
새우젓	1
배	1.5
양파	1.5
찹쌀 풀	0.5
설탕	0.5

실시예 5: 김치 내 비피도박테리움 아니말리스 DY-64의 생존성

균주 분리를 위해서 시료 김치 100 g을 채취한 후 멸균 증류수 100 ㎖을 가하고 20분간 진탕시킨 다음 십진희석법으로 희석하여 BS 아가에 도말한 후 37 ℃에서 3일간 혐기배양을 하였다.

김치에서 분리한 균주가 비피도박테리움 아니말리스 DY-64임을 확인하기 위하여 콜로니 PCR을 실시하였다. PCR에 사용된 프라이머는 비피도박테리움에 특이성 있게 제작한 것을 사용하였다.

정방향 프라이머: 5-gggtggtaatgccggatg- 3 (서열번호 2)

역방향 프라이머: 5-ccaccgttacaccgggaa- 3 (서열번호 3)

콜로니 PCR 반응액은 25 pmole의 각 프라이머, premix 2㎕(Bioneer 社,대전), SDDW 5 ㎕를 사용하였다. PCR 증폭조건은 94 ℃, 5분간 변성(denaturation) 시키고 90 ℃에서 1분, 55 ℃에서 30초, 72 ℃에서 1분 조건에서 5 사이클을 수행하고, 91 ℃에서 30초, 55 ℃에서 30초, 72 ℃에서 1분 조건에서 30 사이클을 수행한 후 72 ℃에서 7분간 증폭하는 조건으로 실시하였다. PCR 반응 후 생성된 PCR 산물은 에티듐 브로마이드(ethidium bromide)가 포함된 아가로즈 젤 상에서 전기영동을 실시하고 자외선을 조사하여 확인하였다[도 2].

김치에 1.6 ×10⁸ cfu/g 첨가된 비피도박테리움 아니말리스는 4 ℃ 온도에서 김치 발효 과정 중 우수한 생존력을 나타내어 10일 후에 5.4 ×10⁷ cfu/g을 나타내었고, 30일 발효 후에도 5.3 ×10⁶ cfu/g 수준의 높은 생존성을 나타내었다[표 6].

김치 발효과정 중 비피도박테리움 아니말리스의 생존성 비교(cfu/g)

김치 유형 발효경과일	0	10	15	30
비피도박테리움 아니말리스 DY-64 첨가 김치	1.6×10⁸	5.4×10⁷	3.2×10⁷	5.3×10⁶
대조군(비피도박테리움 아니말리스 DY-64 무첨가 김치)	0	0	0	0

실시예 6: 내산소성 비피도박테리아균이 첨가된 김치의 선호도 조사

비피도박테리움 아니말리스 DY-64를 첨가하여 제조한 김치와 기존의 김치를 다음의 관능검사를 통해 소비자의 선호도를 비교 조사하였다. 조사항목은 색깔, 냄새, 맛, 숙성도, 조직감, 종합적인 기호도를 9점 평가법으로 평가하였다.

매우나쁨: 1, 조금나쁨: 3, 보통: 5, 조금좋음: 7 매우좋음:9

김치¹⁾의 관능평가

day 항목		대조군	비피도박테리움 아니말리스 DY-64 첨가군
색깔		6.0±0.9²⁾	6.3±1.1
냄새	신 내	5.5±1.6	5.6±1.4
	풋 내	4.9±1.5	5.4±1.3
	새콤한 내	5.8±1.7	5.9±1.1
맛	매운 맛	5.2±0.9^b	6.3±1.0^{a 3)}
	신 맛	4.4±1.2^b	6.6±0.8^a
	새콤한 맛	6.3±1.9	6.4±1.5
질감	연함	5.6±1.1^b	6.6±1.0^a
	사각사각함	5.6±1.0^b	7.0±1.0^a
	질깃함	5.6±1.5	5.4±1.7
전체적인 맛		5.6±1.0^b	6.6±0.8^a
1) 4℃, 15일 발효한 김치 2) 평균 ±표준편차, 자료분석은 독립적 t-test를 이용했다. 3) 다른 위 첨자는 유의적 차이를 나타낸다 (p<0.05)

비피도박테리아 첨가한 김치군과 첨가하지 않은 대조군 김치는 관능평가에서 상당한 차이를 나타내었으며 특히 맛과 질감, 전체적인 맛에 있어서 비피도박테리아 첨가군은 대조군보다 우수한 성적을 나타내었다. 이는 신규한 비피도박테리움 아니말리스 DY-64를 첨가한 김치가 대조군보다 더 우수한 기호도를 나타내어 김치 제조에 첨가시 기능성 뿐만 아니라 맛에 있어서도 우수한 김치를 제조할 수 있음을 보여주었다.

실시예 7 : 요구르트 제조

비피도박테리움 아니말리스 DY-64를 100㎖ 스팀 밀크(skim milk)에 1×10⁶ cfu/㎖로 접종하여 37℃에서 24시간 동안 배양하면서 우유배지에서의 증식성과 커 드 생성력을 조사하였다.

발효 후 비피도박테리움 아니말리스 DY-64는 배양액 1㎖당 1×10⁸ cfu/㎖이상으로 증식하였으며, 부드러운 커드를 형성하였다. 이는 신규한 비피도박테리움 아니말리스 DY-64를 첨가함으로서 발효유를 제조할 수 있음을 나타냈다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 신균주 비피도박테리움 아니말리스 DY-64[KCCM 10583]는 한국인 유래의 미생물로서 내산소성, 내산성 및 내염성이 우수하므로 비피도박테리아가 함유된 기능성 식품 등의 개발에 유용하다.

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Claims

내산성, 내산소성 및 내염성이 우수한 비피도박테리움 아니말리스(Bifidobacterium animalis) DY-64[KCCM 10583].
청구항 1의 비피도박테리움 아니말리스(Bifidobacterium animalis) DY-64[KCCM 10583]가 함유된 것임을 특징으로 하는 식품.
제 2 항에 있어서, 상기 식품은 김치, 정장제 또는 요구르트인 것을 특징으로 하는 식품.