JP2021136951A - 乳酸菌含有組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
腸内細菌は、宿主の免疫系の発達に影響を与えると考えられており(非特許文献1)、アレルギー疾患と何らかの関連を有する腸内細菌として乳酸菌が挙げられる。また、乳幼児期におけるペットと生活する環境がアレルギー疾患の環境要因として重要であり、例えば、乳幼児期にペット(イヌやネコなど)と接触することで生じるヒトとペットの微生物クロストークが、アレルギーの発症を抑制することを示唆する報告もある(非特許文献2および3)。Fujimuraらは、イヌが飼われている環境におけるハウスダストに暴露されたマウスの腸内細菌叢において、乳酸菌のLactobacillus Johnsoniiの比率が顕著に上がっており、Lactobacillus Johsoniiがアレルギー性の気道疾患の抑制に重要な役割を果たしていることを報告した(非特許文献4)。
発明者らは、L. animalisをマウスのアトピー性皮膚炎モデルおよびアレルギー性喘息モデルに経口投与したところ、アレルギーによって発症する諸症状を抑制する効果が認められた。さらに、L. animalisは、これまでにアレルギー抑制効果が報告されているLactobacillus johnsonii(L. johnsonii)よりも高いアレルギー抑制効果を示すことが分かった。
本発明は上記知見に基づいて完成されたものである。
(1)ラクトバチルス・アニマリスに属する乳酸菌、またはその菌体処理物を含む組成物。
(2)前記乳酸菌が、受託番号NITE P-03137、受託番号NITE P-03138、受託番号NITE P-03139および/または受託番号NITE P-03140で寄託されたラクトバチルス・アニマリス株である上記(1)に記載の組成物。
(3)抗アレルギー活性を有する上記(1)または(2)に記載の乳酸菌または組成物
(4)前記組成物が飲食品組成物である、上記(1)ないし(3)のいずれかに記載の組成物。
(5)前記組成物が医薬組成物である、上記(1)ないし(3)のいずれかに記載の組成物。
(6)前記組成物が飼料組成物である、上記(1)ないし(3)のいずれかに記載の組成物。
(7)前記組成物が衛生用組成物である、上記(1)ないし(3)のいずれかに記載の組成物。
ラクトバチルス・アニマリスを増殖するための培地は、特に限定されるものではなく、当業者が通常選択する培地を用いることができる。そのような培地として、例えば、炭素源(グルコース、ガラクトース、マンノース、ラクトース、スクロース、セロビオース、トレハロースなど)、窒素源(アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウムなど)、無機塩類(塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、硝酸カルシウムなど)、有機成分(ペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆粉など)を菌種に適する組成で含む培地であればよく、MRS培地やLBS培地などを好適に使用することができる。
また、本発明の組成物には、ラクトバチルス・アニマリスまたはその菌体処理物以外に他の物質が含まれていてもよい。他の物質として、特に制限はないが、例えば、乳糖、ブドウ糖、マンニトール、蔗糖、デキストリン、シクロデキストリン、デンプン、セルロース、コラーゲン、クエン酸、酢酸、食塩、ビタミン類などを含有させてもよい。
本発明の組成物は、アレルギーの発症を抑制する効果を有しており、使用目的に応じて、例えば、飲食品組成物、医薬組成物、飼料組成物および衛生用組成物などとして提供され得るが、これらの組成物に限定されるものではない。
ここで「予防」とは、アレルギーの発症を予め阻止することを目的とする処置のことである。
本発明の予防方法の対象は、特に限定はされないが、哺乳類に分類される任意の動物であればよく、例えば、ヒトの他、イヌ、ネコ、ウサギなどのペット動物、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマなどの家畜動物などのことである。特に好ましい「哺乳動物」は、ヒトおよびイヌである。
以下に実施例を示してさらに本発明の説明を行うが、本実施例は、あくまでも本発明の実施形態の例示にすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
1−1.糞便からの乳酸菌の分離および系統分類
健常犬(16頭)の糞便から分離した細菌240株のうち、アトピー犬の腸内細菌叢より健常犬の腸内細菌叢において優位であった184株を選択し、系統分類解析を行った。具体的には、犬から採取した糞便をMRS液体培地またはLBS液体培地を使用し、嫌気条件下で、37℃にて一晩静置培養を行った。培養後、MRSまたはLBS平板培地で細菌の分離を行った。純化は最低3回行った。細菌の系統分類は、16S rRNAシークエンスに基づき行った。その結果、Bacteroides属、Enterococcus属、Lactobacillus属およびStreptococcus属の4属13種を同定し、その中から、これまでにアレルギー発症との関連性が報告されていなかったLactobacillus属のLactobacillus animalis(L. animalis)を選択し、解析対象とした。なお、本実施例にけるポジティブコントロールとして、アレルギー発症との関連が示唆されているLactobacillus johnsonii(L. johnsonii)を使用した。本実施例で使用したL. animalisは、受託番号NITE P-03137、受託番号NITE P-03138、受託番号NITE P-03139および受託番号NITE P-03140で寄託された菌株を、菌数で1:1:1:1の比率で混合したものである。
本実施例で用いた全ての動物実験は麻布大学動物実験専門委員会に承認を得て実施した。
1−2−1.アトピー性皮膚炎モデル
6週齢の雌性NC/Ngaマウス(日本チャールス・リバー株式会社)を用いて実験を実施した。1週間馴化後、L. animalisまたはL. johnsoniiを1匹あたり0.2 ml(109)2週間経口投与した後、ダニ抗原(コナヒョウヒダニ、Dermatophagoides farinae)の感作を開始した。ダニ抗原の感作前に頚背部皮膚の毛刈りを行い、頚背部には10回のテープストリッピングを行った後、ダニ懸濁液30 μl(0.25 mg/ml)を、両耳介には10μlずつピペットを用いて経皮投与した。ダニ抗原の投与は週2回、12週間実施し、毎週、痒み行動のモニタリング、皮膚症状のスコア、背部皮膚の厚さ測定を実施した。
痒み行動のモニタリングは、ビデオカメラで記録したマウスの行動のうち、後肢、前肢もしくは舌でダニ抗原塗布部位(耳介および背部皮膚)を噛むないし引っ掻く行動を1回の痒み行動とし、60分間における痒み行動の回数を記録した。
皮膚所見は、耳介部、背部皮膚のそれぞれについて痂疲・潰瘍形成、発赤をスコア化し(0〜4段階に症状の程度をスコア化した)、その累計値を累積スコアとして評価した。
背部皮膚の厚さは、週1回ノギスを使って測定した。
ダニ抗原最終投与の翌日に、イソフルラン吸入麻酔下でマウスから採血を行い、その後、安楽殺し、耳介リンパ節および耳介皮膚の採材を行った。
血液は血清を分離後、血中総IgE量をELISA法にて定量した。
耳介リンパ節は、単細胞分離後、フローサイトメトリー法により、細胞表面抗原に基づいて細胞を分離取得した。得られた細胞のうちヘルパーT細胞(CD3+CD4+T細胞)を抗CD3抗体および抗CD28抗体(株式会社ベリタス)存在下で24〜96時間培養後、培養上清中の各種サイトカインの産生量をELISA法で測定した。
採取した耳介皮膚は液体窒素により凍結し、電動ホモジナイザーでPBS 500μl中にホモジナイズして得られた上清中の各種サイトカイン量をELISA法により測定した。
6週齢の雌性BALB/cマウス(日本チャールス・リバー株式会社)を用いて実験を実施した。1週間馴化後、L. animalisまたはL. johnsoniiを1匹あたり0.2 ml(109)2週間経口投与した後、ダニ抗原(コナヒョウヒダニ、Dermatophagoides farinae)の感作を開始した。ダニ抗原の感作は、イソフルラン吸入麻酔下で、ダニ懸濁液30 μl(1 mg/ml)を、ピペットを用いて点鼻投与した。ダニ抗原の投与は、週1回、3週間連続実施した。同様の方法で4週目にイソフルラン吸入麻酔下で、ダニ懸濁液5 μl(0.2 mg/ml)を、ピペットを用いて3日間連続で点鼻惹起した。 ダニ抗原最終惹起の翌日に、イソフルラン吸入麻酔下でマウスから採血を行い、安楽殺し、肺門リンパ節、肺胞洗浄液の採材を行った。
肺胞洗浄液は、洗浄液中の好酸球(eosinophil)および好中球(neutrophil)の数のカウントに使用した。
肺門リンパ節は、単細胞分離後、フローサイトメトリー法により、細胞表面抗原に基づいて細胞を分離取得した。得られた細胞のうちヘルパーT細胞(CD3+CD4+T細胞)を抗CD3抗体および抗CD28抗体存在下で24〜96時間培養後、培養上清中の各種サイトカインの産生量をELISA法で測定した。
得られたデータは、各群で平均値および標準誤差を算出し、実験毎に全群で多重比較検定を実施した。多重比較検定ではBartlett 法によるなど分散の検定を行い、分散の場合は、Dunnett's 検定を用いた。各検査項目について,各群間の統計学的有意差の有無を危険率5および1%レベルで解析した。
2−1.アトピー性皮膚炎モデル
アトピー性皮膚炎は痒みと皮膚の炎症が、交互に発現する事で症状が悪化する病態である。そこで、週1回ダニ抗原の投与直後に1時間あたりのマウスモデルの痒み行動を測定する事で、乳酸菌が痒みに及ぼす影響を検討した。
ダニ抗原を投与してアトピー性皮膚炎を発症させたマウスモデルの解析結果から、コントロールマウス(乳酸菌非投与)に比べ、L.animalis投与マウスおよびL.johnsonii投与マウスでは、引っ掻き行動の回数が有意に減少することが認められた(図1AおよびB)。
また、図2は、ダニ抗原投与期間中のアトピー皮膚症状をスコア化した結果である。アトピー症状発現は個体によるばらつきが大きく、統計学的有意差までは認められなかったが、L.animalis投与群およびL.johnsonii投与群では、コントロール群よりも皮膚症状の軽減の程度が高かった。また、L.animalis投与群とL.johnsonii投与群を比較すると、L.animalis投与群の方が症状の軽減の程度が大きかった。
アトピー性皮膚炎では、その症状の悪化に伴い、表皮の肥厚・細胞浸潤が進行し、皮膚の厚さが増大する。そこで、モデルマウスの背部皮膚の厚さを測定した。その結果、L.animalis投与群およびL.johnsonii投与群では、コントロール群よりも皮膚の厚さの減少が顕著であった。なかでも、L.animalis投与群における厚さの減少は統計学的に有意で、L.johnsonii投与群と比較しても明らかな減少が認めらた(図3)。
次に、モデルマウスから調製した血清中の総IgE量を測定した。その結果、L.animalis投与群およびL.johnsonii投与群において、血清中総IgE量の顕著な減少が認められた(図8)。
アレルギー性喘息モデルマウスを最終解剖した後、肺門リンパ節を採取して、アトピー性皮膚炎モデルと同様に、リンパ節中のアレルギー関連免疫細胞(ヘルパーT細胞、IgE陽性B細胞および活性化樹状細胞)の数をフローサイトメトリー法で解析した。その結果、全てのアレルギー関連免疫細胞に関し、L.animalis投与群およびL.johnsonii投与群の肺門リンパ節における各細胞数の有意な減少が認められた。特に、L.animalis投与群における減少が顕著であった(図9)。
受託番号NITE P-03138
受託番号NITE P-03139
受託番号NITE P-03140
(1)ラクトバチルス・アニマリスに属する乳酸菌、またはその菌体処理物を含む組成物。
(2)前記乳酸菌が、受託番号NITE BP-03137、受託番号NITE BP-03138、受託番号NITE BP-03139および/または受託番号NITE BP-03140で寄託されたラクトバチルス・アニマリス株である上記(1)に記載の組成物。
(3)抗アレルギー活性を有する上記(1)または(2)に記載の乳酸菌または組成物
(4)前記組成物が飲食品組成物である、上記(1)ないし(3)のいずれかに記載の組成物。
(5)前記組成物が医薬組成物である、上記(1)ないし(3)のいずれかに記載の組成物。
(6)前記組成物が飼料組成物である、上記(1)ないし(3)のいずれかに記載の組成物。
(7)前記組成物が衛生用組成物である、上記(1)ないし(3)のいずれかに記載の組成物。
1−1.糞便からの乳酸菌の分離および系統分類
健常犬(16頭)の糞便から分離した細菌240株のうち、アトピー犬の腸内細菌叢より健常犬の腸内細菌叢において優位であった184株を選択し、系統分類解析を行った。具体的には、犬から採取した糞便をMRS液体培地またはLBS液体培地を使用し、嫌気条件下で、37℃にて一晩静置培養を行った。培養後、MRSまたはLBS平板培地で細菌の分離を行った。純化は最低3回行った。細菌の系統分類は、16S rRNAシークエンスに基づき行った。その結果、Bacteroides属、Enterococcus属、Lactobacillus属およびStreptococcus属の4属13種を同定し、その中から、これまでにアレルギー発症との関連性が報告されていなかったLactobacillus属のLactobacillus animalis(L. animalis)を選択し、解析対象とした。なお、本実施例にけるポジティブコントロールとして、アレルギー発症との関連が示唆されているLactobacillus johnsonii(L. johnsonii)を使用した。本実施例で使用したL. animalisは、受託番号NITE BP-03137、受託番号NITE BP-03138、受託番号NITE BP-03139および受託番号NITE BP-03140で寄託された菌株を、菌数で1:1:1:1の比率で混合したものである。
受託番号NITE BP-03138
受託番号NITE BP-03139
受託番号NITE BP-03140
Claims (7)
- ラクトバチルス・アニマリスに属する乳酸菌、またはその菌体処理物を含む組成物。
- 前記乳酸菌が、受託番号NITE P-03137、受託番号NITE P-03138、受託番号NITE P-03139および/または受託番号NITE P-03140で寄託されたラクトバチルス・アニマリス株である請求項1に記載の組成物。
- 抗アレルギー活性を有する請求項1または2に記載の乳酸菌または組成物
- 前記組成物が飲食品組成物である、請求項1ないし3のいずれかに記載の組成物。
- 前記組成物が医薬組成物である、請求項1ないし3のいずれかに記載の組成物。
- 前記組成物が飼料組成物である、請求項1ないし3のいずれかに記載の組成物。
- 前記組成物が衛生用組成物である、請求項1ないし3のいずれかに記載の組成物。
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