DE60127731T2 - Probiotica zur Verwendung als Futter für Haustiere - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft neue Milchsäurebakterien, und insbesondere Mikroorganismen der Gattungen Lactobacillus, Bifidobacterium und Streptococcus (Enterococcus), welche aufgrund ihres probiotischen Potentials isoliert und ausgewählt wurden. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ihre Verwendung zur Zubereitung von Tierfutter-Kompositionen, welche dazu vorgesehen sind, die Gesundheit von Haustieren zu verbessern, und Kompositionen, welche diese(s) enthalten.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Das Wohlergehen von Haustieren ist eng mit deren Füttern verbunden. Korrektes Füttern sollte zu einem aktiven und gesunden Haustier führen. Über das Bereitstellen von Nährwert hinaus beeinflusst Nahrungs-Komposition das Gleichgewicht der intestinalen Mikroflora und kann zu gastrointestinalen Störungen führen oder diese verhindern. Daher ist es für das Verständnis einer praktischen/praktikablen Fütterungs-Praxis wesentlich, den Gastrointestinaltrakt und die Verdauungsprozesse gesunder Tiere zu kennen. Als Fleischfresser sind Katzen und Hunde durch einen kurzen Verdauungstrakt und eine schnelle Flussrate des Essens-Bolus gekennzeichnet.
  • Unter den Konstituenten der gastrointestinalen Mikroflora von Katzen und Hunden können Bacteroides sp., Clostridium sp., Enterobakteriaceae, Bifidobacterium sp., Lactobacillus sp., Streptococcus sp., Staphylococcus sp. und Hefen entdeckt werden.
  • Die Anzahl und Zusammensetzung dieser endogenen Flora neigt dazu, recht stabil zu sein, obwohl sie durch Alter, und zu einem geringeren Ausmaß durch Essen, modifiziert sein kann. Magensäure, Galle, intestinale Peristaltik und lokale Immunität sind Faktoren, welche als wesentlich zur Regulation von Bakterien-Flora im Dünndarm menschlicher Wesen und verschiedener andere Säugetiere angesehen werden.
  • Häufig sind gastrointestinale Störungen bei Hunden und Katzen mit übermäßigem bakteriellen Wachstum und der Produktion von durch pathogene Bakterien erzeugten Enterotoxinen verbunden.
  • Während der letzten wenigen Jahre konzentrierte sich (die) Forschung auf einige wertvolle Stämme von Milchsäurebakterien und deren potentielle Verwendung als probiotische Agentien. Probiotische (Stämme) werden als lebensfähige mikrobielle Zubereitungen angesehen, welche durch Bewahren der natürlichen Mikroflora im Darm die/eine Säugetier-Gesundheit fördern. Man geht davon aus, dass probiotische (Stämme) sich an die Darm-Schleimhaut anheften, den Darm-Trakt besiedeln, und dabei ein Anhaften gefährlicher Mikroorganismen daran verhindern. Eine Vorraussetzung für ihre Wirkung besteht darin, dass sie die Darm-Schleimhaut in einer angemessenen/ordnungsgemäßen und lebensfähigen Form erreichen müssen, und insbesondere nicht durch den Einfluss des im Magen vorherschenden niedrigen pH zerstört werden. Insbesondere weicht die Physiologie des Verdauungstraktes von Katzen und Hunden von der menschlichen ab. Beispielsweise beträgt der mittlere pH im Magen ungefähr 3,4 bei Hunden und 4,2 bei Katzen.
  • Die Veröffentlichung von Hartemink, R. und Rombouts, F. M. ("Comparison of Media for the detection of bifidobacteria, lactobacilli and total anaerobes from faecal samples" ("Vergleich von Medien zur Detektion von Bifidobakterien, Lactobazillen und aller Anaerobiker aus Fäkal-Proben"), Journal of Microbiological Methods, 1999, vol. 36, p. 181–192) betrifft die zur Detektion und Charakterisierung mikrobieller Stämme verwendeten Medien.
  • Der Artikel von Fujisawa, T. und Mitsuoka, T. ("Homofermentative Lactobacillus species predominantly isolatd from canine feces" ("Vornehmlich aus Hunde-Fäkalien isolierte homofermentative Lactobacillus Arten"), Journal of Veterinary Medical Science, 1996, Vol. 58, Nr. 6, p. 591–593) offenbart das Isolieren von Lactobacillus-Stämmen aus den Fäkalien von Hunden.
  • US 5922375 betrifft das Isolieren eines Bifidobacterium-Stamms aus den Fäkalien eines Kleinkindes und Anreichern von Nahrungen mit diesem Stamm. In diesem Dokument wird Tierfutter mit einem probiotischen Stamm angereichert, welcher von Menschen isoliert wurde.
  • WO 9608261 lehrt das Aufnehmen probiotischer Mikroorganismen und eines Trägers in Tiernahrungs-Produkte, so dass die Mikroorganismen den Dickdarm ("large bowel") erreichen und darin gedeihen. Die aus kommerziell verfügbaren Kultur-Sammlungen erhaltenen probiotischen Mikroorganismen oder Isolate menschlicher Fäkalien werden an Mäuse und Schweine verfüttert.
  • WO 99/17788 beschreibt ein Verfahren zum Verhindern oder Behandeln von Candidiasis durch Verabreichen eines probiotischen Stammes an ein Tier. Die darin verwendeten probiotischen Stämme stammen aus ein Vielzahl von Quellen, inklusive Jogurt, menschlicher oder tierischer Fäkalien und Honig-Bienen.
  • Obwohl schließlich US 5968569 die Aufnahme eines probiotischen Mikroorganismus in einer Haustier-Nahrungs-Zerealie offenbart, stellt weder sie, noch die restliche verfügbare Technik/Kunst Information bezüglich Stämmen bereit, welche speziell zur Haustier-Gesundheit vorgesehen sind.
  • Konsequenter Weise besteht ein Bedarf daran, neue Bakterien-Stämme bereitzustellen, welche insbesondere an Haustiere angepasst sind, und welche aufgrund ihrer hoch-probiotischen Eigenschaften ausgewählt wurden, welche für die Haustier-Gesundheit förderlich sind, und diese Stämme in eine Haustier-Nahrungs-Komposition aufzunehmen.
  • Kurzfassung der Erfindung
  • Es wird ein neuer probiotischer Mikroorganismus von Milchsäurebakterien bereitgestellt, welche aufgrund ihrer Fähigkeit ausgewählt wurden, den Gastrointestinaltrakt eines Haustiers zu überleben und zu besiedeln, und eine förderliche probiotische Wirkung auf (die) Haustier-Gesundheit auszuüben.
  • Der probiotische Stamm kann ausgewählt werden aus: Lactobazillen, Bifidobakterien oder Enterokokken.
  • Der probiotische Stamm kann aus der Gruppe ausgewählt werden, welche besteht aus: Lactobacillus reuteri, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus animalis, Lactobacillus ruminis, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus fermentum und Bifidobacterium spp., Enterococcus faecium und Enterococcus spp.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist der probiotische Stamm aus der Gruppe ausgewählt, welche besteht aus: Lactobacillus reuteri (NCC2581; CNCM I-2448), Lactobacillus reuteri (NCC2592; CNCM I-2450), Lactobacillus rhamnosus (NCC2583; CNCM I-2449), Lactobacillus reuteri (NCC2603; CNCM I-2451), Lactobacillus reuteri (NCC2613; CNCM I-2452), Lactobacillus acidophilus (NCC2628; CNCM I-2453), Enterococcus faecium SF68 (NCIMB 10415).
  • Der neue bakterielle Stamm kann in irgendeiner Menge von ungefähr 1,0E + 04 bis ungefähr 1,0E + 12 cfu/Tier und Tag und bevorzugt von 1,0E + 05 bis ungefähr 1,0E + 11 cfu/Tier und Tag, am stärksten bevorzugt von 1,0E + 07 bis 1,0E + 10 cfu/Tier und Tag verwendet werden.
  • Der bakterielle Stamm, welcher oben beschrieben wurde, kann zur Zubereitung einer Komposition/Zusammensetzung verwendet werden, welche zum Behandeln und/oder zur Prophylaxe von Störungen vorgesehen ist, welche mit der Besiedelung des Gastrointestinaltrakts von Haustieren durch pathogene Mikroorganismen in Verbindung stehen.
  • Gemäß eines Aspekts betrifft die Erfindung die Verwendung des oben beschriebene Bakterienstamms zur Zubereitung einer zur Regulation der Immun-Antwort von Haustieren vorgesehenen Komposition. Mit dem Begriff "Regulieren" der Immun-Antwort ist gemeint, dass die oben beschriebenen Bakterien-Stämme die Fähigkeit aufweisen, entweder bestimmte Immun-Funktionen zu stimulieren, welche für die Tier-Gesundheit wesentlich sind, oder andere Immun-Funktionen zu modulieren, welche möglicherweise bei Immun-Störungen, wie Entzündung, Allergie und so weiter, impliziert sein könnten. Das Stimulieren oder Modulieren dieser Immun-Funktionen kann unter Verwendung verschiedener Kombinationen der oben beschrieben Bakterien-Stämme erreicht werden.
  • Es kann ein Verfahren zum Aufrechterhalten oder Verbessern der Gesundheit des Gastrointestinaltrakts, der Haut und/oder des Fell-Systems oder des Immunsystems eines Haustiers ausgeführt werden, welches den Schritt des/eines Fütterns einer Haustier-Nahrungs-Komposition, welche zumindest einen isolierten Stamm, wie er oben beschrieben ist, enthält, an ein Haustier umfasst.
  • Es kann darüber hinaus ein Verfahren zum Behandeln und/oder zur Prophylaxe von Störungen ausgeführt werden, welche mit dem Besiedeln des Gastrointestinaltrakts von Haustieren durch pathogene Mikroorganismen assoziiert sind, welches den Schritt des/eines Fütterns einer Haustier-Nahrungs-Komposition, welche zumindest einen isolierten Stamm gemäß der vorliegenden Erfindung enthält, an ein Haustier umfasst.
  • Es kann ferner ein Verfahren zum Regulieren der Immun-Antwort in Haustieren ausgeführt werden, welches den Schritt zum Füttern einer Haustier-Nahrungs-Komposition welche zumindest einen isolierten Stamm gemäß der vorliegenden Erfindung enthält, an ein Haustier umfasst.
  • Es kann ferner ein Verfahren zum Verbessern oder Reduzieren der Alterungs-Wirkungen bei einem Haustier ausgeführt werden, welches den Schritt eines Fütterns einer Haustier-Nahrungs-Komposition, welche zumindest einen isolierten Stamm gemäß der vorliegenden Erfindung enthält, an ein Haustier umfasst.
  • Diese ausgewählten Mikroorganismen haben einen besonders förderlichen Einfluss auf Haustiere in deren Gastrointestinaltrakt, auf ihre Haut und/oder ihr Fell, auf ihr Immunsystem, und auf Alterungs-Wirkungen.
  • Sie haben einen besonders förderlichen Einfluss auf Darm-Pathogene, wie (die) Stämme Salmonella typhimurium, Escherichia coli, Shigella dysenteriaea oder andere pathogene Enterobacterieceae, welche Haustiere besiedeln, oder Parasiten wie Enthelminthe ("helminth", Toxocara spp.), Protozoen (Cryptosporidium spp., Giardia spp., Pentatrichomonas hominis, Entamoeba histolytica, Toxoplasma gondii, ...) oder Hefen.
  • Kombiniert mit Essen üben diese Mikroorganismen insbesondere ihre probiotisch förderlichen Wirkungen auf Genießbarkeit, Verdauung und Darm-Gesundheit, Immun-Funktion und sanitäre Bedingungen aus, letzteres indem sie zu einer Fäkal-Volumen-Reduktion und zumindest einem partiellen Desodorieren von Hunde-Fäkalien beitragen. Daher kann eine Tierfutter-Komposition einen Mikroorganismus umfassen, welcher hohe probiotische Aktivität in Haustieren aufweist, und dazu in der Lage ist, den Gastrointestinaltrakt eines Haustiers, welches ihn verzehrt, zu überleben und zu besiedeln.
  • Dementsprechend kann eine Tierfutter-Komposition verwendet werden, welche für die Gesundheit des Gastrointestinaltrakts von Haustieren vorgesehen ist, welche zumindest einen probiotischen Stamm, welcher wie oben beschrieben isoliert ist, mit einem essbaren Träger oder einer pharmazeutischen Matrix assoziiert enthält.
  • Ferner betrifft die Erfindung eine Tierfutter-Komposition, welche zur Regulation der Immun-Antwort von Haustieren vorgesehen ist, welche zumindest einen wie oben beschrieben isolierten Stamm enthält, welche(r) mit einem essbaren Träger oder einer pharmazeutischen Matrix assoziiert ist.
  • Ferner kann eine Tierfutter-Komposition verwendet werden, welche zum Verbessern oder Reduzieren der Alterungs-Wirkungen bei Haustieren vorgesehen ist, welche zumindest einen wie oben beschrieben isolierten Stamm enthält, welche(r) mit einem essbaren Träger oder einer pharmazeutischen Matrix assoziiert ist.
  • Schließlich kann eine für die Gesundheit der Haut und/oder des Fells von Haustieren vorgesehene Tierfutter-Komposition verwendet werden, welche zumindest einen wie oben beschrieben isolierten Stamm enthält, welche(r) mit einem essbaren Träger oder einer pharmazeutischen Matrix assoziiert ist.
  • In einer Ausführungsform umfasst der essbare Träger eine in Ernährungs-Hinsicht ausgewogene Haustier-Nahrungs-Komposition. Die genannte Komposition enthält bevorzugt ausreichende Mengen des isolierten Stammes, um zum Bereitstellen der genannten prophylaktischen Wirkung wirksam zu sein, wenn die Komposition als eine vollständige Mahlzeit an ein Haustier verfüttert wird.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • In der folgenden Beschreibung bezeichnet die Abkürzung cfu ("colony-forming-unit", "Kolonie-bildende Einheit") die Anzahl bakterieller Zellen, wie sie mittels mikrobiologischer Zählraten auf Agar-Platten wiedergegeben wird.
  • Darüber hinaus bezeichnet "NCC" Nestlé Culture Collection ("Nestlé-Kultur-Sammlung") (Nestlé Research Center, "Nestlé Forschungszentrum"), Vers-chez-les-Blanc, Lausanne, Schweiz).
  • Bezüglich des ersten Ziels der vorliegenden Erfindung wurden 20 Lactobazillen und 18 Bifidobakterien, welche aus Katzen- und Hunde-Fäkalien isoliert wurden, bezüglich ihrer technologischen und physiologischen Parameter durchmustert und ausgewählt.
  • Ein erstes Durchmustern auf potentielle probiotische Anwendungen hin wurde in-vitro ausgeführt (siehe Beispiele 1 und 2): Wachstums-Merkmale, Toleranz gegenüber Magensäure bei verschieden pHs und verschieden Konzentrationen von im Duodenum vorliegenden Gallen- Salzen, welche in Katzen und Hunden wahrscheinlich vorgefunden werden.
  • Ferner wurde das gute Überleben von gefriergetrockneten Zellen in zwei verschieden Kryoschutz-Medien bei 4°C und 20°C klar nachgewiesen, wie von einem beschleunigten Lagerungs-Test gezeigt wurde.
  • Diese Stämme können gekennzeichnet sein durch: kurze Generations-Zeiten, hohe Zählraten (mehr als 1,0E + 08 cfu/ml) während ihrer stationären Phase, und Stabilität in hohen Anzahlen 8 und 24 h nach Beimpfen, Stabilität gegenüber Gefrier-Trocknen, gefolgt von jedweden ("either") Lagerungs-Bedingungen, Widerstandsfähigkeit gegenüber im Duodenum vorgefundenen physiologischen Galle-Konzentrationen (2% Galle) und ihre geringe Hemmung bei Wachsen-lassen in Anwesenheit von bis zu 4% Galle. Ferner wurden Ergebnisse von DNA-Analysen zur Auswahl von für die untersuchte Vielfalt representativen Bakterien berücksichtigt.
  • Die Stämme, welche für die Katzen- und Hunde-Gesundheit vorgesehen sind, können in Anwesenheit von bis zu 2,0% Gallen-Salze bis zu zumindest 1,0E + 06 cfu/ml wachsen. Die Stämme können auch nach ungefähr 2 Stunden bei einem pH-Bereich von ungefähr 3,4 bis ungefähr 4,2 bis zu zumindest 1,0E + 06 cfu/ml wachsen.
  • Die Bakterien-Stämme gemäß der Erfindung können aus der Gruppe ausgewählt sein, welche besteht aus: Lactobacillus reuteri, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus animalis, Lactobacillus ruminis, Lactobacillus johnsonii Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus fermentum, Bifidobacterium sp., Enterococcus faecium, Enterococcus sp.
  • Die folgenden Stämme: Lactobacillus reuteri NCC2581, Lactobacillus rhamnosus NCC2583, Lactobacillus reuteri NCC2592, Lactobacillus reuteri NCC2603, Lactobacillus reuteri NCC2613 und Lactobacillus acidophilus NCC2628 wurden als (ein) Beispiel(e) unter dem Budapester Vertrag bei der Nationalen Sammlung von Mikroorganismen-Kulturen ("Collection Nationale de Culture de Microorganismes") Doktor-Roux-Straße 25, 75724 Paris, Frankreich, am April 19, 2000, unter den folgenden Referenzen CNCM I-2448, CNCM I-2449, CNCM I-2450, CNCM I-2451, CNCM I-2452 beziehungsweise CNCM I-2453 hinterlegt. Alle Restriktionen bezüglich der Verfügbarkeit dieser Hinterlegungen werden bei erstmaliger Veröffentlichung dieser Anmeldung oder einer anderen Anmeldung zurückgenommen werden/sein, welche die Priorität dieser Anmeldung in Anspruch nimmt.
  • BIOCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG DER AUSGEWÄHLTEN STÄMME
  • Lactobacillus reuteri CNCM I-2448
    • – Gram-positive Mikroorganismen, unbeweglich, nicht-sporend
    • – Ziemlich kurze und dicke Stäbchen
    • – Microaerophilische Mikroorganismen mit heterofermentativem Metabolismus, Produktion von L (+) und D (–) Milchsäure.
    • – Katalase (–), Produktion von CO2 aus Glukose, Hydrolyse von Arginin=NH3 Produktion
    • – Wachstum mit 5% und 10% NaCl
    • – Fermentation von Zuckern: L-Arabinose, Galaktose, D-Glukose, Laktose, Saccharose, D-Raffinose
  • Lactobacillus rhamnosus CNCM I-2449
    • – Gram-positive Mikroorganismen, unbeweglich, nicht-sporend
    • – Ziemlich kurze und dicke Stäbchen
    • – Microaerophilische Mikroorganismen mit heterofermentativem Metabolismus, Produktion von L (+) Milchsäure.
    • – Katalase (–),
    • – Fermentation aller Zucker, welche für Lb. rhamnosus typisch sind
  • Laciobacillus reuteri CNCM I-2450
    • – Gram-positive Mikroorganismen, unbeweglich, nicht-sporend
    • – Ziemlich kurze und dicke Stäbchen
    • – Microaerophilische Mikroorganismen mit heterofermentativem Metabolismus, Produktion von L (+) und D (–) Milchsäure.
    • – Katalase (–), Produktion von CO2 aus Glukose, Hydrolyse von Arginin=NH3 Produktion
    • – Wachstum mit 5% und 10% NaCl
    • – Fermentation von Zuckern: L-Arabinose, Galaktose, D-Glukose, D-Xylose, Laktose, Saccharose, D-Raffinose
  • Lactobacillus reuteri CNCM I-2451
    • – Gram-positive Mikroorganismen, unbeweglich, nicht-sporend
    • – Ziemlich kurze und dicke Stäbchen
    • – Microaerophilische Mikroorganismen mit heterofermentativem Metabolismus, Produktion von L (+) und D (–) Milchsäure.
    • – Katalase (–), Produktion von CO2 aus Glukose, Hydrolyse von Arginin =NH3 Produktion
    • – Wachstum mit 5% und 10% NaCl
    • – Fermentation aller Zucker, welche für Lb. reuteri typisch sind
  • Lactobacillus reuteri CNCM I-2452
    • – Gram-positive Microorrganismen, unbeweglich, nicht-sporend
    • – Ziemlich kurze und dicke Stäbchen
    • – Microaerophilische Mikroorganismen mit heterofermentativem Metabolismus, Produktion von L (+) und D (–) Milchsäure.
    • – Katalase (–), Produktion aus CO2 aus Glukose, Hydrolyse von Arginin =NH3 Produktion
    • – Wachstum mit 5% und 10% NaCl
    • – Fermentation von Zuckern: L-Arabinose, D-Glukose, Laktose, Saccharose, D-Raffinose
  • Lactobacillus acidophilus CNCM I-2453
    • – Gram-positive Mikroorganismen, unbeweglich, nicht-sporend
    • – Ziemlich kurze und dicke Stäbchen
    • – Microaerophilische Mikroorganismen mit homofermentativem Metabolismus, Produktion von L (+) und D (–) Milchsäure.
    • – Katalase (–),
    • – Fermentation von Zuckern: D-Glukose, Laktose, Saccharose, D-Raffinose
  • Drei aus Katzen isolierte Lactobazillen (NCC2581, NCC2592, NCC2583), drei Lactobazillen aus Hunden (NCC2603, NCC2613, NCC2628), ein Bifidobakterium aus Katzen (NCC2627) und ein Bifidobakterium aus Hunden (NCC2657) wurden ferner auf ihre potentiell probiotische Aktivität in Haustieren hin getestet (siehe Beispiele 3 und 4).
  • In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Bakterien-Stämmen, wie sie oben beschrieben sind, für die Zubereitung einer Nahrungs-Komposition, welche zum Verbessern oder Aufrechterhalten der/einer Haustier-Gesundheit geeignet ist.
  • Sie können in ihrer lebensfähigen Form, inaktivierten Form, als ein Überstand einer Kultur oder Fraktionen davon, beispielsweise Zellwänden, Peptidoglykan, Zytoplasma, gereinigte Proteine, funktionelle Metaboliten, bioaktive Moleküle verwendet werden.
  • Sie werden bevorzugt in einer Menge von von ungefähr 1,0E + 04 cfu/g bis ungefähr 1,0E + 11 cfu/g, und bevorzugt von 1,0E + 05 cfu/g bis ungefähr 1,0E + 10 cfu/g, am stärksten bevorzugt von 1,0E + 06 cfu/g bis 1,0E + 09 cfu/g verwendet.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform können sie als Diät-Zusätze zum Verbessern der/einer Haustier-Nahrungs-Qualität verwendet werden, und können in einer Menge von von ungefähr 1,0E + 04 cfu/g bis ungefähr 1,0E + 11 cfu/g enthalten sein. Als Diät-Zusätze können sie eingekapselt sein oder können sie in Pulverform und in Verbindung mit einer Hauptmahlzeit, sei sie feucht oder trocken, oder davon getrennt verpackt bereitgestellt werden. Beispielsweise kann ein Pulver, welches ausgewählte Mikroorganismen gemäß der Erfindung enthält, in Beuteln in einer Pulverform oder in einem Gel oder einem Lipid oder einem anderen geeigneten Träger verpackt werden. Diese separat verpackten Einheiten können zusammen mit einer Hauptmahlzeit oder in Mehrfach-Einheiten-Packungen zur Verwendung mit einer Hauptmahlzeit oder Behandlung gemäß Anwender-Anforderungen bereitgestellt werden. In einem anderen Beispiel kann/können der/die probiotische(n) Stamm/Stämme in einer Mehrfachkammer-Verpackungseinheit zusammen mit einer zweiten, essbaren Komponente, beispielsweise einem stückigen Schrot ("meal"), welches nass oder von mittlerem Feuchtigkeitsgehalt ist, oder einer Portion getrockneter Schrote ("kibbles") von Mahlzeit-Größe in einer Flexibler-Beutel-Konfiguration bereitgestellt werden. Eine erste Kammer in dem Beutel würde den probiotischen Stamm enthalten, und ein zweite, separat verschlossene Kammer die zweite essbare Komponente.
  • Diese ausgewählten Mikroorganismen weisen in Haustieren einen besonders förderlich Einfluss auf deren Gastrointestinaltrakt, auf deren Haut und/oder Fell, auf deren Immunsystem, auf Zahn-Gesundheit oder Mund-Gesundheit, auf ihre Knochen und auf die Alterungs-Auswirkungen auf.
  • Es wurde auch herausgefunden, dass sie in Haustieren Nahrungs-Genießbarkeit, Verdauung, Immunfunktion und sanitäre Bedingungen (Reduktion von Fäkal-Volumen und partielles Desodorieren von Hunde-Fäkalien) verbessern.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Haustier-Nahrungs-Komposition zum Verbessern oder Aufrechterhalten der Gesundheit von Haustieren, welche zumindest einen probiotischen Stamm, welcher die oben genannten Eigenschaften aufweist, assoziiert mit einem essbaren Träger oder einer pharmazeutischen Matrix enthält.
  • Zumindest ein bakterieller Stamm, welcher die oben genannten Eigenschaften aufweist, kann dem Haustier als eine Ergänzung zu seiner normalen Diät oder als eine Komponente einer in Ernährungs-Hinsicht vollständigen Haustier-Nahrung verabreicht werden.
  • Die in Ernährungs-Hinsicht vollständige Haustier-Nahrungs-Komposition gemäß der Erfindung kann in pulverförmiger, getrockneter Form oder als ein feuchtes, gekühltes oder Regal-stabiles Haustier-Nahrungs-Produkt vorliegen. Diese Haustier-Nahrungen können auf in der Technik/Kunst bekannten Wegen erzeugt werden, vorausgesetzt, dass dann, wenn Mikroorganismus-Aktivität gewünscht ist, dafür gesorgt wird, dass das/ein Überleben des Mikroorganismus sichergestellt ist. Abgesehen von den Bakterien-Stämmen und/oder ihrem fermentierten Medium, können diese Haustier-Nahrungen beinhalten: irgendeine oder mehrere einer Stärkequelle, einer Proteinquelle und einer Lipid-Quelle.
  • Geeignete Stärkequellen sind beispielsweise Körner/Getreide und Gemüse wie Korn/Mais, Reis, Weizen, Gerste, Hafer, Soja und Mischungen von diesen.
  • Geeignete Proteinquellen können aus irgendeiner geeigneten tierischen oder pflanzlichen Proteinquelle ausgewählt werden, beispielsweise Fleisch und Schrot ("meal"), Geflügelmehl, Fischmehl, Soja-Protein-Konzentraten, Milch-Proteinen, Gluten und dergleichen. Für ältere Tiere ist es bevorzugt, dass die Proteinquelle ein Protein hoher Qualität enthält.
  • Geeignete Lipidquellen enthalten Fleischsorten, tierische Fette und pflanzlich Fette.
  • Die Wahl der Stärke-, Protein- und Lipidquelle(n) wird im Wesentlichen durch die Nährstoff-Bedürfnisse des Tiers, Genießbarkeits-Betrachtungen, und die Art des eingesetzten Produkts bestimmt. Bei älteren Haustieren enthält die Haustier-Nahrung bevorzugt proportional weniger Fett als Haustier-Nahrungen für jüngere Haustiere. Ferner können die Stärkequellen eines oder oder mehrere von Reis, Gerste, Weizen und Korn/Mais beinhalten.
  • Ferner können auch verschiedene andere Ingredientien, beispielsweise Zucker, Salz, Gewürze ("spices"), Würzmittel ("seasonings"), Vitamine, Mineralien, Geruchsstoffe/Geschmackstoffe, Fette und dergleichen ebenfalls in die Haustier-Nahrung aufgenommen werden, falls gewünscht.
  • Für Haustier-Trockennahrungen ist Extrudier-Kochen ein geeignetes Verfahren, obwohl Backen und andere geeignete Verfahren verwendet werden können. Wenn sie extrudier-gekocht wird, wird die Haustier-Trockennahrung normalerweise in Form eines Schrots ("kibbles") bereitgestellt. Wenn ein präbiotisches Kohlenhydrat verwendet wird, kann das präbiotische (Kohlenhydrat) mit den anderen Ingredientien der Haustier-Trockennahrung vor Verarbeitung gemischt werden. Ein geeigneter Prozess ist in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 0850569 beschrieben. Wenn ein probiotischer Mikroorganismus verwendet wird, und Aktivität im Endprodukt gewünscht wird/ist, wird der Organismus am besten auf die Haustier-Trockennahrung beschichtet oder in diese gefüllt. Ein geeigneter Prozess ist in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 0862863 beschrieben. Wenn Überleben des Mikroorganismus nicht erforderlich ist, kann er der Vor-Extrudieren-Mischung zugeführt werden, wenn gewünscht.
  • Für nasse Essen können die in US-Patenten 4,781,939 und 5,132,137 beschriebenen Prozesse dazu verwendet werden, Fleischersatzprodukte zu erzeugen. Andere Verfahren zum Herstellen von stückartigen Produkten können ebenfalls verwendet werden, beispielsweise Kochen in einem Dampfofen. Alternativ hierzu können Laib-artige Produkte durch Emulgieren eines geeigneten Fleischmaterials erzeugt werden, um eine Fleisch-Emulsion zu erzeugen, indem ein geeignetes Geliermittel zugefügt wird, und die Fleisch-Emulsion vor Füllen in Dosen oder andere Behälter erhitzt wird. Wie im Falle der/einer Herstellung von Haustier-Trockennahrungen, wenn Überleben der ausgewählten probiotischen Spezies nicht essenziell ist, können sie der Zuführ-Mischung vor dem/einem Kochen oder Erhitzen zugefügt werden, oder in irgendeinem angemessenen oder bequemen Stadium im Produktionsprozess.
  • Die Menge an präbiotischer Substanz in der Haustier-Nahrung beträgt bevorzugt weniger als ungefähr 20 Gewichts-% und stärker bevorzugt weniger als ungefähr 10 Gewichts-%. Beispielsweise kann die präbiotische Substanz von ungefähr 0,1 Gewichts-% bis ungefähr 5 Gewichts-% der Haustier-Nahrung umfassen. Bei Haustier-Nahrungen, welche Chicorée als die präbiotische Substanz verwenden, kann das Chicorée so beinhaltet sein, dass es ungefähr 0,5% bis ungefähr 10 Gewichts-% der Zuführ-Mischung, stärker bevorzugt von ungefähr 1 (Gewichts-)% bis ungefähr 5 Gewichts-% umfasst.
  • Die Haustier-Nahrungen können andere aktive Agentien, wie langkettige Fettsäuren enthalten. Geeignete langkettige Fettsäuren beinhalten Alpha-Linoleinsäure, Gamma-Linoleinsäure, Linoleinsäure, eicosapentanoische Säure, und docosahexanoische Säure. Fisch-Öle sind eine geeignete Quelle von eicosapentanoischen Säuren und docosahexanoischer Säure. Borretsch-Öl, Schwarze-Johannisbeer-Samen-Öl und Nachtkerzen-Öl sind geeignete Quellen von Gamma-Linoleinsäure. Färberdistel-Öle, Sonnenblumen-Öle, Korn/Mais-Öle und Sojabohnen-Öle sind geeignete Quellen von Linoleinsäure.
  • Wenn notwendig, werden die Haustier-Nahrungen mit Mineralien und Vitaminen angereichert, so dass sie in Ernährungs-Hinsicht vollständig sind.
  • Wenn gewünscht, kann der Bakterien-Stamm ferner eingekapselt werden, beispielsweise in eine Zucker-Matrix, Fett-Matrix oder Polysaccharid-Matrix. Er kann auch beschichtet werden, wie in EP 862 863 beschrieben.
  • Der neue probiotische Stamm wird bevorzugterweise so verwendet, dass die Haustier-Nahrung bevorzugt ungefähr 1,0E + 04 bis ungefähr 1,0E + 10 Zellen des probiotischen Mikroorganismus pro Gramm der Haustier-Nahrung, stärker bevorzugt ungefähr 1,0E + 06 bis ungefähr 1,0E + 08 Zellen probiotischer Mikroorganismen pro Gramm enthält. Die Haustier-Nahrung kann ungefähr 0,005% bis ungefähr 10 Gewichts-% der Mischung der probiotischen Mikroorganismen enthalten. Sie enthält bevorzugt ungefähr 0,02% bis ungefähr 6 Gewichts-% und am stärksten bevorzugt ungefähr 1% bis ungefähr 6 Gewichts-%.
  • Die Menge an Haustier-Nahrung, welche vom Haustier zu verzehren ist, um eine förderliche Wirkung zu erreichen, wird von der Größe oder dem Haustier, der Art von Haustier und dem Alter des Haustiers abhängen. Allerdings würde eine geeignete Menge an Haustier-Nahrung, um eine tägliche Menge von ungefähr 1,0E + 03–1,0E + 14 cfu von zumindest einem Milchsäurebakterien-Stamm und/oder dem äquivalenten Fermentations-Medium bereitzustellen, üblicherweise ausreichend/angemessen sein. Es werden ungefähr 1,0E + 09 bis 1,0E + 11 cfu/Tag für Hunde oder 1,0E + 07 bis 1,0E + 10 cfu/Tag für Katzen verabreicht.
  • Die gemäß eines Verfahrens gemäß der Erfindung zubereitete Komposition weist eine hohe probiotische Aktivität auf und/oder wurde als besonders wirksam zur Verbesserung und/oder Aufrechterhaltung gesunder Verdauungs-Funktion bei Haustieren, sowie Verbessern und Aufrechterhalten des Gastrointestinaltrakts, der Haut und/oder des Fells, und/oder des Immunsystem, der Gesundheit von Haustieren befunden. Diese Komposition hat auch einen förderlichen Einfluss auf Alterungs-Wirkungen bei Katzen und Hunden.
  • Die vorliegende Erfindung soll nicht durch die spezifischen hierin beschriebene Ausführungsformen im Gültigkeitsbereich begrenzt sein/werden. Den Beispielen geht eine kurze Beschreibung der Figuren voraus.
  • Figuren
  • 1: Lymphozyt-Proliferation periphärer mononuklearer Blutzellen ("peripheral blood mononuclear cells", PMBC) von Hunden aufgrund von Stimulieren mit Mitogenen oder Phorbol-Estern. PMBC von erwachsenen Hunden, welche während 4 Wochen mit (Schwarze Balken) oder ohne (Weiße Balken) L. acidophilus NCC2628 gefüttert wurden, wurden mit verschiedenen Mitogenen mit in der Grafik angegebenen Dosen (μg/ml) stimuliert. Mitogene sind PHA (Phytohemaglutin), ConA (Concanavalin A), PWM ("Pokeweed mitogen", Kermesbeere-Mitogen), und Phorbol-Ester sind PMA/iono (Phorbol-Myristat-Azetat und Ionomycin). * = P < 0,05, Student-t-Test
  • 2: Zytokine, welche von Hunde-Leukozyten erzeugt wurden, welche mit verschieden probiotischen Stämmen stimuliert wurden. Leukozyten von normalen erwachsenen Hunden wurden mit verschieden Haustier-isolierten Lactobacillus-Stämmen für 18 h stimuliert. Kontroll-Kulturen enthielten Medium alleine (Negativ-Kontrolle) oder ein menschliches Lactobacillus-Isolat ST11 (Positiv-Kontrolle). Identifikation von Zytokinen wurde mittels RT-PCR ausgeführt. Ihr Quantifizieren wurde mittels Durchmusterns der Ethidium-Bromid-gefärbten Agarose-Gele und Bestimmen der relativen Pixel(zahl) jedes Streifens unter Verwendung der NIH-Image-Software ausgeführt. Die Ergebnisse sind als der Mittelwert zweier unabhängiger Experimente in willkürlichen Einheiten ausgedrückt. (A) IL-12, (B) IL-10, (C) IFNγ, (D) TGFβ.
  • Beispiele
  • Beispiel 1: Stämme und Kultur-Bedingungen
  • Verschiedene Stämme (aus der Nestlé-Kultur(en)-Sammlung, "Nestlé Culture Collection" = NCC) wurden auf ihre mögliche probiotische Verwendung bei Katzen und Hunden hin durchmustert. Insbesondere wurden Wachstums-Möglichkeiten, Widerstandsfähigkeit gegenüber Gefrier-Trocknen mit anschließender Lagerung, Toleranz gegenüber Magensäure und verschieden Konzentrationen von Gallen-Salzen, welche im Gastrointestinaltrakt von Katzen und Hunden vorgefunden wurden, bei diesen in Tabelle 1 vorgestellten 20 Laktobazillen und 18 Bifidobakterien getestet, welche aus Katzen- und Hunde-Fäkalien isoliert wurden.
  • Tabelle 1: Codes und Merkmale von für die Versuche ausgewählten Bakterien Lactobazillen:
    Figure 00210001
  • Bifidobacterien:
    Figure 00220001
  • Alle 20 Lactobazillen und 18 Bifidobakterien wurden aus Katzen und Hunde isoliert, welche auf verschieden Diäten gehalten wurden, wie in Tabelle 1 gezeigt ist. Die/eine anfängliche Identizierung wurde durch morphologische und physiologische Merkmale bestimmt. API-50CH und Schnelle("Rapid")-ID32A Systeme (BioMérieux) wurden für Lactobazillen beziehungsweise Bifidobakterien verwendet. Reine Stämme wurden gefroren, und bei –80°C in der Nestec-Kultur-Sammlung (NCC) deponiert.
  • Für die Versuche wurden alle Bakterien in Nährmedium kultiviert. Eine Probe von jedem reaktivierten Stamm wurde bei –80°C in 1 ml-Kryoschutz-Medien (40% Glycerin + 60% LL) gelagert. Die Kulturen wurden durch Subkultivieren auf einer wöchentlichen Basis einer 1% Impf-Probe in 10 ml-Wachstums-Medium und anaerober Inkubation bei 37°C gehalten.
  • Laktobazillen wurden in MRS für 18 Stunden herangezogen. Bifidobakterien wurden entweder in MRS + 0,05% (Gewicht/Volumen, "w/v") L-Cystein-Hydrochlorid (MRS-C) für 32 Stunden oder in BHI + 0,05 L-Cystein- Hydrochlorid (BHI-C) für 48 Stunden, beginnend mit einer 5% Impfung, herangezogen.
  • Alle Kulturen wurden zwischen den verschieden Transfers bei +4°C gelagert. Anaerobiose wurde im Allgemeinen durch Verwenden eines anaeroben Wasserstoff-Kohlendioxid-Systems (GasPak, Becton Dickinson, USA) erhalten. Bifidobakterien wurden während ihres Lagerungs-Zeitraums immer in diesen Gläsern gehalten.
  • Beispiel 2: Selektion von Bakterien-Stämmen
  • Diese In-Vitro-Durchmusterung basierte auf Produktions-Merkmalen für eine industrielle Anwendung lebensfähige Zellen, deren Fähigkeit hemmende oder schädliche Magen-Darm-Bedingungen zu überleben, und deren Genom-Vielfalt. Stamm-Vielfalt oder Genom-Ähnlichkeit der nicht-charakterisierten Stämme wurde unter Verwendung von RAPD und Ribotypieren ("ribotyping") berücksichtigt.
  • Materialien und Methoden
  • • Bakterielles Wachstum
  • Die Stämme, welche in der Lage sind, schnell eine hohe Anzahl von Zellen zu erzeugen, müssen identifiziert werden. Ihr bakterieller Wachstums-Zyklus kann durch eine kurze Verzögerungs("lag")-Phase, eine kurze Generations-Zeit, hohe maximale Zählraten und eine lange stationäre Phase gekennzeichnet sein. Daher wurden Stämme durch Berücksichtigen dreier Variablen verglichen: der Länge ihrer Verzögerungs-Phase, ihre Generations-Zeit (in Stunden) und ihre maximalen Zählraten, welche den wesentlichsten Merkmalen entsprachen.
  • Für Lactobazillen:
  • 200 ml bei 37°C vor-beimpftes MRS-Nährmedium wurde mit 1% einer frischen Sub-Kultur beimpft. Für acht Stunden wurde jede Stunde nach Beimpfen Proben von einem ml gesammelt. Eine abschließende Probe wurde nach 24 h genommen. Ein ml jeder Probe wurde zur Zählung in Serie 10-fach in TS verdünnt. Kulturen wurden in MRS-Agar (Gieß-Plattierungs-Technik), anaerob bei 37°C für 48 Stunden herangezogen. Alle Platten mit Kolonie-Anzahlen zwischen 30 und 350 wurden als Kolonie-bildende Einheiten ("colony forming units", cfu) pro ml Kultur registriert, und wurden daher für Zählungen berücksichtigt.
  • Für Bifidobakterien in (MRS-C):
  • In Vorversuchen wurden alle Stämme nach 24 h Wachstum in MRS-C und TPYG-Nährmedium gezählt. Resulte wurden in cfu/ml ausgedrückt. Die Wachstums-Kurven wurden gemäß dem für Lactobazillen beschriebenen Protokoll durch Bestimmen der Zell-Anzahlen nach 0, 4, 12, 24, 32 und 48 h Wachstum in MRS-C etabliert. Um den Einfluss des Sub-Kultur-Mediums und des/eines Optimierens des/eines Entgasens des Wachstums-Mediums zu bestimmen, wurde der folgende Ansatz/Versuch realisiert:
    • • von einer Sub-Kultur, 48 h bei 4°C in BHI-C gelagert, und in MRS-C beimpft
    • • von einer Sub-Kultur, 48 h bei 4°C in BHI-C gelagert, und in gut ausgegastem MRS-C beimpft (Entfernen von Sauerstoff war durch zweifaches Autoklavieren des Mediums und unmittelbares Lagern in anaeroben Gläsern optimiert worden)
    • • von einer frischen Sub-Kultur in MRS, und in gut ausgegastem MRS-C beimpft und vor dem Experiment unter anaeroben Bedingungen gelagert
  • Tabelle 2: Test-Medien für bakterielles Wachstum
    Figure 00250001
  • Durch das Zufügen von Difco Bacto Agar (15 g·l–1) wurden feste Medien erhalten. (Die) Medien wurden bei 121°C für 15 min autoklaviert. Flüssige Medien für Bifidobakterien wurden entweder unter anaeroben Bedingungen gelagert, oder vor Verwendung entgast.
  • Widerstandsfähigkeit gegenüber Magen-pH und Galle
  • Bei Verzehr müssen die Mikroorganismen Magen- und Duodenum-Bedingungen überleben, um in der Lage zu sein, eine förderliche Aktivität im Gastrointestinaltrakt des Tiers auszuüben. Magen-pH und Gallen-Salze sind die Haupt-Komponenten, welche für die/eine Bakterien-Flora-Regulation verantwortlich sind. Daher muss das Ausmaß an Widerstandsfähigkeit der Stämme gegenüber Acidität und Galle getestet werden.
  • Die Physiologie des Verdauungstraktes von Katzen und Hunden unterscheidet sich von Menschen. Der mittlere pH betrug pH 3,4 beziehungsweise 4,2 bei Hunden beziehungsweise Katzen. Eine rekonstruierte Haustier-Galle wurde für die Versuche (Tabelle 4) empfohlen. Die Gallen-Konzentration im Dünndarm variiert in einem Bereich von 0,5 bis 2%, wenn Nahrung verdaut wird.
  • Gemäß bei Katzen und Hunden vorgefundenen extremen pH Werten sollten Zählraten lebensfähiger (Organismen) nach 10 Minuten bei pH 2,6 und nach zwei Stunden bei entweder pH 3,4 (aus Hunden isolierte Stämme) oder pH 4,2 (aus Katzen isolierte Stämme) nicht unter 1,0E + 06 cfu/ml betragen.
  • • Widerstandsfähigkeit gegenüber Magen-pH
  • Alle Lactobazillen wurden mit 1% in MRS-Nährmedium beimpft und anaerob bei 37°C über Nacht herangezogen. Bifidobakterien, beimpft bei 5% in BHI-C, wurden 48 Stunden bei 37°C unter anaeroben Bedingungen herangezogen. Die Kulturen wurden in Reagenzgläser von zwei ml (Eppendorf) dispergiert und bei 3,500 × g/10 min/20°C zentrifugiert. Zellen wurden dreimal mit Ringer-Lösung gewaschen. Die Widerstandsfähigkeit gegenüber magensauren Bedingungen wurde in drei mit HCl (Merck) eingestellten simulierten Magensäften mit pH-Niveaus von 2,6, 3,4 und 4,2 in-vitro getestet. Für alle Filtrier-Sterilisationen wurde wegwerfbares Filtermaterial (Nalgene) verwendet. Das Überleben jeder bakteriellen Suspension wurde durch Zufügen eines ml in eine Serie von fünf ml simulierter Magensäfte (verschieden pHs) welche mit 1,5 ml einer 0,5% NaCl-Lösung angereichert wurden, untersucht.
  • Die Proben wurden bei 37°C inkubiert, und die lebensfähigen Organismen wurden gezählt bei:
    • • 0, 1, 5, 10 Minuten mit dem Magensaft von pH 2,6
    • • 0, 1, 30, 60, 120, 180 Minuten, wenn der Magensaft einen pH von entweder 3,4 (für aus Hunden isolierte Stämme) oder 4,2 (für aus Katzen isolierte Stämme) aufwies.
  • Proben wurden in Phosphat-Puffer verdünnt (pH 7,0), auf MRS-C-Agar plattiert und gezählt.
  • Tabelle 3: Simulierter Magensaft
    Figure 00270001
  • • Widerstandsfähigkeit gegenüber Gallen-Salzen
  • Die Entwicklung der Zählraten lebensfähiger Organismen von Lactobazillen, welche für 18 Stunden in Anwesenheit verschiedener Konzentrationen von rekonstruierter Haustier-Galle gewachsen sind, wurde bestimmt.
  • Zwei Zählraten lebensfähiger Organismen wurden als signifikant verschieden angesehen, wenn die Abweichung ihrer log10 über 0,25 lag. Jeder Stamm wurde durch zwei Variablen gekennzeichnet:
    • • die maximale Gallensalz-Konzentration, welche getestet wurde, wenn keine signifikante Differenz gegenüber der Kontrolle gefunden wurde,
    • • Die Rate der Abnahme an Lebensfähigkeit, wenn sich die/eine Gallen-Konzentration in dem Wachstums-Medium erhöht.
  • Die Stämme, welche durch einen Verlust von mehr als einem log10 ihrer Zählraten lebensfähiger Organismen bei Erhöhung der Gallen-Konzentration in 1%-Schritten gekennzeichnet waren, wurden als empfindlich gegenüber Galle angesehen. Eine größere Reduktion als ein log10 zwischen in Anwesenheit of 0 und 2% Galle gewachsenen Zellen, und bis zu einem log10 pro zusätzliches Prozent Galle (über 2%) wurde als akzeptabel angesehen. Ferner sollten nur Stämme ausgewählt werden, welche mehr als 1,0E + 06 cfu/ml erzeugten, wenn sie in Anwesenheit von bis zu 2% Gallen-Salzen herangezogen wurden, um eine Wirkung im Gastrointestinaltrakt zu erzeugen.
  • Rekonstruierte Haustier-Galle von Katzen oder Hunden wurde wie in Tabelle 4 angegeben zubereitet, und vor Verwenden Filter-sterilisiert. In einem ersten Versuch wurden Lactobazillen anaerob für 24 Stunden in MRS-Nährmedium bei 37°C herangezogen und für zusätzliche 18 Stunden in frische MRS-Nährmedium plus 0, 0,1, 0,3, 0,5, 1, 2, 4% sterile rekonstruierte Haustier-Galle überführt. Proben wurden zum Zählen 10-fach in Serie in TS verdünnt. Verdünnungen 1,0E – 03 und 1,0E – 05 wurden auf MRS-Agar plattiert, unter Verwendung eines WASP (<<Whitley Automatic Spiral Plater>> ("Whitley's automatische Spiral-Plattiervorrichtung"); Don Whitley Scientific Limited, England). Nach Trocknen wurden die Platten invertiert und 48 Stunden bei 37°C in anaeroben Gläsern inkubiert.
  • Floch et al. (1972) definierten eine Hemmung als signifikant, wenn zumindest 2 Logarithmus-Stufen im Test im Vergleich zum Kontroll-Rohr-Wachstum reduziert waren. Basierend hierauf wurden alle gegenüber Galle-Konzentrationen sensitiven Lactobazillen im ersten Versuch und zwei gegenüber 4% Galle resistente Lactobazillen in ähnlicher Weise in Anwesenheit von 0, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4% Galle getestet. Der zweite Test zielte auf eine Wiederholbarkeit ab und stellte fest, ob die Anzahl lebensfähiger Bakterien mit zunehmender Gallen-Konzentration dramatisch abnahm.
  • Andererseits zeigte er auf, dass diese Stämme während dieses 18 h-Zeitraums Gallen-resistent sind. Wachstums-Kurven wurden in Anwesenheit von Gallen-Salzen etabliert, um festzustellen, ob die Verzögerungs-Phase und die Wachstumsrate beeinträchtigt wurden oder nicht. Es wurden Versuche mit Lactobazillen durchgeführt, welche gemäß dem für vorhergehende Wachstums-Messung(en) beschriebenen Protokoll in mit 1% rekonstruierter Haustier-Galle angereichertem MRS-Nährmedium herangezogen wurden.
  • Die Bifidobakterien wurden unter Verwendung von MRS-C Nährmedium mit 0, 1, 2, 3 und 4% rekonstruierter Haustier-Galle für 32 Stunden/37°C/anaerob subkultiviert und herangezogen. Das gleiche Zähl-Verfahren wie für Lactobazillen wurde mit Verdünnungen 1,0E – 03, 1,0E – 04 und 1,0E – 05 verwendet.
  • Tabelle 4: Rekonstruierte Haustier-Galle
    Figure 00290001
  • • Überleben von Gefrier-Trocknung und anschließender Lagerung der Lactobacillus-Stämme
  • Es wurde die Entwicklung des Überlebens ausgewertet. Zählraten lebensfähiger Organismen unterhalb von 10E + 05 CFU/ml wurden als zu klein seiend betrachtet.
  • Für jeden Stamm wurde 200 ml MRS-Nährmedium zu 3% mit einer frischen Sub-Kultur beimpft. Die Kulturen wurden für 16 Stunden bei 37°C herangezogen. Unbelüftete Bedingungen (verschlossene Behälter) wurden als im Wesentlichen anaerob seiend angesehen. Lebensfähige Zellen wurden unter Verwendung des vorher beschriebenen Gieß-Plattier-Verfahrens gezählt.
  • Die Kulturen wurden durch Zentrifugieren bei 3,500 × g/+7°C/20 Minuten (RC3C Sorvall Instrument Zentrifuge) geerntet, und in 10 ml zweier verschiedener Kälteschutz-Medien resuspendiert. Jeder Stamm wurde in zwei verschieden Kälteschutz-Medien resuspendiert. Konzentrierte bakterielle Suspensionen wurden gezählt (Gieß-Plattier-Verfahren) und in Fläschchen ("vials") (0,5 ml pro Ampulle) dispergiert. Die Proben wurden bei –196°C in flüssigem Stickstoff gefroren und für 18 Stunden vakuumgetrocknet. Nach Gefrier-Trocknen wurde durch das Gefriertrocknungs-Luftzuführ-Ventil Stickstoff eingeführt, und alle Ampullen wurden versiegelt. Alle Fläschchen wurden bei +4°C und +20°C für sechs Monate gelagert. Die Anzahl lebensfähige Zellen pro Ampulle (für jedes Bakterium und Suspensions-Medium) wurde monatlich bestimmt.
  • Ergebnisse:
  • Im Rahmen der Auswahl möglicher probiotischer Organismen für Katzen und Hunde sind die Ergebnisse dieser In-Vitro-Durchmusterung von 20 Lactobazillen und 18 Bifidobakterien, welche auf deren Wachstums-Potentialen, Widerstandsfähigkeit gegenüber Gefrier-Trocknen mit anschließender Lagerung, Widerstandsfähigkeit gegenüber im Magen-Darm-Trakt von Katzen und Hunden vorgefundenem Magen-pH und Gallen-Konzentrationen basieren, in Tabelle 5 dargestellt.
  • Die 20 Lactobazillen wurden bezüglich der Kriterien klassifiziert, welche sie in der vorliegenden Studie erfüllten. Vier (gezeigte) Stämme hatten gute Ergebnisse bezüglich ihrer Wachstums-Merkmale, Widerstandsfähigkeit gegenüber Magen-pH, Gallen-Widerstandsfähigkeit und ihrem Überleben während Lagerung nach Gefrier-Trocknen: L. reuteri NCC2581 (CNCM I-2448), L. reuteri NCC2592 (CNCM I-2450), L. reuteri NCC2603 (CNCM I-2451) und L. reuteri NCC2613 (CNCM I-2452). Die folgenden Merkmale wurden ermittelt:
    • • die Generationszeit betrug weniger als eine Stunde bei Wachstum in MRS
    • • die Verzögerungs-Phase war kurz (weniger als zwei Stunden)
    • • die bakteriellen Zählraten waren während der stationären Phase des Wachstums-Zyklus hoch (mehr als 1,0E + 08 CFU/ml) und 8 und 24 h nach Beimpfen stabil
    • • die Stämme waren durch Gefrier-Trocknen und anschließende sechs-monatige Lagerung bei 4°C und 20°C hinweg stabil
    • • die Stämme waren resistent gegenüber extremer Galle-Konzentration, wie sie wahrscheinlich im Gastrointestinaltrakt von Katzen und Hunden vorgefunden wird (2%)
    • • keine signifikante Hemmung in Anwesenheit von bis zu 4% Galle im Medium
    • • es zeigte sich, dass die Stämme für zumindest 10 min pH 2,6 tolerierten, und bei höheren Niveaus als 1,0E + 08 CFU/ml verbleiben konnten
    • • die Stämme waren gegenüber einem mittleren Magen-pH für zumindest zwei Stunden resistent.
  • Daher wurden zwei aus Katzen isolierte (L. reuteri NCC2581 und L. reuteri NCC2592) und zwei aus Hunden isolierte (L. reuteri NCC2603 und L. reuteri NCC2613) Lactobazillen ausgewählt, um auf mögliche probiotische Aktivität hin untersucht zu werden. Stämme NCC2581, NCC2592, NCC2603 und NCC2613 wurden mittels API 50CH Identifizierung als L. reuteri identifiziert. Allerdings zeigte Ribotypieren, dass NCC2581 und NCC2592, sowie NCC2603 und NCC2613, sehr nahe beeinanderliegende Muster aufweisen, was auf eine mögliche nahe Beziehung/Verwandschaft hinweist. Stamm NCC2581 hatte sehr gute Wachstums-Merkmale, und NCC2603 hatte eine bessere Widerstandsfähigkeit gegenüber Galle als NCC2613.
  • Resulte, welche die acht aus Katzen-Fäkalien isolierten Bifidobakterien betreffen, erlaubten eine Auswahl in Funktion/Abhängigkeit ihrer Wachstums-Merkmale, ihrer Widerstandsfähigkeit gegenüber Magen-pH und ihrer Gallen-Sensitivität. Stamm NCC2623 hatte keines der gewünschten Merkmale und würde daher nicht für weitere Studien empfohlen. Andererseits erfüllte Stamm NCC2627 alle (folgenden) Kriterien:
    • • seine Generations-Zeit betrug weniger als eine Stunde bei Wachstum in MRS-C
    • • die Verzögerungs-Phase war so kurz wie bei Lactobazillen
    • • Zählraten waren hoch und während der stationären Phase des Wachstums-Zyklus stabil
    • • der Stamm war gegenüber extremer Galle-Konzentration resistent, wie sie wahrscheinlich im Gastrointestinaltrakt von Katzen und Hunden (2%) vorgefunden wird
    • • keine signifikante Hemmung in Anwesenheit von bis zu 4% Galle im Medium
    • • es zeigte sich, dass der Stamm pH 2,6 für zumindest 10 min tolerierte, und bei höheren Niveaus als 1,0E + 06 CFU/ml verbleiben konnte
    • • die Stämme waren gegenüber mittlerem Magen-pH für zumindest zwei Stunden resistent
  • Der Stamm NCC2627 war viel resistenter als NCC2623 und NCC2635, wohingegen diese drei Stämme durch Ribotypieren nahe beieinanderliegende Muster zeigten, was auf eine möglicherweise nahe Verwandschaft/Beziehung hindeutet (Verdauung mit zwei Restriktions-Enzymen: EcoSI und EcoRV).
  • Die zehn aus Hunden isolierten Bifidobakterien zeigten bei Kennzeichnung durch Ribotypieren nur zwei verschieden Muster. Daher wurden Gallen-Widerstandsfähigkeits-Versuche nur mit vier Stämmen ausgeführt (zwei aus jeder Gruppe): NCC2657, NCC2660, NCC2671 und NCC2677. Diese vier Stämme waren alle gegenüber der/einer Maximal-Konzentration an Galle resistent, welche in-vivo gefunden werden konnte (2% Galle), und Stämme NCC2660 und NCC2657 wiesen keine Abnahme von Zählraten lebensfähiger Organismen auf, wenn sie einem Maximal-Wert von 4% Galle unterworfen wurden. Als eine Konsequenz sind alle aus Hunde-Fäkalien isolierten Bifidobakterien ziemlich resistent gegenüber hohen Konzentrationen an Galle.
  • Was die Wachstums-Merkmale betrifft, konnten diese zehn Bakterien dabei in zwei Gruppen eingeteilt werden:
    • • Stämme, welche resistent gegenüber Galle sind, und gute Wachstums-Merkmale aufweisen: NCC2657, NCC2651, NCC2663 und NCC2667
    • • Stämme, welche resistent gegenüber Galle sind, aber Wachstums-Merkmale aufweisen, welche zur industriellen Produktion optimiert werden müssen NCC2660, NCC2671, NCC2677, NCC2647, NCC2654 und NCC2674.
  • Die vollständigen Ergebnisse bezüglich Widerstandsfähigkeit gegenüber während der Verdauung von Katzen und Hunden vorgefundenem extremem Magen-pH sollte eine bessere Bestimmung der für weitere Studien auszuwählenden Stämme erlauben. Nur Stamm NCC2651 erfüllte nicht die Selektions-Kriterien für pH-Widerstandsfähigkeit.
  • Tabelle 5: Zusammenfassung
    Figure 00340001
  • Bezüglich der vorliegenden Ergebnisse konnten ein aus Katzen isolierter Bifibobakterien-Stamm und drei aus Hunden isolierte Bifidobakterien (NCC2627, NCC2657, NCC2663 beziehungsweise NCC2667) ausgewählt werden.
  • Tabelle 6: Verdünnungs-Medien
    Figure 00350001
  • 9 ml-Portionen wurden in Röhrchen dispergiert und bei 121°C für 15 min autoklaviert.
  • Schließlich wurden 8 der 38 Stämme für weitere Studien ausgewählt (siehe Beispiel 3): drei aus Katzen isolierte Lactobazillen (NCC2581, NCC2592, NCC2583), drei Lactobazillen aus Hunden (NCC2603, NCC2613, NCC2628), ein Bifidobakterium aus Katzen (NCC2627) und ein Bifidobakterium aus Hunden (NCC2657).
  • Diese Stämme sind gekennzeichnet durch: kurze Generations-Zeiten, hohe Zählraten (mehr als 1,0E + 08 cfu/ml) während ihrer stationären Phase und Stabilität in hohen Anzahlen 8 und 24 h nach Beimpfen, Stabilität gegenüber Gefrier-Trocknen gefolgt von jedweden/irgendwelchen "either" Lagerungs-Bedingungen, Widerstandsfähigkeit gegenüber extremen Galle-Konzentrationen, wie sie im Duodenum vorgefunden werden (2% Galle), und ihre niedrige Hemmung bei Wachstum in Anwesenheit von bis zu 4% Galle. Ferner wurden Ergebnisse von DNA-Analysen zur Auswahl von Bakterien berücksichtigt, welche für die untersuchte Diversität representativ sind.
  • Beispiel 3: Effizienz der Besiedlung bei Katzen
  • L. reuteri NCC2581, L. reuteri NCC2592, L. rhamnosus NCC2583 und Bifidobacterium sp. NCC2627 wurden in Fütterungs-Versuchen getestet, um ihre Befähigung zu evaluieren, den Durchgang durch den Katzen-Gastrointestinaltrakt zu überleben.
  • 16 möglichst gleiche männliche und weibliche Katzen wurden 3 Tage Anpassung an Friskies "Grand menu boeuf" ("Großes Rinder-Menu") unterworfen. Das Fütterungs-Protokoll bestand aus 7 Tagen mit "Friskies Grand Menu" und 7 Test-Tagen mit "Friskies Grand Menu" welches einen der oben genannten Stämme enthält: L. reuteri NCC2581 (Diät A), L. reuteri NCC2592 (Diät B), L, rhamnosus NCC2583 (Diät C) und Bifidobacterium sp. NCC2627 (Diät D) enthält. Die Diät-Zuordnung war wie folgt:
  • Figure 00360001
  • Die genannten Stämme wurden in einer ausreichenden Menge und in einer stabil(en) lyophilisierten Form zubereitet, um diese acht verschieden Bakterien im Hinblick auf ein/das Stamm-Überleben im Gastrointestinaltrakt der getesteten Tiere zu applizieren. Alle Stämme wurden mit 4 g Trehalose gemischt, um ein für die Tiere ausreichendes Träger-Volumen zum Mischen der zubereiteten Stämme mit der Nahrungs-Matrix zuzufügen. Bakterien-Stämme werden in individuellen Plastikröhrchen (1,0E + 09 cfu/Tag) zubereitet und täglich in einen Teil des Essens zugefügt, um sicherzugehen, dass die gesamten Bakterien gegessen werden.
  • Frische Fäkalien-Proben werden gewonnen, um Bakterien-Populations-Zahlen zu analysieren, und werden mit der/einer Basislinie (ohne zugefügte Bakterien) verglichen. Fäkalien werden gesammelt an Tag:
    7 und 8 (Basislinie),
    14 und 15,
    21 und 22 (Basislinie),
    28 und 29.
  • Es wird eine sterile Rektal-Sonde verwendet, um eine Fäkalien-Probe von zumindest 0,1 g zu gewinnen. Diese Probe wird präzise eingewogen, und 0,1 g werden mit 10 ml physiologischer Lösung (Ringer), welche 10% Glycerin enthält, gemischt. Diese Lösung wird dann in Kryo-Röhrchen von 1 ml transferiert und in flüssigem Stickstoff gefroren. Alle Proben werden dann bei –80°C bis zur Analyse gelagert.
  • Die endogenen Populationen von Laktobazillen, Bacteroides, Enterobakterien, Enterokokken, Bifidobakterien und Clostridium perfringens wurden gezählt. Bakterien wurden auf selektiven oder semi-selektiven Medien detektiert. Es wurden hundertfache Serien-Verdünnungen von den Verdünnungen im Bereich von –2 bis –8 in Ringer-Lösung ausgeführt, welche 0,5% Cystein enthält. Petrischalen mit verschiedenen selektiver Medien wurden beimpft und inkubiert (siehe Tabelle unten).
    Figure 00370001
    • *: Wadsworth Anaerobic Bacteriology Manual ("Handbuch Anaerober Bakteriologie"), V. Suter, D. Citron und S. Finegold Third ("der Dritte") ed.
    • **: Phosphomycin (79,5 mg/l) + Sulfamethoxazol (0,93 mg/l) + Trimethoprim (5 mg/l)
    • *** NN Agar von Lowbury und Lilly, 1995
  • Ergebnisse:
  • Die Bakterien-Zählraten sind als Logarithmus zur Basis 10 ausgedrückt und in Tabelle 7 dargestellt.
  • Tabelle 7: Fäkalien-Bakterien-Zählraten in Katzen (Mittelwert ± Standardabweichung, n = 8)
    Figure 00380001
  • Während der Behandlung beobachten wir eine Zunahme der Fäkalien-Zählraten von Lactobazillen aufgrund des Verzehrs der genannten probiotischen Bakterien. Wir beobachten keine drastische Zunahme der Zählrate von Enterobakterien, was wiederspiegelt, dass in Bezug auf die Verwendung der ausgewählten probiotischen Organismen keine Schädigung des Darm-Ökosystems stattfindet.
  • Beispiel 4: Besiedelungs-Effizienz bei Hunden
  • L. reuteri NCC2603, L. reuteri NCC2613, L. acidophilus NCC2628 und Bifidobacterium sp. NCC2657 wurden in Fütter-Versuchen getested, um ihre Fähigkeit zu bewerten, den Durchgang durch den Hunde-Gastrointestinaltrakt zu überleben.
  • 10 Hunde, 5 männliche und 5 weibliche im Alter von 4 bis 7 Jahren, wurden diesem speziellen Test unterworfen. Das Fütterungs-Protokoll bestand aus 5 Tagen Adaptation an "Friskies Vitality" mit/ohne Chicorée und 5 Tagen Test mit "Friskies Vitality" mit/ohne Chicorée und 3 Tagen Adaptation, 5 Tagen Test mit "Friskies Vitality" mit/ohne Chicorée + Bakterien: L. reuteri NCC2603 (Diät E), L. reuteri NCC2613 (Diät F), L, acidophilus NCC2628 (Diät G) und Bifidobacterium sp. NCC2657 (Diät H). Die Diät-Zuweisung war wie folgt:
  • Figure 00390001
  • Die genannten Stämme wurden in einer ausreichenden Menge und in einer stabil(en) lyophilisierten Form zubereitet, um diese acht verschieden Bakterien im Hinblick auf das/ein Stamm-Überleben im Gastrointestinaltrakt der getesteten Tiere einzusetzen. Alle Stämme wurden mit 4 g Trehalose gemischt, um ein ausreichendes Träger-Volumen zum Mischen der zubereiteten Stämme mit der Essens-Matrix für die Tiere zuzufügen. Bakterien-Stämme werden in individuellen Plastik-Röhrchen (5,0E + 09 cfu/Tag) zubereitet und täglich einem Teil des Essens zugefügt, um sicher zu sein, dass alle Bakterien gegessen werden.
  • Es werden frische Fäkalien-Proben gewonnnen, um bakterielle Populations-Zahlen zu analysieren, und (diese) werden mit der/einer Basislinie (ohne zugeführte Bakterien) verglichen.
  • Fäkalien werden gesammelt an:
    Tag 7 und 8 (Basislinie),
    14 und 15,
    21 und 22 (Basislinie)
    28 und 29.
  • Es wird eine sterile Rektal-Sonde verwendet, um eine Fäkalien-Probe von zumindest 0,1 g zu gewinnen. Diese Probe wird präzise eingewogen, und 0,1 g werden mit 10 ml physiologischer (Ringer-)Lösung gemischt, welche 10% Glycerin enthält. Diese Lösung wird dann in 1 ml Kryo-Röhrchen transferiert und in flüssigem Stickstoff gefroren. Alle Proben werden dann bei –80°C bis zur Analyse gelagert. Die Bakterien wurden auf den gleichen Medien gezählt, welche in Beispiel 3 beschrieben sind.
  • Ergebnisse:
  • Die Bakterien-Zählraten, ausgedrückt als Logarithmus zur Basis 10, sind in Tabelle 8 wiedergegeben.
  • Tabelle 8: Fäkalien-Bakterien-Zählraten in Hunden (Mittelwert ± Stdabw., n = 5)
    Figure 00400001
  • Figure 00410001
  • Während (der) Behandlung beobachten wir keine wesentliche Veränderung der Fäkalien-Zählraten von Lactobazillen aufgrund des Verzehrs der ausgewählten probiotischen Bakterien, mit Ausnahme des Falls des Stamms L. acidophilus NCC2628. Unter den getesteten Bedingungen war die hemmende Wirkung auf C. perfringens nicht signifikant, da das Basisniveau von C. perfringens sehr niedrig war. Wir beobachten keine drastische Zunahme der/einer Zählrate von Enterobakterien, was wiederspiegelt, dass in Verbindung mit der Verwendung der ausgewählten probiotischen Organismen keine Störung des Darm-Ökosystems vorliegt.
  • Beispiel 5: Wirkung von Laktobazillen und ihrer Metaboliten auf die Lebensfähigkeit von Giardia intestinalis
  • Wir untersuchten die Wirkung von Kultur-Filtrat-Überständen von aus Katzen und Hunden isolierten Laktobazillen-Stämmen.
  • Material und Methoden
  • Bakterien-Stämme und Kulturen: Mikroorganismen, welche dem Genus Lactobacillus zugeordnet sind, stammten aus der Nestlé-Kultur-Sammlung. (Die) Bakterien wurden in MTYI Medium herangezogen. Überstände, welche Metaboliten von Lactobazillen enthalten, wurden bei pH 6 neutralisiert und Filter-sterilisiert.
  • Kontrollen wurden durch Ansäuern von MTYI-Medium mit Milchsäure auf den gleichen pH wie denjenigen der Bakterien-Kulturen ausgeführt. Anschließend wurde (der) pH mit 0,1 N NaOH auf pH 6 eingestellt. Ursprung des untersuchten Stamms und pH von Überständen und Kontrollen sind in Tabelle 9 gezeigt.
  • Figure 00420001
    Tabelle 9.
  • Parasiten: der/ein Giardia intestinalis Stamm WB (ATCC 30957) wurde bei der Amerikanischen Typ-Kultur-Sammlung ("American Type Culture Collection", Rockville, USA) gekauft. Trophozoiten wurden in Keister's modifiziertem TYI-S-33 Medium herangezogen, welches pro Liter enthält: Kasein-Extrakt (Difco), 20 g; Hefeextrakt (BBL), 10 g; Dextrose (Merck), 10 g; Rinder-Galle (Difco), 0,75 g; NaCl (Merck), 2 g; L-Cystein·HCl (Sigma), 2 g; Ascorbinsäure-Natrium-Salz (Fluka), 0,2 g; K2HPO4 (Merck), 0,6 g; Eisen(III)-Ammoniumzitrat ("ferric ammonium citrate") (Sigma), 22,8 mg; Erwachsenes-Rind-Serum (Sigma), 100 ml; Penicillin/Streptomycin (Gibco, 1000 IU/ml, 1000 μg/ml), 15 ml. (Der) pH wurde vor Filter-Sterilisieren (0,22 μm Porengröße) mit NaOH 5 N auf 6,9 eingestellt.
  • Parasiten wurden in Gewebe-Kultur-Flaschen aus Polystyren ("polystirene") (LUX, Miles Laboratories, Inc. Naperville IL 60540) kultiviert, welche mit 40 ml Kultur- Medium gefüllt wurden. Sub-Kulturen wurden ausgeführt durch: Verwerfen des Überstands mit nicht-anhaftenden Parasiten, Zufügen von 5 ml eiskalten Kultur-Mediums, Inkubieren in einem Eisbad für 10 min, um anhaftende Trophozoite zu lösen, und Beimpfen von 0,2 ml der resultierenden Suspension in frisches Medium. Inkubationen wurden bei 37°C im Dunkeln ausgeführt.
  • Proliferations-Versuche: Zweihundert Mikroliter Trophozoit-Suspensionen (1,4 × 105 Parasiten/ml) wurden mit 100 μl Überständen oder Kontrollen gemischt, und es wurde 1 μCi von 3H-Thymidin zugefügt. (Die) Proben wurden bei 37°C für 24 Stunden in Gewebekultur-Platten mit 96 Vertiefungen (Nunc Brand Products) inkubiert. Anschließend wurden Parasiten abgeerntet und es wurde (die) Thymidin-Aufnahme ermittelt.
  • Ergebnisse
  • Thymidin-Aufnahme ist in Tabelle 10 gezeigt. Der aus einem Hund isolierte Stamm NCC 2628 erzeugte eine starke Hemmung der Proliferation von/des WB-Stamms (91%). Andere untersuchte Stämme hemmten Trophozoit-Wachstum nicht.
  • Figure 00440001
    Tabelle 10: Wirkung von Kultur-Filtrat-Überständen auf (die) Proliferation des/eines Giardia intestinalis Stamms
  • In diesem Experiment konnte demonstriert werden, dass während Wachstums of L. acidophilus NCC 2628 erzeugte funktionelle Metaboliten eine sehr stark hemmende Wirkung auf das Wachstum von Giardia intestinalis aufweisen.
  • Beispiele 6 bis 8: Hemmende Wirkungen von Lactobazillen-Stämmen gemäß der Erfindung auf pathogene Darm-Bakterien
  • Um Stämme mit stark antagonistischen Eigenschaften gegenüber Dünndarm-Pathogenen zu identifizieren, wurden Co-Kultur-Experimente in einem Modell-System ausgeführt, welches Hunde-Dünndarm-Bedingungen (pH, Gallen-Komposition und Konzentration, Muzin, Pancreatin) simuliert. Simulierter Hunde-Dünndarm-Saft enthielt rekonstruierte Hunde-Galle (0,345 g/l Taurochenodeoxycholat, Sigma, Deutschland; 0,7 g/l Taurodeoxycholat, Sigma, Deutschland; 3,04 g/l Taurocholat, Sigma, Deutschland; 0,006 g/l Cholat/Cholsäure-Salz/Ester Fluka, Schweiz), Schweine-Mucin (1,9 g/l Sigma, Deutschland), Schweine-Pancreatin (2,42 g/l, Sigma, Deutschland) und Elektrolyt-Lösung (5 g/l NaCl, 0,6 g/l KCl, 0,25 g/l CaCl2, alle von Merck, Deutschland). Der pH des Saftes wurde mit 0,1 N NaOH auf pH 6,5 ± 0,5 eingestellt.
  • Stämme und Kultur-Bedingungen
  • Dünndarm-Pathogene
  • Es wurden vier möglicherweise pathogene Stämme ausgewählt: S. typhimurium SL1344, E. coli ETEC O8:H9 und E. coli 0149:K88 (pathogenes Hunde-Isolat) und ein klinisches Isolat von Sh. dysenteriae (menschlichen Usprungs, freundlicherweise vom Universitäts-Klinik-Zentrum Vaudoise ("Centre Hospitalier Universitaire Vaudoise") – CHUV Lausanne, Schweiz) bereitgestellt. Mit Ausnahme von S. typhimurium SL1344, welcher in Luria-Bertani-Nährmedium (Difco, USA) vermehrt wurde, wurden alle Enterobakterien in Gehirn-Herz-Infusions-Nährmedium (Difco, USA) bei 37°C unter Schütteln (240 rpm) herangezogen.
  • Milchsäurebakterien
  • Ein weiter Bereich von Lactobazillen von Hunde- und Katzen-Ursprung, inklusive L. acidophilus NCC2628 (CNCM I-2453), L. rhamnosus NCC2583 (CNCM I-2449), L. reuteri NCC2581 (CNCM I-2448), L. reuteri NCC2592 (CNCM I-2450) wurden aus der Nestlé-Kultur-Sammlung (NCC, Nestec, Schweiz) ausgewählt und im Hunde-Dünndarm-Model auf Überleben, physiologische Aktivität und hemmende Wirkungen auf oben erwähnte Dünndarm-Pathogene hin durchmustert. Laktobazillen wurden anaerob (anaerocult, Oxoid, England) in "Man Rogosa Sharp"-Nährmedium (Difco, USA) bei 37°C kultiviert.
  • Bestimmung von Zählraten lebensfähiger Zellen
  • Proben wurden in sterilem Phosphat-Puffer (NaH2PO4, pH 7, 0,2 M) verdünnt, und aus 10-fach-Verdünnungen flächig auf Agar-Platten plattiert: MRS Agar (Difco, USA) für Lactobazillen, Salmonella-Shigella-Agar (Oxoid, England) für S. typhimurium und Sh. dysenteriae, und Sorbitol Mac Conkey Agar (Oxoid, England) für E. coli. Agar-Platten wurden 48 Stunden bei 37°C anaerob für Lactobazillen, und 24 Stunden bei 37°C für Enterobakterien inkubiert.
  • Für Co-Kultur-Tests wurde das Wachstum von Enterobakterien auf MRS-Agar durch Zufügen von Polymixin (Oxoid, England) gehemmt.
  • Co-Kultur-Experimente zwischen Milchsäure-Bakterien ("Lactic Acid Bacteria", LAB) und Pathogenen
  • Co-Kultur-Experimente mit möglicherweise probiotischen LAB und pathogenen Stämmen wurden bei 37°C in 20 ml (Falcon Röhrchen) simuliertem Hunde-Dünndarm-Saft ausgeführt, welcher mit verschieden Kohlenstoff-Quellen (Zucker, Haustier-Nahrung) angereichert ist, um metabolische Aktivität der Kulturen zu favorisieren. LAB wurden mit 10E + 08 cfu/ml, Pathogene mit 10E + 02 cfu/ml, 10E + 04 cfu/ml und 10E + 06 cfu/ml beimpft. Es wurden zu verschieden Zeitpunkten, bis zu 8 Stunden, Proben entnommen, und es wurden Zählraten lebensfähiger Zellen durch Flächenplattieren von 10-fach-Verdünnungen in jeweiligen Medien bestimmt.
  • (Die) Co-Kultur-Tests wurden unter verschieden Bedingungen ausgeführt, inklusive Anreichern simulierten Hunde-Dünndarm-Saftes mit Dextrose (5 g/l) und verschieden Konzentrationen kommerziell verfügbarer extrudierter Haustier-Trocken-Nahrung (5, 25 oder 100 g/l; Friskies ALPO Complete, USA). Letztere wurde homogenisiert (Stomacher Lab Blender) und in Elektrolyt-Lösung suspendiert. Alle Experimente wurden doppelt ausgeführt.
  • Beispiel 6
  • Co-Kultur-Experimente zwischen vier Lactobazillen und den vier möglicherweise pathogenen Stämmen E. coli ETEC O8:H9, E. coli 0149:K88, S. typhimurium SL1344 und Sh. dysenteriae wurden in simuliertem, mit 5 g/l Dextrose (Difco) angereichertem Hunde-Duodenal-Saft ausgeführt. Laktobazillen wurden zu 10E + 08 cfu/ml und die Gram-negativen Indikator-Stämme zu 10E + 02 cfu/ml beimpft. (Die) Ergebnisse sind in Tabelle 11 ausgewertet. Tabelle 11: Co-Kultur zwischen LAB und möglicherweise pathogenen Bakterien in mit Dextrose angereichertem simuliertem Hunde-Dünndarm-Saft
    Figure 00470001
    Figure 00480001
    • +
    Wachstums-Hemmung
    ++
    Wachstums-Hemmung und partielle Inaktivierung
    +++
    Wachstums-Hemmung und vollständige Inaktivierung
  • Alle vier untersuchten Lactobazillen zeigten antimikrobielle Aktivität, aber nur L. acidophilus NCC2628 (CNCM I-2453) und L. rhamnosus NCC2583 (CNCM I-2449) zeigten hohe Aktivität gegen alle getesteten Pathogene. Beide Stämme waren nicht nur in der Lage, das Wachstum zu hemmen, sondern waren auch zum vollständigen Inaktivieren der im Test-System enthalten Pathogene in der Lage (keine verbleibenden lebensfähigen Zellen).
  • Beispiel 7
  • Es wurden Co-Kultur-Experimente zwischen Lactobazillen [(L. acidophilus NCC2628 (CNCM I-2453), L. rhamnosus NCC2583 (CNCM I-2449) und S. typhimurium SL1344 in mit kommerziell verfügbarer extrudierter Haustier-Trockennahrung (5, 25 oder 100 g/l; Friskies ALPO Complete ("vollständig"), USA) angereichertem simuliertem Hunde-Duodenal-Saft ausgeführt. Laktobazillen wurden zu 10E + 08 cfu/ml, und die Gram-negativen Indikator-Stämmen zu 10E + 02 cfu/ml beimpft. Ergebnisse sind in Tabelle 12 ausgewertet. Tabelle 12 Co-Kultur zwischen LAB und möglicherweise pathogenen Bakterien in mit Haustier-Trockennahrung angereichertem simuliertem Hunde-Dünndarm-Saft
    Figure 00490001
    • +
    Wachstums-Hemmung
    ++
    Wachstums-Hemmung und partielles Inaktivieren
    +++
    Wachstums-Hemmung und vollständiges Inaktivieren
  • Ergebnisse zeigen das hohe Potential von insbesondere L. acidophilus NCC2628 (CNCM I-2453), das Wachstum von Dünndarm-Pathogenen unter sehr praktischen Bedingungen, wie in einer Mischung von simuliertem Dünndarm-Saft und Haustier-Nahrung, zu hemmen und sogar vollständig zu inaktivieren. Die antimikrobielle Aktivität von L. acidophilus NCC2628 war sehr hoch, selbst bei niedrigen Anreicherungs-Niveaus mit kommerzieller Haustier-Nahrung, welche als eine Quelle fermentierbarer Zucker für den Organismus dienen. Im Gegensatz zu dieser für L. acidophilus NCC2628 gemachten Beobachtung war die Wirksamkeit von L. rhamnosus NCC2583 (CNCM I-2449) in der Weise vom Anreicherungs-Niveau mit Haustier-Nahrung abhängig, dass mit zunehmenden Mengen von dem Testsystem zugeführter Haustier-Nahrung eine zunehmende antimikrobielle Aktivität beobachtet wurde.
  • Beispiel 8
  • Co-Kultur-Experimente mit L. acidophilus NCC2628 (CNCM I-2453) und verschiedene Beimpfungs-Niveaus von S. typhimurium SL1344 wurden in mit Dextrose (5 g/l, Difco) angereichertem simuliertem Hunde-Duodenal-Saft ausgeführt. L. acidophilus NCC2628 (CNCM I-2453) wurde zu 10E + 08 cfu/ml beimpft, S. typhimurium SL1344 wurde zu 10E + 02 cfu/ml, 10E + 04 cfu/ml und 10E + 06 cfu/ml beimpft. Ergebnisse sind in Tabelle 13 ausgewertet. Tabelle 13: Co-Kultur von L. acidophilus NCC2628 (CNCM I-2453) und verschiede Beimpfungs-Niveaus von S. typhimurium SL1344
    Figure 00500001
    • +
    Wachstums-Hemmung
    ++
    Wachstums-Hemmung und partielle Inaktivierung
    +++
    Wachstums-Hemmung und vollständige Inaktivierung
  • Die antimikrobielle Aktivität von L. acidophilus NCC2628 (CNCM I-2453) war ausreichend hoch, um selbst die/eine hohe anfängliche Konzentration an S. typhimurium SL1344 vollständig zu inaktivieren.
  • Beispiel 9: in-vivo Immun-Stimulierung bei Hunden
  • Das Immun-Stimulier-Potential für aus Haustieren isolierte Stämme probiotischer (Organismen) wurde in einer klinischen Studie unter Verwendung des Stammes L. acidophilus NCC 2628 getestet.
  • Methoden:
  • Proliferation periphärer mononuklearer Hunde-Blut-Zellen ("canine peripheral blood mononuclear cells", PBMC) bei Stimulieren mit verschieden Mitogenen:
  • 20 Hunde von 4 bis 7 Jahren Alter wurden dieser Studie unterworfen. Das Fütterungs-Protokoll bestand in einer Woche Adaptation mit "Friskies Vitality" mit/ohne Chicorée und 4 Wochen Test mit "Friskies Vitality" mit/ohne Chicorée + L. acidophilus NCC2628 Bakterien.
  • L. acidophilus NCC2628 wurde in einer ausreichenden Menge und in einer stabil(en) lyophilisierten Form bezüglich des/eines Stamm-Überlebens im Gastrointestinaltrakt der getesteten Tiere zubereitet. Bakterien wurden mit 4 g Trehalose gemischt, um ein für die Tiere ausreichendes Träger-Volumen zum Mischen der zubereiteten Bakterien mit der Essens-Matrix zuzufügen. Bakterien wurden in individuellen Plastik-Röhrchen (5,0E + 09 cfu/Tag) zubereitet, und wurden täglich in einen Teil des Essens zugefügt, um sicherzugehen, dass alle Bakterien gegessen werden.
  • Nach den vier Wochen Verabreichung probiotischer (Organismen) wurde den Hunden Blut abgenommen. Das Blut wurde durch eine VaccutainerTM-Säule (Becton Dickinson, Mountain View, CA) fraktioniert. PBMC wurden gemäß den Hersteller-Empfehlungen zurückgewonnen.
  • Zellen wurden mit verschieden Mitogenen oder Phorbol-Estern stimuliert, welche eine starke Proliferation an T-Zellen (Concanavalin A (conA), Phytohämaglutinin (PHA)), an B-Zellen (Pokeweed mitogen (PWM)), und an allen Zellen (Phorbol-Myristat-Acetat/Ionomycin (PMA/Iono)) induzieren. Es wurden 105 Zellen pro Vertiefung ("well") mit Mitogenen oder den Phorbol-Estern (die jeweiligen Dosen sind in 1 angegeben) in einem End-Volumen von 200 μl RPMI-1640 Kultur-Medium, welches mit 10% fetalem Kälberserum und Antibiotika angereichert ist, in Flachboden-Kultur-Platten mit 96 Vertiefungen ("wells") (Nunc) inkubiert.
  • (Die) Zellen wurden für 48 h bei 37°C in angefeuchteter 5% CO2-Atmosphäre gehalten. Die Zellen wurden für weitere 18 h mit 1 μCi [3H]Thymidin (Amersham Pharmacia Biotech, Schweiz) Puls-markiert. Die Zellen wurden dann auf Nitrozellulose-Filtern (Packard) geerntet und gebunden. [3H]Thymidin wurde durch Szintillations-Zählen (TopCount; Packard, Schweiz) gemessen. Zellen-Proliferation wurde als der Mittelwert (Zählraten pro Minute ("counts per minute", c.p.m) (±SD) von Dreiergruppen berechnet.
  • Ergebnisse:
  • 1: Es gab im Vergleich mit der Kontroll-Gruppe eine klare Zunahme an Zellen-Proliferation in Antwort auf alle Mitogene in der Gruppe von Hunden, welche mit L. acidophilus NCC2628 gefüttert wurden. Diese Zunahme war signifikant in Kulturen, welche mit den Phorbol-Estern PMA + Ionomycin stimuliert wurden. Diese Daten zeigen, dass Lymphoid-Zellen von mit probitischen Organismen gefütterten Hunden durch Aktivierung in-vitro reaktiver wurden, und legt nahe, dass das Immunsystem von mit probitischen Organismen gefütterten Hunden stimuliert worden ist.
  • Beispiel 10: In-Vitro-Modulieren von Immun-Funktionen mittels aus Haustieren isolierter Lactobacillus-Stämme
  • Es wurde eine In-Vitro-Durchmusterung der verschieden oben beschriebenen aus Haustieren isolierten Lactobacillus-Stämme angesetzt, um deren Immun-Modulier-Potential zu bestimmen. Hierzu maßen wir deren Fähigkeit, entzündungsfördernde Zytokine (IL-12, IFNγ) und/oder entzündungshemmende Zytokine (IL-10, TGF-β) (Anand A. C., Adya CM. 1999, Trop. Gastroenterol; 20(3): 97–106; Spellberg B., Edwards J. E. Jr 2001, Clin. Infect. Dis.; 32(1): 76–102.) zu induzieren. Dies zielte darauf ab, mögliche Kandidaten-Stämme für stark anti-pathogene oder anti-karzinogene Immun-Funktionen sowie antagonistische Funktionen gegen Hunde-Darm-Pathologien, wie Allergie und Entzündung (endzündliche Darm-Krankheiten) auszuwählen. Zusätzliche Kulturen wurden mit Medium alleine (Negativ-Kontrolle), mit Enterococcus faecium Stamm SF68 (NCIMB 10415, Cerbios-Pharma, Schweiz) und mit einem menschlichen Lactobazillus-Isolat ST11 (NCC 2461, CNCM I-2116) (Positiv-Kontrolle) angesetzt.
  • Methode:
  • Von verschieden probiotischen Stämmen in Hunde-Leukozyten induzierte Zytokin-Profile:
  • Blut von normalen erwachsenen Hunden wurde 5 min bei Raumtemperatur mit ACK Lyse-Puffer (150 mM NH4Cl, 1 mM KHCO3, und 0,1 mM Na2EDTA in H2O, pH = 7,4) behandelt. Die Leukozyten wurden zweimal mit RPMI-Medium (ohne Antibiotika) gewaschen, und mit 2.106 Zellen/ml in Gewebekultur-Platten mit 24 Vertiefungen ("well") ausgesäht. 1 ml einer (unten beschriebenen) bakteriellen Suspension, welche 106 CFU enthält, wurde zu jeder Vertiefung zugefügt.
  • Zur Kontroll-Behandlung wurde Medium alleine zu den Leukozyten zugefügt. Die Proben wurden 18 h bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Anschließlich wurden Leukozyten gesammelt, in PBS gewaschen und zentrifugiert. Das Zellen-Pellet wurde mit 500 μl Trizol-Reagens (Gibco BRL) aufgelöst ("lysed"). Es wurde von (den) Zellen-Lysaten unter Verwendung des Nucleospin RNA-Kits (Macherey-Nagel) RNA extrahiert. RT-PCR für Hunde-Zytokin-Verstärkungen wurden unter Verwendung des "AB gene kit" (Merck) ausgeführt. Die Primer-Referenzen (alle von Microsynth erzeugt) sind unten angegeben. Densitometrische Analyse der in den Ethidiumbromid-gefärbten Agarsose-Gelen zu erkennenden PCR-Banden wurde unter Verwendung der NIH-Image("Bild")-Software ausgeführt. Alle Banden wurden mit den jeweiligen, bei jeder Probe erhalten, β-Aktin-PCR-Produkt-Banden normiert (interne Kontrolle), und die in willkürlichen Einheiten ausgedrückten Ergebnisse spiegeln die Pixel-Dichten jedes Zytokin-PCR-Produkt-Streifens wider (2).
    • – Zubereitung der Bakterien: die verschiedenen Stämme von Lactobazillen wurden in MRS-Medium für ungefähr 8 h herangezogen, bis sie identische Dichte erreichten. Die Bakterien wurden in RPMI-Medium ohne Antibiotika auf End-Konzentrationen von 106 CFU/ml verdünnt.
    • – Für Zytokine-RT-PCRs verwendete Primer:
      Figure 00540001
  • Ergebnisse:
  • 2: Die Daten zeigen, dass von Lactobazillen induzierte Zytokin-Profile Stamm-abhängig sind. Beispielsweise induzierte der Stamm NCC2628 hohe Niveaus an IL-10 und TGF-β, was das Potential dieses besonderen Stamms für die Immun-Modulierung von endzündlichen Störungen wie Allergie- und endzündlichen Darm-Krankheiten beleuchtet. Im Gegensatz dazu induzierte der Stamm NCC2583 starke Niveaus an IFNγ und IL-12, was diesen Stamm einen guten Kandidaten für anti-pathogene oder anti-karzinogene Aktivität werden lässt.
  • Beispiel 11
  • Drei Haustier-Trockennahrungen werden in der Studie verwendet. Diese werden als "A", "B" und "C" bezeichnet. Haustier-Nahrung "A" ist eine in Ernährungs-Hinsicht vollständige Haustier-Trockennahrung, welche unter dem Handelsnamen ALPO verfügbar ist (ALPO ist eine eingetragene Handels-Marke von SOCIETÉ DES PRODUITS NESTLÉ S. A. der Schweiz).
  • Haustiernahrung B ist die gleiche in Ernährungs-Hinsicht vollständige Haustier-Trockennahrung wie Haustiernahrung A, ist aber mit einer pulverförmigen Mischung ausgewählter probiotischer Mikroorganismen angereichert, welche mittels eines Beutel gefüttert/zugeführt werden. Die Mischung umfasst im Wesentlichen gleiche Mengen an L. acidophilus NCC2628 und Bifidobacterium sp. NCC2657.
  • Sie wird bei jedem Mahlzeit-Füttern über das Essen gestreut, wobei die dargebotene Dosierung ungefähr 1,0E8 cfu/Tag beträgt.
  • Haustiernahrung C ist eine in Ernährungs-Hinsicht vollständige Haustier-Trockennahrung, welche im Wesentlichen zu Haustier-Nahrung A identisch ist, welche aber 1,2 Gewichts-% eines getrockneten Überstands einer Kultur von Enterococcus faecium SF68 (NCIMB 10415) enthält.
  • Für diese Studie werden 30 Hunde verwendet. Die Hunde werden für 8 Wochen unter Verwendung von Haustier-Nahrung A vor-gefüttert. Die Hunde werden dann in 3 Gruppen von jeweils 10 Hunden eingeteilt, welche mit A, B und C bezeichnet werden, und mit den entsprechend benannten Diäten für 8 Wochen gefüttert:
    Die Hunde haben freien Zuganng zu Wasser und werden einmal am Tag gefüttert. Das Vorherschen von Schuppen im Fell wird durch ein Bewertungs-Paneel mit 30 Mitgliedern zu Beginn und dann 7 Wochen später bewertet.
    Die Hunde werden vor der Bewertung durch das Paneel gekämmt/gepflegt ("groomed") und die Paneel-Mitglieder vergleichen während der Bewertung keine Noten.
    Bei dieser Bewertung werden die Hunde jedem der verschiedenen Paneel-Mitglieder in 20 verschieden Paaren präsentiert. Die Paneel-Mitglieder werden beauftragt, auf ihren Bewertungsbögen anzugeben, welcher Hund des präsentierten Paars (1) weniger Schuppen (2) höheren Fell-Glanz und (3) weniger Fell-Geruch zeigte.
    Der Fell-Gesamt-Zustand aller Hunde ist visuell und taktil gut, wie es von normalen gesunden Hunden erwartet werden kann. Allerdings stellte es sich heraus, dass die Hunde, welche mit Diät C gefüttert wurden, spürbar weniger Schuppen aufwiesen als diejenigen, welche mit Kontroll-Diät A gefüttert wurden. Diejenigen, welche mit Diät B gefüttert wurden, weisen spürbar glänzenderes Fell auf und zeigen weniger merkbaren Fell-Geruch als diejenigen auf A. Diese Merkmale werden als im Vergleich zu den Hunden in Gruppe B nicht signifikant statistisch abweichend befunden.
  • Beispiel 12:
  • Es wird eine Zuführ-Mischung aus ungefähr 58 Gewichts-% Korn/Mais, ungefähr 6 Gewichts-% Korn/Mais-Gluten, ungefähr 23 Gewichts-% Fleisch und dem Rest Schrot ("meal"), Salzen, Vitaminen und Mineralien zubereitet.
  • Die Zuführ-Mischung wird einer Vorkonditioner-Vorrichtung zugeführt und angefeuchtet. Dieser Mischung wird ein Pulver zugeführt, welches eine Mischung der folgenden Lactobacillus-Stämme enthält: Lactobacillus rhamnosus NCC2583 (CNCM I-2449), Lactobacillus acidophilus NCC2628 (CNCM I-2453) und Enterococcus faecium SF68 (NCIMB 10415). Das Pulver wird im Wesentlichen homogen in der Mischung dispergiert. Die angefeuchtete Zuführ-Mischung wird dann einem Extruder-Kocher zugeführt und gelatiniert. Die gelierte Matrix, welche den Extruder verläßt, wird durch eine Formplatte ("die") gezwungen und extrudiert. Das Extrudat wird in zum Verfüttern an Hunden geeignete Teile geschnitten, bei ungefähr 110°C für ungefähr 20 Minuten getrocknet, und abgekühlt, um Pellets zu bilden. Die Extruder-Teile werden auf bakterielle Aktivität der zugeführten Stämme hin getestet. Es wird keine detektiert.
  • Beispiel 13
  • In dieser Studie werden 24 Hunde verwendet. Sie beinhalten jüngere und ältere Hunde, wobei letztere ein Alter von 8 bis 12 Jahren aufweisen. Die ausgewählten älteren Hunde zeigen äußere Anzeichen von ihren Altern entsprechender Gelenk-Entzündung und scheinen zeitweise einige Schwierigkeiten damit zu haben, sich zu bewegen. Bestimmte Bewegungen scheinen schmerzhaft zu sein. Diese Symptome werden bei älteren Hunden oft beobachtet, und es wird angenommen, dass sie mit Arthritis-Zustand in Beziehung stehen.
  • In der Studie werden drei Haustier-Trockennahrungen verwendet, welche mit A, B und C bezeichnet werden. Haustier-Nahrung A ist eine in Ernährungs-Hinsicht vollständige Haustier-Trockennahrung (ALPO Beefy Dinner). Dies ist die Kontroll-Nahrung.
  • Alle 24 Mitglieder der ausgewählten werden für 8 Wochen unter Verwendung von Haustier-Nahrung A vor-gefüttert. Die Hunde werden dann in 3 Gruppen, A, B und C eingeteilt, welche jeweils 8 Hunde, und darunter das gleiche Verhältnis an jüngeren und älteren, aufweist. Jeder Gruppe werden dann die folgende jeweilige Diäten für 8 Wochen gefüttert:
  • Figure 00580001
  • Haustiernahrung B ist eine in Ernährungs-Hinsicht vollständige Haustier-Trockennahrung, welche im Wesentlichen zu Haustier-Nahrung A identisch ist, welche aber eine Beschichtung enthält/aufweist, welche 2% ihres Gewichts ausmacht, wobei die Beschichtung die Mikroorganismen von Enterococcus faecium SF68 (NCIMB 10415) umfasst. Die täglich jedem Hund verfütterte Menge an Essen wird gemäß des individellen Körpergewichtes so berechnet, dass die Dosierung 1,0E + 09 cfu/Tag beträgt.
  • Diät C umfasst die in Beispiel 12 oben erzeugten extrudierten Schrots ("kibbles"). Die täglich jedem Hund verfütterte Menge an Essen wird gemäß des individellen Körpergewichtes so berechnet, dass die Mikroorganismen- Dosierung 1,0E + 11 cfu/Tag beträgt.
  • Die Hunde haben freien Zugang zu Wasser und werden einmal am Tag gefüttert. Es ist eine Aktivitäts-Messvorrichtung an das Halsband jedes Hundes angefügt und es werden täglich Messungen ausgeführt. Die Hunde werden auch visuell auf Aktivität hin durch Zwinger-Mitarbeiter bewertet.
  • Der Zustand aller Hunde ist visuell und taktil gut, wie von normalen gesunden Hunden erwartet werden kann. Allerdings sind die Hunde in den Gruppen, welche Haustier-Nahrung-Diäten B und C bekommen, spürbar aktiver als ihre Pendants auf Diät A. Mess-Ablesungen stützen diese Beobachtungen.
  • Ferner scheinen die älteren Hunde in Gruppen B und C nach Füttern mit Diäten B und C über den Test-Zeitraum weniger äußere Anzeichen lokaler Gelenk-Entzündung aufzuweisen. Ferner scheinen die Hunde bei physischer Bewegung niedrigere Schmerz-Niveaus zu erfahren und sich freier zu bewegen als vorher. Es kann geschlossen werden, dass Diäten B und C (eine) Erleichterung bezüglich bestimmter Anzeichen von Altern bereitzustellen, und die Bewegbarkeit älterer Haustiere zu verbessern scheinen.
  • Beispiel 14: Katzen-Trockenfutter
  • Eine Zuführ-Mischung besteht aus ungefähr 58 Gewichts-% Korn/Mais, ungefähr 6% Gewichts-% Korn/Mais-Gluten, ungefähr 23 Gewichts-% Hühnermehl und dem Rest Salzen, Vitaminen und Mineralien.
  • Die Zuführ-Mischung wird einer Vorkonditioner-Vorrichtung zugeführt und befeuchtet. Die befeuchtete Zuführ(-Mischung) wird dann einem Extrudier-Kocher zugeführt und geliert. Die gelierte Matrix, welche den Extruder verlässt, wird durch eine Formplatte ("die") gezwungen und extrudiert. Das Extrudat wird in zum Füttern an Katzen geeignete Teile geschnitten, bei ungefähr 110°C für ungefähr 20 Minuten getrocknet, und abgekühlt, um Pellets zu bilden. An diesem Punkt wird ein lyophilisiertes Pulver eines oder mehrerer Stämme der folgenden Lactobacillus Arten zum Applizieren auf die Pellets bereitgestellt: Lactobacillus rhamnosus NCC2583 (CNCM I-2449), Lactobacillus acidophilus NCC2628 (CNCM I-2453) oder Enterococcus faecium SF68 (NCIMB 10415). Es wird ausreichend (viel) Pulver bereitgestellt, damit die zugehörige Diät-Aufnahme-Menge für die Katze von ungefähr 1,0E + 07–1,0E + 9 cfu/Tag beträgt. Ein Teil des Pulvers wird in eine erste Masse von Pellets gemischt und verpackt. Eine zweite Menge des Pulvers wird abgemessen und mit einem Lipid-Träger gemischt, welcher dann auf eine zweite Masse von Pellets gesprüht wird. Die Pellets werden verpackt, nachdem die Beschichtung bei 50–60°C für einige Minuten ausreichend getrocknet ist.
  • Beispiel 15: Haustier-Dosennahrung und Ergänzungsmittel
  • Es wird eine Mischung aus 73% Geflügel-Kadaver, Schweinelungen und Rinderleber (zerrieben), 16% Weizenmehl, 2% Farben, Vitaminen, und anorganischen Salzen zubereitet. Diese Mischung wird bei 12°C emulgiert und in der Form eines Puddings extrudiert, welcher dann bei einer Temperatur von 90°C gekocht wird. Er wird auf 30°C abgekühlt und in Stücke geschnitten. 45% dieser Stücke werden mit 55% einer Sauce gemischt, welche aus 98% Wasser, 1% Farbe und 1% Guargummi zubereitet ist. Es werden Weißblech-Dosen gefüllt und bei 125°C für 40 min sterilisiert. Als ein mit der Tiernahrung vor Fütterung zu mischendes probiotisches Ergänzungsmittel, werden zusätzliche Verpackung(en) in Beutel-Form mit Stämmen der folgenden Lactobacillus-Arten bereitgestellt: Lactobacillus rhamnosus NCC2583 (CNCM I-2449), Lactobacillus acidophilus NCC2628 (CNCM I-2453) oder Enterococcus faecium SF68 (NCIMB 10415). Die entsprechende Menge für das Haustier beträgt von ungefähr 106–1012 cfu/Tag, in Abhängigkeit davon, ob es sich um eine Katze oder einen Hund handelt, und von physischen Faktoren, wie dem Körpergewicht. Dies wird als ein Ergänzungsmittel ausgeliefert, welches zusammen mit Fütterungs-Anleitungen entfernbar an die Dose angefügt ist.

Claims (7)

  1. Verwendung von Lactobacillus reuteri NCC2581, hinterlegt unter CNCM I-2448, Lactobacillus reuteri NCC2592, hinterlegt unter CNCM I-2450, Lactobacillus rhamnosus NCC2583, hinterlegt unter CNCM I-2449, Lactobacillus reuteri NCC2603, hinterlegt unter CNCM I-2451, Lactobacillus reuteri NCC2613, hinterlegt unter CNCM I-2452, Lactobacillus acidophilus NCC2628, hinterlegt unter CNCM I-2453, Enterococcus faecium SF68, hinterlegt unter NCIMB 10415, zur Zubereitung einer Zusammensetzung, welche zum Regulieren des Immunsystems von Katzen und/oder Hunden durch Stimulieren und/oder Modulieren von Immun-Funktionen vorgesehen ist.
  2. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei der Stamm in der Zusammensetzung in einer Menge von 1,0E + 04 cfu/g bis 1,0E + 11 cfu/g enthalten ist.
  3. Tierfutter-Zusammensetzung, welche zum Regulieren des Immunsystems von Katzen und/oder Hunden durch Stimulieren und/oder Modulieren von Immun-Funktionen vorgesehen ist, (und) welche zumindest einen Stamm von Lactobacillus reuteri NCC2581, hinterlegt unter CNCM I-2448, Lactobacillus reuteri NCC2592, hinterlegt unter CNCM I-2450, Lactobacillus rhamnosus NCC2583, hinterlegt unter CNCM I-2449, Lactobacillus reuteri NCC2603, hinterlegt unter CNCM I-2451, Lactobacillus reuteri NCC2613, hinterlegt unter CNCM I-2452, Lactobacillus acidophilus NCC2628, hinterlegt unter CNCM I-2453, Enterococcus faecium SF68, hinterlegt unter NCIMB 10415 enthält, welche(r) mit einem essbaren Träger oder einer pharmazeutischen Matrix assoziiert ist/sind.
  4. Zusammensetzung gemäß Anspruch 3, wobei der ausgewählte Stamm in einer Menge von 1,0E + 04 cfu/g bis 1,0E + 11 cfu/g vorliegt.
  5. Zusammensetzung gemäß Anspruch 3 oder 4, welche ferner eine präbiotische Substanz enthält.
  6. Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 3 bis 5, welche in Form von: i. einer in Ernährungs-Hinsicht ausgewogenen Haustier-Nahrung in einer pulverisierten, getrockneten oder einer feuchten, gekühlten oder Regal-stabilen Form, oder ii. in Form eines Diät-Zusatzes vorliegt.
  7. Diät-Zusatz gemäß Anspruch 6, welcher zusammen mit einer Haustier-Nahrung in einer gesonderten Verpackung, wie einem Beutel, bereitgestellt wird.
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