CN104286408B - 一种嗜酸乳杆菌xd13r制备的生物制剂在减少宠物体内抗药性细菌比例的应用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了本发明的目的在于提供嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)XD13R，保藏号为CCTCC M 2014216，制备的生物制剂在减少宠物体内抗药性细菌比例的应用方法。该方法利用嗜酸乳杆菌菌株XD13R制备生物制剂降低宠物体内抗药性细菌比例，降低宠物体内的免疫抑制，降低中毒指数，提高健康指数。
Description
技术领域
本发明涉及了一种生物制剂的应用方法，尤其涉及一种利用能减少动物体内抗药性细菌比例的嗜酸乳杆菌XD13R制备的生物制剂在减少宠物体内抗药性细菌比例上的应用方法。
背景技术
宠物养殖已经越来越普及，其中以宠物狗、宠物猫最为普及。以宠物狗为例，从体型上分类有大型犬、中型犬、小型犬，从品种上分类有波美、等等。
宠物来自野生动物，自从被人们领养以后，得到了宠物主的百般关爱，从生活条件、生活环境、食物结构、活动方式等等，均与野生动物截然不同，由于和人类完全生活在一起，大大中城市生活，从空气质量、饮用水质量、饲料等等均与野生条件由很大的差别，污染严重。
因此宠物养殖中90%以上的宠物主均是给宠物饮用自来水，由于目前的自来水质量日益下降，消毒剂等有毒有害物质含量较高，没有煮沸直接给宠物饮用，对宠物的健康有较大的影响。
从调查数据看，目前的宠物亚健康情况非常严重，其健康指数越来越低，免疫抑制越来越严重，中毒指数越来越高，特别是体内的抗药性细菌比例高，比较容易得病，得病后的治愈能读越来越大。
发明内容
本发明的目的是提供一种降解宠物体内抗药性细菌比例的方法，特别是一种嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus) XD13R，其保藏号为CCTCC NO：M 2014216，制备的生物制剂在减少宠物体内抗药性细菌比例的应用方法，该方法能有效降低宠物体内抗药性细菌的比例，降低宠物体内的免疫抑制，降低中毒指数，提高健康指数。
本发明的目的通过以下技术措施来实现：一种嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus) XD13R制备的生物制剂在减少宠物体内抗药性细菌比例的应用方法，所述生物制剂由嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus) XD13R，保藏号：CCTCC NO：M2014216，发酵而得，所述生物制剂添加至水或宠物饲料中，在日常养殖中供宠物饮用或食用。
本发明所述的生物制剂中，酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus) XD13R的含量为1×105~1×108 cfu/ml。
所述生物制剂与水或宠物饲料的重量比为1﹕50-5000。
具体地，本发明的应用方法可以包括以下几种：
第一：制成专用的水剂产品，如宠物水或宠物饮料或宠物饲料伴侣直接供宠物日常饮用，即将上述通过液体发酵的生物制剂与纯净水按重量比1﹕50-5000的比例混合均匀后，装入饮料包装瓶中，与瓶装饮料一样直接作为商品销售给宠物饮用；
第二：制成宠物的添加剂添加到宠物饮用水中供宠物日常饮用，即将上述通过液体发酵的生物制剂直接装入包装瓶中，作为一种宠物饮用水添加剂，每天按添加剂与饮用水的重量比1﹕50-5000的比例，添加到宠物的饮用水中给宠物饮用；
第三：制成宠物饲料伴侣在喂养宠物时拌入宠物饲料中，供宠物食用，即将上述通过液体发酵的生物制剂直接装入包装瓶中，作为一种宠物饲料添加剂，每天按添加剂与饲料的重量比1﹕50-5000的比例，添加到宠物的饲料中给宠物食用。
作为本发明的一个实施例，上述嗜酸乳杆菌XD13R制备生物制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1) 培养基的制作：以蔗糖、蛋白胨、酵母膏、KH2PO4、西红柿汁和水为主要原料配制培养基，它们的重量百分比为：
蔗糖2.0~5.0%、蛋白胨1.5~4%、酵母膏0.5~3%、KH2PO4 0.2~3%、西红柿汁3~8%，水余量；
(2) 取嗜酸乳杆菌XD13R菌液接种至经过高温灭菌的所述步骤（1）制备的培养基中，调整起始pH至5~6.5，在发酵罐中进行厌氧发酵3~15天，至终点pH为3~4，即得该嗜酸乳杆菌制备的生物制剂。
所述步骤(2)中嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus) XD13R菌液的制备方法：接种嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus) XD13R的新鲜培养物至装有MRS培养基的三角瓶中，在30-40℃的培养箱中培养18~48h，获得XD13R菌液。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
本发明利用嗜酸乳杆菌菌株XD13R经过液体发酵的发酵物作为制备的减少宠物体内抗药性细菌比例的生物制剂，将其应用在宠物养殖上，改变了传统宠物养殖中宠物直接饮用自来水的养殖方法，从而有效降低宠物体内抗药性细菌的比例，降低宠物体内的免疫抑制，降低中毒指数，提高健康指数，消除目前宠物普遍存在的亚健康状态，减少宠物携带的抗药性传统给人的机会。
本发明的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus) XD13R已经于2014年5月22日在中国典型培养物保藏中心保藏，地址：武汉市武昌珞珈山武汉大学，并收到保藏登记号(CCTCC NO：M 2014216)。
附图说明
图1是本发明的嗜酸乳杆菌株XD13R的DNA测序图。
具体实施方式
实施例一：
嗜酸乳杆菌菌株XD13R的驯化和筛选：从广东省微生物研究所菌种保藏中心购买了4株芽孢杆菌（XD05B-XD08B），3株乳酸菌（XD05R-XD07R），1株酵母（XD05J），从广州百佳超市购买了2株酵母（XD06J-XD07J），再从自然界分离筛选了8株菌斑形态、菌体形态均有别于上述菌株的乳酸菌（XD08-RXD15R），合计共收集了4株芽孢杆菌（XD05B-XD08B），11株乳酸菌（XD05R-XD15R），3株酵母（XD05J-XD07J），然后将它们分别经10代高抗药性细菌比例的生猪粪水环境的诱变培养，最后挑选出能适应上述生猪粪水环境的，能降低抗药性细菌比例的菌株。
上述的高抗药性细菌比例的生猪粪水：是从十多个养殖场取来新鲜猪粪各15公斤，按猪粪比水的重量比为1﹕5的比例配制后，滤去粪渣，将粪水分别添加0mg/kg、25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg的链霉素和盐酸林可霉素后，在35度培养箱培养36小时，分别进行细菌总数的计数，将各种抗生素分别添加25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg的细菌总数除以添加0mg/kg的对照组的细菌总数，得出该粪水中的细菌在该抗生素该浓度下的抗药性细菌比例，挑选出抗药性细菌比例最高的粪水来自清远市清城区沙田养猪场，作为用于筛选具有降低抗药性细菌比例功能的粪水。
上述的降低抗药性细菌比例的检验方法：将上述方法制成的粪水分别装入144个500ml的三角瓶中，分别接种上述的18种菌，每种菌接种8瓶，在35度的培养箱培养8小时后，分别添加0mg/kg、25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg的链霉素和盐酸林可霉素，在35度培养箱培养36小时，分别进行细菌总数的计数，将各种抗生素分别添加25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg的细菌总数除以添加0mg/kg的对照组的细菌总数，得出该粪水中的细菌在该抗生素该浓度下的抗药性细菌比例，首先筛选出具有降低粪水中抗药性细菌比例的菌株，再经过上述步骤重复10次，最终筛选出降低抗药性细菌能力最强的菌株为XD13R，对该菌株我们送华南农业大学分子遗传实验室进行DNA测序（见图1），结果证明该菌株是一株嗜酸乳杆菌的菌株。
实施例二：
(1) 制备嗜酸乳杆菌XD13R菌液：接种嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)XD13R的新鲜培养物至装有MRS培养基的10~20个500ml三角瓶中，在30℃的培养箱中培养48h，得XD13R菌液。
(2) 培养基的制作：以蔗糖、蛋白胨、酵母膏、KH2PO4、西红柿汁和水为主要原料配制培养基，它们的重量百分比为：
蔗糖4%、蛋白胨2.5%、酵母膏1%、KH2PO4 1%、西红柿汁4%、水余量。
(3) 取上述嗜酸乳杆菌XD13R菌液接种至经过高温灭菌的上述培养基中，调整起始pH至5~6.5，在发酵罐中进行厌氧发酵15天，至终点pH为3~4，即得该嗜酸乳杆菌制备的生物制剂。
实施例三：
(1) 制备嗜酸乳杆菌XD13R菌液：接种嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)XD13R的新鲜培养物至装有MRS培养基的10~20个500ml三角瓶中，在38℃的培养箱中培养40h，得XD13R菌液。
(2) 培养基的制作：以蔗糖、蛋白胨、酵母膏、KH2PO4、西红柿汁和水为主要原料配制培养基，它们的重量百分比为：
蔗糖4%、蛋白胨2.5%、酵母膏1%、KH2PO4 1%、西红柿汁4%、水余量。
(3) 取上述嗜酸乳杆菌XD13R菌液接种至经过高温灭菌的上述培养基中，调整起始pH至5~6.5，在发酵罐中进行厌氧发酵4天，至终点pH为3~4，即得该嗜酸乳杆菌制备的生物制剂。
实施例四：
(1) 制备嗜酸乳杆菌XD13R菌液：接种嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)XD13R的新鲜培养物至装有MRS培养基的10~20个500ml三角瓶中，在40℃的培养箱中培养18h，得嗜酸乳杆菌XD13R菌液。
(2) 培养基的制作：以蔗糖、蛋白胨、酵母膏、KH2PO4、西红柿汁和水为主要原料配制培养基，它们的重量百分比为：
蔗糖5%、蛋白胨2%、酵母膏1.5%、KH2PO4 1.2%、西红柿汁6%、水余量。
(3) 取上述嗜酸乳杆菌XD13R菌液接种至经过高温灭菌的上述培养基中，调整起始pH至5~6.5，在发酵罐中进行厌氧发酵5天，至终点pH为3~4，即得该嗜酸乳杆菌制备的生物制剂。
实施例五：
(1) 制备嗜酸乳杆菌XD13R菌液：接种嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)XD13R的新鲜培养物至装有MRS培养基的10~20个500ml三角瓶中，在35℃的培养箱中培养35h，得XD13R菌液。
(2) 培养基的制作：以蔗糖、蛋白胨、酵母膏、KH2PO4、西红柿汁和水为主要原料配制培养基，它们的重量百分比为：
蔗糖5.0%、蛋白胨4%、酵母膏3%、KH2PO4 3%、西红柿汁8%、水余量。
(3) 取上述嗜酸乳杆菌XD13R菌液接种至经过高温灭菌的上述培养基中，调整起始pH至5~6.5，在发酵罐中进行厌氧发酵10天，至终点pH为3~4，即得该嗜酸乳杆菌制备的生物制剂。
试验例一：
将所筛选出来的嗜酸乳杆菌XD13R菌株制成的生物制剂在广东省清远市清城区沙田养猪场、广东省鹤山市鹤城镇邓三辉养猪场，鹤山市源生态农民专业合作社马山养殖场进行养殖了3个批次共90头肉猪的养殖试验，试验的方法是选择30公斤左右的普通瘦肉型中猪，将上述实施例三所制成的生物制剂按重量比1﹕50的比例稀释后每天供生猪饮用，经60-90天的喂养试验结果表明，这种生物制剂适口性好，生猪喜欢饮用，安全性好，没有出现任何不良反应，吃了这种饲料的生猪极少发病，栏舍内的氨气浓度一直保持在0-5ppm之间，明显优于国家行业标准（栏舍内氨气浓度≤30ppm），生猪粪便中的抗药性细菌比例如表一所示：
表一：
试验例二：
将所筛选出来的嗜酸乳杆菌XD13R菌株制成的生物制剂在广东省鹤山市桃源镇麦明益养猪场、广东省鹤山市雅瑶镇李建芳养猪场，鹤山市源生态农民专业合作社马山养殖场进行养殖了3个批次共90头肉猪的养殖试验，试验的方法是选择30公斤左右的普通瘦肉型中猪，将上述实施例三所制成的生物制剂按重量比1﹕300的比例添加到饲料中每天供生猪食用，经60-90天的喂养试验结果表明，这种生物制剂适口性好，生猪喜欢饮用，安全性好，没有出现任何不良反应，吃了这种饲料的生猪极少发病，栏舍内的氨气浓度一直保持在0-4ppm之间，明显优于国家行业标准（栏舍内氨气浓度≤30ppm）。
试验例三：
将所筛选出来的嗜酸乳杆菌XD13R菌株制成的生物制剂在广东省鹤山市古劳镇冯景强、王耀文养殖场进行养殖了3个批次共90头肉猪的养殖试验，试验方法是选择30公斤左右的三元杂中猪，将述实施例二所制成的生物制剂直接投喂（即喂养100%的发酵饲料），经60-90天的喂养试验结果，与上述采用瘦肉猪养殖的差异不显著。
试验例四：
将所筛选出来的嗜酸乳杆菌XD13R菌株制成的生物制剂在广东省鹤山市古劳镇冯景强、王耀文养殖场进行养殖了3个批次共90头肉猪的养殖试验，试验方法是选择30公斤左右的三元杂中猪，将实施例二所制成的生物制剂30%，添加60%左右的普通中猪饲料，经60-90天的喂养试验结果，与上述采用瘦肉猪养殖的差异不显著。
试验例五：
取实施例二的嗜酸乳杆菌XD13R菌株制备成能降低动物体内抗药性细菌比例的，含菌量为1×105~1×108 cfu/ml的生物制剂，再将这种生物制剂按质量比为1﹕1000的比例配制成宠物狗专用饮用水，装瓶后供宠物犬博美日常饮用，饮用30天后取粪便送广东省微生物分析测试中心对抗药性微生物数量进行检测。
从应用结果表明，嗜酸乳杆菌XD13R制备的生物制剂，可明显降低宠物犬粪便中抗药性细菌的比例。
试验例六：
取实施例二的嗜酸乳杆菌XD13R菌株制备成能降低动物体内抗药性细菌比例的，含菌量为1×105~1×108 cfu/ml的生物制剂，再将这种生物制剂直接装瓶后作为添加剂，供博美和贵宾等宠物犬作为饮用水添加剂使用，每天在其饮用水中按质量比为1﹕500的比例添加上述饮用水添加剂，饮用6天和35天后分别抽取血液送农业部种猪质量监督检验测试中心（广州）健康评价工作室进行检测，检测结果如表五、表六所示。
从表五、表六的数据可以清楚的看出，嗜酸乳杆菌XD13R制备的生物制剂可明显减少宠物犬体内的免疫抑制，降低中毒指数，提高健康指数，对解决宠物犬目前所存在的亚健康问题，提高免疫能力有重要的促进作用。
试验例七：
取实施例三的嗜酸乳杆菌XD13R菌株制备成能降低动物体内抗药性细菌比例的，含菌量为1×105~1×108 cfu/ml的生物制剂，再将这种生物制剂直接装瓶后作为添加剂，供宠物犬金毛作为饲料添加剂使用，每天在其饲料中按质量比为1﹕500的比例添加上述饲料添加剂，饮用6天和35天后分别抽取血液送农业部种猪质量监督检验测试中心（广州）健康评价工作室进行检测，检测结果如表七所示。
从表七可以清楚的看出，嗜酸乳杆菌XD13R制备的生物制剂可明显减少宠物犬体内的免疫抑制，降低中毒指数，提高健康指数，对解决宠物犬目前所存在的亚健康问题有重要的促进作用。
本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。本发明的上述实施例都只能认为是对本发明的说明而不是限制，因此凡是依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何细微修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
Claims (5)
1.一种嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus) XD13R制备的生物制剂在减少宠物体内抗药性细菌比例的应用方法，其特征在于，所述生物制剂由嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus) XD13R，保藏号：CCTCC M 2014216，发酵而得，所述生物制剂添加至水或宠物饲料中，在日常养殖中供宠物饮用或食用。
2.根据权利要求1所述的应用方法，其特征在于，所述生物制剂中，嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus) XD13R的含量为1×105~1×108cfu/ml。
3.根据权利要求1所述的应用方法，其特征在于，所述生物制剂与纯净水按重量比1﹕50~5000混合后，供宠物饮用。
4.根据权利要求1所述的应用方法，其特征在于，所述生物制剂与饮用水按重量比1﹕50~5000混合后，供宠物饮用。
5.根据权利要求1所述的应用方法，其特征在于，所述生物制剂与饲料按重量比1﹕50~5000混合后，供宠物食用。
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