JPH02255085A - イヌリナーゼ活性を有する酵素組成物およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、環状イヌロオリゴ糖生成能を有する新規イヌ
リナーゼおよびその製造法に関するものである。

〔従来の技術〕

イヌリンは、主にキク科植物、キクイモ、ダリアの塊茎
、ゴボウの根、ヤーコンの根などに含まれている多糖類
であって、分子末端にシュクロースを有し、それにβ−
２，１−フラクトフラノシド結合で７ラクトースが３０
〜５０個結合している。

このイヌリンを分解する酵素・イヌリナーゼとしては、
アスペルギルス・ニガー由来のｅｎｄｏ型イヌリナーゼ
、ペニシリウム属微生物由来のｅｘｏ型イヌリナーゼな
ど、イヌリンを加水分解してフラクトースおよびイヌロ
オリゴ糖を生成させる酵素や、アースロバフタ−・ウレ
アファシェンス、アースロバフタ−・グロビフオーミス
、シュウトモナス・フルオレセンスなどに由来するイヌ
リンフラクトトランスフェラーゼのように、イヌリンを
分解してフラクトース２分子よりなる環状化合物（たと
えばシフラクトフラノース２’、ｌ：２，１’−ジアン
ヒドリド、シフラクトフラノース２’、Ｉ：２，３’ジ
アンヒドリドなど）を生成させる酵素が知られている。

〔発明が解決しようとする課題〕 上述のように、イヌリンから７ラクト一ス２分子よりな
る環状化合物を生じさせるイヌリナーゼは公知であるが
、それ以上に多数のフラクトース分子からなる環状化合
物を生じさせるイヌリナーゼは、見いだされていない。

そのような多フラクトース環状化合物は、内径の大きい
環を形成しているので、サイクロデキストリンのように
種々の物質を包接し、その物質の物理的化学的性質を変
化させることが期待される。たとえば水難溶性物質を水
に溶けるようにしたり、光や熱に不安定な物質を安定化
したりする可能性がある。

そこで本発明の目的は、イヌリンより多フラクトース環
状化合物を生成させることのできる酵素を提供すること
にある。

〔課題を解決するための手段〕

種々検討の結果、本発明者らは、バチルス属に属する細
菌の中に上記本発明の目的達成を可能にする菌株がある
ことを見いだし、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、下記の理化学的性質を有する新規
イヌリナーゼを提供するものである。

（イ）作用 イヌリンに作用させるとイヌリンのβ−２，１−フラク
トシド結合を切断すると同時に分子内転移反応を生じさ
せ、６〜８個のフラクトース分子がβ２ｊ−７ラクトシ
ド結合した環状イヌロオリゴ糖を生成させる。

（ロ）基質特異性 イヌリンなど重合度８以上のβ−２，１結合フラクトー
スポリマーに特異的に作用し、β−２，６結合の７ラク
トースポリマーであるレバンには作用しない （ハ）至適ｐＨおよび安定ｐｌ（範囲 至適ｐＨ：約７．２ 安定ｐＩ（範囲：６，５〜８．５ （ニ）至適温度および安定温度範囲 至適温度：４５℃ 安定温度範囲：５０’Ｏ以下。

以下、この新規イヌリナーゼを、その作用に基づきｃｙ
ｃｌｏｉｎｕｌｏ−ｏｌｉｇｏｓａｃｃｂａｒｉｄｅ　
ｆｒｕｃｔａｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（略称：ＣＦ
Ｔａｓｅ）と呼ぶ。

ＣＦ　Ｔ　ａｓｅは、バチルス・サーキュランス１１１
２　Ｎｏ、３１（微工研菌寄第９９４３号）など、この
酵素を生産する能力を有するバチルス属細菌をフラクト
ースポリマー含有培地で培養すると菌体外に生産される
ので、培養物を酵素精製の常法により精製することによ
り容易に得ることができる。

バチルス・サーキュランスＭ２　Ｎｏ、３１は、本発明
者らがイヌリンを唯一の炭素源として含有する培地で多
くの細菌を培養し、培養物中に生産された酵素の性質を
調べるスクリーニングを行なった結果選抜されたもので
ある。最初、広島県尾道市の土壌より分離された菌株で
あって、その菌学的性質は次のとおりである。

（ａ）形態 ■細胞の形および大きさ−太さ０．５〜０．７μｍ１長
さ３〜６μｍの桿菌 ■運動性：あり。周毛を有する。

■胞子：あり。球形ないし楕円形。端部またはその近く
にある。

■ダラム染色性：不定 ■抗酸性：なし くｂ）生育 ■肉汁寒天斜面培養：粗面；半透明；クリーム白色。

■グルコース寒天斜面培養二発育悪い、透明。

クリーム白色。

■肉汁液体培養・少量の沈殿を生じる。

■肉汁ゼラチン穿刺培養：変化しない。

■リドマスミルク：変化しない。

（ｃ）生理的性質 ■硝酸塩の還元ニする ■脱窒素：しない ■ＭＲテスト：陽性 ■ｖｐテスト：陰性 ■インドールの生成：なし ■硫化水素の生成：なし ■でんぷんの分解ニする ■クエン酸の利用：しない ■色素の生成：なし ［相］カタラーゼ：陽性 ■酸素要求性：好気性 ■生育の範囲：ｐＨ６〜８（３０’０．７日間）；温度
１５〜３５℃；　１０℃では生育微弱；４０℃では生育
しない（ＩＩＨ７，０，７ＥＩ間）０食塩の影響：３％
食塩含有ブイヨンで生育しない。

■炭水化物の利用ニゲルコース、７ラクトース、マルト
ース、ガラクトース、マンニット、シュクロース、ラク
トース、エスクリンを利用する。

ソルビット、アトニット、イノシトール、エタノールを
利用しない。

［相］リジン、アルギニン、オルニチンの脱炭酸：しな
い［相］尿素分解：しない 以上の諸性状をバージエイのマニュアル・オブ・デター
ミナティブ・バクテリオロジー、第８版（１９７４年）
の記載と照合すると、本菌株は好気性、桿菌、胞子を形
成する点などから、バチルス属に属するものと認められ
た。種については、諸性質が上記マニュアル記載のバチ
ルス・サーキュランスのそれと合致することから、本菌
株はバチルス・サーキュランスと同定された。

〔作用〕

本発明のＣＦＴａｓｅは、前述のように、イヌリンに作
用させるとイヌリンのβ−２，１−フラクトシド結合を
切断すると同時に分子内転移反応を生じさせ、６〜８個
のフラクトース分子がβ−２，１−フラクトシド結合し
た下記構造式の環状イヌロオリゴ糖を生成させる。

この反応を環状イヌロオリゴ糖の製造に利用する場合は
、好ましくはｐＨ６〜８、温度３５〜５０℃で、最高収
率が達成されるまで反応させればよい。

本発明のＣＦ　Ｔ　ａｓｅをＣＦ　Ｔ　ａｓｅ生産菌の
培養により製造する場合は、培地にβ−２，１−フラク
トシド結合を有する７ラクトースのポリマーを炭素源と
して、好ましくは唯一の炭素源として、約０．０１〜３
０％、好ましくは約０．３〜３％含有させ、本発明のＣ
Ｆ　Ｔ　ａｓｅを誘導産生させる。使用可能なフラクト
ースのポリマーとしては、イヌリン、レバン、イヌロオ
リゴ糖類、フラクトオリゴ糖類、レバンオリゴ糖類、お
よびこれらを含有する植物抽出物または微生物培養物な
どがあるが、特に好ましいのは、イヌリンおよびレバン
である。培地には、ほかに酵母エキス、ペプトン、肉エ
キス、コーンステイープリカー、大豆粕、硫酸アンモニ
ウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、尿素など
の窒素源のほか、マグネシウム塩、カリウム塩、リン酸
塩、鉄塩、ビタミン等の無機塩類、微量栄養素等を適宜
含有させる。培養は、２０〜３５℃で１〜７日間、好気
的に行う。培地ｐＨが６．０以下に下がると本発明のＣ
Ｆ　Ｔ　ａｓｅの活性収量が低下するので、ｐＨは培養
中つねに６，０以上に保つことが望ましい。培養は、回
分式、連続式のいずれによっても行うことができる。

ＣＦ　Ｔ　ａｓｅは菌体内および菌体外に生産されるが
、培養液中に多量に蓄積されるので、これを利用するの
が経済的には有利である。これを培養液から分離し精製
する操作は、たとえは次のようにして行うことができる
。まず、培養液中の菌体を遠心分離、濾過などの方法で
除く。得られた上澄液は、そのままでも粗酵素液として
酵素反応に使用することができるが、精製する場合は、
たとえば硫酸アンモニウム塩析、アセトン、エタノール
、イソグロバノール等による溶媒沈殿法、ゲル濾過法、
イオン交換樹脂精製法等、−船釣な酵素精製法を用いる
ことができる。

〔実施例〕

以下、実施例を示して本発明を説明する。なお、各例に
おいて示したＣ　Ｆ　Ｔ　ａｓｅの活性は、次のように
して測定されたものである。

１％イヌリン溶液（０，１Ｍリン酸緩衝液溶液：ｐＨ６
，５）１ｍｌと酵素液１ｍｌを混合し、４５℃で１時間
反応させる。生成した環状イヌロオリゴ糖のうちαＣＩ
（フラクトース６分子からなるもの）の量を高速液体ク
ロマトグラフィーで定量し、１分間に１μＭのαＣＩを
生成させる酵素量を１単位とする。高速液体クロマトグ
ラフィーの条件は次のとおりにする。

カラム：　Ｔ　Ｓ　Ｋ　ｇｅｌ　Ａｍ１ｄｅ−８０キャ
リヤー：アセトニトリル／水（６５／３５）流速：１．
２ｍｌ／ｍｉｎ カラム温度＝４２℃ 検出：ＲＩ 実施例１ イヌリン　１％、酵母エキス０．１％、Ｋ２ＨＰＯ，０
，１％、ＮａＮＯ３０，５％、ＭｇＳＯ４・７１１２０
０．０５％を含むｐＨ７，０の培地にバチルス・サーキ
ュランスＭＺ　Ｎｏ、３１を植菌し、３０℃で４日間、
好気的に培養した。培養終了後、１０．ＯＯＯｒｐｍで
２０分間遠心分離して培養液から菌体を除き、ＩＱの上
澄液を得た。

この上澄液を等量の冷アセトン中に投入し、生じた沈殿
を濾別し、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６，５）に溶解
させ、１夜４℃で同緩衝液に対して透析した。その後、
生じた沈殿を遠心分離して除き、上溝液を同上緩衝液で
平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍに吸着させ、
０．１Ｍ−０，５ＭのＮａＣ１を含む同上緩衝液を用い
る濃度勾配法によって酵素を溶出させた。溶出した活性
画分を集め、同上緩衝液に対して１夜４℃で透析する。

同様の操作をさらに２度繰り返し、得られた透析内液（
精製酵素■）を、同上緩衝液で平衡化したセファデック
スＧ−１００のゲル濾過カラムクロマトグラフィーを行
い、０．１Ｍ−ＮａＣ１を含む同上緩衝液で酵素を溶出
させ、活性画分（精製酵素■）を集めた。これにより、
収率２７％で、比活性が５８５倍精製された酵素を得た
。

上述の精製の経過を表１に示す。

表１ 培養上清　　　３２００　　７６　　　０．０２　　１
００アセトン沈殿　　５６０　　５１　　　０．０９　
　６７精製酵素Ｉ　　　　　３４　　３７　　　１．１
　　　４９精製酵素１１　　　　１．８　　２１　　１
１．７　　　２７実旅例２ レバン０．５％、酵母エキス０．５％、ＫＪＰｏ、　０
．１％、ＮａＮＯ３０，５％、ＭｇＳＯ４−７Ｈ２００
，０５％を含むｐ）１７．０の培地１００ｍ１を５００
ｍ１容坂ロコルベンに分注し、１２１　’０で１５分間
加熱殺菌した。冷却後、バチルス・サーキュランスＭ２
　Ｎｏ、３１を１白金耳植菌して３０℃で４日間振とう
培養した。培養終了後、遠心分離して培養液から菌体を
除き、粗酵素液を得た。そのＣＦ　Ｔ　ａｓｅ活性は０
．０４単位／ｍｌであった。

〔発明の効果〕

本発明の新規イヌリナーゼを用いることにより、フラク
トース６〜８分子からなる環状構造の新規オリゴ糖を容
易に製造することができる。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記の理化学的性質を有する新規イヌリナーゼ：
   （イ）作用 イヌリンに作用させるとイヌリンのβ−２，１−フラク
   トシド結合を切断後ただちに分子内転移反応を生じさせ
   、６〜８個のフラクトース分子がβ−２，１−フラクト
   シド結合した環状イヌロオリゴ糖を生成させる； （ロ）基質特異性 イヌリンなど、重合度８以上のβ−２，１結合フラクト
   ースポリマーに特異的に作用し、β−２，６結合のフラ
   クトースポリマーであるレバンには作用しない； （ハ）至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲 至適ｐＨ：約７．２ 安定ｐＨ範囲：６．５〜８．５ （ニ）至適温度および安定温度範囲 至適温度：４５℃ 安定温度範囲：５０℃以下
2. （２）フラクトースのポリマーを含有する培地を用いて
   請求項１記載のイヌリナーゼを生産する能力を有するバ
   チルス属細菌を培養し、培養物からイヌリナーゼを採取
   することを特徴とする請求項１記載のイヌリナーゼの製
   造法。
3. （３）イヌリナーゼを生産するバチルス属細菌としてバ
   チルス・サーキュランスＭＺＮｏ．３１（微工研菌寄第
   ９９４３号）を用いる請求項２記載の製造法。
4. （４）フラクトースのポリマーがイヌリンまたはレバン
   である請求項２記載の製造法。