CN104611311A - 利用灰平链霉菌Streptomyces griseoplanus S501固态发酵生产外切菊粉酶的方法 - Google Patents

利用灰平链霉菌Streptomyces griseoplanus S501固态发酵生产外切菊粉酶的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了利用灰平链霉菌Streptomyces griseoplanus S501固态发酵生产外切菊粉酶的方法，属于微生物技术领域，所述方法包括以下步骤：将菌株S501冻干粉以无菌水配成菌悬液于选择培养基上在28℃下培养3-5d，将孢子刮下，置于无菌水中稀释至孢子菌悬液浓度为106cfu/mL，接种于固态发酵培养基，于28℃静止培养3-6d；待发酵结束后，加入去离子水，振荡提取1h后过滤，将滤液于4℃，转速8000rpm/min离心20min得到含外切菊粉酶的上清液，将上清液按常规冷冻干燥法制得菊粉酶制剂。本发明以麸皮作为固态发酵基质，采用廉价易得的大蒜皮粉作为碳源，诱导菌株S501产外切菊粉酶，外切菊粉酶酶活最高可达到209.63±0.96U/g，克服了现有技术中使用菊粉做碳源的成本高，液态发酵方法耗时耗力，不适合工业生产的缺陷。

Description

利用灰平链霉菌Streptomyces griseoplanus S501固态发酵生产外切菊粉酶的方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种利用灰平链霉菌Streptomyces griseoplanus S501固态发酵生产外切菊粉酶的方法。
背景技术
菊粉是一种天然的果聚糖，由D-呋喃果糖以β-2,1糖苷键相连，其还原端连接一个葡萄糖基，呈直链结构。富含菊粉的植物主要有菊芋、菊苣等，菊粉以其具有的益生元等独特功能而近年来备受食品行业的关注，应用前景十分广阔。菊粉酶是能够水解β-2,1-D-果聚糖果糖苷键的一类水解酶，按作用的方式主要分为内切酶和外切酶。外切型菊粉酶水解菊粉可生产高纯度果糖，内切型菊粉酶则可水解菊粉生产低聚果糖，这两种物质均可分别作为食品添加剂，也可进一步发酵生产酒精、有机酸等产品[1]。菊粉酶的来源广泛，自然界中的许多微生物都可以产生菊粉酶[2-3]。
目前，菊粉酶传统的生产方法一般采用微生物液态发酵。近年来，多有文献报道采用固态发酵法生产菊粉酶[4-7]。在酶生产方面，固态发酵相比于液态发酵有很多的优势，如产酶活性高、技术简单、成本低、能耗低、产废水少以及更高的产品回收率等。因此，固态发酵更适合工业化生产，而且通过固态发酵制得的粗酶可以直接用于生物合成和生物转换酶的来源。但是大多数的研究均以含菊粉植物菊芋、菊苣等作为碳源对菌株进行产菊粉酶的诱导，导致使用菊粉生产酶的成本较高，不适合工业生产，如果可以寻找一种价廉易得的碳源来得到酶活高的菊粉酶，则可以满足工业生产的需求。
食品加工厂在生产过程中会产生大量的大蒜皮，这些大蒜皮在日常中使用率极低，通常作为垃圾处理，全国每年废弃处理的大蒜皮达到20万吨，造成了大量的浪费，同时也对环境造成了污染。
发明人自行申请的申请号为201310691141.8；申请日为：2013 年12月13日；申请人为：大连民族学院；发明名称为：一株产内切菊粉酶的灰平链霉菌S501及其培养方法和应用的发明专利，涉及一株从自然界中分离出的微生物灰平链霉菌Streptomyces griseoplanus S501，所述的灰平链霉菌Streptomyces griseoplanus S501，已于2013年9月13日提交保藏。
在上述专利申请中提及利用该微生物采用液态发酵法产内切菊粉酶，其产酶活力可达121.62U/ml。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用灰平链霉菌Streptomyces griseoplanus(以下称S.griseoplanus)S501固态发酵生产外切菊粉酶的方法。
本发明是发明人在自行申请的申请号为201310691141.8的发明专利的基础上进一步研究。发明人在实践中发现，液态发酵方法耗时、耗力，而且由于采用菊粉作为碳源，成本高，不适合工业化生产，故而发明人试图改用固态发酵的方法生产内切菊粉酶，但是实验中意外的发现采用发明人实验中的一种方法最终产物不是内切菊粉酶，而是外切菊粉酶，而且外切菊粉酶酶活大幅度提高，达到了出乎预料的技术效果，具有显著的进步。外切菊粉酶水解产物为高纯度果糖，是比蔗糖更为优秀的甜味剂、功能性食品原料和添加剂，而传统方法生产的外切菊粉酶，酶活低、成本高，且工艺方法复杂，本发明恰恰克服了上述缺陷，提供了一种工艺简单、酶活高、成本低的生产外切菊粉酶的方法。
本发明的技术方案如下：利用灰平链霉菌Streptomyces griseoplanus S501固态发酵生产外切菊粉酶的方法，该固态发酵方法包括以下步骤：将菌株S501冻干粉以无菌水配成菌悬液，用无菌签子蘸取适量于选择培养基上，在28℃下培养3-5d，将孢子刮下，置于无菌水中稀释至孢子菌悬液浓度为106cfu/mL，孢子菌悬液按8.0～12.0％(v/w)的接种量接入固态发酵培养基中，所述的接种量是指 孢子菌悬液体积(ml)与固态发酵培养基的质量(g)的比例；于28℃静止培养3-6d；待发酵结束后，以干重计，每克固态发酵培养基基质加入5mL去离子水，振荡提取1h，用纱布过滤，将滤液于4℃，转速8000rpm/min离心20min得到含外切菊粉酶的上清液，将上清液按常规冷冻干燥法制得外切菊粉酶；
所述的固态发酵培养基基质为麸皮，碳源为菊粉、大蒜皮粉、大蒜粉、洋葱粉、韭菜粉、香蕉皮粉和玉米粉中的一种，优选大蒜皮粉，可达到出乎意料的效果，相比采用大蒜粉、洋葱粉、韭菜粉、香蕉皮粉和玉米粉作为碳源，使用大蒜皮粉为碳源时，产物酶活分别较之提高了14.22％、28.44％、44.23％、50.55％和20.54％，优势相当明显。
进一步的，培养条件为：孢子菌悬液按11.6％(v/w)的接种量接入固态发酵培养基中，发酵时间141h，期间翻曲3-4次，所得菊粉外切酶酶活最高可达到209.63±0.96U/g。
在一个优选的实施方案中，所述的选择培养基由包括以下含量的组分组成：
所述的选择培养基pH为7.2，于112℃高压灭菌20min。
在一个优选的实施方案中，所述的固态发酵培养基由包括以下含量的组分组成：
将所述的固态发酵培养基于112℃高压灭菌20min。
在另一个优选的实施方案中，所述的固态发酵培养基具体为：
固态发酵培养基pH为8.0～9.0，固液比为1:1.4～1.5，于121℃高压灭菌20min；所述固液比即每1g麸皮加入1.4～1.5ml溶液，该溶液具体由NH4NO3、NaCl、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O和去离子水组成，每1L去离子水中含NH4NO3 0.42～0.83g，NaCl 0.42g，K2HPO4·3H2O 0.42g，MgSO4·7H2O 0.42g，FeSO4·7H2O 0.008g，大蒜皮粉与固态发酵基质麸皮的质量比为0.048～0.1:1。
发明人采用麸皮作为固态发酵的基质，将廉价易得的大蒜皮粉，大蒜粉，洋葱粉，韭菜粉，香蕉皮粉和玉米粉作为碳源，诱导菌株S501产菊粉酶，尤其是在基质中添加大蒜皮粉可显著提高外切菊粉酶活性，达到出乎意料的技术效果，这是因为外切菊粉酶是一种诱导酶，需要含菊粉的植物作为碳源进行诱导，大蒜皮粉的组分中含有一定量的菊粉，因此可以诱导产生外切菊粉酶，而且效果显著。
进一步的，上述的固态发酵培养基具体为：固态发酵培养基pH为9.0，固液比为1:1.4，于121℃高压灭菌20min，所述固液比即每1g麸皮加入1.4ml溶液，每1L去离子水中含NH4NO30.42g，NaCl 0.42g，K2HPO4·3H2O 0.42g，MgSO4·7H2O 0.42g，FeSO4·7H2O 0.008g，大蒜皮粉与固态发酵基质麸皮的质量比为0.048:1。
发明人发现不同氮源对菌株产外切菊粉酶酶活的影响不同，并对比了无机氮源和有机氮源(添加量分别占固态发酵基质麸皮的0.1％，保持培养基的其他组分不变)，发现无机氮源和有机氮源对菌株S501产酶活性影响差异显著。总体来说，无机氮源对产酶活性提高是有明 显的促进作用，而在无机氮源中，NH4NO3对菌株S501提高产酶活性影响最为显著，平均酶活性可达169.92U/g。
关于温度，温度是影响微生物菌株发酵的重要因素之一，不同产菊粉酶微生物菌株均有其最适的产酶温度，发明人考察了菌株S501在不同温度下对产酶活性影响，结果发现，在26～34℃范围内，菌株S501产酶活性差异明显。
关于培养基的pH，固态发酵培养基中的pH可以影响菊粉酶的合成，通过调整发酵培养基中所加的少量营养液的pH来间接调整，该营养液成分中含有NH4NO3、NaCl、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O和FeSO4·7H2O，当pH＝9.0时，酶活达到最高。
关于固态发酵培养基的固液比，固液比是影响微生物菌株固态发酵的另一重要因素。合适的固液比将利于菌株产酶活性。含水量过高会使基质粘结成团，影响氧气的传递和发酵热的散失，含水量过低，则会导致营养物质不能充分溶解，而不能给微生物生长提供适宜的水分和养分，当固态发酵培养基的固液比为1:1.4时为最佳培养条件。
关于接种量，接种量直接影响到菌株产酶量和活性。接种量过大，将导致菌体浓度过高，在固定条件下，将可能造成营养需求缺乏和生长空间不足，而影响产酶量和活性；反之，如接种量过低，虽然营养和生长空间得以满足，但由于菌体浓度过低，则导致菌株代谢或合成产物能力不足，而使产酶量和活性降低。因此，接种量也是影响固态发酵的重要因素。
关于发酵时间，不同菌株的产酶最大酶活出现时间有所不同，通常微生物菌株在对数生长期产酶量和酶活性较高。单因素影响研究发现，随着发酵时间的增加，酶活性逐渐增加，如图1所示在第144h时，酶活达到高峰，随后快速下降，这可能是菌株S501在第144h进入生长对数期，而第144h后，进入生长稳定期或衰退期，由于营养成分大量消耗，导致产酶量和酶活急剧下降，根据响应面实验方法优化，当发酵时间141h为最佳条件。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1.本发明采用麸皮作为固态发酵基质，利用菌株S.griseoplanus S501采用固态发酵法生产外切菊粉酶。
2.本发明对产酶酶活进行了优化，得到灰平链霉菌S.griseoplanus S501最佳培养基配方和培养条件，尤其是使用大蒜皮粉的外切菊粉酶酶活最高可达到209.63±0.96U/g，是优化前的1.4倍。相比采用大蒜粉、洋葱粉、韭菜粉、香蕉皮粉和玉米粉作为碳源，其酶活分别提高了14.22％、28.44％、44.23％、50.55％和20.54％。
3.本发明采用廉价易得的大蒜皮粉为碳源，诱导菌株S501产外切菊粉酶，将常见的大蒜皮变废为宝，不仅显著提高外切菊粉酶活性，还克服了现有技术中使用菊粉生产菊粉酶的成本高的缺陷。
4.本发明采用固态发酵法生产外切菊粉酶，克服了液态发酵方法耗时、耗力，不适合工业生产的缺陷。
附图说明
图1为发酵时间对产酶活性影响。
具体实施方式
下面以具体实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但本发明不以任何形式受限于实施例内容。
如无特殊说明，本发明所用的仪器和试剂包括：菊粉，由大连佐源集团提供；蔗糖、3,5-二硝基水杨酸(DNS)均购自大连；其他试剂均为分析纯试剂。
Hf safe-1200超净工作台：上海力申科学仪器有限公司；电子精密天平：赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；离心机H-2050R：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；紫外可见分光光度计UV-9200型北京瑞利分析仪器公司；恒温水浴锅：巩义市予华仪器有限责任公司；电子万用炉：北京市永光明医疗仪器厂；全温振荡培养箱HZQ-F160：哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；电热恒温鼓风干燥；DHG-9053A：上海精宏实验设备有限公司。
果糖标准曲线的制备：
分别取1mg/mL果糖标准液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mL于试管中，加蒸馏水定容至2.0mL，分别加入DNS溶液1.5mL，混匀，沸水浴反应5min，冷却至室温，定容至25.0mL，混匀，在540nm下测定吸光度值，以果糖含量为横坐标，吸光值(Abs)为纵坐标，绘制果糖标准曲线。
DNS菊粉酶酶活测定：
采用DNS法测定，取3次平行实验的平均值，果糖标准曲线法计算还原糖含量。同时，以不接种的固态发酵培养基做对照。菊粉酶活力单位定义为：50℃条件下，菊糖每分钟转化生成1μmol还原糖所需的酶量为1个酶活力单位(U)。
式中，m1：果糖含量(mg)，
1000：转换因子， 
V1：反应酶液体积(mL)，
V2：体系中加水量(mL)，
m2：固体基质质量(g)。
实施例1
1.菌种培养
将菌株S501冻干粉以无菌水配成菌悬液，用无菌签子蘸取适量于选择培养基上在28℃下培养3-5d，用无菌小铲子将平板上孢子轻轻刮下，置于无菌水中稀释至孢子菌悬液浓度为106cfu/mL。
所述的选择培养基由包括以下含量的组分组成：
所述的选择培养基pH为7.2，于112℃高压灭菌20min。
2.外切菊粉酶制备
将上述菌悬液以8％(v/w)接种量接入固态发酵培养基，28℃静止培养6d；固态发酵培养基的组分为：
将上述固态发酵培养基于112℃高压灭菌20min，pH为8.0；待发酵结束后，以固态发酵基质干重计算，每克固态发酵培养基基质加入5ml去离子水，振荡提取1h，用四层纱布过滤，将滤液于4℃，转速8000rpm/min离心20min得到含外切菊粉酶的上清液，将上清液进行DNS法酶活性测定为150.24±1.16U/g。
实施例2
1.菌种培养
将菌株S501冻干粉以无菌水配成菌悬液，用无菌签子蘸取适量于选择培养基上在28℃下培养3-5d，用无菌小铲子将平板上孢子轻轻刮下，置于无菌水中稀释至孢子菌悬液浓度为106cfu/mL。
所述的选择培养基由包括以下含量的组分组成：
所述的选择培养基pH为7.2，于112℃高压灭菌20min。
2.外切菊粉酶制备
将上述菌悬液以8％(v/w)接种量接入固态发酵培养基，28℃静止培养6d；固态发酵培养基的组分为：
所述的固态发酵培养基pH为8.0，于121℃高压灭菌20min，待发酵结束后，以固态发酵基质干重计算，每克固态发酵培养基基质加入5ml去离子水，振荡提取1h，用四层纱布过滤，将滤液于4℃，转速8000rpm/min离心20min得到含外切菊粉酶的上清液，将上清液进行DNS法酶活性测定为148.99±1.09 U/g。
实施例3
1.菌种培养
将菌株S501冻干粉以无菌水配成菌悬液，用无菌签子蘸取适量于选择培养基上在28℃下培养3-5d，用无菌小铲子将平板上孢子轻轻刮下，置于无菌水中稀释至孢子菌悬液浓度为106cfu/mL。
所述的选择培养基由包括以下含量的组分组成：
所述的选择培养基pH为7.2，于112℃高压灭菌20min。
2.外切菊粉酶制备
将上述菌悬液以8.7％(v/w)接种量接入固态发酵培养基，28℃静止培养3d；固态发酵培养基的组分为：
所述的固态发酵培养基pH为8.0，固液比1:1.5，所述固液比即每1g麸皮加入1.5ml溶液，该溶液具体由NH4NO3、NaCl、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O和去离子水组成；大蒜皮粉与固态发酵基质麸皮的质量比为0.1:1。发酵期间翻曲3-4次，所述的固态发酵培养基于121℃高压灭菌20min，待发酵结束后，以固态发酵基质干重计算，每克固态发酵培养基基质加入5ml去离子水，振荡提取1h，用四层纱布过滤，将滤液于4℃，转速8000rpm/min离心20min得到含外切菊粉酶的上清液，将上清液进行DNS法酶活性测定为195.07±1.02U/g。
实施例4
1.菌种培养
将菌株S501冻干粉以无菌水配成菌悬液，用无菌签子蘸取适量于选择培养基上在28℃下培养3-5d，用无菌小铲子将平板上孢子轻轻刮下，置于无菌水中稀释至孢子菌悬液浓度为106cfu/mL。
所述的选择培养基由包括以下含量的组分组成：
所述的选择培养基pH为7.2，于112℃高压灭菌20min。
2.外切菊粉酶制备
将上述菌悬液以11.6％(v/w)接种量接入固态发酵培养基，28℃静止培养141h；固态发酵培养基的组分为：
所述的固态发酵培养基pH为9.0，固液比1:1.4，所述固液比即每1g麸皮加入1.4ml溶液，该溶液具体由NH4NO3、NaCl、 K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O和去离子水；大蒜皮粉与固态发酵基质麸皮的质量比为0.048:1。所述的固态发酵培养基于121℃高压灭菌20min，发酵期间翻曲3-4次，待发酵结束后，以固态发酵基质干重计算，每克固态发酵培养基基质加入5ml去离子水，振荡提取1h，用四层纱布过滤，将滤液于4℃，转速8000rpm/min离心20min得到含外切菊粉酶的上清液，将上清液进行DNS法酶活性测定为209.63±0.96 U/g。
实施例5
1.菌种培养
将菌株S501冻干粉以无菌水配成菌悬液，用无菌签子蘸取适量于选择培养基上在28℃下培养3-5d，用无菌小铲子将平板上孢子轻轻刮下，置于无菌水中稀释至孢子菌悬液浓度为106cfu/mL。
所述的选择培养基由包括以下含量的组分组成：
所述的选择培养基pH为7.2，于112℃高压灭菌20min。
2.外切菊粉酶制备
将上述菌悬液以12.0％(v/w)接种量接入固态发酵培养基，28℃静止培养141h；固态发酵培养基的组分为：
所述的固态发酵培养基pH为8.0，固液比1:1.5，所述固液比即每1g麸皮加入1.5ml溶液，该溶液具体由NH4NO3、NaCl、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O和去离子水组成；大蒜皮粉与固态发酵基质麸皮的质量比为0.1:1。发酵期间翻曲3-4次，所述的固态发酵培养基于121℃高压灭菌20min，待发酵结束后，以固态发酵基质干重计算，每克固态发酵培养基基质加入5ml去离子水，振荡提取1h，用四层纱布过滤，将滤液于4℃，转速8000rpm/min离心20min得到含外切菊粉酶的上清液，将上清液进行DNS法酶活性测定为197.03±0.98 U/g。
碳源对产菊粉酶的影响
菊粉酶通常被认为是一种诱导酶，许多研究以含菊粉植物菊芋、菊苣等作为碳源对菌株进行产菊粉酶的诱导。本发明将麸皮作为固态发酵的基质，由于考虑到使用菊粉生产酶的成本较高，不适合工业生产，研究考察了较为廉价易得的大蒜皮粉，大蒜粉，洋葱粉，韭菜粉，香蕉皮粉和玉米粉作为碳源，诱导菌株S501产菊粉酶。从表1中可知，基质中添加大蒜皮粉可显著提高菊粉酶活性，而韭菜、大蒜、洋葱、玉米粉测酶活性均低于对照(仅含基质麸皮)，香蕉皮则表现较差。
表1不同碳源对产酶活性的影响
发明人又通过添加不同质量大蒜皮粉对酶活影响进行了探索(见表2)，从表2结果可见，在保持碳源总量不变的情况下，在固态发酵培养基基质麸皮中加入不同质量的大蒜皮粉，在添加量为4.5％-9.1％时(即大蒜皮粉与固态发酵基质麸皮的质量比为0.048～0.1:1)，可较显著提高产酶活性，但当添加量>10％时，酶活提高不明显，甚至抑制产酶活性。可见，大蒜皮粉(碳源)在此过程中可能是起到诱导菌株产酶的作用，但添加量过高，则不利于产菊粉酶。
表2添加不同质量大蒜皮粉对酶活的影响
以麸皮作为固态发酵基质，利用菌株S.griseoplanus S501采用固态发酵法生产外切菊粉酶，根据单因素影响条件，采用响应面实验方法对产酶酶活进行了优化，得到最佳培养基配方和培养条件为：固态基质麸皮与大蒜皮粉质量比为1：0.048，NH4NO3 0.42g/L，NaCl 0.42g/L，K2HPO4·3H2O 0.42g/L，MgSO4·7H2O 0.42g/L，FeSO4·7H2O 0.008g/L，pH 9.0；固液比1:1.4，灰平链霉菌S.griseoplanus S501的 孢子菌悬液的接种量11.6％(v/w)，发酵时间141h，期间翻曲3-4次，菊粉酶平均酶活可达到209.63±0.96 U/g。
上述参照实施例对该固态发酵生产菊粉酶的方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可根据所限定范围例举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属于本发明的保护范围之内。
参考文献
[1]Coitinho J B,Guimarase V M,De Almeida M N,et al.Characterization of an exoinulinase produced by Aspergillus terreus CCT 4083 grown on sugar cane bagasse[J].J Agr Food Chem，2010,(58):8386-8391.
[2]管晓冉,张德纯.功能性低聚糖生产工艺的研究现状[C].重庆市预防医学会2010年论文集，2010:380-384.
[3]袁文杰,任剑刚,赵心清,等.一步法发酵菊芋生产乙醇[J].生物工程学报,2008(11):1931-1936.
[4]Chen Xiong,Wang Jinhua,Li Dongsheng.Optimization of solid-state medium for the production of inulinase by Kluyveromyces S120 using response surface methodology[J].Biochemical Engineering Journal 2007,34:179-184. 
[5]Selvakumar P,Ashok Pandey.Solid state fermentation for the synthesis of inulinase from Staphylococcus sp.and Kluyveromyces marxianus[J].Process Biochemistry,1999,34:851-855. 
[6]Marcio Mazutt,i Joao Paulo Bender,Helen Treichel,etal.Optimization of inulinase production by solid-state fermentation using sugarcane bagasse as substrate[J].Enzyme and Microbial Technology,2006,39:56-59. 
[7]陈雄,王金华,李世杰.克鲁维酵母固体发酵高产菊粉酶的研究[J].食品科学,2005,26(10):54-57.

Claims (7)

1.一种利用灰平链霉菌Streptomyces griseoplanus S501固态发酵生产外切菊粉酶的方法，其特征在于，该固态发酵方法包括以下步骤：将菌株S501冻干粉以无菌水配成菌悬液，用无菌签子蘸取适量于选择培养基上，在28℃下培养3-5d，将孢子刮下，置于无菌水中稀释至孢子菌悬液浓度为106cfu/mL，孢子菌悬液按8.0～12.0％(v/w)的接种量接入固态发酵培养基中，于28℃静止培养3-6d；待发酵结束后，以干重计，每克固态发酵培养基基质加入5ml去离子水，振荡提取1h，用纱布过滤，将滤液于4℃，转速8000rpm/min离心20min得到含外切菊粉酶的上清液，将上清液按常规冷冻干燥法制得外切菊粉酶；
所述的固态发酵培养基基质为麸皮，碳源为菊粉、大蒜皮粉、大蒜粉、洋葱粉、韭菜粉、香蕉皮粉和玉米粉中的一种。
2.根据权利要求1所述的利用灰平链霉菌Streptomycesgriseoplanus S501固态发酵生产外切菊粉酶的方法，其特征在于，所述的碳源为大蒜皮粉。
3.根据权利要求1所述的利用灰平链霉菌Streptomycesgriseoplanus S501固态发酵生产外切菊粉酶的方法，其特征在于，培养条件为：孢子菌悬液按11.6％(v/w)的接种量接入固态发酵培养基中，发酵时间141h，期间翻曲3-4次，所得菊粉外切酶酶活最高可达到209.63±0.96U/g。
4.根据权利要求1所述的利用灰平链霉菌Streptomycesgriseoplanus S501固态发酵生产外切菊粉酶的方法，其特征在于，所述的选择培养基由包括以下含量的组分组成：
所述的选择培养基的pH为7.2，于112℃高压灭菌20min。
5.根据权利要求1所述的利用灰平链霉菌Streptomycesgriseoplanus S501固态发酵生产外切菊粉酶的方法，其特征在于，所述的固态发酵培养基由包括以下含量的组分组成：
将所述的固态发酵培养基于112℃高压灭菌20min。
6.根据权利要求1所述的利用灰平链霉菌Streptomycesgriseoplanus S501固态发酵生产外切菊粉酶的方法，其特征在于，所述的固态发酵培养基具体为：
固态发酵培养基pH为8.0～9.0，固液比为1:1.4～1.5，于121℃高压灭菌20min；所述固液比即每1g麸皮加入1.4～1.5ml溶液，该溶液具体由NH4NO3、NaCl、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O和去离子水组成，每1L去离子水中含NH4NO30.42～0.83g，NaCl0.42g，K2HPO4·3H2O 0.42g，MgSO4·7H2O 0.42g，FeSO4·7H2O 0.008g；大蒜皮粉与固态发酵基质麸皮的质量比为0.048～0.1:1。
7.根据权利要求6所述的利用灰平链霉菌Streptomycesgriseoplanus S501固态发酵生产外切菊粉酶的方法，其特征在于，所述的固态发酵培养基具体为：
固态发酵培养基pH为9.0，固液比为1:1.4，于121℃高压灭菌20min，所述固液比即每1g麸皮加入1.4ml溶液，每1L去离子水中含NH4NO30.42g，NaCl 0.42g，K2HPO4·3H2O 0.42g，MgSO4·7H2O0.42g，FeSO4·7H2O 0.008g；大蒜皮粉与固态发酵基质麸皮的质量比为0.048:1。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106676040A (zh) * 2016-12-16 2017-05-17 吉林农业大学 一种灰平链霉菌及其应用和微生物菌剂
CN111748489A (zh) * 2020-06-03 2020-10-09 曲阜师范大学 海洋灰平链霉菌hn60及其应用
CN114804330A (zh) * 2022-05-30 2022-07-29 水发规划设计有限公司 一种低碳源污水的果皮混凝剂外加碳源应用方法

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109207456A (zh) * 2018-10-19 2019-01-15 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种外切菊粉酶、其制备方法及应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH04144692A (ja) * 1990-10-03 1992-05-19 Mitsubishi Kasei Corp ジフルクトース・ジアンヒドリドｉの製造方法
CN103642738A (zh) * 2013-12-13 2014-03-19 大连民族学院 一株产内切菊粉酶的灰平链霉菌s501 及其培养方法和应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH04144692A (ja) * 1990-10-03 1992-05-19 Mitsubishi Kasei Corp ジフルクトース・ジアンヒドリドｉの製造方法
CN103642738A (zh) * 2013-12-13 2014-03-19 大连民族学院 一株产内切菊粉酶的灰平链霉菌s501 及其培养方法和应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ARUN DEV SHARMA等: "Inulinase production using garlic (Allium sativum) powder as a potential substrate in Streptomyces sp.", 《JOURNAL OF FOOD ENGINEERING》 *
ARUN DEV SHARMA等: "Purification and characterization of heat-stable exo-inulinase from Streptomyces sp.", 《JOURNAL OF FOOD ENGINEERING》 *
M. DILIPKUMAR等: "Optimization of Inulinase Production from Garlic by Streptomyces sp. in Solid State Fermentation Using Statistical Designs", 《BIOTECHNOLOGY RESEARCH INTERNATIONAL》 *
宫颖等: "微生物源菊粉酶的研究进展", 《食品安全质量检测学报》 *
张宁等: "发酵菊粉酶酶解大蒜渣的工艺研究", 《食品科技》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106676040A (zh) * 2016-12-16 2017-05-17 吉林农业大学 一种灰平链霉菌及其应用和微生物菌剂
CN106676040B (zh) * 2016-12-16 2019-11-26 吉林农业大学 一种灰平链霉菌及其应用和微生物菌剂
CN111748489A (zh) * 2020-06-03 2020-10-09 曲阜师范大学 海洋灰平链霉菌hn60及其应用
CN111748489B (zh) * 2020-06-03 2022-03-04 曲阜师范大学 海洋灰平链霉菌hn60及其应用
CN114804330A (zh) * 2022-05-30 2022-07-29 水发规划设计有限公司 一种低碳源污水的果皮混凝剂外加碳源应用方法

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