JPH08168375A - ピルベートオルトホスフェートジキナーゼ及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 低温域における保存に安定で、かつ、凍結・
融解などにも極めて安定な性質を有する新規ピルベート
オルトホスフェートジキナーゼであり、またミクロビス
ポーラ属に属し、ピルベートオルトホスフェートジキナ
ーゼ生産能を有する菌株を用いるピルベートオルトホス
フェートジキナーゼの製造方法である。 【効果】本酵素は、従来のピルベートオルトホスフェー
トジキナーゼに比べて、低温域での保存及び凍結・融解
に対して極めて安定であるので、保存した本酵素を、Ａ
ＭＰ、ピロリン酸、カルシウム、マグネシウム、アンモ
ニウムなどの測定などに用いれば、これらを精度よく測
定することが可能である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、低温域における保存安
定性及び凍結・融解操作に対する安定性に優れた、新規
なピルベートオルトホスフェートジキナーゼ及びピルベ
ートオルトホスフェートジキナーゼの製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ピルベートオルトホスフェートジキナー
ゼは、アデノシン５’−一リン酸（以下、ＡＭＰという
ことがある）とホスホエノールピルビン酸及びピロリン
酸から、アデノシン５’−三リン酸（以下、ＡＴＰとい
うことがある）とピルビン酸及びリン酸を生成する反応
を触媒する酵素である。そして、該酵素は、例えばピロ
リン酸の定量などに用いられている（特開昭６１−１２
３００号公報）。ピルベートオルトホスフェートジキナ
ーゼは、動物、植物、微生物界に広く分布し、例えばプ
ロピオニバクテリウム・シェルマニ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｈｅｒｍａｎｉｉ）由来のもの
として、〔Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １０，７２１−
７２９ （１９７１）、（以下、文献１という）〕、バ
クテロイデス・シンビオサス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ
ｓｙｍｂｉｏｓｕｓ）由来のものとして、〔Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ４２，１９９−
２１２（１９７５）、（以下、文献２という）〕及び
〔Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ
１２５，５３１−５３９ （１９７１）、（以下、文献
３という）〕、トウモロコシ葉由来のものとして、〔Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １２，２８６２−２８６７
（１９７３）、（以下、文献４という）〕、フラベリア
（Ｆｌａｖｅｒｉａ）由来のものとして、〔Ｐｌａｎｔ
ａｎｄＣｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ３１，２９
５−２９７ （１９９０）、（以下、文献５とい
う）〕、アセトバクター・キシリナム（Ａｃｅｔｏｂａ
ｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｍ）由来のものとして、〔Ｊｏ
ｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １０
４，２１１−２１８ （１９７０）、（以下、文献６と
いう）〕及びサトウキビ葉由来のものとして、〔Ｔｈｅ
ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＪｏｕｒｎａｌ １１４，１
１７−１２５ （１９６９）、（以下、文献７とい
う）〕などが挙げられる。一般に、酵素を、前記のごと
くある物質の定量に用いたり、他の種々の目的に使用す
る場合、その酵素を採取後、使用時までに一旦低温ある
いは凍結などの状態で保存されることが多い。このた
め、使用酵素には低温域での安定性、凍結・融解に対す
る安定性が要求されている。

【０００３】しかしながら、これまで知られているピル
ベートオルトホスフェートジキナーゼは、通常の他の酵
素の有する性質とは異なり、いずれも低温域で失活する
か、凍結・融解時に失活するか、あるいは低温域及び凍
結・融解時のいずれにおいても失活するなどこれら安定
性に欠けている（詳細については後述する）。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
従来のピルベートオルトホスフェートジキナーゼが有す
る欠点がない、低温域における保存に安定で、かつ、凍
結・融解などにも耐え得る安定性の高い性質を有する新
規なピルベートオルトホスフェートジキナーゼを得るこ
と、及びピルベートオルトホスフェートジキナーゼの効
率的な製造方法を提供することを目的としてなされたも
のである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記目的
を達成するために鋭意研究を重ねた結果、ある微生物が
低温域及び凍結・融解などにも極めて安定な新規なピル
ベートオルトホスフェートジキナーゼを生産すること、
及びミクロビスポーラ属に属する菌株が、ピルベートオ
ルトホスフェートジキナーゼを効率よく生産することを
見出し、これらの知見に基づいて本発明を完成するに至
った。

【０００６】すなわち、本発明は、下記の理化学的性質
を有するピルベートオルトホスフェートジキナーゼであ
る。 （１）作用：マグネシウムイオン存在下で、アデノシン
５’−一リン酸、ホスホエノールピルビン酸及びピロリ
ン酸に作用して、アデノシン５’−三リン酸、ピルビン
酸及びリン酸を生ずる反応を触媒し、その逆の反応も触
媒する。

【０００７】（２）基質特異性：アデノシン５’−一リ
ン酸に特異的に作用し、イノシン５’−一リン酸、シチ
ジン５’−一リン酸、グアノシン５’−一リン酸、チミ
ジン５’−一リン酸又はウリジン５’−一リン酸に作用
しない。また、アデノシン５’−三リン酸に特異的に作
用し、イノシン５’−三リン酸、シチジン５’−三リン
酸、グアノシン５’−三リン酸、チミジン５’−三リン
酸又はウリジン５’−三リン酸に作用しない。

【０００８】（３）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：至適ｐ
Ｈは、６．５〜７．０であり、安定ｐＨ範囲は、３７
℃、６０分間処理で、ｐＨ６．０〜１１．０である。

【０００９】（４）作用適温の範囲：作用適温の範囲
は、５０〜６０℃である。

【００１０】（５）ｐＨ、温度などによる失活の条件：
ｐＨ５．５以下及びｐＨ１２以上では６５％以下に失活
し、ｐＨ７．５で３０分処理したときの熱安定性は、０
〜６０℃で安定であるが７０℃以上では完全に失活し、
また、氷中（０℃）で少なくとも２４時間の保存におい
ても安定であり、かつ、凍結及び融解による失活がみら
れない。

【００１１】（６）阻害、活性化及び安定化：Ｈｇ⁺⁺、
Ａｇ⁺、Ｚｎ⁺⁺ によって強く阻害され、またＦｅ⁺⁺、Ｃ
ｕ⁺⁺、Ｃａ⁺⁺、Ｍｎ⁺⁺及びピルビン酸によっても阻害さ
れ、ＮＨ₄ ⁺によって強く活性化される。

【００１２】（７）分子量 約２３０，０００（ゲルろ過法）。また、本発明は、ミ
クロビスポーラ属に属し、ピルベートオルトホスフェー
トジキナーゼ生産能を有する菌株を培地に培養し、その
培養物からピルベートオルトホスフェートジキナーゼを
採取することを特徴とするピルベートオルトホスフェー
トジキナーゼの製造方法である。

【００１３】以下、本発明について具体的に説明する。
まず、本発明の新規なピルベートオルトホスフェートジ
キナーゼ（以下、本酵素ということもある）の理化学的
性質は下記のとおりである。 （1）作用：３ｍＭ 硫酸マグネシウム、２５ｍＭ 硫
酸アンモニウム、２ｍＭ ２メルカプトエタノール、２
ｍＭ ピロリン酸、２ｍＭ ホスホエノールピルビン酸
及びＡＭＰ ０．１ｍＭを含む５０ｍＭ ＢＩＳ−ＴＲ
ＩＳ ＰＲＯＰＡＮＥ緩衝液（ｐＨ６．８）１８０μｌ
をマイクロチューブに採って反応系として用い、温度平
衡を３７℃に到達させた後、本酵素０．００２９単位
（Ｕ）を加え、９０分間反応させ、沸騰水中で３分間煮
沸して反応を止め、この反応液中に生成したＡＴＰを、
後記の力価の測定法に従い測定したところ、１．８×１
０^-8ｍｏｌであった。また、生成したピルビン酸及びリ
ン酸を公知の方法で定量したところ、それぞれ２．０×
１０^-8ｍｏｌ、１．８×１０^-8ｍｏｌであった。このこ
とから、

【００１４】

【化１】

【００１５】で示されるごとく、本酵素は、マグネシウ
ムイオン存在下で、ＡＭＰ、ホスホエノールピルビン酸
及びピロリン酸に作用して、ＡＴＰ、ピルビン酸及びリ
ン酸を生ずる反応を触媒することが認められた。なお、
生成したピルビン酸の定量は、乳酸脱水素酵素を用い
て、ＮＡＤＨの減少量を吸光度変化量によって、そして
リン酸は、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、キサン
チンオキシダーゼにより、無機リン酸から生じた過酸化
水素をパーオキシダーゼ及び色素を用いて比色定量して
求めた。

【００１６】（２）基質特異性：ヌクレオチド一リン酸
を基質としたとき、反応によって生ずるヌクレオチド三
リン酸を高速液体クロマトグラフィーによって検出し、
定量して基質特異性を調べた結果、本酵素は、ＡＭＰに
特異的に作用し、他のヌクレオチド一リン酸、例えばイ
ノシン５’−一リン酸（以下、ＩＭＰという）、シチジ
ン５’−一リン酸（以下、ＣＭＰという）、グアノシン
５’−一リン酸（以下、ＧＭＰという）、チミジン５’
−一リン酸（以下、ＴＭＰという）又はウリジン５’−
一リン酸（以下、ＵＭＰという）に作用しない。また、
本酵素は、逆反応において、ＡＴＰに特異的に作用し、
他のヌクレオチド三リン酸、例えばイノシン５’−三リ
ン酸（以下、ＩＴＰという）、シチジン５’−三リン酸
（以下、ＣＴＰという）、グアノシン５’−三リン酸
（以下、ＧＴＰという）、チミジン５’−三リン酸（以
下、ＴＴＰという）又はウリジン５’−三リン酸（以
下、ＵＴＰという）に作用しない。本酵素の各種基質に
対する相対活性を調べた一例を表１に示す。

【００１７】

【表１】

【００１８】（３）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：本酵素
の至適ｐＨは、５０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．３〜
５．８）及び５０ｍＭ ＢＩＳ−ＴＲＩＳ ＰＲＯＰＡ
ＮＥ緩衝液（ｐＨ６．１〜８．５）を用い、生成するＡ
ＴＰの量を後記の力価の測定法に従って各ｐＨにおける
本酵素の活性測定を行なって求めた。その結果は図１に
示すとおりであり、本酵素の至適ｐＨはｐＨ６．５〜
７．０である。なお、図１中に示すマークで、○印は、
５０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．３〜５．８）を、△
印は５０ｍＭ ＢＩＳ−ＴＲＩＳ ＰＲＯＰＡＮＥ緩衝
液（ｐＨ６．１〜８．５）を用いたときの結果を示して
いる。

【００１９】また、安定ｐＨ範囲は、本酵素０．１２Ｕ
を含有する各種緩衝液、すなわち１００ｍＭ ＭＥＳ緩
衝液（ｐＨ５．５〜６．５）、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ
緩衝液（ｐＨ７．０〜８．０）、１００ｍＭ Ｔｒｉｃ
ｉｎｅ緩衝液（ｐＨ８．５〜９．０）、１００ｍＭ 炭
酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．１
〜１１．０）及び１００ｍＭ 炭酸水素ナトリウム−水
酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１１．３〜１１．９）の各
１００μｌを用い、ｐＨ５．５〜１１．９において、３
７℃で６０分間それぞれ処理した後、本酵素の残存活性
を調べた。その結果は図２に示すとおりであり、本酵素
の安定ｐＨ範囲は、ｐＨ６．０〜１１．０である。な
お、図２中に示すマークで、○印は１００ｍＭ ＭＥＳ
緩衝液（ｐＨ５．５〜６．５）を、▲印は１００ｍＭ
ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０〜８．０）を、×印は１
００ｍＭ Ｔｒｉｃｉｎｅ緩衝液（ｐＨ８．５〜９．
０）を、□印は１００ｍＭ 炭酸ナトリウム−炭酸水素
ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．１〜１１．０）を、また●
印は１００ｍＭ 炭酸水素ナトリウム−水酸化ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ１１．３〜１１．９）をそれぞれ用いた
ときの結果を示している。

【００２０】（４）力価の測定法： 生成するＡＴＰを発光法で定量する方法 ３ｍＭ 硫酸マグネシウム、２５ｍＭ 硫酸アンモニウ
ム、２ｍＭ ２メルカプトエタノール、２ｍＭ ピロリ
ン酸、２ｍＭ ホスホエノールピルビン酸及び０．１ｍ
Ｍ ＡＭＰを含む５０ｍＭ ＢＩＳ−ＴＲＩＳ ＰＲＯ
ＰＡＮＥ緩衝液（ｐＨ６．８）１８０μｌをマイクロチ
ューブにとり、温度平衡を３７℃に到達させた後、適当
な活性を有する酵素溶液２０μｌを加え、１５分間反応
させ、沸騰水中で３分間煮沸し反応を止める。この反応
液を適当に希釈したもの５０μｌを試験管にとり、そこ
に「ルシフェールＬＵ」（キッコーマン社製）溶液を５
０μｌ滴下し、発光量を測定する。別にあらかじめ既知
濃度のＡＴＰの標準溶液を用いて、その発光量との関係
を調べたグラフを用意する。このグラフを用いて、３７
℃で１分間あたりに生成されるＡＴＰのμｍｏｌを計算
し、この数字を使用酵素液中の活性単位とする。なお、
３７℃で１分間あたりに１μｍｏｌのＡＴＰを生成する
酵素量を１単位（Ｕ）とする。

【００２１】（５）作用適温の範囲：各種の温度（２５
〜７０℃）にて酵素反応させて生成したＡＴＰの量を前
記力価の測定法に従って本酵素の活性を測定した。その
結果は図３に示すとおりであり、本酵素の作用適温の範
囲は、５０〜６０℃である。

【００２２】（６）ｐＨ、温度などによる失活の条件：
本酵素は、３７℃で６０分間の処理では、前記のごとく
ｐＨ６．０〜１１．０で安定であり、図２からわかるよ
うに、それより酸性側及びアルカリ性側では急速に失活
し、ｐＨ５．５以下及びｐＨ１２以上では６５％以下に
失活する。また、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ
７．５）を用いて、本酵素を各温度（０〜７０℃）で３
０分処理したときの熱安定性を前記の力価の測定法に従
って調べた。その結果は図４に示すとおりであり、０〜
６０℃で安定であるが７０℃以上では完全に失活する。

【００２３】さらにまた、本酵素は、氷中（０℃）で少
なくとも２４時間の保存においても安定であり、かつ、
凍結及び融解による失活がみられない。例えば本精製酵
素０．０６Ｕ（０．０６ｍｇ／ｍｌの酵素液０．１ｍ
ｌ）を含有する５０ｍＭ カリウム−リン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６．８）を用いて氷中（０℃）で２４、４８及び７２
時間保存した後の各残存酵素活性を、また、本精製酵素
１．２Ｕ（１．２ｍｇ／ｍｌの酵素液０．１ｍｌ）を含
有する２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）を用
いて氷中（０℃）で１か月間、３か月間及び６か月間保
存した後の各残存酵素活性を、そしてまた凍結（−１８
〜−２０℃）させた本酵素液を２０℃で融解する操作を
繰り返したときの残存酵素活性をそれぞれ調べた。その
結果は表２に示すとおりであり、氷中（０℃）で保存し
た後の残存酵素活性は、いずれも１００％であり、ま
た、１０回凍結・融解を繰り返しても残存酵素活性は１
００％であり失活がみられず、上記のいずれの条件にお
いても極めて安定である。

【００２４】

【表２】

【００２５】（７）阻害、活性化及び安定化：５０ｍＭ
ＢＩＳ−ＴＲＩＳ ＰＲＯＰＡＮＥ緩衝液（ｐＨ６．
８）に、本酵素及び種々の添加剤（金属塩）を各３ｍＭ
の濃度になるように溶解し、３７℃で１５分間反応を行
なった後、前記の力価の測定法に従って測定した。その
結果は、表３に示すとおりであり、本酵素はＨｇ⁺⁺、Ａ
ｇ⁺、Ｚｎ⁺⁺によって強く阻害され、またＦｅ⁺⁺、Ｃｕ
⁺⁺、Ｃａ⁺⁺、Ｍｎ⁺⁺によっても阻害される。このほか
に、本酵素はピルビン酸によっても阻害され、例えば２
ｍＭのピルビン酸によって残存活性は５３％となる。一
方、本酵素はＮＨ₄ ⁺によって強く活性化され、例えば
６．２５ｍＭ 硫酸アンモニウムを添加した場合の相対
活性は、無添加区を１００としたとき、９９０となる。
なお、本酵素はバッファー中でも安定であるが、グリセ
ロール、牛血清アルブミンによってさらに安定化され
る。

【００２６】

【表３】

【００２７】（８）精製方法：本酵素の単離、精製は常
法に従って行うことができ、例えば硫安塩析法、有機溶
媒沈殿法、イオン交換体などによる吸着処理法、イオン
交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲ
ルろ過クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、
アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動法などが
単独又は適宜組み合わせて用いられる。

【００２８】（９）分子量 ＴＳＫゲル Ｇ３０００ＳＷ_XLカラム（東ソー社製）を
用いたゲルろ過法で、０．３Ｍ 硫安含有２０ｍＭ Ｈ
ＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）中で測定した結果、本酵
素の分子量は、約２３０，０００であった。なお、ＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量は
約９１，０００であるため、本酵素は、２量体と考えら
れる。

【００２９】本酵素の主要な理化学的性質は前記のとお
りであるが、この酵素が新規なピルベートオルトホスフ
ェートジキナーゼである根拠を次に示す。本酵素及び前
記した公知のピルベートオルトホスフェートジキナーゼ
の氷中（０℃）保存時の残存活性及び凍結・融解安定性
について前記の表２にまとめて示す。なお、表２中、本
酵素の氷中（０℃）及び凍結・融解の操作をした際の各
残存酵素活性の測定は、前記〔（６）ｐＨ、温度などに
よる失活の条件〕に記載したとおりであるが、本酵素以
外のデータは、前記の各文献に記載された事項を引用し
た。また、同表中の「凍結・融解安定性」の欄におい
て、各文献の記載に基づき、凍結融解の操作に耐えるも
のを＋、ほとんど失活するものを−で示した。

【００３０】表２から、前記した公知のピルベートオル
トホスフェートジキナーゼは、氷中（０℃）で保存した
とき及び／又は凍結・融解の操作によって失活を受ける
のに対して、本酵素は、氷中（０℃）で保存したときの
残存酵素活性が極めて高く、かつ、凍結・融解の操作に
対しても失活がみられないことなどから、前記の公知ピ
ルベートオルトホスフェートジキナーゼとは全く異なる
新規なピルベートオルトホスフェートジキナーゼである
ことがわかる。

【００３１】次に本発明におけるピルベートオルトホス
フェートジキナーゼの製造法について述べる。まず、本
発明の製造方法で使用される微生物は、ミクロビスポー
ラ属に属し、前記のピルベートオルトホスフェートジキ
ナーゼ生産能を有する菌株であって、その具体例として
は、ミクロビスポーラ・サーモローザ（Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｓｐｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｒｏｓｅａ）ＩＦＯ １４０
４７〔Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ
ｙ，Ｊａｎ．１７８−１７９ （１９９１）及びＪｏｕ
ｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
ｏｇｙ（１９９０），１３６，１９０５−１９１３によ
れば、ミクロビスポーラ・ローザ・サブスピーシーズ・
アエラタ（Ｍｉｃｒｏｂｉｓｐｏｒａ ｒｏｓｅａ ｓ
ｕｂｓｐ．ａｅｒａｔａ）に分類が変更されている〕な
どが挙げられ、該菌株の変種又は変異株も用いられる。
なお、本発明の製造方法におけるピルベートオルトホス
フェートジキナーゼとしては、前記した本発明の新規な
ピルベートオルトホスフェートジキナーゼに限定される
ことなく、ピルベートオルトホスフェートジキナーゼで
あればどのようなものでもよい。そして前記の微生物
は、このようなピルベートオルトホスフェートジキナー
ゼを得るための一例であって、本発明においては、ミク
ロビスポーラ属に属し、ピルベートオルトホスフェート
ジキナーゼ生産能を有する菌株であれば全て使用でき
る。

【００３２】次に、ピルベートオルトホスフェートジキ
ナーゼ生産能を有する微生物を用いて、ピルベートオル
トホスフェートジキナーゼを製造するには、通常の固体
培地でも良いが、液体培養法が好適である。そして本発
明で使用される培地としては、炭素源、窒素源、無機
物、その他の栄養素を適宜含有しているものであれば、
合成培地又は天然培地のいずれでも使用できる。炭素源
としては、資化可能な炭素化合物であればよく、例えば
グルコース、マルトース、デンプン加水分解物、グリセ
リン、フラクトース、糖蜜などを使用できるが、本発明
においては、炭素源として乳酸を含有する培地で培養し
たときに、本酵素を最も収量良く得ることができる。ま
た、窒素源としては、利用可能な窒素化合物であればよ
く、例えば酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンス
チープリカー、大豆粉、アミノ酸、カザミノ酸、硫安、
硝酸アンモニウムなどを使用することができる。その他
必要により、食塩、硫酸第一鉄、塩化カリウム、リン酸
一カリウム、リン酸二カリウム、硫酸マグネシウム、塩
化マンガン、炭酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなどの種
々の塩類、ビタミン類、消泡剤などが使用される。これ
らの栄養源は、それぞれ単独で用いることもでき、また
適宜組み合わせて用いることもできる。

【００３３】このようにして調製した液体培地を用い
て、ピルベートオルトホスフェートジキナーゼを製造す
るには、無通気で攪拌深部培養してもよいが、通気攪拌
深部培養又は振盪培養などにより好気的に培養するのが
好ましい。その際、培養開始ｐＨを６〜８程度、好まし
くはｐＨ７付近に調製し、３０〜５０℃、好ましくは４
５℃付近の温度で１２〜７２時間培養する。このように
することによって、培養物中にピルベートオルトホスフ
ェートジキナーゼが生産、蓄積する。この培養物からピ
ルベートオルトホスフェートジキナーゼを採取するに
は、通常の酵素採取手段を用いることができる。

【００３４】ピルベートオルトホスフェートジキナーゼ
は、主として菌体中に存在するため、培養物から、例え
ばろ過、遠心分離などの操作により菌体分離し、菌体を
集め、この菌体から該酵素を採取するのが好ましい。そ
して、常法、例えば超音波破砕機、フレンチプレス、ダ
イナミル、などの種々の破壊手段を用いて菌体を破壊す
る方法、リゾチームなどの細胞壁溶解酵素を用いて菌体
細胞壁を溶解する方法、トリトンＸ−１００などの界面
活性剤を用いて菌体から酵素を抽出する方法などを単独
又は組合せて採用することができる。次いで、ろ過、遠
心分離などにより細胞壁断片などの不溶物及び核酸など
を除去し、ピルベートオルトホスフェートジキナーゼの
粗酵素液を得る。このようにして得られた粗酵素液から
ピルベートオルトホスフェートジキナーゼを必要により
単離するには、前記の精製方法が適用できる。

【００３５】

【発明の効果】本酵素は、低温域及び凍結・融解などに
も極めて安定な新規なピルベートオルトホスフェートジ
キナーゼであるので、従来できなかった低温域での保存
及び凍結による保存が可能なものである。そして前記の
条件で保存した本酵素を、ＡＭＰ、ピロリン酸、カルシ
ウム、マグネシウム、アンモニウムなどの測定に用いれ
ば、これらを精度よく測定することが可能であり、また
本酵素を用いれば、無細胞蛋白質合成系で用いられるア
ミノアシル転移ＲＮＡを効率よく供給することも可能で
ある。また、本発明の製造方法によれば、ピルベートオ
ルトホスフェートジキナーゼを効率よく製造することが
できる。

【００３６】

【実施例】次に、実施例により本発明をさらに詳細に説
明するが、本発明はこれらの例によってなんら限定され
るものではない。

【００３７】実施例１（本酵素の製造） 酵母エキス ０．２％、カザミノ酸 ０．２％、硫酸第
一鉄 ０．００１％、塩化カリウム ０．０５％、リン
酸二カリウム ０．１％、硫酸マグネシウム０．０５
％、乳酸 ０．３％からなる培地（ｐＨ７．０）５０ｍ
ｌを坂口フラスコ（５００ｍｌ容量）に入れて、１２１
℃で１５分間殺菌した。この培地に、ミクロビスポーラ
・サーモローザ（Ｍｉｃｒｏｂｉｓｐｏｒａｔｈｅｒｍ
ｏｒｏｓｅａ）ＩＦＯ １４０４７を接種し、これを４
５℃で一晩振盪培養して培養物を得た。この培養物５０
ｍｌを、前記と同一組成の培地１ｌを入れた５ｌ容坂口
フラスコ中に植えて一晩振盪培養して培養物を得た。こ
の培養物を、前記と同一組成の培地２０ｌを入れた３０
ｌのジャーファーメンター２基に５００ｍｌずつ植え、
通気量２０ｌ／分、攪拌速度３００ｒ．ｐ．ｍの条件で
４５℃で２４時間通気攪拌培養を行なった。培養終了
後、この培養物４０ｌからマイクローザ（旭化成工業社
製）を用いて菌体を集めた。この菌体の一部（２００
ｇ）に、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＭｇＳＯ₄、１ｍ
Ｍ ＤＴＴを含有する２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）（以下、緩衝液Ａという）を加え、菌体を十
分に懸濁して７００ｍｌとした。本酵素の精製は、この
菌体懸濁液７００ｍｌに対して、以下に示す操作により
行なった。

【００３８】ステップ １（粗酵素液の調製） 前記の菌体懸濁液７００ｍｌに、リゾチーム（ナガセ生
化学工業社製）８．７５ｇを加え、室温でゆるく攪拌し
ながら２時間放置した後、リン酸二アンモニウム２３．
１ｇを加え、さらに２時間室温で攪拌して菌体を破砕し
た。この破砕液を７０００ｒ．ｐ．ｍ、１５分間、遠心
分離して上清部分を集め、６２０ｍｌの液を得た。 ステップ ２（第一回目ＱＡＥ−セファデックス・クロ
マトグラフィー） 前記６２０ｍｌの液に、２ｇ／１００ｍｌの割合で硫安
を溶解させ、これをあらかじめ０．１５Ｍの硫安含有し
た前記緩衝液Ａ（ｐＨ７．５）で平衡化したＱＡＥ−セ
ファデックス樹脂約７００ｍｌに酵素を吸着させた。こ
れを０．１５Ｍ硫安を含んだ前記緩衝液Ａ（ｐＨ７．
５）で洗浄して不要な蛋白を除いた後、０．６Ｍ 硫安
を含んだ前記緩衝液Ａ（ｐＨ７．５）で溶出した。 ステップ ３（第二回目ＱＡＥ−セファデックス・クロ
マトグラフィー） 前記溶出液をホロファイバー限外濾過装置（ＰＡＮ１３
−ＤＸ、旭メディカル株式会社製）によって濃縮した
後、あらかじめ前記緩衝液Ａ（ｐＨ７．５）で平衡化し
たＱＡＥ−セファデックスを充填したカラム（直径６ｃ
ｍ×１５ｃｍ）にかけて酵素を吸着させた。次に０．１
５Ｍ 硫安を含んだ前記緩衝液Ａ（ｐＨ７．５）で洗浄
して不要な蛋白を除いた後、０．１５Ｍ 硫安を含んだ
前記緩衝液Ａ（ｐＨ７．５）と０．８Ｍ 硫安を含んだ
緩衝液（ｐＨ７．５）をつなぐことによってつくった濃
度勾配をもった緩衝液３ｌで溶出した。 ステップ ４（ブチルトヨパール・クロマトグラフィ
ー） 前記の活性部分を回収し、硫安を加え硫安濃度を１Ｍに
調整した後、あらかじめ１Ｍ硫安を含む前記緩衝液Ａ
（ｐＨ７．５）で平衡化したブチルトヨパール（東ソー
社製）を充填したカラム（直径４．５ｃｍ×１５ｃｍ）
にかけて酵素を吸着させた。これを前記緩衝液Ａ（ｐＨ
７．５）中の硫安濃度勾配（１．０Ｍから０Ｍ）をもっ
た緩衝液（ｐＨ７．５）１．２ｌによって溶出した。 ステップ ５（ゲルろ過クロマトグラフィー） 前記の活性部をアミコン社製限外濾過膜装置（分画１０
０００）で２ｍｌにまで濃縮し、このうち１００μｌを
あらかじめ０．３Ｍ硫安を含んだ２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ
緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＴＳＫゲルＧ３００
０ＳＷ_XLカラム（直径０．７６ｃｍ×３０ｃｍ×２本）
にかけてゲルろ過をおこなった。すべての酵素をゲルろ
過し、活性部を濃縮した。活性部を再び前記と同様のカ
ラムにかけてゲルろ過を行った。すべての酵素をゲルろ
過して溶出された活性画分５．４ｍｌを採取した。該画
分は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（図
５）により、均一と判断された本酵素の標品であり、全
タンパク量が６．６５ｍｇ、全活性が６６．０Ｕ、比活
性が９．９２Ｕ／ｍｇのものであった。この酵素を、氷
中（０℃）で６か月間保存したもの及び−１８〜−２０
℃で凍結し、２０℃の水浴で融解する操作を１０回繰り
返したものの活性は、いずれも全く低下していなかっ
た。

【００３９】実施例２（アンモニウムイオンの測定） ３ｍＭ 硫酸マグネシウム、２ｍＭ ２メルカプトエタ
ノール、２ｍＭ ピロリン酸、２ｍＭ ホスホエノール
ピルビン酸、０．１ｍＭ ＡＭＰ及び図６に示した０〜
２．５ｍＭ 硫酸アンモニウム、を含む５０ｍＭ ＢＩ
Ｓ−ＴＲＩＳＰＲＯＰＡＮＥ緩衝液（ｐＨ６．８）１８
０μｌをマイクロチューブに採り、これに実施例１で得
た本酵素の凍結・融解したもの５．４×１０^-5Ｕを含む
緩衝液２０μｌを加え、３７℃で１５分間反応させた
後、沸騰水中で３分間煮沸し反応を止めた。この反応液
を蒸留水で１万培に希釈したもの５０μｌを試験管に採
り、これに「ルシフェールＬＵ」（キッコーマン社製）
溶液を５０μｌ滴下し、生成したＡＴＰ量を発光量から
求めた。その結果、図６に示すごとく、硫酸アンモニウ
ムが０〜２．５ｍＭの範囲では、加えた硫酸アンモニウ
ム量（ｘ）と生成したＡＴＰ量（ｙ）との間には、極め
て高い相関（ｒ²＝０．９７９）があり、ｙ＝０．７３
７＋１．４７６ｘで示される比例関係が認められた。こ
のことから、本酵素の凍結・融解したものを用いても、
アンモニウムイオンを精度よく測定できることがわか
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】本酵素の至適ｐＨを示すグラフ。

【図２】本酵素の安定ｐＨ範囲を示すグラフ。

【図３】本酵素の作用適温の範囲を示すグラフ。

【図４】本酵素の熱安定性を示すグラフ。

【図５】本酵素の電気泳動によるバンドを示す図。

【図６】実施例２におけるＡＴＰ量と硫酸アンモニウム
量の関係（検量線）を示すグラフ。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記の理化学的性質を有するピルベートオ
   ルトホスフェートジキナーゼ。 （１）作用：マグネシウムイオン存在下で、アデノシン
   ５’−一リン酸、ホスホエノールピルビン酸及びピロリ
   ン酸に作用して、アデノシン５’−三リン酸、ピルビン
   酸及びリン酸を生ずる反応を触媒し、その逆の反応も触
   媒する。 （２）基質特異性：アデノシン５’−一リン酸に特異的
   に作用し、イノシン５’−一リン酸、シチジン５’−一
   リン酸、グアノシン５’−一リン酸、チミジン５’−一
   リン酸又はウリジン５’−一リン酸に作用しない。ま
   た、アデノシン５’−三リン酸に特異的に作用し、イノ
   シン５’−三リン酸、シチジン５’−三リン酸、グアノ
   シン５’−三リン酸、チミジン５’−三リン酸又はウリ
   ジン５’−三リン酸に作用しない。 （３）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：至適ｐＨは、６．５
   〜７．０であり、安定ｐＨ範囲は、３７℃、６０分間処
   理で、ｐＨ６．０〜１１．０である。 （４）作用適温の範囲：作用適温の範囲は、５０〜６０
   ℃である。 （５）ｐＨ、温度などによる失活の条件：ｐＨ５．５以
   下及びｐＨ１２以上では６５％以下に失活し、ｐＨ７．
   ５で３０分処理したときの熱安定性は、０〜６０℃で安
   定であるが７０℃以上では完全に失活し、また、氷中
   （０℃）で少なくとも２４時間の保存においても安定で
   あり、かつ、凍結及び融解による失活がみられない。 （６）阻害、活性化及び安定化：Ｈｇ⁺⁺、Ａｇ⁺、Ｚｎ
   ⁺⁺ によって強く阻害され、またＦｅ⁺⁺、Ｃｕ⁺⁺、Ｃａ
   ⁺⁺、Ｍｎ⁺⁺及びピルビン酸によっても阻害され、ＮＨ₄ ⁺
   によって強く活性化される。 （７）分子量 約２３０，０００（ゲルろ過法）。
2. 【請求項２】ミクロビスポーラ属に属し、ピルベートオ
   ルトホスフェートジキナーゼ生産能を有する菌株を培地
   に培養し、その培養物からピルベートオルトホスフェー
   トジキナーゼを採取することを特徴とするピルベートオ
   ルトホスフェートジキナーゼの製造方法。
3. 【請求項３】ピルベートオルトホスフェートジキナーゼ
   が、請求項１記載のピルベートオルトホスフェートジキ
   ナーゼである請求項２記載のピルベートオルトホスフェ
   ートジキナーゼの製造方法。