CZ279735B6 - Způsob kryoprezervace biologických, zejména rostlinných materiál ů - Google Patents

Abstract

Způsob kryoprezervace biologických, zejména rostlinných materiálů za použití mikroorganismů způsobujících nukleaci vzniku ledu. Krystalizačně aktivní bakterie jsou uchyceny v prostorové síti hydrogelu a to tak, že ani po důkladném omytí povrchu částic hydrogelu bakterie z nich neunikají. Bakterie uzavřené v částicích hydrogelu přicházejí s okolní kapalinou do styku jen prostřednictvím nerozpustného, bobtnavého hydrogelu.V částicích hydrogelu je uzavřeno velké množství nukleačně účinné. Pomoicí částic hydrogelu s nukleačně aktivními bakteriemi je zajištěna tvorba ledu vně buněk rostlinného materiálu aniž dojde k jejich kontaminaci. Teplotu nukleace lze volit podle specifické nukleační aktivity použitého kmene bakterií.ŕ

Description

Předmětem vynálezu je způsob kryoprezervace biologických, zejména rostlinných materiálů za použití činidel, způsobujících nukleaci vzniku ledu vně buněk biologického materiálu při teplotách mezi 0 °c a -8 °c, zvláště za použití nukleačně aktivních mikroorganismů. Kryoprezervace se obvykle provádí v ochranném roztoku suspenzního média, zabraňujícím zmrznutí letálního množství intracelulární vody. Nejčastěji se jako kryoprotektant používá 5% až 20% vodný roztok dimethylsulfoxidu (DMSO). V literatuře je popsán jednoduchý způsob takové kryoprezervace například meristémů rostlin, viz například Bajaj Y.P.S., Technology and prospects of cryopreservation of germplasm, Euphytica 28, 1979, 267 až 285. Velkou výhodou kryoprezervace ve srovnání s jinými způsoby uchovávání biologického materiálu je maximální dlouhodobé uchování genetických vlastností, což je zvlášů významné při množení in vitro.

V podchlazených rostlinných vzorcích je voda v metastabilním stavu, který vede k nekontrolovatelnému zmrznutí vody uvnitř buněk. Při kryoprezervaci biologických materiálů se přidáním nukleačního materiálu vyvolá mrznutí vody vně biologického objektu, následkem čehož dojde k tvorbě ledu i v mezibuněčném prostoru rostlinných tkání. Následným snižováním teploty se buňky stále více dehydratují, podle toho jaké množství vody vymrzá v mezibuněčném prostoru. Nukleaci ledu v rostlinných vzorcích blízko 0 °C se zabrání podchlazení a následnému spontánnímu mrznutí vody uvnitř buněk, které je pro ně vždy letální. Nutnost nukleace okolního média rostlinných meristémů při teplotě blízko snížení bodu mrznutí kryoprotektivního roztoku demonstrují Keefe, P.D. a Henshaw, G.G., A notě on the multiple role of artificial nucleation....Cryo-Letters 5,71 až 78, (1984). Iniciace extracelulárního mrznutí při vysokých záporných teplotách blízko 0 °C při následném pomalém ochlazování je nezbytná pro úspěšnou kryoprezervaci biologických objektů.

Krystaly ledu jsou nejúčinnější přirozený nukleátor. Používání krystalů ledu při kryoprezervaci má však různé nevýhody. Musí se otvírat kryonádobky se sterilním biologickým materiálem. Většina přístrojů vyráběných pro kryoprezervaci neumožňuje při zmrazování vzorků manipulaci a otevírání kryonádobek. Proto výrobci hlubokomrazicích zařízení vybavují přístroje pro kryoprezervaci tzv. auto-seed. Při zvolené záporné teplotě prudkým ochlazením kryonádobek krátkým vstřikem par tekutého dusíku se vyvolává nukleace ledu. Tento způsob má tu nevýhodu, že před vlastní nukleaci dochází k nekontrolovatelnému podchlazení.

Dalším způsobem vyvolání nukleace je přímý kontakt vychlazeného materiálu s kryonádobkou, nebo zavedení teplotního impulsu pomocí vodiče tepla k objektu určenému pro kryoprezervaci. Ani při tomto způsobu nelze zabránit nežádoucímu podchlazení před vlastním mrznutím.

Proti nevýhodám shora uvedených způsobů nukleace ledu má přidáni nukleační látky do kryoprotektivního média tu výhodu, že dochází k nukleaci při určité teplotě specifické podle použité nukleační látky. Většina chemických nukleačních přísad jako například jodid stříbrný je pro biologické objekty toxická.

-1CZ 279735 B6

V nedávné době byla objevena schopnost některých bakterií nukleovat tvorbu ledu při záporných teplotách. Některé vybrané kmeny bakterií Pseudomonas syringae a Erwinia herbicola mají teploty nukleace dokonce vyšší než nukleačně aktivní chemické látky. Vážným problémem při použití nukleačně aktivních bakterií je kontaminace biologicky aktivního materiálu. Některé z těchto baktérií žijí totiž normálně na povrchu neporušených listů aniž jim škodí, ale při porušení vnějších vrstev vnikají dovnitř a mohou být pro obnažené tkáně patogenní. Tím spíše mohou napadnout nejčastěji používané rostlinné materiály jako meristémy, které nemají ochrannou vrstvu. Tyto materiály, pěstované ve sterilních podmínkách in vitro při množení vyšlechtěných odrůd klonováním, nemohly proto být podrobeny uvedené kryoprezervaci za pomoci nukleačně aktivních bakterií.

Překvapujícím způsobem se ukázalo, že lze k tomuto účelu výhodně použít nukleačně účinné bakterie nebo jiné vhodné nukleačně aktivní látky, immobilizované v hydrogelu nerozpustném ve vodě. Použití imobilizovaných mikroorganismů nebo enzymů je v biotechnologii už delší dobu známé, nebylo však možno očekávat, že se tento způsob ukáže účinným i při kryoprezervaci, když částice, například kapky gelu obsahujícího bakterie byly před použitím důkladně opláchnuty vodou nebo vodnými roztoky, popřípadě disperzemi, takže kontaminace biologického materiálu immobilizovanými bakteriemi přitom nenastává. Použité hydrogely sice samy o sobě nemají nukleační účinky, ale neomezují prakticky nukleační účinek použitých nukleačně aktivních látek, a to ani po důkladném opláchnutí gelových částic, tyto látky obsahující.

Částice hydrogelu mohou mít libovolný tvar, například drobných kapek nebo kuliček, nebo i hranatý tvar vzniklý rozřezáním hydrogelové fólie nebo struny, do které byla nukleačně aktivní přísada vpravena před koagulací. Toho lze dosáhnout různým způsobem,například koagulací roztoku lineárního polymeru, jako je například kyselina algová (alginová), obsahující suspendovanou krystalizačně aktivní látku jako například bakterie Pseudomonas syringae, přidáním vícemocných iontů například vápenatých, které rozpuštěnou algovou kyselinu přemění v nerozpustný hydrogel. Jinou možnosti je suspendovat nukleačně aktivní látku jako je například jodid stříbrný, v roztoku vhodného polymeru jako je například kopolymer 90 dílů hydroxyethylmethakrylátu (prostého dimethakrylátu) s 10 díly methakrylonitrilu nebo akrylonitrilu ve směsi dimethylsulfoxidu a vody. Takto získaný viskozní roztok polymeru koaguluje v přebytečné vodě na nerozpustný hydrogel. Koagulaci lze provést například vytlačováním roztoku polymeru se suspendovaným nukleačně aktivním činidlem do přebytečné studené vody tryskou například v podobě tlusté struny, kterou lze po důkladném vyprání rozřezat na krátké kousky a před použitím znovu opláchnout

Ještě jiný použitelný způsob je suspendovat nukleačně aktivní látku ve vodném roztoku monomeru nebo směsi monomerů a potom monomer nebo monomery zpolymerovat přidáním vhodného iniciátoru nebo osvětlením. Polymeraci vodného roztoku lze provést i známým suspenzním (perličkovým) způsobem v kapalině nemísitelné s vodou, popřípadě použít některé jiné známé metody polymerace nebo kopolymerace suspenze nukleačně aktivní látky v monomerní směsi. Při použití mikroorganismů jako jsou bakterie rodu Psudomonas jsou

-2CZ 279735 B6 ovšem vhodné především takové metody, při nichž se mikroorganismy zachovají živé, protože mrtvé bakterie jsou méně nukleačně účinné .

Nejvhodnější hydrogely jsou takové, které si i po zmrznutí zachovají dostatečnou elasticitu, takže se vytvořením ledu uvnitř gelové kapky mechanicky neporuší. Nukleačně aktivní baktérie jsou uchyceny v prostorové síti hydrogelu, a to tak, že ani po důkladném omytí povrchu částic gelu bakterie z nich neunikají, částice, například kapky gelu s bakteriemi nebo s chemickým nukleačním činidlem se přidávají do kryoprotektivního média s biologickým objektem. Takto předem připravené vzorky se zmrazují a při teplotě odpovídající teplotě snížení teploty mrznutí kryoprotektivní látky dochází podle specifické teploty nukleace k tvorbě ledu. Nukleace ledu v kryoprotektivním médiu má za následek extracelulární vymrzání vody z biologických objektů. Spolehlivá nukleace při vysokých záporných teplotách je zajištěna i při poměrně malém počtu baktérií v povrchové vrstvě gelové částice, aniž dochází ke kontaminaci a poškození biologického materiálu. Nukleace začíná i uvnitř gelových částic a mrznutí pokračuje potom v okolní kapalině. Silně zbobtnalý gel sice udržuje zárodky nukleace jako například bakterie nehybné, ale nepřekáží styku kapaliny uvnitř gelu s okolní kapalinou. Bylo sice už dříve známo immobilizovat enzymy nebo bakterie uvnitř hydrogelů k různým účelům například k odbourání bílkovin způsobujících časem zákaly v pivu (viz například Petre D., Noel C. a Thomas D., A new method for cell immobilization, Biotechnology and Bioengineering 1978, 20, str. 124 až 134, nebo Toza T. et. al., Immobilization of enzymes and microbial cells using carageenen matrix, ibidem 1979, 21, str. 1697 až 1709, použití immobilizace mikroorganismů způsobujících nukleaci tvorby ledu však nebylo dosud popsáno, pravděpodobně proto, že na základě dosavadních znalostí nebylo možno očekávat, že kapky nebo jiné částice hydrogelu mohou být pro tento účel plně účinné.

Hlavní výhody tohoto vynálezu jsou: V kapce nebo jiné částici hydrogelu je uzavřeno velké množství nukleačně aktivních jednotek, například bakterií, které jsou i v tomto stavu nukleačně účinné, takže je nukleace zajištěna aniž dojde ke kontaminaci nebo k jinému poškození biologického materiálu. Teplotu nukleace lze volit podle použitého bakteriálního kmene, majícího specifickou teplotu nukleace ledu. Po odtáni biologických objektů se nukleační činidlo v podobě částic zbobtnalého gelu snadno odstraní. Další výhodou je, že se gelové kapky s bakteriemi dají opakovaně použit. Manipulace a dávkováni nukleačního agens jsou velmi snadné, také proto, že částice gelu jsou alespoň o jeden řád většího průměru než je samotné nukleační činidlo. Nežádoucí kontaminace nebo jiné poškození citlivého biologického materiálu se prakticky vyloučí, takže způsob kryoprezervace podle vynálezu ze s výhodou použít v rostlinné výrobě ve velkém měřítku. Takto lze prakticky využít poznatku, že kryoprezervací se uchovávají vlastnosti množených rostlin.

Příklad 1.

Metodika přípravy gelových kapek: 5 ml suspenze nukleačně aktivních bakterií rodu Pseudomonas syringae (Patent 278 277)

-3CZ 279735 B6 s koncentrací bakterií 10⁸ v 1 ml destilované vody bylo smícháno s 10 ml vodného roztoku alginátu sodného. Kapky roztoku byly zkoagulovány v 50 ml 0,1 M roztoku chloridu vápenatého. Takto vytvořené gólové kapky byly několikrát promyty v destilované autoklavované vodě.

Příklad 2.

Nukleační aktivita gelových kapek připravovaných podle příkladu 1 byla zkoušena v 30 kapkách destilované vody po 10 μΐ. Na obr. 1 je znázorněna nukleační aktivita samotné destilované vody (d), gelových kapek bez bakterií (c), gelových kapek s bakteriemi podle příkladu 1. (a) a gelových kapek s jodidem stříbrným (b).

Příklad 3

Nukleační aktivita gelových kapek s bakteriemi byla zkoušena v 30ti kapkách kryoprotektantu (12,5% roztoku dimethylsulfoxidu), objem kapky 10 μΐ. Na obr.2 je nukleační aktivita samotného kryoprotektantu 12,5% DMSO) (c), téhož kryoprotektantu s nuklečními bakteriemi v gelových kapkách podle příkladu 1 (a) a kryoprotektantu s jodidem stříbrným v gelových kapkách (b). Z naměřených výsledků je zřejmé, že bakterie immobilizované v gelových kapkách jsou nukleačně aktivní i v použitém kryoprotektivním roztoku. Nižší teplota nukleace ve srovnání s teplotou nukleace stejných bakterií v destilované vodě je způsobena nižší teplotou tuhnutí kryoprotektantu.

Kumulativní relativní spektra zmrznutí kapek byla získána pomocí diferenční scanning kalorimetrie při rychlosti snižování teploty 1 °C min“¹.

-4CZ 279735 B6

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (7)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob kryoprezervace biologických, zejména rostlinných materiálů za použití činidel způsobujících nukleaci vzniku ledu vně buněk biologického materiálu při teplotách mezi 0 °C a -8 °C zvláště za použití nukleačně aktivních mikroorganismů, vyznačující se tím, že nukleační činidla se aplikují uzavřena v částečkách zbobtnalého hydrofilního gelu nerozpustného ve vodném prostředí.
2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že částice hydrofilního gelu jsou alespoň o jeden řád většího průměru než je průměr jednotek nukleačního činidla.
3. 3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že částice hydrofilního gelu obsahujícího nukleační činidlo se před použitím opláchnou sterilní vodou nebo vodným prostředím.
4. 4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se používají hydrogely kovalentně nezesítěné nebo jen mírně zesítěné tak, že si při teplotách nukleace zachovají elasticitu chránící je před roztrháním tvořícím se ledem.
5. 5. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se hydrogel koaguluje v kapalinové suspenzi nukleačního činidla.
6. 6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že se do kapalné vodné suspenze nukleačního činidla přimísí za míchání v libovolném pořadí jednak roztok polymeru s ionogenními postranními skupinami, jednak roztok obsahující příslušné protiionty, tvořící s polymerem jeho ve vodě nerozpustnou sůl.
7. 7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že se jako protiionty použijí nejméně dvojmocné ionty, s výhodou ionty vápníku.

   1 výkres