JP6973731B2 - ヒト多能性幹細胞由来心筋細胞の凍結方法 - Google Patents
ヒト多能性幹細胞由来心筋細胞の凍結方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6973731B2 JP6973731B2 JP2017143628A JP2017143628A JP6973731B2 JP 6973731 B2 JP6973731 B2 JP 6973731B2 JP 2017143628 A JP2017143628 A JP 2017143628A JP 2017143628 A JP2017143628 A JP 2017143628A JP 6973731 B2 JP6973731 B2 JP 6973731B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- freezing
- sample
- temperature
- magnetic field
- hcm
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
前記心筋細胞に凍結保存液を加えてなる細胞懸濁液をサンプルとして、当該サンプルが収納された容器を漸次冷却して当該サンプルを凍結させる冷却ステップと、
前記冷却ステップの実行中に前記サンプルに対して交流磁場を印加する磁場印加ステップと、
を含み、
前記冷却ステップでは、前記凍結槽内に前記サンプルが収納された容器を配置した上で、前記凍結槽内の温度を初期温度T1から前記サンプルの凍結温度よりも低い温度T3まで冷却するとともに、前記温度T3に至る過程で前記サンプルが過冷却状態となる温度T2で所定時間維持するように前記凍結槽内の温度を制御し、
前記磁場印加ステップでは、前記サンプルに60Hzの周波数で磁束密度が0.5mT以上1.0mT以下の交流磁場を印加する、
ことを特徴とするヒト多能性幹細胞由来心筋細胞の凍結方法としている。
本発明の実施例は、ヒト多能性幹細胞から分化誘導された心筋細胞の凍結保存方法であり、解凍後の心筋細胞の生存率を飛躍的に高めることができる。そして本実施例の特徴の一つは、上記特許文献2や非特許文献3〜5にも記載されている、CAS(Cell Alive System:「CAS」「Cell Alive System」は登録商標)冷凍技術と呼ばれる技術を用いて心筋細胞を凍結させる点にある。
上述したように、CAS冷凍技術を医療や生物工学(バイオテクノロジー)分野で利用する例としては上記非特許文献3〜5に記載の凍結技術がある。とくに非特許文献3に記載の技術では、ヒトiPS細胞から分化誘導された神経幹細胞を凍結させている。そこで本発明者は、この非特許文献3に記載の技術は、ヒト多能性幹細胞由来心筋細胞を凍結する際の指標になり得ると考えた。そして非特許文献3には、神経幹細胞は30Hzの周波数で0.22mT〜0.40mT程度の交流磁場を印加しながら神経幹細胞を凍結させることで解凍後の神経幹細胞の生存率を最大で70%程度にまで高めることができることが記載されていた。また非特許文献3の記載内容から、磁束密度が0.5mT以上の高い磁場を印加すると却って生存率が低下することが分かった。
本発明の実施例に係るヒト多能性幹細胞由来心筋細胞の凍結方法では、iPS細胞由来の心筋細胞(以下、HCMとも言う)をCAS冷凍技術を用いて凍結させている。本実施例では、凍結槽内にCASエネルギーとして磁場を発生することができるとともに、凍結槽内の温度を可変制御できるプログラムフリーザー(Cells Alive-1:株式会社アビー製、以下、CAS冷凍装置とも言う)を用いてHCMを凍結させている。概略的には凍結保存液中にHCMを含ませた細胞懸濁液(以下、サンプルとも言う)が収納されたクライオチューブを上記のCAS冷凍装置の凍結槽内に配置することでHCMを凍結させている。なお凍結保存液としては、上記非特許文献6に記載されているジメチルスルホキシド(DMSO)を含む周知の細胞用の凍結保存液(例えば、STEM-CELLBANKER(登録商標)がよく知られている。そして本実施例は、凍結に至るサンプルの冷却手順や磁場の印加条件に特徴を有して解凍後のHCMの生存率を高めている。以下ではCAS冷凍装置の構成について説明し、その上で本実施例に係るHCMの凍結方法について説明する。
図1は実施例に用いたCAS冷凍装置1の概略構成を示す図である。図1(A)はCAS冷凍装置1の外観図であり、図1(B)はCAS冷凍装置1の機能ブロック構成の概略を示す図である。図1(A)に示したように、CAS冷凍装置1は、水平面に載置した状態で上下方向に長い箱状の冷凍装置本体(以下、本体10とも言う)と本体10とケーブル2で接続されて本体10の動作を制御したり、その動作状態を監視したりするための制御ユニット20とから構成されている。図1(B)に示したように、本体10は内部に凍結槽11、スターリング冷凍機12、熱交換器である冷却ヘッド13、ヒーター14、凍結槽11内の温度を監視する温度センサ15、および凍結槽11内に磁場を発生させるためのコイル16などを含んで構成されている。なおコイル16を構成する導線は上下方向を軸として凍結槽11の周囲に矩形状に巻回されている。また冷却ヘッド13は上面が凍結槽の底面を構成し、この冷却ヘッド13内にヒーター14と温度センサ15が組み込まれている。それによって凍結槽11内がこの冷却ヘッド13を介して直接冷却あるいは加温される。
本実施例に係るHCMの凍結方法の効果を確認するために、従来の方法で凍結させたサンプルと、CAS冷凍装置を用いて様々な磁場印加条件で凍結させたサンプルのそれぞれについて、解凍後のHCMの生存率を比較した。また凍結させずに培養したHCMの生存率も調べた。以下では、まず、従来の冷却手順とCAS冷凍装置を用いた冷却手段、およびサンプルの解凍手順について説明する。
従来の冷却手順としては、上記非特許文献2に記載されている細胞凍結容器を用いた方法がよく知られている。細胞凍結容器は樹脂製の有底円筒状の容器本体と、当該容器本体の開口を密封する樹脂製のキャップと、「バイアルホルダー」と呼ばれるサンプルホルダーから構成されている。細胞凍結容器を用いてサンプルを凍結させる手順としては、まずサンプルを収納したクライオチューブをサンプルホルダーの孔に保持させ、そのサンプルホルダーをイソプロピルアルコールを満たした容器本体内に収納する。そして容器本体の開口をキャップで密封し、細胞凍結容器を−80℃の温度に維持された凍結槽内に配置する。それによって、サンプルが1℃/min程度のゆっくりとした降温速度で冷却され凍結に至る。すなわち細胞凍結容器は、降温速度を精密に制御できないディープフリーザーを用いても、プログラムフリーザーを用いた周知の緩慢凍結法と同様の冷却手順でサンプルを凍結させることができる。
一方、本実施例に係るHMCの凍結方法では、図1に示した冷凍装置を利用し、凍結対象物にCASエネルギー(本実施例では、交流磁場)を印加しながら凍結対象物を冷却し凍結させることとしている。そしてCAS冷凍技術では、過冷却の状態で維持され、凝固が開始されるとほぼ瞬時に凍結されるというメカニズムに基づいて凍結対象物を凍結することから、CAS冷凍装置を用いて凍結させるサンプルについては、過冷却状態がより維持されやすいような手順で冷却している。概略的には、サンプルを凍結させる過程で、凍結槽内の温度(以下、庫内温度とも言う)を過冷却状態となる温度近傍で一定時間維持し、その後は徐々に庫内温度を下げてサンプルを凍結させることとしている。
次に、iPS細胞からHCMを分化誘導させ、そのHCMを異なる条件で凍結させ、そのHCMの解凍後に生存しているHCMの数を調べた。ここではクライオチューブ内の凍結保存液に、iPS細胞からの分化誘導後30日が経過したHCMを加えたものをサンプルとして用意し、各サンプルを異なる条件で凍結させた。また生物学的反復(Biological replicate、以下nと記す)を3(n=3)とした。すなわち同じ凍結条件ごとに3個のサンプルを用意した。そして、各サンプルを凍結状態で24時間保存した後、サンプルを解凍した。サンプルの解凍には、サンプルの入ったクライオチューブを予め37℃に温めておいた温水に浸漬させてサンプル中のHCMを融解させる周知の急速融解法を用いた。そして解凍直後、および解凍後のサンプル中から分離したHCMを48時間培養した時点で生存しているHCMの細胞数を心筋トロポニンT遺伝子(TNNT2)をマーカーとした免疫染色法を用いて数えた。なおサンプルの解凍方法やその後のHCMの培養方法については、上記非特許文献6に記載されている方法に従った。さらに比較例に係るサンプルとして、iPS細胞から分化誘導後30日が経過したHCMを凍結させずに48時間培養したものも用意した。比較例に係るサンプルについてもn=3とし、その比較例に係るサンプルの培養前後でのHCMの数を調べた。
まず、凍結させたサンプルについて、凍結前後での生存しているHCMのTNNT2陽性率の比(TNN2positive ratio)をTNNT2陽性率比として、当該TNNT2陽性率比を調べた。具体的にはサンプル2〜11についてのTNNT2陽性率比は、凍結前におけるTNNT2陽性細胞の数をAとし、解凍後におけるTNNT2陽性細胞の数をBとしたときの割合B/Aを百分率で表したものである。サンプル1のTNNT2陽性率比については、再播種した時点でのTNNT2陽性細胞の数をaとし、再播種後に接着したTNNT2陽性細胞の割合bとしたときの割合b/aを百分率で表したものである。
上述したように、HCMを、CAS冷凍装置を用いて所定の冷却手順と所定の磁場印加条件とによって凍結させることで、HCMの解凍後の付着率や生存率を向上させることができる。しかし生存後のHCMが正常に機能してなければ、凍結保存したHCMを移植用途はもちろん研究用途に利用することができない。そこで上記サンプル10の磁場印加条件で凍結させたHCMについて、凍結前と解凍後の拍動を調べてみた。図9に60Hz,0.5mTの条件で凍結させたHCMの凍結前と解凍後の拍動を示した。図示したように凍結前と解凍後での一分あたりの拍動数(bpm)に有為差がなく、凍結後に解凍したHCMが凍結前と同様に正常に機能することが確認できた。
上記実施例ではiPS細胞由来のHCMを凍結させていたが、周知のごとく、iPS細胞から分化誘導されたHCMと他のヒト多能性幹細胞から分化誘導されたHCMとにはほとんど差異がない。すなわち本発明の実施例における凍結の対象は、あらゆるヒト多能性幹細胞由来のHCMとすることができる。なおiPS細胞は体細胞から作製することができ、受精卵から作製されるES細胞に対して倫理的な問題が少ないという利点がある。またiPS細胞を用いれば、ドナーとレピシエントが同じであれば拒絶反応のない自家移植が可能となることから、ドナーが将来の移植に備えて自身の体細胞から作製したiPS細胞に由来する心筋細胞を凍結保存させておくこともできる。
16 コイル、20 制御ユニット、22 コイル制御部、25 温度制御部、
30 サンプルホルダー、35 孔
Claims (2)
- 凍結槽と、当該凍結槽内に磁場を発生させる手段と、前記凍結槽内の温度を可変制御する手段とを備えた冷凍装置を用いてヒト多能性幹細胞由来心筋細胞を凍結する方法であって、
前記心筋細胞に凍結保存液を加えてなる細胞懸濁液をサンプルとして、当該サンプルが収納された容器を漸次冷却して当該サンプルを凍結させる冷却ステップと、
前記冷却ステップの実行中に前記サンプルに対して交流磁場を印加する磁場印加ステップと、
を含み、
前記冷却ステップでは、前記凍結槽内に前記サンプルが収納された容器を配置した上で、前記凍結槽内の温度を初期温度T1から前記サンプルの凍結温度よりも低い温度T3まで冷却するとともに、前記温度T3に至る過程で前記サンプルが過冷却状態となる温度T2で所定時間維持するように前記凍結槽内の温度を制御し、
前記磁場印加ステップでは、前記サンプルに60Hzの周波数で磁束密度が0.5mT以上1.0mT以下の交流磁場を印加する、
ことを特徴とするヒト多能性幹細胞由来心筋細胞の凍結方法。 - 請求項1において、前記ヒト多能性幹細胞由来心筋細胞をiPS細胞由来の心筋細胞とすることを特徴とするヒト多能性幹細胞由来心筋細胞の凍結方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2017143628A JP6973731B2 (ja) | 2017-07-25 | 2017-07-25 | ヒト多能性幹細胞由来心筋細胞の凍結方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2017143628A JP6973731B2 (ja) | 2017-07-25 | 2017-07-25 | ヒト多能性幹細胞由来心筋細胞の凍結方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2019024325A JP2019024325A (ja) | 2019-02-21 |
JP6973731B2 true JP6973731B2 (ja) | 2021-12-01 |
Family
ID=65474842
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017143628A Active JP6973731B2 (ja) | 2017-07-25 | 2017-07-25 | ヒト多能性幹細胞由来心筋細胞の凍結方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP6973731B2 (ja) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP7266892B2 (ja) * | 2020-11-16 | 2023-05-01 | 株式会社アビー | 細胞凍結保存液、凍結細胞保存方法、及び細胞凍結方法 |
JP7280623B2 (ja) * | 2020-12-28 | 2023-05-24 | 株式会社アビー | 細胞凍結保存液、及び細胞凍結方法 |
CA3238227A1 (en) * | 2021-11-11 | 2023-05-19 | The Doshisha | Cryopreservation preparation for corneal endothelial cells and method for producing said cryopreservation preparation |
JP7318983B2 (ja) * | 2021-12-21 | 2023-08-01 | 株式会社アビー | 細胞凍結保存液、及び細胞凍結方法 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6250087B1 (en) * | 1999-10-01 | 2001-06-26 | Abi Limited | Super-quick freezing method and apparatus therefor |
JP4243924B2 (ja) * | 2001-09-17 | 2009-03-25 | 株式会社アビー | 高機能性冷凍装置および高機能性冷凍方法 |
JP2014183825A (ja) * | 2013-03-25 | 2014-10-02 | Naofumi Moriguchi | 再生医療に資するヒトiPS細胞(人工多能性幹細胞)由来の心筋細胞あるいはヒト心筋細胞を安定的に大量培養して保存する方法に関する。 |
WO2017010544A1 (ja) * | 2015-07-15 | 2017-01-19 | テルモ株式会社 | 多能性幹細胞または脂肪組織もしくは骨髄由来の間葉系幹細胞由来の心筋細胞の凍結保存方法 |
JP6820531B2 (ja) * | 2015-12-10 | 2021-01-27 | 学校法人慶應義塾 | ヒトiPS細胞由来神経幹細胞/前駆細胞の凍結方法 |
-
2017
- 2017-07-25 JP JP2017143628A patent/JP6973731B2/ja active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2019024325A (ja) | 2019-02-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6973731B2 (ja) | ヒト多能性幹細胞由来心筋細胞の凍結方法 | |
Finger et al. | Cryopreservation by vitrification: a promising approach for transplant organ banking | |
Zhang et al. | Emerging technologies in medical applications of minimum volume vitrification | |
Yong et al. | Biobanking of human mesenchymal stem cells: future strategy to facilitate clinical applications | |
JP6012164B2 (ja) | 多能性幹細胞由来の組織の凍結保存方法 | |
JP6820531B2 (ja) | ヒトiPS細胞由来神経幹細胞/前駆細胞の凍結方法 | |
EP1986493A1 (en) | Frozen viable solid organs and method for freezing same | |
US6361934B1 (en) | Method and apparatus for cryopreservation | |
Gavish et al. | Cryopreservation of whole murine and porcine livers | |
Han et al. | Engineering challenges in tissue preservation | |
Baust et al. | Concepts in biopreservation | |
Liebermann | Chapter 11 human embryo vitrification | |
Fuller et al. | Cryopreservation of mammalian embryos | |
Maffei et al. | Freezing and freeze-drying: the future perspective of organ and cell preservation | |
Arav et al. | Automation in oocyte and ovarian tissue vitrification | |
WO2023243709A1 (ja) | 生細胞凍結方法および生細胞凍結システム | |
Liebermann | Vitrification of embryos | |
JP2020010681A (ja) | 細胞凍結方法 | |
Talwar et al. | Sperm freezing injuries | |
Brian | Cryopreservation of plant protoplasts | |
JP7266892B2 (ja) | 細胞凍結保存液、凍結細胞保存方法、及び細胞凍結方法 | |
Nel-Themaat et al. | Slow Freezing of Embryos | |
Sugishita et al. | Methods of ovarian tissue cryopreservation: vitrification | |
US11039610B2 (en) | Methods and compositions for cryopreservation of endothelial cells | |
Zacà et al. | Chapter 8 Human oocytes slow-rate freezing: methodology |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170726 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170803 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20200619 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20210324 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20210427 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210608 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20210928 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20211025 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6973731 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |