CN111567515A - 一种鲟鱼性腺组织的冷冻保存液和冷冻保存及复苏的方法 - Google Patents

一种鲟鱼性腺组织的冷冻保存液和冷冻保存及复苏的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种鲟鱼性腺组织的冷冻保存液和冷冻保存及复苏的方法。本发明首先以养殖鱼类匙吻鲟为对象，系统的研究并筛选到组分相对简单的冷冻保存液和简易的冷冻保存方法，且通过生殖细胞移植实验证明了复苏后制备得到性腺细胞的生殖干细胞特性，还将该方法应用到濒危鱼类中华鲟精巢冷冻保存。利用本发明提供的方法开展鲟鱼性腺组织超低温冷冻保存，复苏后制备性腺单细胞悬液，细胞活性可达90%以上，与新鲜性腺制备得到细胞的活性没有差异；进一步通过生殖细胞移植技术有效的评估了性腺细胞的生殖干细胞特性。本发明冷冻保存液组分简单、冻存方法操作便捷，为濒危鲟鱼种质资源长期保存和物种恢复提供了一条新的且有效的途径。

Description

一种鲟鱼性腺组织的冷冻保存液和冷冻保存及复苏的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鲟鱼性腺组织的冷冻保存液和冷冻保存及复苏的方法。
背景技术
目前，全世界现存27个种，都被列入《国际濒危动植物贸易公约》附录I或II保护物种。它们的野生种群都处于不同程度的濒危状况，有的甚至已经灭绝。虽然多种鲟鱼的全人工繁殖已突破，但由于大多数鲟鱼具有个体大（体重可达几百公斤）、初次性成熟时间较长（需要十年以上）、且雌雄成熟不同的特点，导致在养殖和保种过程中需要投入大量的人力、物力和财力，造成养殖成本巨大且规模极有限。因此，有必要寻求新技术和方法，来加强鲟鱼种质资源的长期保存，以及后续物种恢复。
鱼类卵子体积大、卵黄含量高和细胞膜通透性低导致鱼类卵子和胚胎的冷冻保存技术尚未突破。另一方面，鱼类精液冷冻保存技术已较成熟，且可通过雄核发育得到后代，但雄核发育的成功率和后代个体成活率都非常低，而且只具有单亲的遗传信息。目前相对有效的鱼类种质资源保存方法是活体养殖。但是，活体养殖的方法也具有很大风险，如养鱼设施故障、疾病爆发、遗传多样性和对自然环境的适应性降低。因此，建立携带双亲遗传物质的性腺组织冷冻保存技术，再结合生殖细胞移植技术，可以实现种质资源的长期保存以及后续物种恢复。鲟鱼中，目前仅见达氏鲟精巢细胞冷冻保存液及精巢细胞冷冻保存方法的研究。该研究以冻存细胞为载体，未涉及对性腺组织的研究；且其冷冻保存液组分和冷冻程序较复杂；其中最重要的关键点：“复苏后的精巢细胞是否具有生殖干细特性”也是未知。
发明内容
本发明提供了一种组分较为简单的鲟鱼性腺组织的冷冻保存液，利用该保存液，能实现鲟鱼性腺组织的长期保存，复苏制备的细胞具备生殖干细胞特性，从而达到种质资源的长期保存。本发明的另一个目的在于建立一种相对简单、易操作的冷冻保存及复苏方法，可应用到养殖试验基地。
为了达到上述目的，本发明提供了以下技术方案：
一种鲟鱼性腺组织的冷冻保存液，所述冷冻保存液包括：L-15培养基、1.0 mol/L～1.6mol/L 二甲亚砜、0.1mol/L～0.3mol/L海藻糖和体积分数为5%～15%的胎牛血清，所述浓度均为在L-15培养基中的浓度，胎牛血清体积分数为在L-15培养基中的体积分数。
进一步的，所述冷冻保存液包括：L-15培养基、1.3 mol/L二甲亚砜、0.1 mol/L海藻糖和体积分数为10%的胎牛血清。
本发明还提提供了采用所述冷冻保存液的冷冻保存及复苏的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
（1）解剖取出鲟鱼性腺组织，用预冷的PBS清洗血块；
（2）称取性腺组织的重量，然后将性腺组织剪碎，用L-15培养基清洗，离心，弃上清液，将性腺组织置于冰上备用；
（3）向性腺组织中加入冷冻保存液，混匀，装于冻存管中，进行冷冻处理，然后保存在液氮中；
（4）复苏：将冻存管从液氮中取出解冻，将性腺组织转移至离心管中，用L-15培养基清洗；
（5）将复苏后的性腺组织用消化液进行消化，停止消化后进行过滤，离心弃上清；然后再加入L-15培养基，使细胞终浓度为精巢细胞数目为5×106~9×106个细胞，卵巢细胞数目为2×107~4×107个细胞，离心，弃上清，加入染色剂染色；加入L-15培养基阻止反应，离心后弃上清，加入L-15培养基重新悬浮细胞，加入FBS和DNase I，置于冰上备用。
进一步的，所述鲟鱼为中华鲟或匙吻鲟。
进一步的，所述步骤（3）中性腺组织与冷冻保存液的比例为1:10～20，性腺组织的单位g，冷冻保存液的单位为ml。
进一步的，所述步骤（3）中冷冻处理的方法为：先将冻存管和程序降温盒置于冰上1h~2h，然后把冻存管转移到程序降温盒−80℃~−90℃保存1.5 h～2 h。
进一步的，所述步骤（4）中解冻温度为23℃～25℃，解冻时间为1min～2min。
进一步的，所述步骤（5）中所述消化液为2 mg/ml Collagenase H、500 U/mlDispaseⅡ、5% FBS和0.05% DNase I溶于L-15培养基制得。
进一步的，所述步骤（5）中性腺组织消化的时间分别为：精巢消化4h~5h，卵巢消化3h~4h。
进一步的，所述步骤（5）中停止消化的方法为加入体积分数10%胎牛血清停止消化。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
本发明提供的一种鲟鱼性腺组织的冷冻保存液和冷冻保存及复苏的方法，不仅配方组分简单、程序操作便捷，而且能长期有效的保存鲟鱼性腺组织，复苏后制备的性腺细胞具备很高的活性，且具有生殖干细胞特性，为濒危鲟鱼种质资源的长期保存及后续物种恢复提供了一条有效的途径。本发明首先以养殖鱼类匙吻鲟为对象，系统的研究并筛选到组分相对简单的冷冻保存液和简易的冷冻保存方法，且通过生殖细胞移植实验证明了复苏后制备得到性腺细胞的生殖干细胞特性。还将该方法应用到濒危鱼类中华鲟精巢冷冻保存，取得了非常好的效果。因此，本发明提供了一种有效的鲟鱼性腺组织的冷冻保存液和冷冻保存方法，为濒危鲟鱼种质资源长期保存和物种恢复提供了一条新的且有效的途径。
附图说明
图1为匙吻鲟精巢和卵巢经不同渗透性冷冻保护剂冻存复苏后制备得到细胞的数目和活性，其中，A和B为匙吻鲟精巢经不同渗透性冷冻保护剂冻存复苏后制备得到细胞的数目和活性；C和D为为匙吻鲟卵巢经不同渗透性冷冻保护剂冻存复苏后制备得到细胞的数目和活性。
图2为匙吻鲟精巢和卵巢经不同非渗透性冷冻保护剂冻存复苏后制备得到细胞的数目和活性，其中，A和B为匙吻鲟精巢经不同非渗透性冷冻保护剂冻存复苏后制备得到细胞的数目和活性；C和D为匙吻鲟卵巢经不同非渗透性冷冻保护剂冻存复苏后制备得到细胞的数目和活性。
图3为匙吻鲟精巢和卵巢经不同冷冻保护剂冻存复苏后制备得到细胞的数目和活性，其中，A和B为匙吻鲟精巢经不同冷冻保护剂冻存复苏后制备得到细胞的数目和活性；C和D为匙吻鲟卵巢经不同冷冻保护剂冻存复苏后制备得到细胞的数目和活性。
图4为移植后第60天供体匙吻鲟生殖细胞嵌合到受体达氏鲟幼鱼性腺，其中，A和B分别为供体匙吻鲟精原细胞嵌入受体性腺在荧光和白光下的视野；C和D分别为供体匙吻鲟卵原细胞嵌入受体性腺在荧光和白光下的视野；E和F分别为未移植达氏鲟幼鱼性腺在荧光和白光下的视野。
图5为移植后第60天供体中华鲟精原细胞嵌合到受体达氏鲟幼鱼性腺，其中，A和B分别为供体中华鲟精原细胞嵌入受体性腺在荧光和白光下的视野；C和D分别为未移植达氏鲟幼鱼性腺在荧光和白光下的视野。
具体实施方式：
以下实施例旨在进一步说明本发明的内容，而不是限制本发明的保护范围。
本发明提供了一种鲟鱼性腺组织冷冻保存及复苏的方法，所述方法包括以下步骤：
（1）解剖取出鲟鱼性腺组织，用预冷的PBS清洗血块；
（2）称取性腺组织的重量，将性腺组织剪碎，用L-15培养基清洗，离心，弃上清液，将性腺组织置于冰上备用；
（3）将性腺组织中加入冷冻保存液，混匀，装于冻存管中，先将冻存管置于冰上1 h~2h，然后−80℃~−90℃保存1.5h～2h，然后保存在液氮中；性腺组织与冷冻保存液的比例为1 :10～20，性腺组织的单位g，冷冻保存液的单位为ml。
（4）复苏：将冻存管从液氮中取出23℃～25℃解冻，将性腺组织转移至离心管中，用含胎牛血清的L-15培养基清洗。然后将性腺组织转移置新的离心管中，用含胎牛血清的L-15培养基清洗；
（5）将复苏后的性腺组织用消化液进行消化，停止消化后进行过滤，离心弃上清；然后再加入L-15培养基，使细胞终浓度为精巢细胞数目为5×106~9×106个细胞，卵巢细胞数目为2×107~4×107个细胞，离心，弃上清，加入染色剂染色；加入L-15培养基阻止反应，离心后弃上清，加入L-15培养液重新悬浮细胞，加入FBS和DNase I，置于冰上备用。
实施例1冷冻保存液组成的研究
对冷冻保存液的组成进行筛选，具体如下：
一、鲟鱼性腺组织的冷冻保存液组分中渗透性保护剂（二甲亚砜、乙二醇和甲醇）筛选，具体步骤如下：
1. 用L-15培养基分别配制3种浓度（1.0mol/L、1.3mol/L和1.6mol/L）的二甲亚砜、乙二醇和甲醇 5 ml，得到冷冻保存液。
2. 解剖2龄匙吻鲟，将精巢和卵巢组织分别放入置于冰上的不同培养皿中，用预冷的PBS清洗血块。
3. 加适量L-15培养基于培养皿中，去除精巢和卵巢上的腹膜和脂肪，并分别称取精巢和卵巢的重量，并分别取3 g精巢和卵巢；用剪刀分别将精巢和卵巢剪碎至1 mm3左右大小，用约3倍体积L-15培养基清洗组织块，4℃ 200 g离心5 min，重复3次。
4. 将精巢和卵巢组织都分成10等份，其中9份用于不同浓度的渗透性保护剂冻存，最后1份精巢和卵巢组织分别用于制备细胞。每份精巢和卵巢组织中加入5 ml冷冻保存液，混匀后转移至冻存管。
5. 将冻存管和程序降温盒置于冰中1 h后，把冻存管转移到程序降温盒于−80℃保存90 min，最后置于液氮保存3天。
6. 复苏：将装有精巢和卵巢样品的冻存管从液氮中取出置于冰上，接着将其置于水浴锅（23℃～25℃）中解冻 1 min，然后将性腺组织转移置新的离心管中，用含10% 胎牛血清的L-15培养基清洗3次，置于冰上。
7. 性腺细胞的制备：配置性腺组织消化液，配方为2 mg/ml Collagenase H，500U/ml DispaseⅡ，5% FBS和0.05% DNase I溶于L-15培养基；每份精巢或卵巢样品加消化液3 ml，将其混匀后转移置6孔板，将6孔板置于培养箱（23℃～25℃）中孵育，精巢为4小时，卵巢为3小时；加入10%胎牛血清停止消化，依次用150 µm和50 µm滤器过滤消化液，4℃ 200 g离心5 min；用L-15 培养基清洗2次，加1 ml L-15培养基重悬细胞，用细胞计数板统计细胞数目和台盼蓝染色检测和统计细胞活性。
实现结果见图1，通过比较细胞数目和活性，发现1.3mol/L二甲亚砜作为渗透性保护剂的效果最好。
二、鲟鱼性腺组织的冷冻保存液组分中非渗透性保护剂（海藻糖、葡萄糖和乳糖）筛选，具体如下：
1.在以1.3mol/L二甲亚砜为保护剂的基础上，筛选非渗透性保护剂（海藻糖、葡萄糖和乳糖），分别设置3个浓度（0.1mol/L、0.2mol/L和0.3mol/L）共9组实验。分别配制各组冷冻保存液5 ml。
2. 解剖2龄匙吻鲟，将精巢和卵巢组织分别放入置于冰上的不同培养皿中，用预冷的PBS清洗血块。
3. 加适量L-15培养基于培养皿中，去除精巢和卵巢上的腹膜和脂肪，并分别称取精巢和卵巢的重量，并分别取3 g精巢和卵巢；用剪刀分别将精巢和卵巢剪碎至1 mm3左右大小，用约3倍体积L-15培养基清洗组织块，4℃ 200 g离心5 min，重复3次。
4. 将精巢和卵巢组织都分成10等份，其中9份用于不同浓度的非渗透性保护剂冻存，最后1份精巢和卵巢组织分别用于制备细胞。每份精巢和卵巢组织中加入5 ml冷冻保存液，混匀后转移至冻存管。
5. 将冻存管和程序降温盒置于冰中1 h后，把冻存管转移到程序降温盒于−80℃保存90 min，最后置于液氮保存3天。
6. 复苏：将装有精巢和卵巢样品的冻存管从液氮中取出置于冰上，接着将其置于水浴锅（23℃～25℃）中解冻 1 min，然后将性腺组织转移置新的离心管中，用含10% 胎牛血清的L-15培养基清洗3次，置于冰上。
7. 性腺细胞的制备：配置性腺组织消化液，配方为2 mg/ml Collagenase H，500U/ml DispaseⅡ，5% FBS和0.05% DNase I溶于L-15培养基；每份精巢或卵巢样品加消化液3 ml，将其混匀后转移置6孔板，将6孔板置于培养箱（23℃～25℃）中孵育，精巢为4小时，卵巢为3小时；加入10%胎牛血清停止消化，依次用150 µm和50 µm滤器过滤消化液，4℃ 200 g离心5 min；用L-15 培养基清洗2次，加1 ml L-15培养基重悬细胞，用细胞计数板统计细胞数目和台盼蓝染色检测和统计细胞活性。
实验结果见图2，通过比较细胞数目和活性，1.3mol/L二甲亚砜和0.1mol/L海藻糖作为冷冻保存液组分的效果最佳。
三、鲟鱼性腺组织的冷冻保存液组分中牛血清白蛋白、胎牛血清和卵黄的筛选，具体如下：
1.在1.3mol/L二甲亚砜和0.1mol/L海藻糖作为组分的基础上，进一步筛选牛血清白蛋白（质量分数1%、2%和3%）、胎牛血清（体积分数5%、10%和15%）和卵黄（体积分数4%、8%和12%），共9组实验。分别配制各组冷冻保存液5 ml。
2. 解剖2龄匙吻鲟，将精巢和卵巢组织分别放入置于冰上的不同培养皿中，用预冷的PBS清洗血块。
3. 加适量L-15培养基于培养皿中，去除精巢和卵巢上的腹膜和脂肪，并分别称取精巢和卵巢的重量，并分别取3 g精巢和卵巢；用剪刀分别将精巢和卵巢剪碎至1 mm3左右大小，用约3倍体积L-15培养基清洗组织块，4℃ 200 g离心5 min，重复3次。
4. 将精巢和卵巢组织都分成10等份，其中9份用于不同浓度的冷冻保存剂中冻存，最后1份精巢和卵巢组织分别用于制备细胞。精巢和卵巢组织中加入5 ml冷冻保存液，混匀后转移至冻存管。
5. 将冻存管和程序降温盒置于冰中1 h后，把冻存管转移到程序降温盒于−80℃保存90 min，最后置于液氮保存3天。
6. 复苏：将装有精巢和卵巢样品的冻存管从液氮中取出置于冰上，接着将其置于水浴锅（23℃～25℃）中解冻 1 min，然后将性腺组织转移置新的离心管中，用含10% 胎牛血清的L-15培养基清洗3次，置于冰上。
7. 性腺细胞的制备：配置性腺组织消化液，配方为2 mg/ml Collagenase H，500U/ml DispaseⅡ，5% FBS和0.05% DNase I溶于L-15培养基；每份精巢或卵巢样品加消化液3 ml，将其混匀后转移置6孔板，将6孔板置于培养箱（23℃～25℃）中孵育，精巢为4小时，卵巢为3小时；加入10%胎牛血清停止消化，依次用150 µm和50 µm滤器过滤消化液，4℃ 200 g离心5 min；用L-15 培养基清洗2次，加1 ml L-15培养基重悬细胞，用细胞计数板统计细胞数目和台盼蓝染色检测和统计细胞活性。
实验结果见图3，通过比较细胞数目和活性，L-15培养基、1.3mol/L二甲亚砜、0.1mol/L海藻糖和10%胎牛血清作为冷冻保存液组分的效果最佳。
实施例2匙吻鲟性腺组织冷冻保存及复苏
具体如下：
1. 根据实施例2的结果，配制冷冻保存液包括：L-15培养基、1.3mol/L二甲亚砜、0.1mol/L海藻糖和10%胎牛血清100 ml。解剖2龄匙吻鲟，将精巢和卵巢组织分别放入置于冰上的不同培养皿中，用预冷的PBS清洗血块。
2. 加适量L-15培养基于培养皿中，去除精巢和卵巢上的腹膜和脂肪，并分别称取精巢和卵巢的重量，并分别取3 g精巢和卵巢；用剪刀分别将精巢和卵巢剪碎至1 mm3左右大小，用约3倍体积L-15培养基清洗组织块，4℃ 200 g离心5 min，重复3次。
3. 向精巢和卵巢组织别加入50 ml冷冻保存液，混匀后转移至冻存管。将冻存管和程序降温盒置于冰中1 h后，把冻存管转移到程序降温盒于−80℃保存90 min，最后置于液氮保存1年。
4. 复苏：将装有精巢和卵巢样品的冻存管从液氮中取出置于冰上，接着将其置于水浴锅（245℃）中解冻 1 min，然后将性腺组织转移置新的离心管中，用含10% 胎牛血清的L-15培养基清洗3次，置于冰上。
5. 性腺细胞的制备：配置性腺组织消化液，配方为2 mg/ml Collagenase H，500U/ml DispaseⅡ，5% FBS和0.05% DNase I溶于L-15培养基；精巢和卵巢样品分别加消化液30 ml，将其混匀后转移置6孔板，将6孔板置于培养箱（23℃～25℃）中孵育，精巢为4小时，卵巢为3小时；加入体积分数10%胎牛血清停止消化，依次用150 µm和50 µm滤器过滤消化液，4℃ 200 g离心5 min，弃上清，用L-15 培养基清洗2次，加1 ml L-15培养基重悬细胞，得到的精巢细胞数目为8×106，卵巢细胞为2×107；离心4℃ 200 g 5 min，弃上清，PKH26染色，使其终浓度为10 µM，室温5 min；加入1 ml L-15培养基阻止反应，离心4℃ 200 g 5min；弃上清，加入1 ml L-15培养基清洗2次；加入适量1 mlL-15培养基重悬细胞，并加入50µl FBS和50µl DNase I，置于冰上，用于细胞移植实验。
6. 生殖细胞移植：将分离得到的细胞加入到玻璃片凹槽中，置于冰上，使细胞聚集在底部，然后置于解剖镜下，通过注射仪将细胞吸入到针中。将出膜后7-8天达氏鲟仔鱼用0.001% MS-222麻醉，用玻璃吸管将仔鱼转移到用3%琼脂糖包被的培养皿中。在解剖镜下，将针插入到仔鱼腹腔靠近生殖嵴位置，把细胞注射到仔鱼体内。完成后，养殖于实验桶。
实验结果见图4，移植后60天，解剖受体达氏鲟，取出性腺在荧光显微镜下观察，发现供体匙吻鲟的生殖细胞成功嵌合到受体性腺，证明经过长期冷冻保存后的匙吻鲟性腺制备得到的精巢和卵巢细胞都具备生殖干细胞的特性。
实施例3中华鲟性腺组织的冷冻保存及复苏
具体如下：
1. 配制冷冻保存液含L-15培养基、1.3mol/L二甲亚砜、0.1mol/L海藻糖和10%胎牛血清50 ml。解剖4尾3龄雄性中华鲟，将精巢放入培养皿中，用预冷的PBS清洗血块。
2. 加适量L-15培养基于培养皿中，去除精巢上的腹膜和脂肪，称取精巢的重量，取3g精巢；用剪刀将精巢剪碎至1mm3左右大小，用约3倍体积L-15培养基清洗组织块，4℃200 g离心5 min，重复3次。
3. 向精巢加入50 ml冷冻保存液，混匀后转移至冻存管。将冻存管和程序降温盒置于冰中1 h后，把冻存管转移到程序降温盒于−80℃保存90 min，最后置于液氮保存1年。
4. 复苏：将装有精巢和样品的冻存管从液氮中取出置于冰上，接着将其置于水浴锅（23℃～25℃）中解冻 1 min，然后将精巢组织转移置新的离心管中，用含10% 胎牛血清的L-15培养基清洗3次，置于冰上。
5. 精巢细胞的制备：配置精巢组织消化液，配方为2 mg/ml Collagenase H，500U/ml DispaseⅡ，5% FBS和0.05% DNase I溶于L-15培养基；精巢样品加入消化液30 ml，将其混匀后转移置6孔板，将6孔板置于培养箱（23℃～25℃）中孵育，消化为4小时；加入10%胎牛血清停止消化，依次用150 µm和50 µm滤器过滤消化液，4℃ 200 g离心5 min，弃上清；用L-15 培养基清洗2次，加1 ml L-15培养基重悬细胞，得到的精巢细胞数目为9×106；离心4℃ 200 g 5 min，弃上清，PKH26染色，使其终浓度为10 µM，室温5 min；加入1 ml L-15培养基阻止反应，离心4℃ 200 g 5 min；弃上清，加入1 ml L-15培养基清洗2次；加入适量1 mlL-15培养基重悬细胞，并加入50 µl FBS和50µl DNase I，置于冰上，用于细胞移植实验。
6. 生殖细胞移植：将分离得到的中华鲟精巢细胞加入到玻璃片凹槽中，置于冰上，使细胞聚集在底部，然后置于解剖镜下，通过注射仪将细胞吸入到针中。将出膜后7-8天达氏鲟仔鱼用0.001% MS-222麻醉，用玻璃吸管将仔鱼转移到用3%琼脂糖包被的培养皿中。在解剖镜下，将针插入到仔鱼腹腔靠近生殖嵴位置，把细胞注射到仔鱼体内。完成后，养殖于实验桶。
移植后60天，解剖受体达氏鲟，取出性腺在荧光显微镜下观察，发现供体中华鲟的生殖细胞成功嵌合到受体性腺，见图5，证明长期冷冻保存后的中华鲟精巢制备得到的生殖细胞仍具备生殖干细胞的特性，即本发明的性腺组织冷冻保存液和冷冻方法也能应用到中华鲟。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种鲟鱼性腺组织的冷冻保存液，其特征在于：所述冷冻保存液包括：L-15培养基、1.0 mol/L～1.6mol/L 二甲亚砜、0.1mol/L～0.3mol/L海藻糖和体积分数为5%～15%的胎牛血清。
2.根据权利要求1所述的冷冻保存液，其特征在于：所述冷冻保存液包括：L-15培养基、1.3 mol/L二甲亚砜、0.1 mol/L海藻糖和体积分数为10%的胎牛血清。
3.采用权利要求1所述冷冻保存液的冷冻保存及复苏的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
（1）解剖取出鲟鱼性腺组织，用预冷的PBS清洗血块；
（2）称取性腺组织的重量，然后将性腺组织剪碎，用L-15培养基清洗，离心，弃上清液，将性腺组织置于冰上备用；
（3）向性腺组织中加入冷冻保存液，混匀，装于冻存管中，进行冷冻处理，然后保存在液氮中；
（4）复苏：将冻存管从液氮中取出解冻，将性腺组织转移至离心管中，用L-15培养基清洗；
（5）将复苏后的性腺组织用消化液进行消化，停止消化后进行过滤，离心弃上清；然后再加入L-15培养基，使精巢细胞终浓度为5×106~9×106个细胞，使卵巢细胞终浓度为2×107~4×107个细胞；离心，弃上清，加入染色剂染色，加入L-15培养基阻止反应；离心后弃上清，加入L-15培养基重新悬浮细胞，加入FBS和DNase I，置于冰上备用。
4.根据权利要求3所述的冷冻保存及复苏的方法，其特征在于：所述鲟鱼为中华鲟或匙吻鲟。
5.根据权利要求3所述的冷冻保存及复苏的方法，其特征在于：所述步骤（3）中性腺组织与冷冻保存液的比例为1 :10～20。
6.根据权利要求3所述的冷冻保存及复苏的方法，其特征在于：所述步骤（3）中冷冻处理的方法为：先将冻存管和程序降温盒置于冰上1h~2h，然后把冻存管转移到程序降温盒−80℃~−90℃保存1.5 h～2 h。
7.根据权利要求3所述的冷冻保存及复苏的方法，其特征在于：所述步骤（4）中解冻温度为23℃～25℃，解冻时间为1 min～2min。
8.根据权利要求3所述的冷冻保存及复苏的方法，其特征在于：所述步骤（5）中所述消化液为2 mg/ml Collagenase H、500 U/ml DispaseⅡ、5% FBS和0.05% DNase I溶于L-15培养基制得。
9.根据权利要求3所述的冷冻保存及复苏的方法，其特征在于：所述步骤（5）中性腺组织消化的时间分别为：精巢消化4h~5h，卵巢消化3h~4h。
10.根据权利要求3所述的冷冻保存及复苏的方法，其特征在于：所述步骤（5）中停止消化的方法为加入体积分数10%胎牛血清停止消化。
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