CN116731966A - 一种猪外周血单核细胞的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种猪外周血单核细胞的制备方法，包括以下步骤：获得标准猪源样品；获得全血采血装置；利用所述全血采血装置从所述猪源样品上采集抗凝血样品，静置分层后吸取上层细胞样品，离心去上层清液，获得猪外周血单核细胞沉淀物；将所述猪外周血单核细胞沉淀物重悬，加入红细胞裂解液，离心处理，获得不含红细胞的猪外周血单核细胞沉淀物；将所述不含红细胞的猪外周血单核细胞沉淀物重悬、离心、洗涤，再进行细胞培养，获得猪外周血单核细胞。本发明旨在提供一种制备方法，以制备出低污染、质量好，制备量高的猪外周血单核细胞。

Description

一种猪外周血单核细胞的制备方法

技术领域

本发明涉及细胞制备技术领域，具体涉及一种猪外周血单核细胞的制备方法。

背景技术

外周血(Peripheral Blood)是机体内具有造血、免疫和防御机能，柔软且富有血液的组织，是除骨骼之外的血液的总称。猪外周血单核细胞(Peripheral BloodMononuclear Cell，PBMC)为外周血中不同内各种细胞的总称，外周血中的细胞类型众多，主要含有红细胞、白细胞和血小板，单核细胞是血液中最大的血细胞，也是体积最大的白细胞。猪外周血单核细胞(PBMC)主要包括淋巴细胞、单核细胞和树突状细胞，是机体免疫系统的重要组成部分，具有抗御病原体入侵、吞噬异物并产生抗体和机体损伤后治愈等功能，机体的生理或病理变化通常会造成血液中免疫细胞数量和成分的变化。猪外周血中T淋巴细胞丰富，但淋巴细胞亚群的功能和作用尚不清楚。NK细胞在防御病毒、寄生虫和细菌等病原体感染中发挥重要作用。B细胞则主要负责产生抗体，帮助身体抵御病原体的入侵。总之，外周血与身体的每个器官和组织相互作用，因此其状态和数量可以反映机体生理和病理状态，这种与身体状态的反射关系，使得外周血成为疾病预测，诊断的重要组织类型。

猪PBMC的制备研究因非洲猪瘟(African Swine Fever，ASF)病大流行而有所增多。非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)引起的烈性传染病，在软蜱，家猪，野猪之间传播，OIE将其列为法定报告动物疾病。其特征是发病过程短，最急性和急性感染死亡率接近100％，目前，无有效疫苗，无特效药物，对全世界养殖业造成了巨大的经济损失。我国也将其被列为一类动物疫病。ASFV是一种双链DNA病毒，具有二十面体的形态。ASFV复杂庞大的病毒基因组及其调节宿主免疫反应的能力还需要进一步研究。非洲猪瘟病毒自发现100多年来，采用传统疫苗研制策略均未成功。目前，通过基因缺失致弱成为该疫苗研究重要的方向，但非洲猪瘟病毒只能通过极少数的原代细胞培养后配制成的疫苗才有效，其中，猪PBMC分化成的巨噬细胞就是其中一种最重要的原代细胞。有研究表明巨噬细胞是猪感染ASFV的主要靶点。因此对猪PBMC的获取和分析具有重要的临床意义。

猪PBMC的常规制备方法多采用Ficoll试剂进行密度梯度离心法，适用于制备少量猪PBMC，多用于实验室研究，但是常规制备方法主要存在制备量不稳定，制备量少，操作时间过长，污染难控，成本高等问题，一直无法制备大量的目的细胞用于放大生产研究。

发明内容

本发明的主要目的是提出一种猪外周血单核细胞的制备方法，旨在解决现有猪外周血细胞制备时细胞污染率高、细胞制备量少、制备效率低的问题。

为实现上述目的，本发明提出一种猪外周血单核细胞的制备方法，包括以下步骤：

获得标准猪源样品；

获得全血采血装置；

利用所述全血采血装置从所述猪源样品上采集抗凝血样品，静置分层后吸取上层细胞样品，离心去上层清液，获得猪外周血单核细胞沉淀物；

将所述猪外周血单核细胞沉淀物重悬，加入红细胞裂解液，离心处理，获得不含红细胞的猪外周血单核细胞沉淀物；

将所述不含红细胞的猪外周血单核细胞沉淀物重悬、离心、洗涤，再进行细胞培养，获得猪外周血单核细胞。

可选地，在所述获得全血采血装置的步骤中，所述全血采血装置包括：

混匀装置，包括第一容器和三通结构，所述三通结构包括第一支路、第二支路和第三支路，所述第一支路连接至所述第一容器；

全血输出装置，包括输血管，一端连接至所述猪源样品，另外一端连接至所述第二支路，用于将所述猪源样品中的猪全血样品输送至所述第二支路；以及，

冷凝装置，包括第二容器和输液管，所述第二容器内设有抗凝液，所述输液管的一端连接至所述抗凝液，另外一端连接至所述第三支路，用于将所述抗凝液输送至所述第三支路。

可选地，所述全血输出装置还包括控制器和固定器，所述控制器和所述固定器间隔设于所述输血管上，且所述控制器设于靠近所述第二支路的一侧；和/或，

所述输血管远离所述第二支路的一端呈倾斜设置。

可选地，所述冷凝装置还包括：

第三容器，所述第三容器内形成有容纳腔，所述容纳腔内设有冷凝液；

温度计，设于所述第三容器内，用于检测所述冷凝液的温度；以及，

泵，设于所述输液管上；

其中，所述第二容器设于所述第三容器内，且被所述容置腔内的冷凝液环绕设置。

可选地，所述第一支路、所述第二支路和所述第三支路的交界处设有混匀叶片，所述混匀叶片用于搅拌混匀所述抗凝液和所述猪全血样品。

可选地，所述抗凝液的组分包含：3％的明胶、100～200U/ml的青霉素、0.1～0.2mg/ml链霉素和无菌0.01mol/L的PBS。

可选地，所述利用所述全血采血装置从所述猪源样品上采集抗凝血样品，静置分层后吸取上层细胞样品，离心去上层清液，获得猪外周血单核细胞沉淀物的步骤还包括以下步骤：

将所述标准猪源样品麻醉，利用所述全血采血装置收集所述标准猪源样品的抗凝血；

将所述凝抗血至于无菌环境静置20～60min，分层后吸取上层细胞样品；

将所述上层细胞样品在1000～1500rpm的转速下，离心处理8～12min，去除上层清液，获得猪外周血单核细胞沉淀物。

可选地，所述红细胞裂解液包括1.2～1.5mol/L NH₄Cl、90～110mmol/LKHCO₃和8～15mmol/L Na₄EDTA；和/或，

所述红细胞裂解液的pH值为7.2～7.4。

可选地，所述细胞培养的培养基配方包括78～89％RPMI 1640、10～20％FBS和1～2％双抗。

可选地，所述获得标准猪源样品的步骤还包括以下步骤：

采集1～2ml的猪源样品的血清，分离血清，获得猪血清；

对所述猪血清分别进行猪圆环病毒II型、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒检测，筛选获得标准猪源样品。

本发明的技术方案中，本发明所提供的制备方法操作简单，制备过程中细胞污染率较低，细胞制备；量稳定，且细胞制备量高，操作时间短，制备效率高；在制备过程中，采用全血采血装置直接从标准猪源样品获得采集抗凝血样品，一方面能够尽可能多的收集血样，从而获得更多的猪外周血单核细胞，另外一方面，直接通过全血采血装置获得抗凝血样品可以降低污染；用红细胞裂解液裂解收集的细胞悬液，裂解效果更加好，培养后的细胞状态更加优，存活率更加高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。

图1为本发明提供的猪外周血单核细胞的制备方法的一实施例的流程示意图；

图2为本发明提供的全血采血装置的一实施例的结构示意图；

图3为本发明提出的明胶分离红细胞的效果图；

图4为猪PBMC裂解与非裂解培养结果示意图；

图5为猪PBMC沉淀培养3天在40x显微镜下的结果图；

图6为猪PBMC沉淀培养7天在40x显微镜下的结果图；

图7为猪PBMC沉淀培养14天在40x显微镜下的结果图。

标号说明：

本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。另外，全文中出现的“和/或”的含义，包括三个并列的方案，以“A和/或B”为例，包括A方案、或B方案、或A和B同时满足的方案。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

目前国内外分离外周血单个核细胞的常用方法是Ficoll法。其原理是单个核细胞与其他成分存在密度差异，利用淋巴细胞分离液作密度梯度离心时，各种细胞成分按密度梯度重新分布聚集，从而获得单个核细胞。但由于离心后部分红细胞仍悬浮于Ficoll溶液中，致使收集的单个核细胞里可能混杂红细胞，不利于单个核细胞的收集。另外，Ficoll方法仅适用于制备少量猪PBMC，多用于实验室研究，放大使用时Ficoll试剂使用占比过大，成本高，难以实现量产。

鉴于此，本发明提供一种猪外周血单核细胞的制备方法，采用本方法制备的猪外周血单核细胞，操作方法简单，细胞污染率低，细胞制备量稳定，且细胞制备量高，操作时间短，制备效率高。

需要说明的是，为了便于描述，下文中的猪外周血单核细胞将统一简写为猪PBMC，即猪PBMC代表猪外周血单核细胞。

结合图1所示的猪PBMC的制备方法的一实施例的流程示意图，所述猪PBMC的制备方法，包括以下步骤：

步骤S10、获得标准猪源样品；

猪PBMC用猪源筛选是获得有效细胞的前提，良好的猪源制备的细胞不含影响细胞活性的外源病毒，制备的细胞活率高，可用性强，实验数据重复性好，实验数据可信。常见猪源性疾病中，猪圆环病毒II型(PCVII)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(ASFV&CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)等病毒多可侵入猪PBMC中，引起细胞的异常，故通过国标方法或灵敏度不低于国标方法对备用猪源进行筛选，规避掉这些潜在病毒对后续制备的猪PBMC的影响，保障后续猪PBMC的质量；也可以根据制备猪PBMC的使用目的差异，而筛选不同抗原特性的猪源用于猪PBMC的制备。

具体地，在进行步骤S10时，可以通过以下步骤进行：

步骤S101、采集1～2ml的猪源样品的血清，分离血清，获得猪血清；

步骤S102、对所述猪血清分别进行猪圆环病毒II型、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒检测，筛选获得标准猪源样品。

需要说明的是，猪源在采全血前，每头备用猪源需采集1～2ml血样，分离血清，按国标或灵敏度不低于国标的检测方法进行外源病毒检测，挑选符合后续细胞使用需求的备用猪源用于猪PBMC制备。

步骤S20、获得全血采血装置100；

本发明提供了一种全血采血装置100，用于采集猪体内所有血样，具体全血采血装置100如下所述：

请参阅图2，所述全血采血装置100包括混匀装置1、全血输出装置2和冷凝装置3；其中，冷凝装置3由泵35和输液管32道组成，冷凝装置3可将抗凝液通过输液管32输送至混匀装置1；全血输出装置2由固定器23、输血管21及控制器22组成，将猪血通过心脏的跳动而泵入混匀装置1；混匀装置1通过混匀叶片124混合抗凝液与猪全血；冷凝装置3由盛装冰水混合物的容器31与温度计34组成，用以监控抗凝液的温度；具体地：

所述混匀装置1包括第一容器11和三通结构12，所述三通结构12包括第一支路121、第二支路122和第三支路123，所述第一支路121连接至所述第一容器11；所述全血输出装置2包括输血管21，一端连接至所述猪源样品，另外一端连接至所述第二支路122，用于将所述猪源样品中的猪全血样品输送至所述第二支路122；所述冷凝装置3包括盛装冰水混合物的第二容器31、第三溶器33和输液管32，所述第三容器33内设有抗凝液，所述输液管32的一端连接至所述抗凝液，另外一端连接至所述第三支路123，用于将所述抗凝液输送至所述第三支路123。具体地，在本实施例中，所述三通结构12是一类似于Y型三通，上端两管直径略小，是抗凝液与猪全血的输入接口，下端直径略大是混合液的输出接口；所述冷凝装置3还包括用以盛装所述抗凝液的补料瓶4，所述输液管32的一端连通至所述第三容器33的底部，所述输液管32的另一端连接混匀装置1；此外，需要说明的是，所述输液管32可卡在泵35的动力卡槽上，用以通过所述输液管32抽取所述第三容器33内的抗凝液并输送至混匀装置1，所述泵35上设有流速控制器和泵开启/暂停的开关，用以控制抗凝液流速和开启/暂停；在实际操作过程中，所述所输血管21可将猪心脏泵出的猪全血样品输送到所述第二支路122，同时所述输液管32将抗凝液输送至所述第三支路123，所述猪全血样品与所述抗凝液混合，再从所述第一支路121流向所述第一容器11。

在本实施例中，利用混匀装置1不仅可快速混匀抗凝液与全血样品，减少全血凝固，也可以在血液接触空气前将抗凝液与全血样品充分混匀，改善空气对非抗凝血的影响，减少猪PBMC的损失；混匀装置1采用输入口直径小，输出口直径大的方式，避免管道里抗凝血的压力过大，可减少细胞的破裂损失；冷凝装置3可实现抗凝液的输出稳定且可控，实现与不同流速的猪全血样的同步输出，使用灵活，效果好；同时，冷凝装置3可有效保障抗凝液的输出温度，有利于保护体外猪PBMC活力少受影响。

需要说明的是，全血采血装置100的血液接触物品均可借用高压灭菌，以避免污染源的引入；采血时动物外表面的清洗消毒，剖开后的酒精喷雾消毒，输血管21插入心脏时的酒精火焰保护，抗凝液中双抗使用等保护措施，均在保护猪PBMC免受污染。

进一步地，所述第一容器11的具体结构不做限定，在本实施例中，所述第一容器11优选为补料瓶4。

进一步地，请继续参阅图2，所述全血输出装置2还包括控制器22和固定器23，所述控制器22和所述固定器23间隔设于所述输血管21上，且所述控制器22设于靠近所述第二支路122的一侧；在本实施例中，所述固定器23一端用于固定输血管21，另一端固定于猪组织上，用于防止输液管21被冲出动脉，引起血液的外流，从而引起细胞损失，降低污染几率。

进一步地，所述输血管21远离所述第二支路122的一端呈倾斜设置。所述输血管21是一直经与动脉大小相近的塑料管，一端剪成45°斜角，利于输血管21沿颈动脉推送至心脏，接近动脉插管处卡于固定器23，固定于猪组织上，另一端与混匀装置1连接；控制器22位于固定器23后，用于控制猪全血流出的速度。

请继续参阅图2，所述冷凝装置3还包括第三容器33、温度计34和泵35；所述第三容器33内形成有容纳腔，所述容纳腔内设有冷凝液；所述温度计34设于所述第二容器31内，用于检测所述冷凝液的温度；所述泵35设于所述输液管32上；其中，所述第三容器32设于所述第二容器31内，且被所述容置腔内的冷凝液环绕设置。具体地，在本实施例中，所述第二容器31用以盛装冰水混合物和所述第三容器33，以使所述第三容器33处于冰水混合物环境中，所述温度计34设于所述第二容器31，用以检测所述第二容器31内的温度。需要说明的是，盛装抗凝液的补料瓶4通过呼吸器与外界保持畅通，在保证无菌的同时，也便于液体出入容器里；输入口连接管道，便于添双抗；抗凝液在使用前，超净工作台中通过输入管口添加终浓度为100～200U/ml青霉素和0.1～0.2mg/ml链霉素。

同时，需要说明的是第一容器11也采用与补料瓶4相同的方式接收血样，需注意的是，瓶内的管道离瓶底约1cm，便于统计观察开始时液体流出的速度，离瓶底过高，滴落时会导致更多的细胞破裂，过低不便于确定液体的流速。

进一步地，所述第一支路121、所述第二支路122和所述第三支路123的交界处设有混匀叶片124，所述混匀叶片124用于搅拌混匀所述抗凝液和所述猪全血样品。在本实施例中，在液体(即全血样品和抗凝液)流过导片时会引起导片的转动，可混匀流经的液体；混匀装置1进口小，出口大，避免管道里液压过大而引起细胞的破裂。

步骤S30、利用所述全血采血装置100从所述猪源样品上采集抗凝血样品，静置分层后吸取上层细胞样品，离心去上层清液，获得猪PBMC沉淀物；

在进行步骤S30时，具体可以通过以下步骤进行：

步骤S301、将所述标准猪源样品麻醉，利用所述全血采血装置100收集所述标准猪源样品的抗凝血；

为了获得更多的猪PBMC，降低污染率，在采集猪全血样时，需要尽量避免血样不被污染，因此，在制备过程中，首先用消毒液对实验猪的表面进行清洗和消毒，再对实验猪进行麻醉，放置在已消毒的手术台上，对仔猪的前腔部位再次进行消毒，用手术刀划开前腔，找到颈动脉，用两把止血钳分别夹住颈动脉两端，中间留出约10cm区域，酒精消毒操作区域，在酒精棉火焰保护下，用剪刀划破颈动脉，将输血管21控制器22关闭，取出灭菌包裹好的输血管21的45°斜角，插入划破的颈动脉里，顺着颈动脉往近心端推送，在接近近心端止血钳时，松开止血钳，继续往前推送，输血管21的45°斜角进入心脏时，可明显感觉到手中的输血管21会随着心脏跳动，即可停止继续推进，将输血管21近心端入口处卡在固定器23上，固定器23夹在猪组织上，可避免输血管21被猪心脏泵出，造成血液流出和引起污染。

具体地，在实际操作时，先仅启动泵35，通过观察纯抗凝液在第一容器11中流速；再缓慢逐步调大全血输出装置2的控制器22，当第一容器11中混合抗凝血的流速是纯抗凝液流速一倍左右时即可停止继续调整控制器22；并按此流速收集全部血样。

步骤S302、将所述凝抗血至于无菌环境静置20～60min，分层后吸取上层细胞样品；

采集的抗凝血，转移至超净工作台，拆除补料瓶4上的管道，将抗凝血转移到合适的无菌容器中，室温静置20～60min，静待红细胞沉降。

需要说明的是，在本申请中，采用3％明胶可快速高效促进红细胞的沉降，因明胶溶液可以破坏红细胞表面电荷而加速红细胞的沉积，对其他的主要成分包括单个核细胞基本无影响。因此用明胶可促进红细胞的聚集与下沉，缩短制备时间，提高制备效率。

进一步地，所述抗凝液的组分包含：3％的明胶、100～200U/ml的青霉素、0.1～0.2mg/ml链霉素和无菌0.01mol/L的PBS。请参阅图3，采用明胶可在半小时左右可促进红细胞与猪PBMC的分层，缩短细胞制备时间，不仅可保障猪PBMC的活率，更可实现猪PBMC的量产制备，且操作过程省时，省力，高效。

步骤S303、将所述上层细胞样品在1000～1500rpm的转速下，离心处理8～12min，去除上层清液，获得猪PBMC沉淀物。

在本实施例中，离心的速度和离心的时间都会影响猪PBMC的活性，因此，为了获得活性更好的猪PBMC，在离心处理时，需要控制离心速度为1000～1500rpm，离心处理时间为8～12min。为了获得更多的目的细胞，可适当多吸取些分层面的混合细胞，收获更多的猪PBMC。

步骤S40、将所述猪PBMC沉淀物重悬，加入红细胞裂解液，离心处理，获得不含红细胞的猪PBMC沉淀物；

在进行步骤S40之前，首先需要配制红细胞裂解液，所述红细胞裂解液包括1.2～1.5mol/L NH4Cl、90～110mmol/L KHCO3和8～15mmol/L Na4EDTA；所述红细胞裂解液的pH值为7.2～7.4；配制红细胞裂解液具体可以通过以下步骤操作：按终浓度1.3mol/L NH4Cl、100mmol/L KHCO3和10mmol/LNa4EDTA称取各试剂，溶解后用NaOH和HCl调节溶液的pH值至7.2～7.4，定容至1000ml。置116℃，灭菌30min；使用时用无菌超纯水进行10倍稀释即可获得红细胞裂解液；需要说明的是，采用红细胞裂解液裂解收集的细胞悬液，裂解效果更加好，培养后的细胞状态更加优，存活率更加高。

经验证，按照上述配方配制的红细胞裂解液相较于商品化裂解液效果更佳，该配方的红细胞裂解液使用比例仅为裂解样品体积的2倍，低于市场上多数红细胞裂解液的3倍用量；对于裂解时间方面，该配方裂解液混匀后直接离心即可，优于商品化裂解液需冷藏环境下作用5-10分钟后再离心，裂解时间更加短，且无需进行冷冻处理，操作更加简单；此外，该配方裂解液培养14天均不见结团，商品化裂解液培养7天左右就开始出现结团，9天后，细胞结团严重；因此，本发明提供的细胞裂解液质量更加，操作和使用更加简单，采用其处理猪PBMC沉淀物制备出来的猪PBMC质量更加好。

此外，在进行步骤S40时，离心处理时，离心的转速为1000～1500rpm，离心的时间为8～12min。

步骤S50、将所述不含红细胞的猪PBMC沉淀物重悬、离心、洗涤，再进行细胞培养，获得猪PBMC。

在进行步骤S50时，具体可以通过以下步骤进行：对不含红细胞的猪PBMC沉淀进行离心，在1000～1500rpm的转速作用下离心8～12min，收集沉淀物，再使用无菌0.01M PBS进行洗涤，获得猪PBMC样品，再将猪PBMC样品接种到培养基上进行培养，其中，培养箱条件为：温度35～37℃，二氧化碳的含量为4.5～5％；此外培养基的配方包括78～89％RPMI 1640、10～20％FBS和1～2％双抗；作为本实施例中的优先实施例，培养基的配方为89％RPMI1640、10％FBS和1％双抗。

以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

前序准备工作：

(1)猪源筛选：挑选30～50日龄的仔猪50头，前腔采血2mL/头，分离血清，进行PCVII、PRV、ASFV、CSFV和PRRSV检测，挑选外源病毒抗原全阴性猪源10头，作为标准猪源样品，将标准猪源分成10份，依次标记为一号标准猪源样品、二号标准猪源样品、三号标准猪源样品、四号标准猪源样品、五号标准猪源样品、六号标准猪源样品、七号标准猪源样品、八号标准猪源样品、九号标准猪源样品、十号标准猪源样品；

(2)物品准备：用无菌PBS配制3％的明胶溶液5L，置于补料瓶中；连接混匀装置、输血管、抗凝液输液管道和抗凝血收集瓶之间的管道，用扎带扎紧接口，用布或牛皮纸包裹各接口后，置116℃，灭菌30min后备用；

按终浓度1.3mol/L的NH₄Cl、100mmol/L的KHCO₃和10mmol/L的Na₄EDTA称取各试剂，溶解后用NaOH和HCl调节溶液的pH值至7.2，定容至1000ml，将其置于116℃的温度下，灭菌30min，使用时用无菌超纯水进行10倍稀释即可获得红细胞裂解液；

采集全血前准备：在超净工作台中，通过补液管道向抗凝液中补加终浓度为100～200U/ml青霉素和0.1～0.2mg/ml链霉素，混匀后冷藏预冷备用；

冷凝装置容器中添加冰水化合物，观测温度计，待温度降低至2～8℃时，将预冷的抗凝液置于冷凝装置中，将输液管卡在泵的动力卡槽上，启动泵，使抗凝液充盈整个管道装置，关闭输血管的控制器，调整泵的转速将抗凝液滴入收集瓶的速度控制在约100滴/min时即可。

实施例1

(1)用消毒液对一号标准猪源样品的体表进行清洗和消毒，再对一号标准猪源样品进行麻醉，放置在已消毒的手术台上，酒精消毒一号标准猪源样品前腔表面，用手术刀划开前腔，找到颈动脉，用两把止血钳分别夹紧颈动脉两端，中间留出约10cm区域，酒精消毒操作区域，在酒精棉火焰保护下，用剪刀划破颈动脉，确定输血管控制器已关闭，取出灭菌的输血管45°斜角插入划破的颈动脉里，顺着颈动脉往近心端推送，在接近近心端止血钳时，松开止血钳，继续往前推送，当可明显感觉到手中的输血管会随着心脏跳动时即可，将输血管近心端入口处卡在固定器上，固定器夹在猪组织上；启动泵和输血管开关，缓慢增大血液流出速率，当抗凝液滴入收集瓶的速度约200滴/min时，抗凝液与全血流出速度相近时即可，收集抗凝血样品；

(2)将采集的抗凝血样品转移至超净工作台，拆除补料瓶上的管道，将抗凝血样品转移到合适的容器中，室温静置20min，静待红细胞沉降；

(3)吸取分层的抗凝血上层，在转速为1000r/min的条件下，离心处理10min，去上清，获得猪PBMC沉淀物；

(4)将所述猪PBMC沉淀物重悬，按照猪PBMC沉淀与红细胞裂解液体积比为1:2的比例加入红细胞裂解液，在转速为1000r/min的条件下，离心处理10min，去上清，获得不含红细胞的猪PBMC沉淀物；

(5)在离心转速为1000rpm的条件下，将所述不含红细胞的猪PBMC沉淀物离心处理10min，洗涤三次，然后进行细胞培养(细胞培养的培养基配方包括79％的RPMI 1640、20％的FBS和1％的双抗)，获得猪PBMC。

实施例2

(1)样品采用二号标准猪源样品，其他步骤与实施例1的步骤1一致；

(2)将采集的抗凝血样品转移至超净工作台，拆除补料瓶上的管道，将抗凝血样品转移到合适的容器中，室温静置30min，静待红细胞沉降；

(3)吸取分层的抗凝血上层，在转速为1200r/min的条件下，离心处理8min，去上清，获得猪PBMC沉淀物；

(4)将所述猪PBMC沉淀物重悬，按照猪PBMC沉淀与红细胞裂解液体积比为1:2的比例加入红细胞裂解液，，在转速为1200r/min的条件下，离心处理8min，去上清，获得不含红细胞的猪PBMC沉淀物；

(5)在离心转速为1200rpm的条件下，将所述不含红细胞的猪PBMC沉淀物离心处理8min，洗涤三次，然后进行细胞培养(细胞培养的培养基配方包括79％的RPMI 1640、20％的FBS和1％的双抗)，获得猪PBMC。

实施例3

(1)样品采用三号标准猪源样品，其他步骤与实施例1的步骤1一致；

(2)将采集的抗凝血样品转移至超净工作台，拆除补料瓶上的管道，将抗凝血样品转移到合适的容器中，室温静置60min，静待红细胞沉降；

(3)吸取分层的抗凝血上层，在转速为1200r/min的条件下，离心处理8min，去上清，获得猪PBMC沉淀物；

(4)将所述猪PBMC沉淀物重悬，按照猪PBMC沉淀与红细胞裂解液体积比为1:2的比例加入红细胞裂解液，，在转速为1200r/min的条件下，离心处理8min，去上清，获得不含红细胞的猪PBMC沉淀物；

(5)在离心转速为1200rpm的条件下，将所述不含红细胞的猪PBMC沉淀物离心处理8min，洗涤三次，然后进行细胞培养(细胞培养的培养基配方包括89％的RPMI 1640、10％的FBS和1％的双抗)，获得猪PBMC。

实施例4

(1)样品采用四号标准猪源样品，其他步骤与实施例1的步骤1一致；

(2)将采集的抗凝血样品转移至超净工作台，拆除补料瓶上的管道，将抗凝血样品转移到合适的容器中，室温静置20min，静待红细胞沉降；

(3)吸取分层的抗凝血上层，在转速为1000r/min的条件下，离心处理10min，去上清，获得猪PBMC沉淀物；

(4)将所述猪PBMC沉淀物重悬，按照猪PBMC沉淀与红细胞裂解液体积比为1:2的比例加入红细胞裂解液，，在转速为1000r/min的条件下，离心处理10min，去上清，获得不含红细胞的猪PBMC沉淀物；

(5)在离心转速为1000rpm的条件下，将所述不含红细胞的猪PBMC沉淀物离心处理10min，洗涤三次，然后进行细胞培养(细胞培养的培养基配方包括89％的RPMI 1640、10％的FBS和1％的双抗)，获得猪PBMC。

实施例5

(1)样品采用四号标准猪源样品，其他步骤与实施例1的步骤1一致；

(2)将采集的抗凝血样品转移至超净工作台，拆除补料瓶上的管道，将抗凝血样品转移到合适的容器中，室温静置20min，静待红细胞沉降；

(3)吸取分层的抗凝血上层，在转速为1500r/min的条件下，离心处理10min，去上清，获得猪PBMC沉淀物；

(4)将所述猪PBMC沉淀物重悬，按照猪PBMC沉淀与红细胞裂解液体积比为1:2的比例加入红细胞裂解液，，在转速为1500r/min的条件下，离心处理10min，去上清，获得不含红细胞的猪PBMC沉淀物；

(5)在离心转速为1500rpm的条件下，将所述不含红细胞的猪PBMC沉淀物离心处理10min，洗涤三次，然后进行细胞培养(细胞培养的培养基配方包括79％的RPMI 1640、20％的FBS和1％的双抗)，获得猪PBMC。

对比例1

采用现有技术，即常规的Ficoll法分离获得猪PBMC。

对比例2

采用实施例1中的步骤制备，除样品采用六号标准猪源样品、在将抗凝液由3％明胶改成肝素外，其他步骤均同实施例1。

对比例3

采用实施例1中的步骤制备，除样品采用七号标准猪源样品、在进行全血采集时改为无冷凝装置，抗凝液未预冷，均在常温常态下制备外，其他步骤均同实施例1。

对比例4

采用实施例1中的步骤制备，除样品采用八号标准猪源样品、在进行全血采集时，不用混匀装置，直接在收集瓶中手动摇动混匀，其他步骤均同实施例1。

对比例5

采用实施例1中的步骤制备，除样品采用九号标准猪源样品、在进行全血采集时，输血管不推进至心脏，仅仅插入动脉，其他步骤均同实施例1。

对比例6

采用实施例1中的步骤制备，除样品采用十号标准猪源样品、在进行步骤(6)时，改为按照猪PBMC沉淀与红细胞裂解液体积比为1:1的比例加入红细胞裂解液外，其他步骤均同实施例1。

分别对实施例1～5、以及对比例1～6中制备的猪PBMC计数，统计猪PBMC总量和存活率，测试结果如表1所示，图5至图7为猪PBMC培养过程中在40x显微镜下的结果图。

表1测试结果

在实施例1～5中，在1000～1500r/min、离心8～10min时，猪PBMC制备总量及制备时间上差异不显著；但培养后FBS含量对猪PBMC存活率影响较大；

对比例1中，采用常规的Ficoll法分离猪PBMC，猪PBMC总量只有1.1×10¹⁰cells，细胞存活率达到96％，制备的细胞中混有红细胞。传统方法对Ficoll试剂的使用量大，成本高；

对比例2中，采用肝素液替代明胶用作抗凝液，红细胞沉淀时间长，仍无法很好分层，细胞制备量低，细胞活力低于90％；

对比例3中，全血收集全程不控制低温环境，制备过程中红细胞破裂多，细胞制备量几乎无影响，但细胞活力有些影响，死细胞增多；

对比例4中，全血收集全程不用混匀装置，直接在收集瓶中手动摇动混匀抗凝血时，红细胞破裂多，少量凝血小块，细胞制备量与细胞活力略有下降；

对比例5中，全血收集全程输血管不推进至心脏，仅仅插入动脉，全血收集量有所减少，总细胞量有所减少，且输血管极易冲出动脉，引起血液外流，引入污染风险；

请参阅图4，对比例6中，按体积比1:1添加自制红细胞裂解液时存在红细胞裂解不完全，大量未裂解的红细胞会影响猪PBMC的纯度，影响后续培养；

本发明实施例1中，猪PBMC总量共计1.1×10¹⁰cells，细胞活率97％，制备耗时6.5h；细胞数量活率、总量、耗时、制备细胞的纯净性和可用性等综合效果均优于对比例。

采用本发明实施例1统计了一批重约15kg健康仔猪制备猪PBMC的相应数据，相应数据按体重进行过折算。并列举出一头12.6kg的健康仔猪制备猪PBMC数据。

经多次研究表明，经过本发明的该标准操作程序制备一头重约15kg仔猪的猪PBMC总量约可达0.5～1.5×10¹⁰个，制备的猪PBMC活率基本在90％以上。实验室细胞制备过程可控制在6.0h左右，制备后的细胞培养时无污染。刚制备的猪PBMC呈圆形，贴壁生长，37℃，5％的CO₂培养箱静置培养约3天，大部分细胞已贴壁，绝大部分呈正圆形，极少量会出现生长，呈长梭形(图5)；培养约7天时，猪PBMC均已贴壁，细胞状态佳，大部分生长，呈长梭形、煎鸡蛋型等，少部分正圆形(图6)；培养到约14天时，细胞状态下降，细胞脱落，漂浮于上层(图7)。

以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种猪外周血单核细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

获得标准猪源样品；

获得全血采血装置；

利用所述全血采血装置从所述猪源样品上采集抗凝血样品，静置分层后吸取上层细胞样品，离心去上层清液，获得猪外周血单核细胞沉淀物；

将所述猪外周血单核细胞沉淀物重悬，加入红细胞裂解液，离心处理，获得不含红细胞的猪外周血单核细胞沉淀物；

将所述不含红细胞的猪外周血单核细胞沉淀物重悬、离心、洗涤，再进行细胞培养，获得猪外周血单核细胞。

2.如权利要求1所述的猪外周血单核细胞的制备方法，其特征在于，在所述获得全血采血装置的步骤中，所述全血采血装置包括：

混匀装置，包括第一容器和三通结构，所述三通结构包括第一支路、第二支路和第三支路，所述第一支路连接至所述第一容器；

全血输出装置，包括输血管，一端连接至所述猪源样品，另外一端连接至所述第二支路，用于将所述猪源样品中的猪全血样品输送至所述第二支路；以及，

冷凝装置，包括第二容器和输液管，所述第二容器内设有抗凝液，所述输液管的一端连接至所述抗凝液，另外一端连接至所述第三支路，用于将所述抗凝液输送至所述第三支路。

3.如权利要求2所述的猪外周血单核细胞的制备方法，其特征在于，所述全血输出装置还包括控制器和固定器，所述控制器和所述固定器间隔设于所述输血管上，且所述控制器设于靠近所述第二支路的一侧；和/或，

所述输血管远离所述第二支路的一端呈倾斜设置。

4.如权利要求2所述的猪外周血单核细胞的制备方法，其特征在于，所述冷凝装置还包括：

第三容器，所述第三容器内形成有容纳腔，所述容纳腔内设有冷凝液；

温度计，设于所述第三容器内，用于检测所述冷凝液的温度；以及，

泵，设于所述输液管上；

其中，所述第二容器设于所述第三容器内，且被所述容置腔内的冷凝液环绕设置。

5.如权利要求2所述的猪外周血单核细胞的制备方法，其特征在于，所述第一支路、所述第二支路和所述第三支路的交界处设有混匀叶片，所述混匀叶片用于搅拌混匀所述抗凝液和所述猪全血样品。

6.如权利要求2所述的猪外周血单核细胞的制备方法，其特征在于，所述抗凝液的组分包含：3％的明胶、100～200U/ml的青霉素、0.1～0.2mg/ml链霉素和无菌0.01mol/L的PBS。

7.如权利要求1所述的猪外周血单核细胞的制备方法，其特征在于，所述利用所述全血采血装置从所述猪源样品上采集抗凝血样品，静置分层后吸取上层细胞样品，离心去上层清液，获得猪外周血单核细胞沉淀物的步骤还包括以下步骤：

将所述标准猪源样品麻醉，利用所述全血采血装置收集所述标准猪源样品的抗凝血；

将所述凝抗血至于无菌环境静置20～60min，分层后吸取上层细胞样品；

将所述上层细胞样品在1000～1500rpm的转速下，离心处理8～12min，去除上层清液，获得猪外周血单核细胞沉淀物。

8.如权利要求1所述的猪外周血单核细胞的制备方法，其特征在于，所述红细胞裂解液包括1.2～1.5mol/L NH₄Cl、90～110mmol/L KHCO₃和8～15mmol/L Na₄EDTA；和/或，

所述红细胞裂解液的pH值为7.2～7.4。

9.如权利要求1所述的猪外周血单核细胞的制备方法，其特征在于，所述细胞培养的培养基配方包括78～89％RPMI 1640、10～20％FBS和1～2％双抗。

10.如权利要求1所述的猪外周血单核细胞的制备方法，其特征在于，所述获得标准猪源样品的步骤还包括以下步骤：

采集1～2ml的猪源样品的血清，分离血清，获得猪血清；

对所述猪血清分别进行猪圆环病毒II型、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒检测，筛选获得标准猪源样品。