CN113406337A - 能够用于培养PRRSV获得高病毒含量病毒液的Marc-145细胞株的筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种能够用于培养PRRSV获得高病毒含量病毒液的Marc‑145细胞株的筛选方法，属于生物工程技术领域。本发明提供的方法包括利用间接免疫荧光法检测由候选Marc‑145单克隆细胞株繁殖形成的Marc‑145单克隆细胞群中细胞表面存在CD163受体的细胞占Marc‑145细胞群的百分比，再根据该百分比筛选出能够用于培养PRRSV获得高病毒含量病毒液的Marc‑145细胞株，具有快速、方便、客观、准确的优势，还能够基于此预测由Marc‑145细胞群培养PRRSV获得的病毒液中病毒含量，可以指导疫苗生产。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种能够用于培养PRRSV获得高病毒含量病毒液的Marc-145细胞株的筛选方法，特别涉及一种利用免疫荧光方法检测细胞表面CD163受体从而快速、方便、客观、准确筛选能够用于培养PRRSV获得高病毒含量病毒液的Marc-145细胞株的方法，以及利用免疫荧光方法检测Marc-145细胞表面CD163受体来预测利用该细胞体外培养增殖PRRSV所获得的病毒液中病毒含量的方法及其在疫苗制备中的应用。
背景技术
猪繁殖和呼吸障碍综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS，俗称蓝耳病)是由猪繁殖和呼吸综合征病毒(porcine reproductive andrespiratory syndrome virus，PRRSV，俗称蓝耳病毒)所引起的一种接触性传染病，主要侵害猪的呼吸系统和繁殖系统。猪被该病毒感染后，先在局部易感巨噬细胞中复制，然后迅速向全身淋巴组织和肺部扩散。大约一周左右，病猪出现高烧不退、腹泻等症状，怀孕母猪染病后易流产、早产、产死胎等。目前猪场针对猪繁殖和呼吸障碍综合征主要以PRRSV疫苗预防为主，其中在PRRSV疫苗的生产中主要采用哺乳动物细胞作为PRRSV增殖的基质，具有重复性高、生产稳定、抗原特异性更接近自然株、变态反应少等优势。
Marc-145细胞属于恒河猴肾细胞系，是目前PRRSV体外增殖的最主要宿主细胞，也是最适用于生产PRRSV疫苗的哺乳动物细胞之一。目前，国内外PRRSV疫苗生产时，常采用贴壁培养的Marc-145细胞或悬浮培养的Marc-145细胞增殖病毒PRRSV，收获的病毒液中病毒含量的高低是决定疫苗质量和疫苗效力的关键因素，因此筛选能够用于培养PRRSV获得高病毒含量的病毒液的Marc-145细胞株对于PRRSV疫苗的研究和生产具有重要意义。
现有技术中，用于培养PRRSV以获得高病毒含量病毒液的Marc-145细胞株的筛选方法普遍为病毒感染法(例如专利文献CN103966157A，以下称文献1)，其利用不同的Marc-145细胞株在96孔培养板中长满单层细胞(称为Marc-145单克隆细胞群)后接种PRRSV，共培养48h后观察细胞病变情况，挑选细胞病变明显的细胞株用于体外培养增殖PRRSV，以获得高病毒含量的病毒液。由于病毒感染后的细胞病变情况直接反应该病毒在该细胞的培养体系中的增殖能力和毒力大小，进而可以准确、客观筛选出能够用于培养PRRSV以获得高病毒含量病毒液的Marc-145细胞株。然而，上述文献1公开的病毒感染法在筛选能得到高病毒含量的细胞株过程中需要向待筛选细胞株中接种病毒，随后还需共培养48h左右以观察细胞病变情况，因此存在操作繁琐、费时长的问题，并且在接种病毒过程中还可能存在感染的风险。
发明内容
针对现有技术中存在的一个或多个问题，本发明一个方面提供一种能够用于培养PRRSV获得高病毒含量病毒液的Marc-145细胞株的筛选方法，其包括以下步骤：
检测：利用间接免疫荧光法检测由候选Marc-145单克隆细胞株繁殖形成的Marc-145单克隆细胞群中细胞表面存在CD163受体的细胞占Marc-145细胞群的百分比；
筛选：将所述百分比≥50％对应的候选Marc-145单克隆细胞株作为能够用于培养PRRSV获得高病毒含量病毒液的Marc-145细胞株；
其中所述高病毒含量病毒液是指病毒含量≥107.0TCID50/ml的病毒液。
上述筛选方法中，筛选标准更优为：所述百分比≥80％，所述高病毒含量病毒液中病毒含量≥108.0TCID50/ml。
上述筛选方法中，所述细胞表面存在CD163受体的细胞为利用间接免疫荧光法检测到的细胞表面出现特异性荧光的细胞。
上述筛选方法中，所述候选Marc-145单克隆细胞株为候选Marc-145单克隆贴壁细胞株或候选Marc-145单克隆悬浮细胞株，由所述候选Marc-145单克隆贴壁细胞株繁殖形成的细胞群为Marc-145单克隆贴壁细胞群，由所述候选Marc-145单克隆悬浮细胞株繁殖形成的细胞群为Marc-145单克隆悬浮细胞群。
上述筛选方法中，由所述候选Marc-145单克隆贴壁细胞株繁殖形成Marc-145单克隆贴壁细胞群的具体操作为：将所述候选Marc-145单克隆贴壁细胞株按照1个细胞/孔接种于细胞培养板，置于37±1℃5％CO2的条件下用含10％新生牛血清的DMEM培养基培养7～14天，得到Marc-145单克隆贴壁细胞群。
上述筛选方法中，由所述候选Marc-145单克隆悬浮细胞株繁殖形成Marc-145单克隆悬浮细胞群的具体操作为：将所述候选Marc-145单克隆悬浮细胞株按照1个细胞/板接种于半固体琼脂糖平板中，置于37±1℃5％CO2的条件下用CD293培养基培养7～14天，得到Marc-145单克隆悬浮细胞群。
上述筛选方法中，所述间接免疫荧光法中所使用的一抗为抗CD163单克隆抗体，使用的二抗为FITC标记羊抗鼠IgG二抗。
本发明另一方面提供一种利用Marc-145细胞群培养PRRSV获得的病毒液中病毒含量的预测方法，其包括利用间接免疫荧光法检测所述Marc-145细胞群中细胞表面存在CD163受体的细胞占Marc-145细胞群的百分比，通过该百分比数值预测病毒液中病毒含量；
预测判断标准为：
若所述Marc-145细胞群中细胞表面存在CD163受体的细胞占比达到50％，则利用该Marc-145细胞群培养PRRSV获得的病毒液中病毒含量平均值不低于107.0TCID50/ml；
若所述Marc-145细胞群中细胞表面存在CD163受体的细胞占比达到80％，则利用该Marc-145细胞群培养PRRSV获得的病毒液中病毒含量平均值不低于108.0TCID50/ml；
若所述Marc-145细胞群中细胞表面存在CD163受体的细胞占比低于40％，则利用该Marc-145细胞群培养PRRSV获得的病毒液中病毒含量平均值低于107.0TCID50/ml。
上述预测方法中，所述预测判断标准为：
若所述Marc-145细胞群中细胞表面存在CD163受体的细胞占比达到90％，则利用该Marc-145细胞群培养PRRSV获得的病毒液中病毒含量平均值不低于108.44TCID50/ml；
若所述Marc-145细胞群中细胞表面存在CD163受体的细胞占比达到80％，则利用该Marc-145细胞群培养PRRSV获得的病毒液中病毒含量平均值不低于108.11TCID50/ml；
若所述Marc-145细胞群中细胞表面存在CD163受体的细胞占比达到70％，则利用该Marc-145细胞群培养PRRSV获得的病毒液中病毒含量平均值不低于107.61TCID50/ml；
若所述Marc-145细胞群中细胞表面存在CD163受体的细胞占比达到50％，则利用该Marc-145细胞群培养PRRSV获得的病毒液中病毒含量平均值不低于107.22TCID50/ml。
上述预测方法中，所述Marc-145细胞群为Marc-145多克隆贴壁细胞群、Marc-145多克隆悬浮细胞群、Marc-145单克隆贴壁细胞群和Marc-145单克隆悬浮细胞群中的任一种；其中所述Marc-145多克隆贴壁细胞群为由多种不同的Marc-145贴壁细胞株繁殖形成，所述Marc-145多克隆悬浮细胞群为由多种不同的Marc-145悬浮细胞株繁殖形成。
基于以上技术方案提供的筛选方法利用间接免疫荧光方法检测Marc-145单克隆细胞群中细胞表面出现特异性荧光的细胞(即细胞表面存在CD163受体的细胞)占细胞群的百分比，可以快速(即利用间接免疫荧光方法检测细胞表面存在CD163受体的细胞占细胞群的百分比的时间，约3h)、方便、准确、客观筛选出能够用于培养PRRSV以获得高病毒含量(不低于107.0TCID50/ml，甚至不低于108.0TCID50/ml)病毒液的Marc-145细胞株，相对于上述文献1病毒感染的方法(不低于48h)效率更高，并且可以避免上述文献1中公开的病毒感染法中需要向Marc-145单克隆细胞群接种病毒而存在的潜在感染风险。
另一方面，本发明提供的方法还可以用于预测由Marc-145细胞群生产的病毒液中的PRRSV病毒含量，经验证，当Marc-145细胞群(包括Marc-145单克隆细胞群和Marc-145多克隆细胞群(由多种不同的Marc-145细胞株繁殖形成))中细胞表面存在CD163受体的细胞占比达到50％，则利用该Marc-145细胞群培养PRRSV获得的病毒液中病毒含量平均值不低于107.0TCID50/ml；若所述Marc-145细胞群中细胞表面存在CD163受体的细胞占比达到80％，则利用该Marc-145细胞群培养PRRSV获得的病毒液中病毒含量平均值不低于108.0TCID50/ml，若所述Marc-145细胞群中细胞表面存在CD163受体的细胞占比低于40％，则利用该Marc-145细胞群培养PRRSV获得的病毒液中病毒含量平均值低于107.0TCID50/ml。基于以上方法，在PRRSV疫苗生产过程中，在向用于生产PRRSV病毒液的Marc-145细胞群中接种PRRSV种毒之前可以先通过检测Marc-145细胞群中细胞表面存在CD163受体的细胞在细胞群中所占的百分比来提前预估由该Marc-145细胞群待生产的病毒液中PRRSV病毒含量，做到不需要接种种毒就可以提前预估所生产的病毒液中的病毒含量，例如，如果按照上述预测标准预估的病毒液中病毒含量不低于107.0TCID50/ml，就可以直接进行病毒液的生产，如果预估的病毒液中病毒含量低于107.0TCID50/ml，就选择更换为能获得更高病毒含量的病毒液的Marc-145细胞群，因此可以保证疫苗的质量，并提高疫苗的生产效率，进而可以指导疫苗生产。
附图说明
图1为Marc-145多克隆贴壁细胞群的间接免疫荧光照片；
图2为E7P单克隆贴壁细胞群的间接免疫荧光照片；
图3为F9P单克隆贴壁细胞群的间接免疫荧光照片；
图4为C8P单克隆贴壁细胞群的间接免疫荧光照片；
图5为D9P单克隆贴壁细胞群的间接免疫荧光照片。
具体实施方式
针对现有技术中存在的通过病毒感染法筛选用于培养PRRSV以获得高病毒含量病毒液的Marc-145细胞株中需要向Marc-145单克隆细胞群(由单个Marc-145细胞株繁殖形成的细胞群)接种病毒而可能存在安全问题以及耗时长的缺陷，本发明旨在利用间接免疫荧光方法检测Marc-145单克隆细胞群中细胞表面出现特异性荧光的细胞(即细胞表面存在CD163受体的细胞)占细胞群的百分比，从而可以快速、方便、准确、客观筛选出能够用于培养PRRSV以获得高病毒含量(不低于107.0TCID50/ml，甚至不低于108.0TCID50/ml)病毒液的Marc-145细胞株，可以避免现有的病毒感染法中需要向Marc-145单克隆细胞群接种病毒而存在的潜在感染风险和耗时长的问题。
已知PRRSV入侵靶细胞与细胞表面受体密切相关，且已发现多种细胞受体和关键分子在PRRSV感染过程中发挥作用，包括CD163受体、唾液酸黏附素(Sn或CD169)、硫酸乙酰肝素(HepS)、波形蛋白(Vimentin)、CD151受体以及MYH9、CD209和Siglecs(例如Siglec-10)分子等。其中CD163受体、波形蛋白、CD151受体、MYH9和Siglecs是Marc-145细胞表面存在的主要参与PRRSV感染和入侵Marc-145细胞的受体和关键分子，均在PRRSV结合感染Marc-145细胞以及病毒内化过程中发挥重要作用，例如波形蛋白可参与PRRSV与其他细胞骨架细丝结合与介导PRRSV的细胞内转运，MYH9和CD163受体可在PRRSV感染细胞过程中共同作用促进病毒内化，CD163受体可与不同的Siglecs结合从而参与病毒入侵过程等(参见叶梦雪等人，猪繁殖与呼吸综合征病毒受体及其在病毒感染中的作用研究进展，动物医学进展，2020，41(12)：102-107，以下称文献2)。显然，使用天然Marc-145细胞体外培养增殖PRRSV获得的病毒液中的病毒含量应与Marc-145细胞表面存在的所有参与PRRSV感染和入侵Marc-145细胞的受体和关键分子的总含量密切相关，而不取决于其中一种受体或关键分子的含量，这些受体和关键分子的总含量越高，感染细胞并内化的病毒数量就可能越多，就越有可能获得高病毒含量的病毒液，并且现有技术(例如专利文献CN103525773A)已经通过基因重组方法构建能够表达这些受体和分子(例如硫酸乙酰肝素、唾液酸粘附素、波形蛋白、CD163、CD151等)中的单个或多个的Marc-145细胞来增加Marc-145细胞表面的受体和分子含量，进而提高PRRSV感染滴度。
然而，发明人在PRRSV疫苗生产过程中惊讶发现，在天然Marc-145细胞群(包括由不同的Marc-145细胞株繁殖形成的多克隆细胞群和由单株Marc-145细胞繁殖形成的单克隆细胞群)中并非本领域中普遍所认为的所有的Marc-145细胞表面都存在CD163受体(例如参见上述文献2，第106页左栏最后一段)，并且在该Marc-145细胞群中细胞表面存在CD163受体的细胞(利用间接免疫荧光方法检测为细胞表面出现特异性亮绿色荧光的细胞)占细胞群的百分比与使用该Marc-145细胞群体外培养增殖PRRSV获得的病毒液中的病毒含量(TCID50)具有直接的正相关关系，而无需考虑Marc-145细胞表面上所有参与PRRSV感染和入侵Marc-145细胞的受体和关键分子的总含量。因此，发明人认为可以通过利用间接免疫荧光方法检测Marc-145细胞群中细胞表面出现特异性荧光的细胞(即细胞表面存在CD163受体的细胞)占细胞群的百分比来表征利用该细胞群体外培养增殖PRRSV所获得的病毒液的病毒含量，进而可以利用间接免疫荧光方法检测由单株Marc-145细胞繁殖形成的单克隆细胞群中细胞表面存在CD163受体的细胞占细胞群的百分比来筛选能够用来培养增殖PRRSV以获得高病毒含量(107.0TCID50/ml以上，甚至达到108.0TCID50/ml以上)病毒液的Marc-145细胞株。经验证，当Marc-145单克隆细胞群中细胞表面存在CD163受体的细胞占比达到50％时，利用该Marc-145单克隆细胞群体外培养增殖PRRSV获得的病毒液中病毒含量不低于107.0TCID50/ml；当Marc-145单克隆细胞群中细胞表面存在CD163受体的细胞占比达到80％时，利用该Marc-145单克隆细胞群体外培养增殖PRRSV获得的病毒液中病毒含量不低于108.0TCID50/ml，进而可以筛选出能够用来培养增殖PRRSV以获得高病毒含量病毒液的Marc-145细胞株。基于此，发明人还认为可以通过利用间接免疫荧光方法检测Marc-145细胞群(包括Marc-145多克隆细胞群(贴壁或悬浮)和Marc-145单克隆细胞群(贴壁或悬浮))中细胞表面存在CD163受体的细胞占细胞群的百分比来预测利用该细胞群体外培养增殖PRRSV所获得的病毒液中病毒的含量，进而可以用于指导PRRSV疫苗的生产。
通过以下具体实施方式详细说明本发明。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但不应作为对本发明内容的限制。
实施例1：间接免疫荧光方法检测Marc-145贴壁细胞CD163受体
该实施例利用间接免疫荧光方法检测Marc-145多克隆贴壁细胞群(由不同的Marc-145贴壁细胞株繁殖形成的多克隆贴壁细胞群)中细胞表面的CD163受体，并利用该多克隆贴壁细胞群体外培养增殖PRRSV，以测定所获得的病毒液中的病毒含量，具体包括以下操作。
1.1、Marc-145贴壁细胞的培养：将Marc-145贴壁细胞(金宇保灵生物药品有限公司兽用疫苗国家工程实验室保存)在细胞培养瓶中培养，生长液为含有10％(体积百分比)新生牛血清的DMEM培养基(商购)，在37℃5％CO2的恒温培养箱中培养，2～3天传代1次，长满单层细胞。用胰酶消化后，加入生长液制成细胞悬液以3×105个/ml的密度接种于96孔板，每孔100μL，置于37℃5％CO2的条件下培养，48h后细胞贴壁铺满孔底。
1.2、间接免疫荧光方法检测Marc-145贴壁细胞群中细胞表面CD163受体
(1)洗涤：弃去步骤1.1中96孔板的孔中生长液，用PBS洗涤3次，每次5min；
(2)固定：将-20℃、80％丙酮溶液加入细胞孔中，于2～8℃冰箱中固定30min，PBS洗涤3次，每次5min；
(3)一抗孵育：用PBS稀释抗CD163单克隆抗体(购自abcam)，稀释倍数为200倍，加入细胞孔中，湿盒37℃孵育60min，用PBS洗涤3次，每次5min；
(4)二抗孵育：用PBS稀释FITC标记羊抗鼠IgG二抗(购自siama)，稀释倍数为300倍，加入一抗孵育后的细胞孔中，湿盒37℃孵育60min，用PBS洗涤3次，每次5min；
(5)荧光观察及结果判定：将96孔板置于荧光倒置显微镜上观察，观察在暗室中进行。
荧光观察结果如图1(放大倍率为10倍)所示，可见由不同的Marc-145细胞株繁殖形成的多克隆贴壁细胞群中只有部分细胞的细胞膜有特异性荧光，这类细胞在细胞群中的占比约为50％，证明了在Marc-145多克隆贴壁细胞群中并非所有的Marc-145细胞表面都存在CD163受体。
1.3、利用多克隆贴壁细胞群体外培养增殖PRRSV并测定收获的病毒液中病毒含量
向步骤1.1的长满单层Marc-145贴壁细胞的培养瓶中按照1％接毒量接种PRRSV种毒(金宇保灵生物药品有限公司兽用疫苗国家工程实验室保存)，加入含有2％新生牛血清的DMEM维持液(商购)，于37℃培养36～48h有80％以上的细胞出现细胞病变，收获病毒液(重复三次)，按Reed-Muench法计算TCID50值作为病毒含量，结果见下表1。可见利用该多克隆细胞群体外培养增殖PRRSV获得的病毒液中病毒含量基本保持在107.33TCID50/ml左右。
实施例2：能够用于培养PRRSV以获得高病毒含量的病毒液的Marc-145单克隆贴壁细胞株的筛选
该实施例利用间接免疫荧光方法检测Marc-145贴壁细胞群(由单一Marc-145贴壁细胞株繁殖形成的单克隆贴壁细胞群)中细胞表面的CD163受体，并利用该单克隆贴壁细胞群体外培养增殖PRRSV，以测定所获得的病毒液中的病毒含量，具体包括以下操作。
2.1、Marc-145单克隆贴壁细胞群的获得：将实施例1中步骤1.1长满单层且状态良好无外源病毒污染的Marc-145贴壁细胞用胰酶消化成单个散在细胞，用含10％新生牛血清的DMEM培养基稀释细胞，按照1～2个细胞/孔接种于96孔细胞培养板，置于37℃5％CO2的条件下培养，标记只含1个细胞的孔，将这些细胞株分别命名为：D7、E7、G10、F9、F2、H5、C8、D9，待各孔中细胞数量增加后进行扩大培养(约7～14天，10％新生牛血清的DMEM培养基)，得到由单一Marc-145单克隆贴壁细胞株繁殖形成的Marc-145单克隆贴壁细胞群，对应于单克隆贴壁细胞株分别命名为：D7P、E7P、G10P、F9P、F2P、H5P、C8P、D9P。
2.2、按照实施例1中步骤1.2的间接免疫荧光检测方法分别检测各个Marc-145单克隆贴壁细胞群中细胞表面的CD163受体。
结果如图2-图5(放大倍率均为10倍)所示，仅示例性示出了E7P、F9P、C8P和D9P单克隆贴壁细胞群的荧光照片，其中图2为E7P单克隆贴壁细胞群的荧光照片，图3为F9P单克隆贴壁细胞群的荧光照片，图4为C8P单克隆贴壁细胞群的荧光照片，图5为D9P单克隆贴壁细胞群的荧光照片。明显可见，不同的单克隆贴壁细胞群中也都只有部分细胞的细胞膜有特异性荧光，且这类细胞膜具有特异性荧光的细胞在不同的单克隆贴壁细胞群中所占百分比也不同，即在不同的单克隆贴壁细胞群中，细胞表面存在CD163受体的细胞所占的百分比是有差异的，其中这类细胞在各个单克隆贴壁细胞群中所占的百分比示于下表1中。明显可见，这类细胞膜具有特异性荧光的细胞(即细胞表面存在CD163受体的细胞)在E7P单克隆贴壁细胞群中的占比最高，达到约90％，而在F9P单克隆贴壁细胞群中的占比最低，仅为约20％。
2.3、按照实施例1中步骤1.3的方法利用步骤2.1获得的各Marc-145单克隆贴壁细胞群体外培养增殖PRRSV，并测定所获得的病毒液中病毒含量，结果见下表1。可见利用其中细胞表面存在CD163受体的细胞所占百分比不同的Marc-145单克隆贴壁细胞群体外培养增殖PRRSV获得的病毒液中病毒含量也不同，并且随着细胞表面存在CD163受体的细胞占单克隆贴壁细胞群百分比的升高，利用该单克隆贴壁细胞群所获得的病毒液中病毒含量也升高，两者之间呈现明显正相关关系。
根据表1所列数据，明显可见，当细胞表面存在CD163受体的细胞在单克隆贴壁细胞群中的占比达到约50％时，利用该单克隆贴壁细胞群体外培养增殖PRRSV的多次重复试验所获得的病毒液中病毒含量均不低于107.0TCID50/ml，平均值约为107.22-107.39TCID50/ml；当细胞表面存在CD163受体的细胞在单克隆贴壁细胞群中的占比达到约70％时，利用该单克隆贴壁细胞群体外培养增殖PRRSV的多次重复试验所获得的病毒液中病毒含量均不低于107.5TCID50/ml，平均值约为107.67TCID50/ml；当细胞表面存在CD163受体的细胞在单克隆贴壁细胞群中的占比达到约80％时，利用该单克隆贴壁细胞群体外培养增殖PRRSV的多次重复试验所获得的病毒液中病毒含量均不低于108.0TCID50/ml，平均值约为108.11TCID50/ml；当细胞表面存在CD163受体的细胞在单克隆贴壁细胞群中的占比达到约90％时，利用该单克隆贴壁细胞群体外培养增殖PRRSV的多次重复试验所获得的病毒液中病毒含量均不低于108.33TCID50/ml，平均值约为108.44TCID50/ml；而当细胞表面存在CD163受体的细胞在单克隆贴壁细胞群中的占比小于约50％时，利用该单克隆贴壁细胞群体外培养增殖PRRSV的多次重复试验所获得的病毒液中病毒含量均低于107.0TCID50/ml。即当细胞表面存在CD163受体的细胞在单克隆贴壁细胞群中的占比达到50％时，利用该单克隆贴壁细胞群体外培养增殖PRRSV所获得的病毒液中病毒含量可以达到107.0TCID50/ml；当细胞表面存在CD163受体的细胞在单克隆贴壁细胞群中的占比达到80％时，利用该单克隆贴壁细胞群体外培养增殖PRRSV所获得的病毒液中病毒含量可以达到108.0TCID50/ml。因此可以直接利用细胞表面存在CD163受体的细胞在单克隆贴壁细胞群中的占比筛选出能够用来培养增殖PRRSV以获得高病毒含量(不低于107.0TCID50/ml，甚至不低于108.0TCID50/ml)病毒液的Marc-145单克隆贴壁细胞株，因此在表1所列的多种Marc-145单克隆细胞株中，E7单克隆贴壁细胞株是能够用于培养增殖PRRSV以获得最高病毒含量(平均达到108.44TCID50/ml左右)病毒液的Marc-145贴壁细胞株，此外，D7、F2、C8和D9单克隆贴壁细胞株也是均能够用于培养增殖PRRSV以获得病毒含量为不低于107.0TCID50/ml的病毒液的Marc-145贴壁细胞株。
表1：各单克隆细胞群中细胞表面存在CD163受体的细胞占比以及利用该单克隆细胞群培养增殖PRRSV获得的病毒液中病毒含量
实施例3：间接免疫荧光方法检测Marc-145悬浮细胞CD163受体
该实施例利用间接免疫荧光方法检测Marc-145多克隆悬浮细胞群(由不同的Marc-145悬浮细胞株繁殖形成的多克隆悬浮细胞群)中细胞表面的CD163受体，并利用该多克隆悬浮细胞群体外培养增殖PRRSV，以测定所获得的病毒液中的病毒含量，具体包括以下操作。
3.1、Marc-145悬浮细胞群的培养：将Marc-145悬浮细胞(金宇保灵生物药品有限公司兽用疫苗国家工程实验室保存)在细胞培养瓶中培养，生长液为CD293培养基(商购)，在37℃5％CO2的恒温振荡培养箱中培养，培养2～3天，待细胞密度达到2×106个/ml以上时，用CD293培养基将Marc-145悬浮细胞稀释至0.5-0.8×106个/ml进行传代，待细胞生长至对数生长期时取细胞悬液滴加至载玻片上，置于超净台中进行风干。
3.2、间接免疫荧光方法检测Marc-145悬浮细胞群中细胞表面CD163受体
(1)固定：将-20℃、80％丙酮溶液滴加至载玻片上的细胞悬液中，于2～8℃冰箱中固定30min，PBS洗涤3次，每次5min；
(2)一抗孵育：用PBS稀释抗CD163单克隆抗体(购自abcam)，稀释倍数为200倍，滴加至载玻片上，湿盒37℃孵育60min，用PBS洗涤3次，每次5min；
(3)二抗孵育：用PBS稀释FITC标记羊抗鼠IgG二抗(购自sigma)，稀释倍数为300倍，滴加至一抗孵育后的载玻片上，湿盒37℃孵育60min，用PBS洗涤3次，每次5min；
(4)荧光观察及结果判定：将载玻片置于荧光倒置显微镜上观察，观察在暗室中进行。
3.3、向步骤3.1的培养瓶中的细胞密度达到2×106个/ml的Marc-145悬浮细胞液中按照1％接毒量接种PRRSV种毒，加入含有2％新生牛血清的DMEM维持液，于37℃培养36～48h有80％以上的细胞出现细胞病变，收获病毒液(重复三次)，按Reed-Muench法计算TCID50值作为病毒含量。
以上荧光观察结果和病毒含量检测结果表明，与上述实施例1的结果一致，也可见由不同的Marc-145悬浮细胞株繁殖形成的多克隆悬浮细胞群中只有部分细胞的细胞膜有特异性荧光，证明了在Marc-145多克隆悬浮细胞群中并非所有的Marc-145细胞表面都存在CD163受体。并且根据间接免疫荧光方法检测到的细胞表面存在CD163受体的细胞在Marc-145多克隆悬浮细胞群中的占比与利用该Marc-145多克隆悬浮细胞群体外培养增殖PRRSV获得的病毒液中病毒含量之间的关系符合上表1所示的规律。
实施例4：能够用于培养PRRSV以获得高病毒含量的病毒液的Marc-145单克隆悬浮细胞株的筛选
该实施例利用间接免疫荧光方法检测Marc-145悬浮细胞群(由单一Marc-145悬浮细胞株繁殖形成的单克隆悬浮细胞群)中细胞表面的CD163受体，并利用该单克隆悬浮细胞群体外培养增殖PRRSV，以测定所获得的病毒液中的病毒含量，具体包括以下操作。
4.1、Marc-145单克隆悬浮细胞群的获得：将Marc-145悬浮细胞在三角瓶中培养，生长液为CD293培养基，置于37℃5％CO2的恒温振荡培养箱中培养，培养2～3天，待细胞密度达到2×106个/ml以上时，用CD293培养基将Marc-145悬浮细胞稀释至0.5-0.8×106个/ml进行传代，将处于对数生长期的Marc-145悬浮细胞用CD293培养基进行稀释成单个散在悬浮细胞，取多个单个散在悬浮细胞在半固体琼脂糖平板中培养，待单个悬浮细胞增殖成细胞团后进行扩大培养(约7～14天，CD293培养基)，得到对应的一系列由Marc-145单克隆细胞株繁殖形成的Marc-145单克隆悬浮细胞群。
4.2、待步骤4.1的各悬浮细胞群中的细胞生长至对数生长期时取细胞悬液滴加至载玻片上，置于超净台中进行风干，按照实施例3中步骤3.2的间接免疫荧光方法检测各Marc-145悬浮细胞群中细胞表面CD163受体。
4.3、按照实施例3中步骤3.3的方法利用步骤4.1获得的各Marc-145单克隆悬浮细胞群体外培养增殖PRRSV，并测定所获得的病毒液中病毒含量。
结果与实施例2获得的结果一致，利用其中细胞表面存在CD163受体的细胞所占百分比不同的Marc-145单克隆悬浮细胞群体外培养增殖PRRSV获得的病毒液中病毒含量也不同，并且随着细胞表面存在CD163受体的细胞占单克隆悬浮细胞群百分比的升高，利用该单克隆悬浮细胞群所获得的病毒液中病毒含量也升高，两者之间呈现如实施例2所述的明显正相关关系。即当细胞表面存在CD163受体的细胞在单克隆悬浮细胞群中的占比达到50％时，利用该单克隆悬浮细胞群体外培养增殖PRRSV所获得的病毒液中病毒含量可以达到107.0TCID50/ml；当细胞表面存在CD163受体的细胞在单克隆悬浮细胞群中的占比达到80％时，利用该单克隆悬浮细胞群体外培养增殖PRRSV所获得的病毒液中病毒含量可以达到108.0TCID50/ml。因此也可以直接利用细胞表面存在CD163受体的细胞在单克隆悬浮细胞群中的占比筛选出能够用来培养增殖PRRSV以获得高病毒含量(不低于107.0TCID50/ml，甚至不低于108.0TCID50/ml)病毒液的Marc-145单克隆悬浮细胞株。
综上所述，可以通过利用间接免疫荧光方法检测Marc-145细胞群(Marc-145单克隆细胞群(贴壁或悬浮))中细胞表面存在CD163受体的细胞占细胞群的百分比来筛选能够用于体外培养增殖PRRSV以获得高病毒含量(例如不低于107.0TCID50/ml，甚至不低于108.0TCID50/ml)病毒液的Marc-145细胞株(包括Marc-145贴壁细胞株和Marc-145悬浮细胞株)。基于此，也可以利用间接免疫荧光方法检测Marc-145细胞群(包括Marc-145多克隆细胞群(贴壁或悬浮)和Marc-145单克隆细胞群(贴壁或悬浮))中细胞表面存在CD163受体的细胞占细胞群的百分比来预测利用该细胞群体外培养增殖PRRSV所获得的病毒液中病毒的含量，进而可以用于指导PRRSV疫苗的生产，预测判断标准为：若Marc-145细胞群中细胞表面存在CD163受体的细胞占比达到50％，则利用该Marc-145细胞群培养PRRSV获得的病毒液中病毒含量平均值不低于107.0TCID50/ml；若Marc-145细胞群中细胞表面存在CD163受体的细胞占比达到80％，则利用该Marc-145细胞群培养PRRSV获得的病毒液中病毒含量平均值不低于108.0TCID50/ml。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种能够用于培养PRRSV获得高病毒含量病毒液的Marc-145细胞株的筛选方法，其包括以下步骤：
检测：利用间接免疫荧光法检测由候选Marc-145单克隆细胞株繁殖形成的Marc-145单克隆细胞群中细胞表面存在CD163受体的细胞占Marc-145细胞群的百分比；
筛选：将所述百分比≥50％对应的候选Marc-145单克隆细胞株作为能够用于培养PRRSV获得高病毒含量病毒液的Marc-145细胞株；
其中所述高病毒含量病毒液是指病毒含量≥107.0TCID50/ml的病毒液。
2.根据权利要求1所述的筛选方法，其中筛选标准更优为：所述百分比≥80％，所述高病毒含量病毒液中病毒含量≥108.0TCID50/ml。
3.根据权利要求1或2所述的筛选方法，其中所述细胞表面存在CD163受体的细胞为利用间接免疫荧光法检测到的细胞表面出现特异性荧光的细胞。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的筛选方法，其中所述候选Marc-145单克隆细胞株为候选Marc-145单克隆贴壁细胞株或候选Marc-145单克隆悬浮细胞株，由所述候选Marc-145单克隆贴壁细胞株繁殖形成的细胞群为Marc-145单克隆贴壁细胞群，由所述候选Marc-145单克隆悬浮细胞株繁殖形成的细胞群为Marc-145单克隆悬浮细胞群。
5.根据权利要求4所述的筛选方法，其中由所述候选Marc-145单克隆贴壁细胞株繁殖形成Marc-145单克隆贴壁细胞群的具体操作为：
将所述候选Marc-145单克隆贴壁细胞株按照1个细胞/孔接种于细胞培养板，置于37±1℃5％CO2的条件下用含10％新生牛血清的DMEM培养基培养7～14天，得到Marc-145单克隆贴壁细胞群。
6.根据权利要求4所述的筛选方法，其中由所述候选Marc-145单克隆悬浮细胞株繁殖形成Marc-145单克隆悬浮细胞群的具体操作为：
将所述候选Marc-145单克隆悬浮细胞株按照1个细胞/板接种于半固体琼脂糖平板中，置于37±1℃5％CO2的条件下用CD293培养基培养7～14天，得到Marc-145单克隆悬浮细胞群。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的筛选方法，其中所述间接免疫荧光法中所使用的一抗为抗CD163单克隆抗体，使用的二抗为FITC标记羊抗鼠IgG二抗。
8.一种利用Marc-145细胞群培养PRRSV获得的病毒液中病毒含量的预测方法，其包括利用间接免疫荧光法检测所述Marc-145细胞群中细胞表面存在CD163受体的细胞占Marc-145细胞群的百分比，通过该百分比数值预测病毒液中病毒含量；
预测判断标准为：
若所述Marc-145细胞群中细胞表面存在CD163受体的细胞占比达到50％，则利用该Marc-145细胞群培养PRRSV获得的病毒液中病毒含量平均值不低于107.0TCID50/ml；
若所述Marc-145细胞群中细胞表面存在CD163受体的细胞占比达到80％，则利用该Marc-145细胞群培养PRRSV获得的病毒液中病毒含量平均值不低于108.0TCID50/ml；
若所述Marc-145细胞群中细胞表面存在CD163受体的细胞占比低于40％，则利用该Marc-145细胞群培养PRRSV获得的病毒液中病毒含量平均值低于107.0TCID50/ml。
9.根据权利要求8所述的预测方法，所述预测判断标准为：
若所述Marc-145细胞群中细胞表面存在CD163受体的细胞占比达到90％，则利用该Marc-145细胞群培养PRRSV获得的病毒液中病毒含量平均值不低于108.44TCID50/ml；
若所述Marc-145细胞群中细胞表面存在CD163受体的细胞占比达到80％，则利用该Marc-145细胞群培养PRRSV获得的病毒液中病毒含量平均值不低于108.11TCID50/ml；
若所述Marc-145细胞群中细胞表面存在CD163受体的细胞占比达到70％，则利用该Marc-145细胞群培养PRRSV获得的病毒液中病毒含量平均值不低于107.61TCID50/ml；
若所述Marc-145细胞群中细胞表面存在CD163受体的细胞占比达到50％，则利用该Marc-145细胞群培养PRRSV获得的病毒液中病毒含量平均值不低于107.22TCID50/ml。
10.根据权利要求8或9所述的预测方法，其中Marc-145细胞群为Marc-145多克隆贴壁细胞群、Marc-145多克隆悬浮细胞群、Marc-145单克隆贴壁细胞群和Marc-145单克隆悬浮细胞群中的任一种；其中所述Marc-145多克隆贴壁细胞群为由多种不同的Marc-145贴壁细胞株繁殖形成，所述Marc-145多克隆悬浮细胞群为由多种不同的Marc-145悬浮细胞株繁殖形成。
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