CN115896004B - 基于野猪肾细胞的非洲猪瘟病毒抗体免疫荧光检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种野猪肾细胞，微生物保藏号为CCTCC NO:C2022258。本发明还公开了一种试剂盒，包含前述野猪肾细胞、非洲猪瘟病毒和FITC标记的抗猪IgG抗体，配合常规设备和试剂，应用该试剂盒能够良好地检测猪血清样本中是否含有抗非洲猪瘟病毒抗体。本发明还公开了一种抗非洲猪瘟病毒抗体检测方法，步骤为：用非洲猪瘟病毒感染前述野猪肾细胞，培养感染的细胞后进行固定，将待测血清样本添加到固定的细胞，孵育后再添加FITC标记的抗猪IgG抗体，然后用荧光显微镜拍照，根据拍照结果判定所述待测样本中是否存在抗非洲猪瘟病毒抗体。该方法敏感度高，特异性好，可推广应用。
Description
技术领域
本发明属于兽医生物技术领域，涉及基于野猪肾细胞的非洲猪瘟病毒抗体免疫荧光检测方法。
背景技术
非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)感染猪引起的一种急性、热性传染病。临床症状主要表现为高热、网状内皮系统出血。以直接、间接接触或软蜱吸血途径传播，仅感染猪科动物。强毒感染死亡率可达100％。世界动物卫生组织(WOAH)将ASF列为法定报告的动物疫病，我国动物疫病病原微生物名录将其列为一类动物疫病。根据编码p72蛋白基因B646L的3’端序列不同，将ASFV分为24个基因型。
2018年8月，ASF首次传入我国，在几个月内，疫情蔓延至绝大多数省(自治区、直辖市)。目前，ASFV在我国流行已经近4年，我国对ASF的防控仍无商品化疫苗可供使用，主要依靠生物安全防控策略，但是疫情的走向依然复杂且不容乐观。流行病毒学调查显示我国田间存在新的ASF流行毒株。致病性实验结果显示有些毒株仍具有很强的毒力，与我国首次分离鉴定的毒株Pig/HLJ/2018一样具有很高的致死力，有些毒株毒力明显降低。低毒力ASFV株感染后呈现亚急性或慢性病症、持续感染，不致死猪，但仍具有很强的传染性，导致流行隐蔽，不易察觉。WOAH推荐在ASFV低毒力流行地区或低流行率地区开展抗体监测。2021年7月中国动物疫病预防控制中心通过严格的比对筛选，公布了33个ASF抗体检测试剂盒(均为ELISA检测方法)作为应急使用，旨在通过常态化抗体筛查，早期发现ASFV感染猪，为ASF的防控提供重要指导。
WOAH和我国现行的非洲猪瘟诊断技术国家标准(GB/T 18648-2020)推荐的血清学检测方法包括酶联免疫吸附试验(ELISA)和间接免疫荧光试验(IFA)。IFA是WOAH推荐的作为血清学检测方法确认的金标准，其他抗体检测方法尤其是ELISA方法均需要与之比较以确定其特异性和敏感性。然而，现用的IFA推荐的方法仍是Sánchez-Vizcaíno于1987年建立的，35年未进行明显的方法改进，主要受限于没有合适的细胞既满足ASFV良好的增殖，又适合进行IFA操作。目前用于ASF抗体检测IFA的细胞主要是非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)和猴稳定细胞系(Monkey stable cells，MS细胞)，此细胞系虽可稳定增殖ASFV，但细胞病变多表现为单个细胞圆缩或几个细胞聚集，IFA时呈现点状绿色荧光，容易受因细胞衰老或其他致细胞损伤导致的非特异性荧光干扰，不易准确判断。
ASFV的天然宿主是猪，猴源细胞与猪源细胞的遗传差别，Vero细胞和MS细胞不能够充分模拟猪细胞中的病毒增殖等遗传活动。
尽管猪肺泡巨噬细胞(PAM)能够用于培养ASFV，但是PAM需要现用现制，难以在培养基中传代，成本高，也限制了使用的方便性。
如果能制备出来源于ASFV靶动物，可连续传代，易于培养，支持ASFV稳定增殖，低剂量接种ASFV后即可形成明显的细胞病变灶的细胞，则进行IFA检测时可能形成更明显的荧光灶，易于进行荧光观察和判定。其他细胞如Vero、MS细胞等进行IFA检测时，往往需要大剂量接种，形成的荧光多呈单个细胞点状，不易于进行荧光观察和准确判定。
发明内容
本发明制备了野猪肾细胞，该细胞能稳定传代。ASFV在野猪肾细胞中能良好增殖，可形成良好的细胞病变(Cytopathic effect，CPE)。基于野猪肾细胞，建立了ASFV抗体的IFA检测方法。为ASFV抗体其他检测方法(如ELISA等)的特异性和敏感性确认提供了便于操作可行的金标准，有助于提升ASFV抗体检测试剂盒应用质量。
本发明第一方面提供了一种野猪肾细胞，所述野猪肾细胞的微生物保藏号为CCTCC NO:C2022258。
本发明第二方面提供了一种野猪肾细胞的传代方法，所述传代方法为：在培养基中培养本发明第一方面所述的野猪肾细胞，得到传代的野猪肾细胞。
在一些实施方式中，所述培养基为RPMI 1640培养液。
在一些实施方式中，所述培养的条件为35-38℃，3-7％二氧化碳。
在一些实施方式中，所述培养的时间为24-120h。
在一些实施方式中，所述培养为单层培养。
在一些实施方式中，所述传代的次数为1-50。
在一些实施方式中，所述传代的次数为10-30。
本发明第三方面提供了一种野猪肾细胞，所述野猪肾细胞是根据本发明第二方面所述的传代方法传代得到的所述野猪肾细胞。
本发明第四方面提供了一种非洲猪瘟病毒的培养方法，所述培养方法为：用本发明第一方面或第三方面所述的野猪肾细胞作为培养细胞，培养所述非洲猪瘟病毒。
在一些实施方式中，所述培养方法包括如下步骤：
S1：在培养基中培养所述培养细胞，得到增殖的培养细胞；
S2：将所述非洲猪瘟病毒接种到所述增殖的培养细胞，得到非洲猪瘟病毒培养体系；
S3：培养所述非洲猪瘟病毒培养体系，收获增殖的非洲猪瘟病毒。
在一些实施方式中，在步骤S1中，所述培养时间为72-96h。
在一些实施方式中，在步骤S2中，所述非洲猪瘟病毒接种剂量为0.05-0.5MOI，培养时间为72-144h。
在一些实施方式中，在步骤S3中，所述培养的条件为35-38℃，3-7％二氧化碳。
本发明第五方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒中含有本发明第一方面或第三方面所述的野猪肾细胞。
在一些实施方式中，所述试剂盒中还含有非洲猪瘟病毒和荧光分子标记的抗猪IgG抗体。
在一些实施方式中，所述非洲猪瘟病毒为基因I型非洲猪瘟病毒。
在一些实施方式中，所述荧光分子为FITC。
在一些实施方式中，所述抗猪IgG抗体是兔抗猪IgG抗体。
在一些实施方式中，所述抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。
在一些实施方式中，述试剂盒中还含有非洲猪瘟病毒阳性血清、非洲猪瘟病毒阴性血清、细胞培养板、PBS溶液、4w/w％多聚甲醛固定液、0.25v/v％Triton-X100透膜液与RPMI 1640培养液中任一种或其组合。
本发明第六方面提供了本发明第一方面或第三方面所述的野猪肾细胞，本发明第二方面所述的传代方法，本发明第四方面所述的培养方法，或本发明第五方面所述的试剂盒在如下A1到A9中任一方面中的用途：
A1：研究或制备非洲猪瘟预防制剂；
A2：研究或制备非洲猪瘟诊断制剂；
A3：研究或制备非洲猪瘟病毒检测制剂；
A4：研究非诊断目的的非洲猪瘟病毒检测方法；
A5：研究非洲猪瘟病毒与抗非洲猪瘟病毒抗体相互作用机制的制剂；
A6：研究或制备非洲猪瘟治疗制剂；
A7：研究非洲猪瘟病毒遗传机制；
A8：研究非洲猪瘟病毒感染的病理机制；
A9：研究或制备干预非洲猪瘟病毒增殖的方法或药物的制剂。
研究非诊断目的的非洲猪瘟病毒检测，包括但不限于检测环境中是否有非洲猪瘟病毒，进行环境评估，为猪舍选址提供线索。
本发明第七方面提供了一种抗非洲猪瘟病毒抗体检测方法，所述检测方法包括如下步骤：
P1：用非洲猪瘟病毒感染本发明第一方面或第三方面所述的野猪肾细胞，得到感染的野猪肾细胞；
P2：将所述感染的野猪肾细胞进行固定，得到固定化野猪肾细胞；
P3：将待测样本添加到所述固定化野猪肾细胞进行孵育，得到孵育的固定化野猪肾细胞；
P4：将荧光分子标记的抗猪IgG抗体添加到所述孵育的固定化野猪肾细胞进行孵育，得到标记的固定化野猪肾细胞；
P5：用荧光显微镜对所述标记的固定化野猪肾细胞进行拍照，根据拍照结果判定所述待测样本中是否存在抗非洲猪瘟病毒抗体。
在一些实施方式中，在步骤P1中，所述非洲猪瘟病毒的感染浓度为103.00TCID50/ml到105.00TCID50/ml，所述野猪肾细胞为单层细胞状态。
在一些实施方式中，所述TCID50是根据Reed-Muench法计算得到的。
在一些实施方式中，在步骤P1中，以RPMI 1640培养液为培养基，在35-38℃，3-7％二氧化碳条件下，感染时间为36-60h。
在一些实施方式中，在步骤P2中，将所述感染的野猪肾细胞在固相表面进行固定。
在一些实施方式中，在步骤P2中，所述固相表面为细胞培养板底面。
在一些实施方式中，在步骤P2中，用4w/w％多聚甲醛固定液将所述感染的野猪肾细胞固定到所述固相表面。
在一些实施方式中，在步骤P2中，固定时间为20-40min，在固定之前与之后分别用PBS清洗所述固相表面。
在一些实施方式中，在步骤P2中，将所述固定化野猪肾细胞加入透膜液进行透膜处理后使用。
在一些实施方式中，在步骤P2中，所述透膜处理的步骤为：使用0.25v/v％Triton-X100透膜液，室温透膜10-20min，再用PBS清洗所述固相表面。
在一些实施方式中，在步骤P3中，所述待测样本为待测猪血清，稀释8-32倍后使用。
在一些实施方式中，在步骤P3中，与所述待测样本平行设置非洲猪瘟病毒阳性血清测试对照和/或非洲猪瘟病毒阴性血清测试对照。
在一些实施方式中，在步骤P3中，孵育温度为35-38℃，孵育时间为30-60min。
在一些实施方式中，在步骤P3中，孵育后，用PBS清洗所述固相表面。
在一些实施方式中，在步骤P4中，所述荧光分子为FITC。
在一些实施方式中，在步骤P4中，所述抗猪IgG抗体是兔抗猪IgG抗体。
在一些实施方式中，在步骤P4中，所述抗体是多克隆抗体或单克隆抗体。
在一些实施方式中，在步骤P4中，孵育温度为35-38℃，孵育时间为30-60min。
在一些实施方式中，在步骤P4中，孵育后，用PBS清洗所述固相表面。
在一些实施方式中，在步骤P5中，所述抗非洲猪瘟病毒抗体阳性判断标准为：可观察到特异性成簇的荧光灶；所述抗非洲猪瘟病毒抗体阴性判断标准为：观察不到特异性成簇的荧光灶。
附图说明
图1示出了胎龄约80日龄的野猪胎儿照片。
图2示出了F1、F5、F10、F20、F30代BK2258细胞形态照片，以及F30代细胞培养的局部放大照片，图中右下角的比例尺指示100nm。
图3示出了ASFV SD/DY-I/21株接种BK2258细胞后不同时间的CPE的照片，图中右下角的比例尺指示100nm。
图4示出了ASFV SD/DY-I/21株在BK2258细胞中的增殖曲线。
图5示出了ASFV不同剂量接种与ASF阳性血清、ASF阴性血清IFA反应结果的照片，图中右下角的比例尺指示100nm。
图6示出了ASFV接种后培养不同时间与ASF阳性、ASF阴性血清IFA反应结果的照片，图中右下角的比例尺指示100nm。
图7示出了ASFV接种孔与不同稀释度ASF阳、ASF阴性血清IFA反应的照片，图中右下角的比例尺指示100nm。
图8示出了ASFV接种孔与不同稀释度ASF阳、ASF阴性血清IFA反应的照片，图中右下角的比例尺指示100nm。
图9示出了ASFV接种孔与不同稀释度二抗IFA反应的照片，图中右下角的比例尺指示100nm。
图10示出了ASFV接种孔孵育不同时间IFA反应的照片，图中右下角的比例尺指示100nm。
图11示出了ASF抗体强阳性血清IFA效价测定的照片，图中右下角的比例尺指示100nm。
图12示出了ASFV IFA方法特异性试验的照片，图中右下角的比例尺指示100nm。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。
本发明没有说明的材料与仪器为本领域常规材料与仪器，本发明没有说明的操作细节为本领域常规操作。
本发明采集约80日胎龄的野猪胎儿，制备肾上皮细胞，命名为野猪肾细胞，简称BK2258。ASFV可在BK2258上稳定增殖，且病毒滴度高，可形成稳定的CPE，特征为细胞聚集、收缩、裂解、形成圆形噬斑，解决了ASFV在传代细胞上不易稳定增殖的难题。基于BK2258建立了检测ASVF抗体的IFA，结果与ASF阳性血清反应可见成片的明显的特异性绿色荧光，非常易于观察，与ASF阴性血清不反应、没有特异性绿色荧光，且未见细胞衰老或其他因细胞损伤导致的非特异性绿色荧光，易于判断，克服了非洲猪瘟IFA荧光多呈点状，不易判定的缺点。
本发明制备了BK2258细胞，该细胞呈卵圆形排列，能稳定传30代以上。ASFV SD/DY-I/21株在BK2258上可稳定增殖，MOI 0.1接种后144h，病毒拷贝数达到高峰约1010拷贝/ml；可形成稳定的CPE，具体特征为细胞聚集、收缩、裂解、最后形成圆形噬斑。以ASFV SD/DY-I/21株接种BK2258细胞，建立了检测ASF抗体的IFA检测方法，该方法敏感性高，对ASFV低毒力感染猪抗体检测呈阳性最早时间为感染后第6天，早于ELISA方法；对ASF抗体阳性样品的检测敏感度为1:25600，高于ELISA方法；该方法与CSFV、PRRSV、PCV2、PRV、FMDV/O和PEDV等6种猪重要病原抗体阳性血清不反应，显示良好的特异性。该方法对包括实验室免疫猪血清和流行病学调查现地采集血清共262份进行检测，结果阳性样品数为149份，阴性样品数为113份，表明建立的方法可应用于临床样品检测。
实施例1.野猪肾细胞的制备
取约80日胎龄的野猪(品种：华北野猪)胎儿(见图1)，采集2个肾脏，去包膜，小心剪取皮质，弃髓质，将皮质剪成大小1～2mm3的碎块，将碎块放入100ml烧杯内，用PBS(pH7.4)洗4次。加入15ml 0.25％胰蛋白酶消化液(含2.5mg/ml胰蛋白酶，8.0mg/ml NaCl，0.4mg/ml KCl，0.06mg/ml Na2HPO4·H2O，0.06mg/ml KH2PO4，0.37mg/ml NaHCO3，水溶液)，37℃水浴消化10min后，用吸管吹打10次，吸取上清加入100ml RPMI 1640培养液(购买自HyClone，货号SH30809.01，添加10％(v/v)胎牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素)中以终止消化反应(得到上清1)。
剩余组织块继续加入10ml 0.25％胰蛋白酶消化液，37℃水浴消化，每隔5min用吸管反复吹打，收集上清(上清2)，直至组织块消化完全。
所有收集的上清(上清1和上清2合并)于4℃、800rpm离心10min，倾弃上清，沉淀中加入50ml RPMI 1640培养液，经200目不锈钢筛网过滤以去除残余的组织块，滤过液分装至培养瓶内，37℃、5％CO2的培养箱中培养。72h后细胞长成单层，用0.25％胰蛋白酶消化液消化分散，将细胞浓度用RPMI1640培养液调整为5×105个细胞/ml准备进行传代培养。传代培养步骤为：培养瓶内，37℃、5％CO2的培养箱中培养，培养时间72-96h。采取有限稀释法对细胞进行单克隆分离。制备的细胞为野猪肾细胞，简称BK2258。
实施例2.野猪肾细胞的传代与形态观察
将制备的野猪肾细胞用倒置显微镜观察，原代(F1)可见不同形态细胞，包括长梭形成纤维细胞、卵圆形肾上皮细胞、无法贴壁的细胞和小组织团块。
采用有限稀释法对细胞进行单克隆筛选与传代，挑选卵圆形肾上皮细胞进行扩增，并传代，培养液为RPMI 1640培养液，传代培养步骤为：培养瓶内，37℃、5％CO2的培养箱中培养，每代培养时间72h。
按照前述方法步骤和标准传代至F30。F1、F5、F10、F20、F30代培养细胞照片参见图2，由此可见，随着代次的增加，细胞形态稳定，从F5代开始，细胞形态变得很稳定，呈卵圆形紧密排列。
由此可见，本发明得到了稳定的野猪肾细胞株。
实施例3.非洲猪瘟病毒在野猪肾细胞中的增殖
本发明测试用非洲猪瘟毒为ASFV SD/DY-I/21株(基因I型，Genebank序列号：MZ945537.1)，为申请人的实验室分离鉴定并保存的ASFV毒株。
BK2258细胞培养的培养液为RPMI 1640培养液，传代培养步骤为：培养瓶内，37℃、5％CO2的培养箱中培养，每代培养时间96h。
ASFV SD/DY-I/21株接种BK2258可形成CPE并可进行病毒传代，随着代次的增加，CPE稳定，具体特征为细胞聚集、收缩、裂解、最后形成圆形噬斑。F10代的不同培养时间对照照片见图3。
ASFV SD/DY-I/21株在F10代BK2258上可稳定增殖，MOI 0.1接种后144h，病毒拷贝数达到高峰，接种时间与病毒拷贝数关系曲线参见图4。
由此可见，本发明所制备的BK2258细胞能够良好地进行体外传代，能够支持ASFV的增殖培养。
本发明将所分离培养得到的BK2258株F20代细胞提交专利程序认可保藏机构保藏。保藏单位为中国典型培养物保藏中心；地址为中国，武汉，武汉大学；微生物保藏号为CCTCC NO:C2022258；培养物名称为野猪肾细胞BK2258；保藏时间为2022年8月10日；鉴定存活时间为2022年8月17日。
实施例4.抗非洲猪瘟病毒抗体IFA检测方法的建立
(一)检测的原理与发明构思
用非洲猪瘟病毒感染易感细胞，然后将感染的易感细胞固定到细胞培养板的培养孔中，就在培养孔内表面固定了非洲猪瘟病毒颗粒，添加含有抗非洲猪瘟病毒抗体的血清后，血清中的抗非洲猪瘟病毒抗体结合到病毒颗粒上，用荧光标记的抗猪IgG抗体再次孵育，用荧光显微镜拍照，照片上可显示荧光，实现了本发明的抗非洲猪瘟病毒抗体免疫荧光检测。
(1)本发明制备了猪肾细胞BK2258株，提供了前述核心技术的易感细胞基础，BK2258株能够稳定地传代，成本较低，BK2258株是猪源细胞，能够良好地繁殖ASFV。
(2)病毒与宿主细胞同时固定在固相载体表面，相比常规ELISA方法固定病毒，省略了病毒分离纯化步骤，简化程序，降低成本。
(3)病毒与宿主细胞同时固定在固相载体表面，相比常规ELISA方法在固相表面固定基因工程表达的病毒抗原，显著降低了操作成本。
(4)病毒与宿主细胞同时固定在固相载体表面，能够保留病毒全组分，就具有结合多种病毒抗体的能力，使得检测抗体更全面；能够最大程度地保留病毒在宿主的活细胞状态下的组分构象，能够更好地模拟生理病理条件下的抗原抗体反应，更准确地进行检测与评估血清样本。
(5)本发明用荧光标记二抗，具有一定的空间位置分布辨别能力，而ELISA化学发光就不具有空间分辨基础。
(6)本发明用荧光标记二抗，荧光强度与结合到固相表明的二抗分子个数成正比，而ELISA化学发光就受反应时间，底物浓度等方面的影响，本发明检准确性更好。
由此可见，本发明必然更够更好地检测ASFV抗体。
(二)最佳接种剂量的确定
(1)材料
ASF的标准阳性血清：由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供，其中，ASFV抗体ELISA效价为1:12800。
ASF的标准阴性血清：由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供，其中，ASFV抗体效价为0。
(2)病毒接种
将ASFV SD/DY-I/21株在BK2258细胞传代至F15，培养液为RPMI 1640培养液，传代培养步骤为：培养瓶内，37℃、5％CO2的培养箱中培养，每代培养时间96h。
根据《中华人民共和国兽药典》(2020版第三部，中国农业出版社出版)，采用Reed-Muench法计算(下同)，测定其滴度为107.80TCID50/ml。
以RPMI 1640培养液为稀释液，将前述培养物以10倍系列稀释至10-6稀释度，分别取10-2、10-3、10-4、10-5和10-6稀释度接种长成良好的96孔板培养的BK2258细胞单层(F25代)，接种量为100μl/孔，每个滴度平行接种4孔。
(3)细胞固定
将96孔板在37℃5％CO2条件下培养48h后，弃去培养液，PBS(pH7.4，下同)浸洗2次，250μl/孔，1min/次，弃PBS；加入预冷的4％(w/w)多聚甲醛固定液(溶剂为PBS)(Solarbio，P1112)(100μl/孔)，室温固定30min，弃掉固定液，PBS浸洗2次，250μl/孔，1分钟/次，弃PBS。
(4)透膜处理
加入0.25％(v/v)Triton-X100透膜液(溶剂为PBS)，室温透膜15min，弃透膜液，用PBS浸洗2次，250μl/孔，1分钟/次，弃PBS。
(5)加一抗
将ASF的标准阳性血清和ASF的标准阴性血清用使用PBS作1:100(体积比)稀释后使用，针对每个滴度接种的4孔，分别加入稀释后的ASF的标准阳性血清和ASF的标准阴性血清各2孔，接种量为100μl/孔，37℃孵育1h，弃样品，用PBS浸洗3次，250μl/孔，1分钟/次，弃PBS。
(6)加荧光标记二抗
将FITC标记的兔抗猪IgG(Sigma，F1638-2ML)用PBS作1:200(体积比)稀释后使用，将稀释后的FITC标记的兔抗猪IgG加入到96孔板中的每个操作孔，接种量为100μl/孔，37℃孵育45min，PBS浸洗3次，250μl/孔，1min/次，最后一次洗板不弃洗液。
(7)结果判定
将加浸洗后的96孔板放到荧光显微镜(ZEISS，Axio Observer)下进行观察、拍照、分析。荧光显微镜观察到特异性绿色荧光判定为ASFV抗体阳性，无特异性绿色荧光判定为ASFV抗体阴性。
结果上述5个不同稀释度接种孔均与ASFV阳性血清反应呈现特异性绿色荧光，而与阴性血清不反应。
10-3、10-4、10-5稀释度病毒孔的白光与荧光照片结果参见图5。分析发现10-4稀释度接种孔与阳性血清反应绿色荧光成簇、明亮、特异，且荧光斑数量适中，易于判断(图5)，因此选择10-4(相当于103.80TCID50/ml)作为最佳接种剂量。
(三)最佳接种时间的确定
ASFV SD/DY-I/21株以103.80TCID50/ml接种BK2258细胞，100μl/孔。37℃5％CO2下分别用四块96孔板培养24h、48h、72h和96h，进行IFA试验。除接种孔数量外，其他步骤与操作方法、参数均与(一)小节相同。
24h、48h、72h和96h ASF阴性血清和ASF阳性血清的荧光照片参见图6，结果接种后培养48h，接种孔与阳性血清反应绿色荧光成簇、明亮、特异，易于判断，24h荧光小且不明显，72h和96h由于细胞病变太明显，细胞损伤明显，荧光弥散(图6)。因此选择接种后孵育48h作为最佳接种时间。
(四)最佳血清稀释度的确定
ASFV SD/DY-I/21株以103.80TCID50/ml接种BK2258细胞，100μl/孔。37℃5％CO2下培养48h。ASF标准阳性血清和ASF标准阴性血清分别进行1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512、1:1024体积比稀释，进行IFA试验。除接种孔数量外，其他步骤与操作方法、参数均与(一)小节相同。
前五个稀释度孔对应的荧光照片参见图7，后五个稀释度孔对应的荧光照片参见图8。
由图7和图8可见，结果上述10个不同血清稀释度阳性血清均与ASFV接种孔呈现特异性绿色荧光，而阴性血清均与ASFV接种孔不反应。分析发现阳性血清1:2稀释时荧光反而不是很强，1:16稀释时绿色荧光最明亮、特异，且背景较弱；阴性血清1:2稀释时虽然没有特异性绿色荧光，但存在一些背景(图7)。因此，选择1:16稀释作为血清最佳稀释度。
(五)最佳二抗稀释度的确定
ASFV SD/DY-I/21株以103.80TCID50/ml接种BK2258细胞，100μl/孔。37℃5％CO2下培养48h。ASF标准阳性血清和ASF标准阴性血清用PBS以1:16体积比稀释，FITC标记的兔抗猪IgG用PBS以1:100、1:200、1:400、1:800和1:1600稀释度稀释，进行IFA试验。除接种孔数量外，其他步骤与操作方法、参数均与(一)小节相同。
荧光照片参见图9，结果显示随着二抗稀释度的增加，阳性血清与ASFV接种孔呈现特异性绿色荧光强度明显减弱，且1:100稀释时荧光最明亮，易于判断；不同稀释度的阴性血清均与ASFV接种孔不反应(图9)。因此，选择1:100稀释度作为二抗最佳稀释度。
(六)最佳一抗、二抗作用时间的确定
ASFV SD/DY-I/21株以103.80TCID50/ml接种BK2258细胞，100μl/孔。37℃5％CO2下培养48h。ASF标准阳性血清和ASF标准阴性血清用PBS以1:16体积比稀释，FITC标记的兔抗猪IgG用PBS以1:100稀释。一抗37℃分别作用30min、45min和60min，二抗37℃分别作用30min、45min和60min，针对每种血清的9种时间组合进行IFA试验。除接种孔数量外，其他步骤与操作方法、参数均与(一)小节相同。
荧光照片参见图10，结果一抗和二抗上述3个不同作用时间阳性血清与ASFV接种孔呈现特异性绿色荧光强度差别不明显(图10)，阴性血清均与ASFV接种孔不反应。为了节省时间和保持更好的稳定性，选择一抗37℃作用30min、二抗37℃作用30min作为最佳作用时间。
(七)ASF抗体IFA检测操作程序
根据上述各试验条件的结果，总结确定IFA操作程序如下(简称“优化操作程序”)：
(1)病毒接种
将ASFV SD/DY-I/21株以103.80TCID50/ml接种成长良好的96孔板培养的BK2258细胞单层，接种量为100μl/孔。37℃5％CO2条件下培养48h。
(2)细胞固定
弃去培养液，用PBS浸洗2次，250μl/孔，1min/次，弃PBS；加入预冷的4％多聚甲醛固定液(100μl/孔)，室温静置30min，弃掉固定液，用PBS浸洗2次，250μl/孔，1分钟/次，弃PBS。
(3)透膜处理
加入0.25％Triton-X100透膜液(200μl/孔)，室温静置15min。弃透膜液，用PBS浸洗2次，250μl/孔，1min/次，弃PBS。
(4)加一抗
加入待检血清样品，使用PBS作1:16体积比稀释，100μl/孔，同时设阳性对照(使用PBS作1:16体积比稀释的ASF的标准阳性血清)和阴性对照(使用PBS作1:16体积比稀释的ASF的标准阴性血清)，37℃孵育30min。弃样品，用PBS浸洗3次，250μl/孔，1min/次，弃PBS。
(5)加酶标二抗
加FITC标记的兔抗猪IgG，使用PBS作1:100稀释，稀释后加入量为100μl/孔，37℃孵育30min。弃二抗，用PBS浸洗3次，250μl/孔，1min/次，最后一次洗板不弃洗液。
(6)结果判定
阳性血清对照孔可观察到特异性绿色荧光，特征为绿色荧光明亮，成簇；阴性血清对照孔无特异性绿色荧光，则试验成立，可用于对待检血清样品中是否存在ASFV抗体进行检测。待检血清样品，观察到特异性绿色荧光判定为阳性，无特异性绿色荧光判定为阴性。
(八)敏感性试验
(1)低毒力ASFV感染猪不同时间抗体检测结果
ASFV低毒力HLJ/HRB1/20株(基因II型，Genebank序列号：MW656282.1)和ASFV SD/DY-I/21株分别接种4头和7头SPF猪(品种：长白猪)，接种剂量均为106TCID50/头。HLJ/HRB1/20株接种后第7、9、11天，ASFV SD/DY-I/21株接种后第2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13天采血分离血清，按照前述优化操作程序进行IFA检测。
同时用某商品化ELISA检测试剂盒按说明书进行检测。
HLJ/HRB1/20株接种4头猪IFA结果显示均在接种后第7天ASF抗体转阳；商品化ELISA检测结果显示有1头猪在接种后第9天ASF抗体转阳，其余3头在接种后第11天转阳(表1)。
ASFV SD/DY-I/21株接种6头猪IFA结果显示有1头猪在接种后第6天ASF抗体转阳，其余6头猪在接种后第7天转阳；商品化ELISA检测结果显示有1头猪在接种后第9天ASF转阳，其余6头在接种后第8天转阳(表1)。
表1低毒力ASFV感染猪不同时间抗体ELISA与IFA检测
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注：猪号1、2、3、19、3983、3995和3996接种ASFV低毒力SD/DY-I/21株；猪号3060、3061、3063和3064接种HLJ/HRB1/20株；S/P＝(样本OD450nm值-阴性对照平均OD450nm值)/(阳性对照平均OD450nm值-阴性对照平均OD450nm值)；S/P≥0.4，判为阳性；S/P＜0.3，判为阴性；0.3≤S/P＜0.4，判为疑似。IFA结果“+”为阳性，“-”为阴性。
(2)ASF抗体强阳性血清敏感度的测定
选取1份ASF抗体呈强阳性的血清，用PBS进行1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、1:25600、1:51200和1:102400稀释，按照前述优化操作程序进行IFA检测。同时用某商品化试剂盒按说明书进行检测。IFA结果显示该血清1:25600稀释时仍为阳性(图11)。商品化试剂盒结果显示1:6400稀释时仍为阳性(表2)。表明该血清IFA效价为1:25600，ELISA效价为1:6400，说明IFA敏感性更高。
表2ASF抗体强阳性血清ELISA效价测定
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注：S/P＝(样本OD450nm值-阴性对照平均OD450nm值)/(阳性对照平均OD450nm值-阴性对照平均OD450nm值)；S/P≥0.4，判为阳性；S/P＜0.3，判为阴性；0.3≤S/P＜0.4，判为疑似。IFA结果“+”为阳性，“-”为阴性。
(九)特异性试验
ASFV SD/DY-I/21株以103.80TCID50/ml接种BK2258细胞，100μl/孔。37℃5％CO2培养48h。取抗非洲猪瘟病毒抗体阳性血清(ASFV)、SPF猪血清(SPF)、古典猪瘟病毒(CSFV)抗体阳性血清、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体阳性血清、猪圆环病毒2型(PCV2)抗体阳性血清、猪伪狂犬病毒(PRV)抗体阳性血清、口蹄疫病毒O型(FMDV/O)抗体阳性血清和猪流行性腹泻病毒(PEDV)抗体阳性血清，按照前述优化操作程序进行IFA检测。
荧光照片参见图11，结果显示，SPF猪血清与上述6种猪重要病原抗体阳性血清与ASFV接种孔均不反应，而抗非洲猪瘟病毒抗体阳性血清与ASFV接种孔反应，表明建立的IFA具有很强的特异性。
(十)临床样品的检测
取临床样品，包括实验室免疫猪血清和流行病学调查现地采集血清共262份，按照前述优化操作程序进行IFA检测。结果显示阳性样品数为149份，阴性样品数为113份。
由技术常识可知，本发明可以通过其它的不脱离其精神实质或必要特征的实施方案来实现。因此，上述公开的实施方案，就各方面而言，都只是举例说明，并不是仅有的。所有在本发明范围内或在等同于本发明的范围内的改变均被本发明包含。
Claims (40)
1.一种野猪肾细胞，所述野猪肾细胞的微生物保藏号为CCTCC NO: C2022258。
2.一种野猪肾细胞的传代方法，所述传代方法为：在培养基中培养权利要求1所述的野猪肾细胞，得到传代的野猪肾细胞。
3.如权利要求2所述的传代方法，其特征在于，所述培养基为RPMI 1640培养液。
4.如权利要求2所述的传代方法，其特征在于，所述培养的条件为35-38℃，3-7%二氧化碳。
5.如权利要求2所述的传代方法，其特征在于，所述培养的时间为24-120h。
6.如权利要求2所述的传代方法，其特征在于，所述培养为单层培养。
7.一种野猪肾细胞，所述野猪肾细胞是根据权利要求2-6中任一项所述的传代方法传代得到的野猪肾细胞。
8.一种非洲猪瘟病毒的培养方法，所述培养方法为：用权利要求1或7所述的野猪肾细胞作为培养细胞，培养所述非洲猪瘟病毒。
9.如权利要求8所述的培养方法，其特征在于，所述培养方法包括如下步骤：
S1：在培养基中培养所述培养细胞，得到增殖的培养细胞；
S2：将所述非洲猪瘟病毒接种到所述增殖的培养细胞，得到非洲猪瘟病毒培养体系；
S3：培养所述非洲猪瘟病毒培养体系，收获增殖的非洲猪瘟病毒。
10.如权利要求9所述的培养方法，其特征在于，在步骤S1中，所述培养时间为72-96h。
11.如权利要求9所述的培养方法，其特征在于，在步骤S2中，所述非洲猪瘟病毒接种剂量为0.05-0.5MOI，培养时间为72-144h。
12.如权利要求9所述的培养方法，其特征在于，在步骤S3中，所述培养的条件为35-38℃，3-7%二氧化碳。
13.一种试剂盒，所述试剂盒中含有权利要求1或7所述的野猪肾细胞。
14.如权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有非洲猪瘟病毒和荧光分子标记的抗猪IgG抗体。
15.如权利要求14所述的试剂盒，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒为基因I型非洲猪瘟病毒。
16.如权利要求14所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光分子为FITC。
17.如权利要求14所述的试剂盒，其特征在于，所述抗猪IgG抗体是兔抗猪IgG抗体。
18.如权利要求14所述的试剂盒，其特征在于，所述抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。
19.如权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有非洲猪瘟病毒阳性血清、非洲猪瘟病毒阴性血清、细胞培养板、PBS溶液、4w/w%多聚甲醛固定液、0.25v/v%Triton-X100透膜液与RPMI 1640培养液中任一种或其组合。
20.权利要求1或7所述的野猪肾细胞或权利要求13-19中任一项所述的试剂盒在制备非洲猪瘟诊断制剂或制备非洲猪瘟病毒检测制剂中的用途。
21.一种非诊断目的的抗非洲猪瘟病毒抗体检测方法，所述检测方法包括如下步骤：
P1：用非洲猪瘟病毒感染权利要求1或7所述的野猪肾细胞，得到感染的野猪肾细胞；
P2：将所述感染的野猪肾细胞进行固定，得到固定化野猪肾细胞；
P3：将待测样本添加到所述固定化野猪肾细胞进行孵育，得到孵育的固定化野猪肾细胞；
P4：将荧光分子标记的抗猪IgG抗体添加到所述孵育的固定化野猪肾细胞进行孵育，得到标记的固定化野猪肾细胞；
P5：用荧光显微镜对所述标记的固定化野猪肾细胞进行拍照，根据拍照结果判定所述待测样本中是否存在抗非洲猪瘟病毒抗体。
22.如权利要求21所述的检测方法，其特征在于，在步骤P1中，所述非洲猪瘟病毒的感染浓度为103.00TCID50/ml到105.00TCID50/ml，所述野猪肾细胞为单层细胞状态。
23.如权利要求22所述的检测方法，其特征在于，所述TCID50是根据Reed-Muench法计算得到的。
24.如权利要求21所述的检测方法，其特征在于，在步骤P1中，以RPMI 1640培养液为培养基，在35-38℃，3-7%二氧化碳条件下，感染时间为36-60h。
25.如权利要求21所述的检测方法，其特征在于，在步骤P2中，将所述感染的野猪肾细胞在固相表面进行固定。
26.如权利要求25所述的检测方法，其特征在于，在步骤P2中，所述固相表面为细胞培养板底面。
27.如权利要求26所述的检测方法，其特征在于，在步骤P2中，用4w/w%多聚甲醛固定液将所述感染的野猪肾细胞固定到所述固相表面。
28.如权利要求21所述的检测方法，其特征在于，在步骤P2中，固定时间为20-40min，在固定之前与之后分别用PBS清洗所述固相表面。
29.如权利要求21所述的检测方法，其特征在于，在步骤P2中，将所述固定化野猪肾细胞加入透膜液进行透膜处理后使用。
30.如权利要求29所述的检测方法，其特征在于，在步骤P2中，所述透膜处理的步骤为：使用0.25 v/v % Triton-X100透膜液，室温透膜10-20min，再用PBS清洗所述固相表面。
31.如权利要求21所述的检测方法，其特征在于，在步骤P3中，所述待测样本为待测猪血清，稀释8-32倍后使用。
32.如权利要求21所述的检测方法，其特征在于，在步骤P3中，与所述待测样本平行设置非洲猪瘟病毒阳性血清测试对照和/或非洲猪瘟病毒阴性血清测试对照。
33.如权利要求21所述的检测方法，其特征在于，在步骤P3中，孵育温度为35-38℃，孵育时间为30-60min。
34.如权利要求21所述的检测方法，其特征在于，在步骤P3中，孵育后，用PBS清洗所述固相表面。
35.如权利要求21所述的检测方法，其特征在于，在步骤P4中，所述荧光分子为FITC。
36.如权利要求21所述的检测方法，其特征在于，在步骤P4中，所述抗猪IgG抗体是兔抗猪IgG抗体。
37.如权利要求21所述的检测方法，其特征在于，在步骤P4中，所述抗体是多克隆抗体或单克隆抗体。
38.如权利要求21所述的检测方法，其特征在于，在步骤P4中，孵育温度为35-38℃，孵育时间为30-60min。
39.如权利要求21所述的检测方法，其特征在于，在步骤P4中，孵育后，用PBS清洗所述固相表面。
40.如权利要求21所述的检测方法，其特征在于，在步骤P5中，所述抗非洲猪瘟病毒抗体阳性判断标准为：可观察到特异性成簇的荧光灶；所述抗非洲猪瘟病毒抗体阴性判断标准为：观察不到特异性成簇的荧光灶。
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