CN103224548A

CN103224548A - 用于制备牛口蹄疫asia i型肽疫苗的多肽及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN103224548A
Application number: CN2013100980024A
Authority: CN
Inventors: 肖进; 齐鹏; 巴利民; 宋芳; 郑明举; 张欣; 张艳宾; 张君; 郑应华; 张爱民; 马爱荣
Original assignee: CHINA ANIMAL HUSBANDRY COMMERICAL (GROUP) GEN CORP; China Animal Husbandry Industry Co Ltd
Current assignee: CHINA ANIMAL HUSBANDRY COMMERICAL (GROUP) GEN CORP; China Animal Husbandry Industry Co Ltd
Priority date: 2013-03-25
Filing date: 2013-03-25
Publication date: 2013-07-31
Anticipated expiration: 2033-03-25
Also published as: CN103224548B

Abstract

本发明提供一种用于制备牛口蹄疫ASIA I型肽疫苗的多肽，所述多肽包含如SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列以及含有该多肽的肽疫苗。提供的牛口蹄疫ASIA I型合成肽疫苗具有良好的免疫效力，并且不会引发传统疫苗存在的发热、红肿等问题，因此本发明的疫苗可以有效应对目前口蹄疫病毒的抗原变异、不存在生物安全性，易于大规模合成，具有良好的应用前景。本发明还提供了所述多肽和肽疫苗的制备方法以及其制药用途。

Description

用于制备牛口蹄疫ASIA I型肽疫苗的多肽及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体而言，本发明涉及一种用于制备牛口蹄疫ASIA I型肽疫苗的多肽，以及含有这些多肽的疫苗及它们的制备方法。

背景技术

口蹄疫（foot and mouth disease，简称FMD）是一种偶蹄动物发生的急性、高度接触性、发热性传染病，在世界范围内广泛分布。口蹄疫的传染性高，传播迅速，感染猪、牛、羊等牲畜后将导致幼畜死亡，成年动物生产能力急剧下降，因此严重危害畜牧业的发展和肉食及其畜产品的生产和供应。目前，口蹄疫使动物及动物产品的市场流通和国际贸易受到极大的封锁和限制，给流行国家和地区畜牧业生产造成巨大的经济损失。

口蹄疫是由口蹄疫病毒（FMDV）感染引起的。口蹄疫病毒属于细小核糖核酸病毒，具有多型性、易变性等特点。目前，已知全世界有7种血清型的口蹄疫病毒：A、O、C、Sat1（南非I型）、Sat2（南非II型）、Sat3（南非III型）和Asia I（亚洲I型）。这些主型中的每一种又分若干亚型，目前发现的亚型已有70多种。血清型A、O、C和Asia I型的口蹄疫病毒最为常见，其中血清型A病毒的变种最多，具有超过30种亚型。研究结果表明，口蹄疫病毒的衣壳蛋白是由四种结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4（Logan D等，1993年）组成的，每种各60个。VP1-VP3组成衣壳蛋白亚单位，位于衣壳蛋白的外侧，而VP4位于病毒颗粒的内部。VP1是主要的保护性抗原，现已发现O型口蹄疫有3个主要的抗原位点位于VP1上，其中133-160和200-213位构成了VP1上最重要且最容易变异的保护性抗原位点。

口蹄疫病毒各型之间的抗原性不同，彼此之间不能交互免疫。而且，在同一种血清型中抗原差异的程度也很大，以至于能够有效地抵抗一种亚型的口蹄疫疫苗可能针对同一血清型中的另一种亚型没有保护性。此外，口蹄疫毒株的抗原性还在不断发生变化，随着时间的推移，原有疫苗的效力减弱甚至消失，因此给口蹄疫的防治工作带来了很大的困难。

当前在我国牛群中流行的口蹄疫主要是O型、ASIA I型和A型口蹄疫。我国对口蹄疫实行强制性免疫，疫苗免疫是防治口蹄疫的主要手段。但是，我国现行使用的口蹄疫疫苗主要是病毒灭活疫苗，其存在着生物安全性差、副反应大、产品质量不稳定等问题。相比之下，目前世界上很多国家已经停止使用灭活疫苗，也禁止从使用灭活疫苗的国家进口畜产品。由此可见，在口蹄疫防治方面，我国已落后于世界发展形势。

在口蹄疫新型疫苗的研究方面，先后有基因工程亚单位疫苗、口蹄疫病毒载体疫苗、口蹄疫基因工程修饰疫苗的研究报道，但是其在免疫效果、生物安全性方面都存在着诸多问题，影响了这些新型疫苗的使用。此外，这些疫苗对于当前已经发生变异的流行毒株往往效果较差，不能有效地保护动物。因此，本领域仍然存在对于安全、有效的口蹄疫新型疫苗的需求。

发明内容

因此，本发明的目的在于提供一种用于制备牛口蹄疫ASIA I型合成肽疫苗的多肽，以及含有该多肽的疫苗。

本发明的另一个目的是提供一种上述多肽以及疫苗的制备方法。

本发明的又一个目的是提供上述多肽以及疫苗的用途。

为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一方面，本发明提供一种用于制备牛口蹄疫ASIA I型肽疫苗的多肽，所述多肽包含如SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列。此序列为口蹄疫AISA I病毒的核心B细胞表位序列，负责产生针对口蹄疫病毒的中和抗体。

SEQ ID NO. 1：

VYNGKCTYGEESSRRGDLAALARRVSNCLPTSFNYGAVK

本发明中提及的“多肽”和“合成肽”为同一概念，均是指通过固相有机合成得到的肽物质。

优选地，所述多肽还包含具有增强免疫作用的口蹄疫内源或外源性T细胞表位氨基酸序列，其中，所述氨基酸序列选自SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 7中的一个或多个。在本发明中，由计算机预测口蹄疫AISA I病毒的T细胞表位，然后利用软件设计新的T细胞表位肽，再通过体外评价动物细胞免疫水平，由此筛选得到上述氨基酸序列的多肽，其能够辅助B细胞表位产生中和抗体。

SEQ ID NO. 2：

AGLAGVMVTESVAFRKK

SEQ ID NO. 3：

VAQHNLSTEAIPLVVHESLMIVAQSIAGELK

SEQ ID NO. 4：

RMEAAKTGIEIAYDERRGLNK

SEQ ID NO. 5：

KKAIEADAKYTRGLNGIERK

SEQ ID NO. 6：

SPGQVVYNRPHNSAYK

SEQ ID NO. 7：

SHLEFNNFTVSVPKVFWLRSAK

进一步优选地，所述多肽包含如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12或SEQ ID NO. 13所示的氨基酸序列。

SEQ ID NO. 8：

AGLAGVMVTESVAFRKKVYNGKCTYGEESSRRGDLAALARRVSNCLPTSFNYGAVK

SEQ ID NO. 9：

VAQHNLSTEAIPLVVHESLMIVAQSIAGELKVYNGKCTYGEESSRRGDLAALARRVSNCLPTSFNYGAVK

SEQ ID NO. 10：

RMEAAKTGIEIAYDERRGLNKVYNGKCTYGEESSRRGDLAALARRVSNCLPTSFNYGAVK

SEQ ID NO. 11：

KKAIEADAKYTRGLNGIERKVYNGKCTYGEESSRRGDLAALARRVSNCLPTSFNYGAVK

SEQ ID NO. 12：

SPGQVVYNRPHNSAYKVYNGKCTYGEESSRRGDLAALARRVSNCLPTSFNYGAVK

SEQ ID NO. 13：

SHLEFNNFTVSVPKVFWLRSAKVYNGKCTYGEESSRRGDLAALARRVSNCLPTSFNYGAVK

根据本发明的具体实施方式，本发明的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12或SEQ ID NO. 13所示；

优选地，所述多肽的氨基酸序列中的两个半胱氨酸的巯基可以经氧化连接在一起形成二硫键；

进一步优选地，所述多肽的氨基酸序列的首尾氨基酸残基之间可以反应形成共价连接。其中本文提供的序列是从N端到C端，也就是N端和C端的残基反应形成连接。具体而言，所述多肽的氨基酸序列的首尾氨基酸残基的羧基与氨基、或者羧基与羟基之间反应形成共价连接。

本发明提供的上述多肽可以直接向商业肽合成公司定制获得，或者采用可商购的自动合成仪、根据制造商的操作规程合成。

另一方面，本发明还提供了上述多肽的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

（1）以氨基树脂为起始原料，以由9-芴甲氧羰基保护的氨基酸为单体，按照所述氨基酸序列依次缩合接上氨基酸以合成所述多肽，每步缩合反应后用乙酰咪唑封闭未反应的氨基端；

（2）合成完毕后加入裂解试剂，从而将所述多肽从氨基树脂上裂解下来；

（3）使用乙醚沉淀所述多肽；和

（4）对所述多肽进行超滤纯化，然后进行无菌处理。

在上述制备方法中，所述步骤（1）具体包括以下步骤：

（1-a）脱保护反应：将氨基树脂置于体积百分比为15-30%的六氢吡啶的N-甲基吡咯烷酮（NMP）溶液中，在20-28℃条件下反应25-40分钟，从而脱除氨基树脂上的9-芴甲氧羰基保护基团；

（1-b）洗涤：氮气吹干，然后用N-甲基吡咯烷酮洗涤氨基树脂；

（1-c）缩合反应：加入1-羟基苯丙三唑（HOBT）、二环己基碳二亚胺（DCC）与由9-芴甲氧羰基保护的氨基酸，然后在20-28℃条件下反应0.5-2.5小时；

（1-d）洗涤：氮气吹干，然后用N-甲基吡咯烷酮洗涤氨基树脂；和

（1-e）封闭反应：加入重量体积百分比为1.5-4%的乙酰咪唑的N-甲基吡咯烷酮（NMP）溶液，在20-28℃条件下反应20-40分钟。

在上述制备方法中，所述步骤（2）中裂解试剂的组分为体积比为85：8：6：1的三氟乙酸：三异丙基硅烷：苯酚：H₂O；并且，所述步骤（2）的裂解时间为1-4小时。

在上述制备方法中，所述步骤（3）具体包括：

（3-a）使用乙醚沉淀所述多肽，然后用二甲基甲酰胺洗涤；

（3-b）在加入占反应体系总体积10%的二甲基亚砜（DMSO）情况下，使沉淀得到的多肽的氨基酸序列中两个半胱氨酸之间形成二硫键；和

（3-c）使所述多肽的氨基酸序列的首尾氨基酸残基之间反应形成共价连接；优选地，在加入占反应体系总体积1%的二异丙基碳二亚胺（DIC）和0.5%的1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑（HOAT）情况下使所述多肽的氨基酸序列的首尾氨基酸残基的羧基与氨基、或者在加入0.1M H₂SO ₄情况下使羧基与羟基之间反应形成共价连接。

在上述制备方法中，所述步骤（4）具体包括以下步骤：

（4-a）使用切向过滤膜包在20-28℃条件下超滤所述多肽，从而除去小分子杂质；和

（4-b）使用0.2微米在线滤器除菌保存。

又一方面，本发明提供了一种肽疫苗，所述肽疫苗包含一种或多种上述多肽。并且，所述肽疫苗优选还包含佐剂；优选地，所述佐剂为选自白油、50V、50VII中的一种或多种。进一步优选地，所述肽疫苗中所包含的多肽和佐剂的体积比为1:1。

再一方面，本发明提供了该肽疫苗的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

（1）用注射用水将所述多肽稀释为50μg/ml的浓度，从而得到多肽抗原水相；

（2）将佐剂在121℃条件下灭菌30分钟；和

（3）在20-28℃条件下，按照所述多肽抗原水相与所述佐剂1：1的体积比，先将佐剂加入乳化罐内，在90-150转/分钟下搅拌1.5-3分钟，然后缓慢加入多肽抗原水相，搅拌20-30分钟，再在8000-10000转/分钟下搅拌15-30分钟，静置5分钟，分装。

还一方面，本发明提供了上述多肽或肽疫苗在制备用于预防牛口蹄疫ASIA I型的药物中的用途。

具体而言，本发明人通过对国内口蹄疫新近流行毒株的序列测定并结合口蹄疫疫苗毒株序列，研究口蹄疫主要抗原位点的变异情况，针对主要变异的氨基酸位点统计其变异的频率，同时结合计算机辅助进行口蹄疫抗原位点的分析预测，对可能的抗原位点肽段进行化学合成，即针对易变异位点根据统计的变异频率，在这些位点使用不同的氨基酸，得到涵盖当前所有可能变异位点的多种候选多肽抗原。进而，通过大量的动物试验对这些候选多肽抗原进行筛选，得到能够引起动物的免疫反应，而且免疫反应水平高，能够很好的保护动物免受口蹄疫流行毒株的攻击的多肽抗原。此外，本发明人根据筛选实验结果对口蹄疫病毒抗原位点进行了优化，并有效组合了T细胞表位和B细胞表位，增强了多肽抗原的免疫效果。

肽疫苗效力实验、安全性实验结果表明，本发明提供的牛口蹄疫ASIA I型合成肽疫苗具有良好的免疫效力，并且不会引发传统疫苗存在的发热、红肿等问题，因此本发明的疫苗可以有效应对目前口蹄疫病毒的抗原变异、不存在生物安全性，易于大规模合成，具有良好的应用前景。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

实施例1 牛口蹄疫ASIA I型合成肽抗原的固相合成

本发明的合成肽抗原可以使用ABI公司433型全自动多肽合成仪，利用Merrifield固相合成法制备，其中采用了由9-芴甲氧羰基（Fmoc）修饰的氨基酸，固相载体为购自美国Sigma公司的Rink Amide MBHA树脂。生产过程通常包括多肽抗原的固相合成、多肽的裂解、抗原纯化与除菌保存。

1.1 合成肽抗原的固相合成

1.1.1 合成原料准备

合成多肽抗原的序列分别如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12或SEQ ID NO. 13所示。

依据抗原的序列以及1mmol的合成规模，准备合适的Fmoc修饰的氨基酸（购自上海吉尔生化），加入相应的氨基酸小瓶中。同样按要求称量Rink Amide MBHA树脂，放入反应腔中，将上下盖子拧紧，贴标签，记录所合成肽的名称、批号、反应腔的皮重及所称树脂的重量。将反应腔装入合成仪。配制合成试剂，包括N-甲基吡咯烷酮（NMP）、乙酰咪唑（AIM）、哌啶（PIP）、甲醇等放置到相对应的试剂瓶中。

1.1.2 合成仪状态检测

检查多肽合成仪是否正常运行。开机后，运行Run Self Test程序，仪器自检各项指标是否正常。另外检查N₂是否充足，系统表压是否正常。合成前应对仪器的性能有所了解，所以要对每种合成试剂的流速进行测定。发送Flow Rate1-18到合成仪，选择Main Menu—Module Test—按Prer或next找ModuleA、ModuleD、ModuleI、ModuleI、ModuleA—按Start—按more进行测量或观察，若流量不合适，则调节下阀门压力，直至达到要求。

1.1.3 合成肽抗原的合成开始

在合成仪的程序中将合成需要的方法Std Fmoc 1.0 Sol DIC90发送到合成仪上。File-New-Sequence-编辑合成肽的序列，保存。File-New-Run，检查Chemistry；Sequence是否为所存名字；设定Cycles；保存。最后发送到合成仪上。

Main Menu—Cycle Monitor—begin，开始运行。

1.1.4 合成肽抗原的合成

如上述的多肽序列，合成的时候是从C端开始至N端，依照给定的顺序，依次不断地重复如下合成步骤：

（1）脱保护反应：将上述氨基树脂置于体积百分比为15%-30%的六氢吡啶的NMP溶液中，在20-28℃条件下反应25-40分钟脱除氨基树脂上的Fmoc保护基团；

（2）洗涤：氮气吹干，NMP洗涤氨基树脂；

（3）缩合反应：加入HOBT、DCC与Fmoc保护的氨基酸在20-28℃条件下反应0.5-2.5小时；

（4）洗涤：氮气吹干，NMP洗涤氨基树脂；

（5）封闭反应：加入重量体积百分比为1.5%-4%的乙酰咪唑的NMP溶液，在20-28℃条件下反应20-40分钟。

1.1.5 合成肽抗原合成结束

抗原合成结束后合成仪将自动停止。然后从多肽合成仪上取下反应器，再用100%甲醇洗涤多肽树脂3次，然后在通风橱内吹干，将多肽树脂转移至棕色瓶内，放入-20℃冰箱内，封口膜密封备用。

1.2 合成肽抗原的裂解及鉴定

1.2.1 合成肽抗原的裂解

按照体积比例（三氟乙酸（TFA）/三异丙基硅烷（TIS）/苯酚/H₂O=85/8/6/1）配制裂解液，然后从冰箱内取出合成的多肽树脂，放入圆底烧瓶内，在通风橱内向烧瓶内加入配制好的裂解液和磁搅拌子，然后稳定地放置在磁力搅拌器上，室温下持续搅拌1小时直至反应完全。反应结束后，使用带冷阱的旋转蒸发仪持续蒸发30至120分钟除去粗产品中的TFA。接着使用乙醚收集、沉淀多肽，然后用二甲基甲酰胺（DMF）多次清洗多肽抗原的粗品，最后将混合在一起的树脂用砂芯漏斗过滤出来，即得到多肽抗原。

1.2.2 合成肽抗原的鉴定

多肽抗原合成完毕后用基质辅助激光解吸飞行时间质谱法（MALDL-TOF）和反相高压液相色谱法（RP-HPLC）进行定性定量分析。

1.3 合成肽抗原的构象形成

用15％DMSO将多肽抗原配制成浓度为2mg/ml的多肽溶液，然后用0.1N NaOH或0.1N HCl调整初步分离多肽溶液的pH值=8.5，在25℃的环境下在转速为110rpm的摇床上放置48小时，使形成二硫键。

进而进行首尾环化，首尾氨基酸的“-COOH”与“-NH₂”环化方法参见Mengfen等Peptide Protein Reserch 1996.48:229-239；使首尾氨基酸的“-COOH”与“-OH”进行反应而形成环状结构的方法参见Mmenhofer等 Chem.Soc 1970.92：3771-3777。由此得到能够模拟病毒粒子天然构象的多肽环化结构。

1.4 合成肽抗原的纯化除菌

合成肽抗原使用循环式切向过滤膜包在20-28℃条件下进行超滤（Tangential Flow Device循环式切向过滤膜包以及与其配套的蠕动泵），多肽抗原是大分子不能通过一定孔径的滤膜，而前期合成过程以及后期环化反应形成或引进的小分子杂质则可以通过滤膜。然后再通过孔径为0.2μm在线过滤器除菌，将最后得到的溶液分装到无菌塑料瓶内，贴上标签。标签上注明多肽的名称、编号、生产批号、浓度、生产日期、保存期限及保存条件，分装后，储存于-20℃或-40℃备用。

为了便于运输和长期保存的需要，将多肽抗原进行冷冻干燥以得到固体状态的多肽。将预先冻好的多肽抗原取出，在Labconco冷冻干燥机上进行干燥，得到固体状态的多肽抗原。同时贴上标签。标签上注明多肽的名称、编号、生产批号、浓度、生产日期、保存期限及保存条件。

实施例2 合成肽疫苗的配制

2.1 抗原水相的配制

分别称取依照实施例1制备的序列分别如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12或SEQ ID NO. 13所示的合成肽抗原，然后用灭菌注射用水将合成肽抗原浓度稀释至50μg/ml。将所得抗原溶液经孔径为0.2μm的过滤器过滤，除菌。

2.2 油相佐剂制备

将油相佐剂50V经121℃灭菌30分钟，备用。

2.3 合成肽疫苗的乳化

用灭菌的蒸馏水2000ml清洗IKA乳化设备3次，然后在20-28℃条件下按油相佐剂和抗原水相为1：1的体积比，先将油相加入乳化罐内，开动电机以90～150r/m慢速转动搅拌2分钟后，同时缓慢加入水相抗原，加完后搅拌30分钟，再以10000r/m高速搅拌20分钟，静置5分钟，使疫苗乳化成油包水的单相疫苗。

实施例3 牛口蹄疫ASIA I型合成肽疫苗效力试验

1. 材料与方法

1.1 合成肽疫苗

按照实施例1制备序列如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12或SEQ ID NO. 13所示的多肽抗原，然后按照实施例2分别配制的对应批号为：ZM62601、ZM62602、ZM62603、ZM62604、ZM62605、ZM62606的ASIA I型口蹄疫合成肽疫苗。

1.2 试验动物

挑选口蹄疫抗体阴性（乳鼠中和抗体滴度≤1∶4）的6月龄健康黄牛37头（购自兰州地区牛场）。

1.3 毒种ASIAI JSL

用3-4日龄乳鼠测定并调整毒价，置于-25℃冷冻保存备用。

1.4 试验方法

将6组试验肽疫苗中的每组疫苗分别免疫5头牛，同时用常规灭活疫苗（牛口蹄疫ASIA I型二价灭活疫苗，由中牧股份兰州生物药厂提供，批号1112001）作为阳性对照，免疫5头牛。阴性对照2头牛。免疫时采用耳后肌肉注射，注射剂量均为2ml/牛。免疫21天后，连同条件相同的对照牛2头，每头牛舌上表面两侧分两点皮内注射牛口蹄疫ASIA I型病毒强毒ASIAI JSL，每点0.1ml（共0.2ml，含10000ID₅₀）。攻毒10天后，观察记录试验结果。

1.5 结果判定

对照牛均应至少3蹄出现水泡或溃疡。免疫牛仅在舌面出现水泡或溃疡、而其它部位无病变时判为保护，除舌面以外任一部位出现典型口蹄疫水泡或溃疡时判为不保护。

2. 试验结果与讨论

2.1试验结果

免疫21天后，连同条件相同的对照牛2头，每头牛舌上表面两侧分两点皮内注射牛口蹄疫ASIA I型病毒强毒ASIAI JSL，每点0.1ml（共0.2ml，含10000ID₅₀）。攻毒10天后，结果详见表1。

表1 牛口蹄疫ASIA I型合成肽疫苗效力试验结果

2.2 结果讨论

从本试验结果可以看出，本发明的牛口蹄疫ASIA I型合成肽疫苗经免疫本动物牛后保护率在80%到100%之间，最高达到100%的保护。由此证明这些抗原配制的牛口蹄疫ASIA I型合成肽疫苗具有良好的免疫效力和临床应用潜力。

实施例4 牛口蹄疫ASIA I型合成肽疫苗的安全性试验

1. 材料与方法

1.1 合成肽疫苗

同实施例3。

1.2 试验动物

自繁350~450g的豚鼠；18~22g的小鼠；至少6月龄的健康易感牛。

1.3 试验方法

1.3.1 用体重350~450g的豚鼠12只，每只皮下注射疫苗2ml；用体重18~22g的小鼠30只，每只皮下注射疫苗0.5ml。连续观察7日，均不得出现因注射疫苗引起的死亡或明显的局部不良反应或全身反应。

1.3.2 用至少6月龄的健康易感牛（口蹄疫细胞中和抗体效价不高于1:8）18头，于每头牛舌皮内分20个点注射疫苗2ml，每点0.1ml，逐日观察至少4日。之后，每头牛肌肉注射疫苗9ml，继续逐日观察6日。均不得出现口蹄疫症状或明显的因注射疫苗引起的毒性反应。

2. 试验结果

2.1 疫苗对豚鼠和小鼠的安全性

豚鼠12只，每只皮下注射疫苗2ml；小鼠30只，每只皮下注射0.5ml。连续观察7日，均没有出现因注射疫苗引起的死亡或明显的局部不良反应或全身反应，具体结果如下表2。

表2 豚鼠和小鼠的疫苗安全性试验结果

2.2. 疫苗对健康易感牛的安全性

将合成肽疫苗取出平衡到室温后，于每头牛舌皮内分20个点注射疫苗2ml，每点0.1ml，逐日观察至少4日。之后，每头牛肌肉注射疫苗9ml，继续逐日观察6日。具体结果见表2。

表3 健康易感牛的疫苗安全性试验结果

上述结果说明这些牛口蹄疫ASIA I型合成肽疫苗对豚鼠、小鼠及牛是安全的，不像传统疫苗那样存在发热、红肿等副反应问题，所以具有良好的推广前景和市场价值。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims

1.一种用于制备牛口蹄疫ASIA I型肽疫苗的多肽，其特征在于，所述多肽包含如SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽还包含具有增强免疫作用的口蹄疫内源或外源性T细胞表位氨基酸序列，其中，所述氨基酸序列选自SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 7中的一个或多个；

优选地，所述多肽包含如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12或SEQ ID NO.13所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求2所述的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12或SEQ ID NO. 13所示；

优选地，所述多肽的氨基酸序列中的两个半胱氨酸的巯基经氧化连接在一起形成二硫键；

进一步优选地，所述多肽的氨基酸序列的首尾氨基酸残基之间反应形成共价连接；

更优选地，所述多肽的氨基酸序列的首尾氨基酸残基的羧基与氨基、或者羧基与羟基之间反应形成共价连接。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的多肽的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

（3）使用乙醚沉淀所述多肽；和

（4）对所述多肽进行超滤纯化，然后进行无菌处理。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）包括以下步骤：

（1-a）脱保护反应：将氨基树脂置于体积百分比为15-30%的六氢吡啶的N-甲基吡咯烷酮溶液中，在20-28℃条件下反应25-40分钟，从而脱除氨基树脂上的9-芴甲氧羰基保护基团；

（1-c）缩合反应：加入1-羟基苯丙三唑、二环己基碳二亚胺与由9-芴甲氧羰基保护的氨基酸，然后在20-28℃条件下反应0.5-2.5小时；

（1-e）封闭反应：加入重量体积百分比为1.5-4%的乙酰咪唑的N-甲基吡咯烷酮溶液，在20-28℃条件下反应20-40分钟。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中裂解试剂的组分为体积比为85：8：6：1的三氟乙酸：三异丙基硅烷：苯酚：H₂O；

优选地，所述步骤（2）的裂解时间为1-4小时。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法的步骤（3）中还包括：

（3-a）使用乙醚沉淀所述多肽，然后用二甲基甲酰胺洗涤；

（3-b）在加入占反应体系总体积10%的二甲基亚砜情况下，使沉淀得到的多肽的氨基酸序列中两个半胱氨酸之间形成二硫键；和

（3-c）使所述多肽的氨基酸序列的首尾氨基酸残基之间反应形成共价连接；优选地，在加入占反应体系总体积1%的二异丙基碳二亚胺和0.5%的1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑情况下使所述多肽的氨基酸序列的首尾氨基酸残基的羧基与氨基、或者在加入0.1M H₂SO₄情况下使羧基与羟基之间反应形成共价连接。

8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）包括以下步骤：

（4-b）使用0.2微米在线滤器除菌保存。

9.一种牛口蹄疫ASIA I型肽疫苗，其特征在于，所述肽疫苗包含一种或多种根据权利要求1至3中任一项所述的多肽。

10.根据权利要求9所述的肽疫苗，其特征在于，所述肽疫苗还包含佐剂；

优选地，所述佐剂为选自白油、50V、50VII中的一种或多种；

进一步优选地，所述肽疫苗中所包含的多肽和佐剂的体积比为1:1。

11.根据权利要求9或10所述的肽疫苗的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

（2）将佐剂在121℃条件下灭菌30分钟；和

（3）在20-28℃条件下，按照所述多肽抗原水相与所述佐剂1：1的体积比，先将佐剂加入乳化罐内，在90-150转/分钟下搅拌1.5-3分钟，然后缓慢加入多肽抗原水相，然后搅拌20-30分钟，再在8000-10000转/分钟下搅拌15-30分钟，静置5分钟，分装。

12.根据权利要求1至3中任一项所述的多肽或者根据权利要求9或10所述的肽疫苗在制备用于预防牛口蹄疫ASIA I型的药物中的用途。