CN105820217B - 合成肽疫苗及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种口蹄疫合成肽疫苗。具体涉及用于O型口蹄疫合成肽疫苗的多肽或其多肽聚合物，以及含有该多肽或其多肽聚合物的疫苗及它们的制备方法，所述多肽具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。本发明通过大量动物试验对这些候选多肽抗原进行筛选，根据筛选结果对口蹄疫病毒抗原位点进行了优化，并有效组合了T细胞表位和B细胞表位，增强了多肽抗原的免疫效果。该O型口蹄疫合成肽疫苗可以有效应对口蹄疫病毒的抗原变异，生物安全性好，易于大规模合成，具有良好的应用前景。

Description

合成肽疫苗及其制备方法
本申请是申请号为“201410081709.9”，发明名称为“一种合成肽疫苗及其制备方法”的专利申请的分案申请
技术领域
本发明涉及一种用于口蹄疫合成肽疫苗的多肽或其多肽聚合物，以及含有该多肽或其多肽聚合物的疫苗及它们的制备方法，具体涉及一种用于O型口蹄疫合成肽疫苗的多肽或其多肽聚合物，以及含有该多肽或其多肽聚合物的疫苗及它们的制备方法。
背景技术
口蹄疫(foot and mouth disease，简称FMD)是一种发生于偶蹄动物的急性、高度接触性、发热性传染病，在世界范围内广泛分布。由于其传染性高，传播迅速，感染猪、牛、羊等牲畜导致幼畜死亡，成年动物生产能力急剧下降，严重危害畜牧业的发展和肉食及其畜产品的生产和供应。同时会使动物及动物产品的市场流通和国际贸易受到极大的封锁和限制，给流行国家和地区畜牧业生产造成巨大的经济损失。口蹄疫是由口蹄疫病毒(FMDV)感染引起的，口蹄疫病毒属细小核糖核酸病毒，具有多型性、易变性等特点。目前，已知全世界有7种血清型的口蹄疫病毒：A、O、C、Sat1(南非I型)、Sat2(南非II型)、Sat3(南非III型)和Asia I(亚洲I型)。而每种主型又分若干亚型，目前发现的亚型已有70多种。血清型A、O、C和Asia I型最为常见，其中血清型A病毒的变种最多，具有超过30种亚型。研究结果表明：口蹄疫病毒的衣壳蛋白是由四种结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4组成的，每种各60个。VP1-VP3组成衣壳蛋白亚单位，位于衣壳蛋白的外侧，而VP4位于病毒颗粒的内部。VP1是主要的保护性抗原，现已发现O型口蹄疫有3个主要的抗原位点位于VP1上，其中133-160和200-213位构成了VP1上最重要且最容易变异的保护性抗原位点。
当前在我国主要流行的口蹄疫是O型和Asia I型口蹄疫。口蹄疫病毒各型之间的抗原性不同，彼此之间不能交互免疫。而且，在同一种血清型中抗原差异的程度也很大，以至于能够有效地抵抗一种亚型的口蹄疫疫苗可能针对同一血清型中的另一种亚型没有保护性。此外，口蹄疫毒株的抗原性还在不断发生变化，随着时间的推移，原有疫苗的效力减弱甚至消失，因此给口蹄疫的防治工作带来了很大的困难。
目前，我国对口蹄疫实行强制性免疫，疫苗免疫是防治口蹄疫的主要手段。而我国现行使用的口蹄疫疫苗主要是病毒灭活疫苗，其存在着生物安全性差、副反应大、产品质量不稳定等问题。目前世界上很多国家已经停止使用灭活疫苗，也禁止从使用灭活疫苗的国家进口畜产品。在口蹄疫新型疫苗的研究方面，先后有基因工程亚单位疫苗、口蹄疫病毒载体疫苗、口蹄疫基因工程修饰疫苗的研究报道，但是其在免疫效果、生物安全性方面都存在着诸多问题，影响了这些新型疫苗的使用。此外，这些疫苗对于当前已经发生变异的流行毒株往往效果较差，不能有效地保护动物。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于口蹄疫合成肽疫苗的多肽或其多肽聚合物，以及含有该多肽或其多肽聚合物的疫苗，特别是用于O型口蹄疫合成肽疫苗的多肽或其多肽聚合物，以及含有该多肽或其多肽聚合物的疫苗。
本发明的另一个目的是提供一种上述多肽以及上述疫苗的制备方法。
为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种用于O型口蹄疫合成肽疫苗的多肽，其中所述多肽具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
上述氨基酸序列中一个或者两个以上缬氨酸可以被正缬氨酸替代；和/或一个或者两个以上亮氨酸可以被正亮氨酸替代。优选地，上述氨基酸序列中全部缬氨酸被正缬氨酸替代；和/或全部亮氨酸被正亮氨酸替代。
上述氨基酸序列中的任意两个半胱氨酸的巯基可以经氧化连接在一起形成二硫键。
上述氨基酸序列的首尾氨基酸残基之间可以反应形成共价连接。具体来说，上述氨基酸序列的首尾氨基酸残基的羧基与氨基、或者羧基与羟基之间反应形成共价连接。
一种口蹄疫合成肽疫苗，其中包括一种或两种以上的上述多肽或其多肽聚合物。如，其中包括SEQ ID NO.2所示的多肽或其多肽聚合物。
更进一步的，其中还包括SEQ ID NO.1的多肽或其多肽聚合物、SEQ ID NO.3所示的多肽或由选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3中的至少一种多肽连接成的多肽聚合物。
例如：具有SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的多肽或其多肽聚合物，或者他们的任意两种或者两种以上的组合。上述疫苗还可以包含佐剂。
本发明还提供了上述多肽的制备方法，其中包括以下步骤：
(1)以氨基树脂为起始原料，以9-芴甲氧羰基保护的氨基酸为单体，按照所述氨基酸序列依次缩合接上氨基酸，每步缩合反应后用乙酰咪唑封闭未反应的氨基端；
(2)合成完毕后加入裂解试剂裂解多肽；
(3)使用乙醚收集、沉淀多肽；
(4)超滤纯化多肽后进行无菌处理。
在上述制备方法中，所述裂解试剂的组分体积比为三氟乙酸(TFA)：三异丙基硅烷(TIS)：苯酚：H2O＝85：8：6：1；所述裂解时间为1-4小时。
在上述的制备方法中，所述步骤(1)具体包括以下步骤：
(a)脱保护反应：将氨基树脂置于体积百分比为15-30％的六氢吡啶的N-甲基吡咯烷酮(NMP)溶液中，在20-28℃条件下反应25-40分钟脱除氨基树脂上的9-芴甲氧羰基保护基团；
(b)洗涤：氮气吹干，N-甲基吡咯烷酮洗涤氨基树脂；
(c)缩合反应：加入1-羟基苯丙三唑(HOBT)、二环己基碳二亚胺(DCC)与9-芴甲氧羰基保护的氨基酸在20-28℃条件下反应0.5-2.5小时；
(d)洗涤：氮气吹干，N-甲基吡咯烷酮洗涤氨基树脂；
(e)封闭反应：加入重量体积百分比为1.5-4％的乙酰咪唑的N-甲基吡咯烷酮(NMP)溶液，在20-28℃条件下反应20-40分钟。
在上述制备方法中，所述步骤(4)具体包括以下步骤：
(a)使用切向过滤膜包在20-28℃条件下超滤制得的多肽，除去小分子杂质；
(b)使用0.2微米在线滤器除菌保存。
本发明还提供了上述疫苗的制备方法，其中包括以下步骤：
(1)用注射用水将上述多肽或其多肽聚合物稀释到50μg/ml制得抗原水相；
(2)将佐剂经121℃、30分钟灭菌备用；
(3)在20-28℃条件下，按照抗原水相与佐剂1：1的体积比，先将佐剂加入乳化罐内，90-150转/分钟慢速搅拌1.5-3分钟，缓慢加入水相，加完后搅拌20-30分钟，再高速8000-10000转/分钟搅拌15-30分钟，静置5分钟，分装后即得。
本发明进一步提供了上述多肽或其多肽聚合物、疫苗在制备治疗和/或预防O型口蹄疫的药物中的用途。其中，所述O型口蹄疫优选为猪O型口蹄疫。
本发明通过对国内口蹄疫新近流行毒株的序列测定并结合口蹄疫疫苗毒株MYA/98和OZK/93序列，研究口蹄疫主要抗原位点的变异情况，针对主要变异的氨基酸位点统计其变异的频率，同时结合计算机辅助进行口蹄疫抗原位点的分析预测，对可能的抗原位点肽段进行化学合成，即针对易变异位点根据统计的变异频率，在这些位点使用不同的氨基酸，得到涵盖当前所有可能变异位点的多种候选多肽抗原。进而通过大量的动物试验对这些候选多肽抗原进行筛选，得到能够引起动物的免疫反应，而且免疫反应水平高，能够很好的保护动物免受口蹄疫流行毒株的攻击的多肽抗原。本发明根据筛选实验结果对口蹄疫病毒抗原位点进行了优化，并有效组合了T细胞表位和B细胞表位，增强了多肽抗原的免疫效果。该口蹄疫O型合成肽疫苗可以有效应对目前口蹄疫病毒的抗原变异、不存在生物安全性，易于大规模合成，具有良好的应用前景。
具体实施方式
下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1、实施例1口蹄疫合成肽抗原的固相合成
本发明通过对国内口蹄疫新近流行毒株的序列测定并结合口蹄疫疫苗毒株MYA/98和OZK/93序列，研究口蹄疫主要抗原位点的变异情况，针对主要变异的氨基酸位点统计其变异的频率，同时结合计算机辅助进行口蹄疫抗原位点的分析预测，对可能的抗原位点肽段进行化学合成，即针对易变异位点根据统计的变异频率，在这些位点使用不同的氨基酸，得到涵盖当前所有可能变异位点的多种候选多肽抗原。进而通过大量的动物试验对这些候选多肽抗原进行筛选，得到能够引起动物的免疫反应，而且免疫反应水平高，能够很好的保护动物免受口蹄疫流行毒株的攻击的多肽抗原。
本发明的多肽抗原可以使用全自动多肽合成仪，利用Merrifield固相合成法制备，其中采用了9-芴甲氧羰基(Fmoc)修饰的氨基酸，固相载体为Rink Amide MBHA树脂。生产过程通常包括多肽抗原的固相合成、多肽的裂解、抗原纯化与除菌保存。
1、多肽抗原的固相合成
1)合成原料准备
合成多肽抗原的序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示。
依据抗原的序列以及合成规模为1mmol准备合适的Fmoc修饰的氨基酸，加入相应的氨基酸小瓶中。同样按要求称量Rink Amide MBHA树脂，放入反应腔中，将上下盖子拧紧，贴标签，记录所合成肽的名称、批号、反应腔的皮重及所称树脂的重量。将反应腔装入合成仪。配制合成试剂，包括N-甲基吡咯烷酮(NMP)、乙酰咪唑(AIM)、哌啶(PIP)、甲醇等放置到相对应的试剂瓶中。
2)合成仪状态检测
检查多肽合成仪是否正常运行。开机后，运行Run Self Test程序，仪器自检各项指标是否正常。另外检查N2是否充足，系统表压是否正常。合成前应对仪器的性能有所了解，所以要对每种合成试剂的流速进行测定。发送Flow Rate1-18到合成仪，选择MainMenu—Module Test—按Prer或next找Module A、ModuleD、ModuleI、ModuleI、Module A—按Start—按more进行测量或观察，若流量不合适，则调节下阀门压力，直至达到要求。
3)多肽抗原的合成开始
在合成仪的程序中将合成需要的方法Std Fmoc 1.0Sol DIC90发送到合成仪上。File-New-Sequence-编辑合成肽的序列，保存。File-New-Run，检查Chemistry；Sequence是否为所存名字；设定Cycles；保存。最后发送到合成仪上。
Main Menu—Cycle Monitor—begin，开始运行。
4)多肽抗原的合成
如上述的多肽序列，合成的时候是从C端开始至N端，依照给定的顺序，依次不断地重复如下合成步骤：
(1)脱保护反应：将上述氨基树脂置于体积百分比为15％-30％的六氢吡啶的NMP溶液中，在20-28℃条件下反应25-40分钟脱除氨基树脂上的Fmoc保护基团；
(2)洗涤：氮气吹干，NMP洗涤氨基树脂；
(3)缩合反应：加入HOBT、DCC与Fmoc保护的氨基酸在20-28℃条件下反应0.5-2.5小时；
(4)洗涤：氮气吹干，NMP洗涤氨基树脂；
(5)封闭反应：加入重量体积百分比为1.5％-4％的乙酰咪唑的NMP溶液，在20-28℃条件下反应20-40分钟。
5)多肽抗原合成结束
抗原合成结束后合成仪将自动停止。然后从多肽合成仪上取下反应器，再用100％甲醇洗涤多肽树脂3次，然后在通风橱内吹干，将多肽树脂转移至棕色瓶内，放入-20℃冰箱内，封口膜密封备用。
2、多肽抗原的裂解及鉴定
1)多肽抗原的裂解
按照体积比例(TFA/TIS/苯酚/H2O＝85/8/6/1)配制裂解液，然后从冰箱内取出合成的多肽树脂，放入圆底烧瓶内，在通风橱内向烧瓶内加入配制好的裂解液和磁搅拌子，然后稳定地放置在磁力搅拌器上，室温下持续搅拌1小时直至反应完全。反应结束后，使用带冷阱的旋转蒸发仪持续蒸发30至120分钟除去粗产品中的TFA。接着使用乙醚收集、沉淀多肽，然后用二甲基甲酰胺(DMF)多次清洗多肽抗原的粗品，最后将混合在一起的树脂用砂芯漏斗过滤出来，即得到多肽抗原。
2)合成抗原的鉴定
多肽抗原合成完毕后用基质辅助激光解吸飞行时间质谱法(MALDL-TOF)和反相高压液相色谱法(RP-HPLC)进行定性定量分析。
3)多肽抗原的构象形成
用15％DMSO将多肽抗原配制成浓度为2mg/ml的多肽溶液，然后用0.1N NaOH或0.1N HCl调整初步分离多肽溶液的pH值＝8.5，在25℃的环境下在转速为110rpm的摇床上放置48小时，使形成二硫键。
进而进行首尾环化，首尾的“-COOH”与“-NH2”环化方法见Mengfen等PeptideProtein Reserch 1996.48:229-239；首尾的“-COOH”与“-OH”进行反应而形成环状结构见Mmenhofer等Chem.Soc 1970.92：3771-3777。即可得到能够模拟病毒粒子天然构象的多肽环化结构。
4)多肽抗原的纯化除菌
多肽抗原使用循环式切向过滤膜包在20-28℃条件下进行超滤(Tangential FlowDevice循环式切向过滤膜包以及与其配套的蠕动泵)，多肽抗原是大分子不能通过一定孔径的滤膜，而前期合成过程以及后期环化反应形成或引进的小分子杂质则可以通过滤膜。然后再通过孔径为0.2μm在线过滤器除菌，将最后得到的溶液分装到无菌塑料瓶内，贴上标签。标签上注明多肽的名称、编号、生产批号、浓度、生产日期、保存期限及保存条件，分装后，储存于-20℃或-40℃备用。
为了便于运输和长期保存的需要，将多肽抗原进行冷冻干燥以得到固体状态的多肽。将预先冻好的多肽抗原取出，在Labconco冷冻干燥机上进行干燥，得到固体状态的多肽抗原。同时贴上标签。标签上注明多肽的名称、编号、生产批号、浓度、生产日期、保存期限及保存条件。
实施例2、合成肽疫苗的配制
1、抗原水相的配制
首先，分别称取依照上述实施例1合成的三种多肽抗原；然后，用灭菌注射用水将合成肽抗原浓度稀释至50μg/ml；将抗原溶液经孔径为0.2μm的过滤器过滤，除菌。
2、油相佐剂制备
将油相佐剂ISA50V经121℃、30分钟灭菌，备用。
3、合成肽疫苗的乳化
用灭菌的蒸馏水2000ml清洗IKA乳化设备(购自IKA公司，货号200603)3次，然后在20-28℃条件下按油相佐剂和抗原水相为1：1的体积比，先将油相加入乳化罐内，开动电机以90～150r/m慢速转动搅拌2分钟后，同时缓慢加入水相抗原，加完后搅拌30分钟，再以10000r/m高速搅拌20分钟，静置5分钟，使疫苗乳化成油包水的单相疫苗。
实施例3、合成肽疫苗的效力试验
一、材料与方法
1、合成肽疫苗
按照上述实施例1合成具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3序列的多肽抗原，这些多肽两个半胱氨酸的巯基经氧化连接在一起形成二硫键，并且首尾氨基酸羧基与羟基之间反应形成共价连接。这些然后按照实施例2的方法分别配制与之对应的批号为：ZM433A01、ZM433A02、ZM433A03的口蹄疫O型合成肽疫苗。
此外，将SEQ ID NO：1中氨基酸序列中全部缬氨酸用正缬氨酸替代；全部亮氨酸用正亮氨酸替代，依据上述实施例提供的方法进行抗原合成，该抗原中同样两个半胱氨酸的巯基经氧化连接在一起形成二硫键，并且首尾氨基酸羧基与羟基之间反应形成共价连接，将按照实施例2的方法配制疫苗批号为：ZM433A04。
依据SEQ ID NO：1序列使用实施例1所述的常规合成肽技术合成该序列的二聚体抗原，其中，组成二聚体中每条多肽两个半胱氨酸的巯基经氧化连接在一起形成二硫键，并且首尾氨基酸羧基与羟基之间反应形成共价连接，按照实施例2的方法配制疫苗，得到批号为：ZM433A05的合成肽疫苗。
2、试验动物
挑选品种相同，4月龄、体重40Kg左右，口蹄疫中和抗体呈阴性的健康架子猪27头(二元杂交，兰州白银猪场)。
3、毒种OR/80MF8
将OR/80MF8(兰州生物药厂提供)经乳鼠测毒合格后置于-20℃冷冻保存，备用。
4、试验方法
针对每组疫苗采用体重40kg左右的健康易感架子猪(经乳鼠中和试验测定无口蹄疫中和抗体)5头。将待检的各批次合成肽疫苗分别于耳根后肌肉注射2ml。接种28日后，连同条件相同的对照猪2头，每头猪耳根后肌肉注射1000个ID50的口蹄疫O型病毒强毒OR/80MF8，连续观察10日。对照猪均至少一蹄出现水泡病变。免疫猪出现任何口蹄疫症状即判为不保护。
5、结果判定
猪一蹄以上或口鼻部出现口蹄疫典型水泡，则判为发病。而猪任何部位无口蹄疫典型水泡出现则判为保护。
二、试验结果与讨论
1、试验结果
免疫28天后，用1000个ID50/头份的OR/80强毒攻击10天后，结果详见表1。
表1 口蹄疫合成肽疫苗效力试验
2、结果讨论
从本试验结果可以看出，本发明的口蹄疫O型合成肽疫苗免疫本动物猪后最高达到100％的保护。同时，研究发现进行了氨基酸替换和抗原聚合的合成肽疫苗具有更好的免疫效果。说明这些抗原配制的口蹄疫O型合成肽疫苗具有良好的免疫效力和临床应用价值。
实施例4、合成肽疫苗的安全性试验
一、试验方法
1、用体重350-450g的豚鼠10只，每只皮下注射疫苗2ml；用体重18-22g的小鼠25只，每只皮下注射疫苗0.5ml。连续观察7日，均不得出现因注射疫苗引起的死亡或明显的局部不良反应或全身反应。
2、用30-40日龄的仔猪(经乳鼠中和试验测定无口蹄疫中和抗体)10头，各两侧耳根后肌肉注射疫苗2ml(每侧1ml)，逐日观察14日。均不得出现口蹄疫症状或明显的因注射疫苗引起的毒性反应。
二、试验结果
1、疫苗对豚鼠和小鼠的安全性
豚鼠10只，每只皮下注射疫苗2ml；小鼠25只，每只皮下注射0.5ml。连续观察7日，均没有出现因注射疫苗引起的死亡或明显的局部不良反应或全身反应，具体结果如下表1。
表1 疫苗对豚鼠和小鼠安全性试验的结果
2、疫苗对仔猪的安全性
将合成肽疫苗取出平衡到室温后，对易感仔猪(经乳鼠中和试验测定无口蹄疫中和抗体)，各两侧耳根后肌肉注射2头份疫苗，一侧1ml，逐日观察14日。均没有出现口蹄疫症状或明显的因注射疫苗引起的毒性反应。具体结果见表2。
表2 合成肽疫苗对仔猪安全性试验结果
上述结果说明这些合成肽疫苗对豚鼠、小鼠及仔猪是安全的，不象传统疫苗那样存在发热、红肿等副反应问题，所以具有良好的推广前景和市场价值。

Claims (4)

1.一种用于O型口蹄疫合成肽疫苗的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述多肽氨基酸序列中的两个半胱氨酸的巯基经氧化连接在一起形成二硫键；所述多肽氨基酸序列的首尾氨基酸残基之间反应形成共价连接。
2.一种口蹄疫合成肽疫苗，其中包括SEQ ID NO.2所示的多肽；所述多肽氨基酸序列中的两个半胱氨酸的巯基经氧化连接在一起形成二硫键；所述多肽氨基酸序列的首尾氨基酸残基之间反应形成共价连接。
3.根据权利要求2所述的口蹄疫合成肽疫苗，其特征在于：所述疫苗包含佐剂。
4.权利要求1所述的多肽、权利要求2或3所述的疫苗在制备预防猪O型口蹄疫的药物中的用途。
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