CN104363925B - 预防口蹄疫的肽疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及式(I)的树枝状肽构建体，其中：T是FMDV的T表位，通过其N末端与赖氨酸核心结合，B是FMDV的B表位，W是连接基团，Z是通过其硫原子结合至连接基团W的半胱氨酸或是通过其ε氨基结合至连接基团W的赖氨酸，当B通过其N末端结合到Z的α‑羧基时，X是不存在的，或当B通过其C末端结合到Z的α‑氨基时，X是酰基。本发明还涉及所述构建体作为免疫原应用于动物口蹄疫的预防的用途。

Description

预防口蹄疫的肽疫苗
技术领域
本发明涉及基于赖氨酸核心的树枝状肽(dendrimeric peptide)构建体，其同时包含口蹄疫病毒(FMDV)的B和T表位。本发明还涉及制备这些构建体的方法、包含这些构建体的组合物和其在动物口蹄疫预防中的应用。
背景技术
口蹄疫病毒(FMDV)是在偶蹄类动物中产生高度传染性和毁灭性疾病的小核糖核酸病毒。因为口蹄疫高度的传染性，所以其对畜牧业是一种严重的瘟疫。其遏制要求在疫苗接种、严格监控、贸易限制和检疫方面付出相当大的努力，并且有时要灭杀百万计的动物。
FMDV颗粒包含大约8500个核苷酸的正链RNA分子，其被包封在二十面体的衣壳内，所述衣壳包含60个拷贝的四种病毒蛋白VP1-4的每一种。基因组RNA编码单一多蛋白，由于不同的病毒蛋白酶的作用，通过蛋白水解过程，从该单一多蛋白产生不同的病毒蛋白，其包括九种成熟的非结构蛋白(NSP)。这些NSP的每一种以及一些前体多肽参与受感染细胞中与病毒生命周期增加相关的功能。FMDV表现出高遗传和抗原变异性，其反映在现存的七种血清型(O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3或ASIA1)和众多变体中。
另一方面，被B淋巴细胞识别的FMDV抗原结构已被详细表征。被认为是病毒主免疫原的主表位B是连续的和免疫显性的(位点A)，且位于VP1蛋白的140-160位置附近的GH环中(例如Bittle et al,Nature1982,vol.298,p.30-33)。在许多研究中，该表位作为免疫原被广泛使用(例如Brown F.,Vaccine 1992,vol.10(14),p.1022-1026)。在1986年，DiMarchi和同事(DiMarchi et al.,Science 1986,vol.232,p.639-641)报道在用如此肽免疫的牛中防护病毒攻击感染，在该肽中，VP1的140-160残基与相应于同一蛋白200-213位置的残基共线合成(colinearly synthesised)。但是，涉及大量动物的进一步研究指出，在天然FMDV宿主中，该肽表位提供有限的保护(例如Barteling S.J,Adv.Biotechnol.Processes1988,vol.10,p.25-60)。
此外，从感染FMDV的猪上，几个被淋巴细胞识别的T细胞表位已在非结构蛋白中被鉴定(例如Blanco E.et al.,Journal of Virology2001,vol.75,p.3164-3174)。在这些表位中，与VP1的表位B[137-156]共线合成的3A蛋白的表位T[21-35]，能够有效刺激来自被感染动物的淋巴细胞，并在体外引发显著水平的血清型特异性的抗FMDV活性。
一方面，口蹄疫病毒的问题——其促使这类的健康关注，是其非常有传染性。被感染的动物通过其唾液(因该疫病产生大量唾液)、其尿液和粪便释放病毒：当水泡破裂时，病毒也从中释放出来。奶和肉也含有病毒。这意味着与被感染动物接触的任何事物都将容易被污染。同样的，该病毒在特定环境下是非常有抗性的。因此，有必要采取严格的预防措施来避免这种疾病的传染和传播，虽然其对人类健康不危险，但会造成严重的经济损失。
当前，口蹄疫主要通过使用基于灭活病毒的疫苗来控制。FMDV感染和基于这些疫苗的免疫都经常引起高水平的特异性循环抗体，其与相关同源病毒和抗原相关病毒的防护有关。
尽管近几年有所进展，但直至现在，已知和使用中的疫苗显示出数个缺点，例如冷链以维持其稳定性的需求、定期重复接种疫苗的需要、疫苗生产中传染性病毒释放的风险以及其不确定的性质，换句话说，即在血清学上区分被感染动物和那些已经接种疫苗的动物的困难。
包含FMDV表位的树枝状肽已经被公开。Francis et al.(Immunology 1991,73,249-254)涉及具有二聚、四聚或八聚结构的多抗原肽(MAP)系统，其包含FMDV的B表位(VP1蛋白的141-160氨基酸)。EP2053056描述了基于赖氨酸核心的四聚肽构建体，其同时包含FMDV的B和T表位。四聚肽在Cubillo等(Journal of Virology 2008,82(14),7223-7229)中也被描述。该参考文献还公开了在制备所述四聚肽时获得的不确定结构的副产物(命名为B2T和B3T)。
尽管存在上述现有技术，仍需要进一步的FMD疫苗。特别是，免疫原性改进的、容易合成或容易纯化的系统将是期望的。
发明内容
发明人发现基于赖氨酸核心并且包含结合至赖氨酸核心的C末端残基的T表位和结合至赖氨酸核心的N末端残基的两个B表位的二聚肽构建体比相应的四聚肽构建体更容易获得和纯化。通过一个赖氨酸的α-氨基和另一个赖氨酸的α-羧基间的氨酰键，赖氨酸核心中的赖氨酸单元相互结合。
此外，发明人惊奇地发现，与EP2053056中公开的相应的四聚肽构建体相比，本发明的这些二聚肽构建体提高了免疫原性活性(见图1和2)。这是值得注意的，尤其是考虑到Francis等(Immunology 1991,73,249-254)，其中公开了四聚结构具有最佳的免疫应答，比相应的二聚体的免疫原性多五到十倍。
因此，在第一方面，本发明涉及一种式(I)的树枝状肽构建体
其中
T是FMDV的T表位，通过其N末端结合到赖氨酸核心；
B是FMDV的B表位；
W是连接基团；
Z是半胱氨酸，通过其硫原子结合到连接基团W上，或是赖氨酸，通过其ε氨基结合到连接基团W上，
当B通过其N末端结合到Z的α-羧基时，X是不存在的，或当B通过其C末端结合到Z的α-氨基时，X是酰基。
在第二方面，本发明涉及制备式(I)的树枝状肽构建体的方法。
在第三方面，本发明涉及包含式(I)的树枝状肽构建体和兽医学上可接受的佐剂、载体或稀释剂的组合物。
本发明的进一步方面涉及式(I)的树枝状肽构建体，在药物中应用和式(I)的树枝状肽构建体，在动物口蹄疫预防中应用。
附图简述
图1显示了本发明的二聚肽构建体(B2T)与相应的四聚肽构建体(B4T)、线性肽(BT)和单独的表位B相比，所引发的抗体应答。B2T指的是根据本发明的式(I)的构建体，其中X是Ac，B是SEQ ID NO：2，Z是半胱氨酸，W是-CH2-CO-和T是SEQ ID NO：1。B4T指的是如EP2053056中所述的四聚肽构建体，其中X、B、Z、W和T如对B2T所限定的。BT指的是由SEQ ID NO：2与SEQID NO：1结合生成的线性肽。B指的是SEQ ID NO:2。
图2表示本发明的二聚肽构建体(B2T)与相应的四聚肽构建体(B4T)、线性肽(BT)和单独的表位B相比，所引发的IFN-γ的表达。B2T、B4T、BT和B如对图1所限定的。
图3显示了本发明构建体1-4所引发的抗体应答。
图4显示了表示本发明构建体1-4所引发的IFN-γ表达。
具体实施方式
第一方面，本发明涉及一种式(I)的树枝状肽构建体
其中
T是FMDV的T表位，通过其N末端结合到赖氨酸核心；
B是FMDV的B表位；
W是连接基团；
Z是半胱氨酸，通过其硫原子结合到连接基团W上，或是赖氨酸，通过其ε氨基结合到连接基团W上，
当B通过其N末端结合到Z的α-羧基时，X是不存在的，或当B通过其C末端结合到Z的α-氨基时，X是酰基。
由代表的赖氨酸核心相应于以下化学结构：
其中标有(1)的氨基与连接基团W连接，和标有(2)的羰基形成与表位T连接的肽键的一部分。
FMDV的T和B表位在本领域众所周知(例如Veterinary Research2001,32:1-30)，或其可以依靠经验鉴定(例如使用PEPSCAN或类似的方法，Geysen et al.(1984)PNAS USA81:3998,Carter(1994)Methods Mol Biol 36:207)，或可被预测(International Journalof Biotechnology Applications 2009,1:1-3；Journal of General Virology 2011,2297；BMC Bioinformatics 2009,10:302)。
在具体的实施方式中，FMDV的T表位是FMDV的非结构蛋白3A、3B或3C的T表位。
在进一步的实施方式中，FMDV的T表位包含C血清型FMDV(CS8毒株)的3A蛋白的残基21-35，或C血清型另一毒株的相应氨基酸残基，或另一血清型FMDV的相应氨基酸残基，例如A、C、SAT1、SAT2、SAT3或ASIA1血清型。
在优选的实施方式中，T表位包含氨基酸序列AAIEFFEGMVHDSIK(SEQ ID NO：1)。
进一步，T表位可利用组成蛋白、蛋白片段和肽的体外T细胞刺激技术进行鉴定以鉴定合适的序列(Ann.Rev.Immunol.,1,465,(1983)；"The Year in Immunology,vol.2",1986,p.151；Ann.Rev.Immunol.,5,477,(1987))。
优选地，T表位在C末端被加帽为羧酰胺。
在具体的实施方式中，FMDV的B表位是FMDV的衣壳蛋白VP1、VP2或VP3的B表位。
FMDV的主B表位被鉴定为称为GH环或抗原位点的区域，其大约位于VP1的140-160残基之间。在进一步的实施方式中，FMDV的B表位包含VP1蛋白的抗原位点A。
在进一步的实施方式中，FMDV的B表位包含O血清型FMDV(O/UK/01、O1Campos、O1BFS毒株)的VP1蛋白的残基141-159，或A血清型FMDV(A2001 TrenqueLauquen、A24Cruz毒株)的VP1蛋白的残基139-158，或C血清型FMDV(CS8毒株)的VP1蛋白的残基136-153，或相同血清型FMDV的另一毒株的相应氨基酸残基，或另一血清型FMDV的相应氨基酸残基，例如SAT1、SAT2、SAT3或ASIA1血清型。
在优选的实施方式中，B表位包含选自下述的氨基酸序列：PVTNVRGDLQVLAQKAART(SEQ ID NO:2)、AVPNVRGDLQVLAQKVVRT(SEQ ID NO:3)、SGLSRRGDLGSLAARVAKAL(SEQ IDNO:4)、GGSGRRGDMGSLAARVVKQL(SEQ ID NO:5)和VPNLRGDLQVLAQKVARTLP(SEQ ID NO:6)。更优选地，B表位包含的氨基酸序列选自PVTNVRGDLQVLAQKAART(SEQ ID NO:2)。
FMDV的T和B表位包含肽，与本文公开的序列相比，其包括一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等)保守氨基酸置换，即用有相关侧链的另一个氨基酸替代该氨基酸。这样的置换和修饰对肽化学领域的普通技术人员是众所周知的。遗传编码的氨基酸一般分为四个家族：酸性(天冬氨酸、谷氨酸)、碱性(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、非极性(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)和不带电极性(甘氨酸、天冬氨酰、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、络氨酸)。通常，这些家族中的单个氨基酸的置换不会对生物学活性造成重大影响。而且，相对于本文公开的序列，该多肽可以具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等)单个氨基酸缺失。此外，相对于本文公开的序列，该多肽可以包括一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等)插入。
在本发明中，术语“连接基团”指的是双功能单元，其使Z的巯基或ε-氨基与赖氨酸核心的氨基共价连接成为可能。在本发明的优选的实施方式中，连接基团不包含具有下列结构的赖氨酸核心：
在具体的实施方式中，W是具有1-20个优选为1-10个碳原子的有机基团，并且任选地包含至少1个优选为1、2、3或4个选自N、O和S的杂原子，不包含如上所述的赖氨酸核心。优选地，W是具有1-20个优选为1-10个碳原子的环烃或无环烃基团，其中，任选地，一个或多个优选为1、2、3或4个-CH2-或-CH-基团被-CO-、-S-、-O-、-NH-或取代，不包含如上所述赖氨酸核心。更优选地，W选自一组式：
-(CH2)n-CO-,
-CO-(CH2)n-S-(CH2)m-CO-,或
其中n和m独立地选自1、2、3、4、5和6。
在进一步的实施方式中，W选自一组式：
-CH2-CO-,
-CO-CH2-S-(CH2)2-CO-,或
在具体的实施方式中，Z是半胱氨酸，其通过-SH基团与连接基团结合。在另一个实施方式中，赖氨酸通过ε-氨基与连接基团结合。
在具体的实施方式中，B通过其C末端与Z的α-氨基结合，且X是酰基，即一组式R-CO-，其中R是具有1-6个优选为1-3个碳原子的烷基。更优选地，X是乙酰基(缩写为Ac)。
在实施方式中，式(I)的肽构建体是式(Ia)、(Ib)、(Ic)或(Id)的构建体：
其中B和T如本文所限定的。式(Ib)涉及如此构建体，其中B通过其N末端与Z(半胱氨酸)的羧基结合，并且式(Ia)、(Ic)和(Id)涉及如此构建体，其中B通过其C末端与Z的氨基结合，且其N端是乙酰化的。
在具体的实施方式中,式(I)的肽构建体是式(Ia)、(Ib)、(Ic)或(Id)的构建体，其中T是FMDV的T表位，其包含C血清型FMDV(CS8毒株)的3A蛋白的残基21-35，或C血清型的另一毒株的相应氨基酸残基，或另一血清型FMDV的相应氨基酸残基，例如A、C、SAT1、SAT2、SAT3或ASIA1血清型。更优选地，其是(Ia)、(Ib)、(Ic)或(Id)的构建体，其中T是包含氨基酸序列AAIEFFEGMVHDSIK(SEQ ID NO：1)的T表位。
在具体的实施方式中,式(I)的肽构建体是式(Ia)、(Ib)、(Ic)或(Id)的构建体，其中B是FMDV的B表位，其包含VP1蛋白的抗原位点A，优选地，O血清型FMDV(O/UK/01、01Campos、01 BFS毒株)的VP1蛋白的残基141-159，或A血清型FMDV(A2001TrenqueLauquen、A24Cruz毒株)的VP1蛋白的残基139-158，或C血清型FMDV(CS8毒株)的VP1蛋白的残基136-153，或同一血清型的另一毒株的相应氨基酸残基，或另一血清型FMDV的相应氨基酸残基，例如SAT1、SAT2、SAT3或ASIA1血清型。更优选地，其是式(Ia)、(Ib)、(Ic)或(Id)的构建体，其中B是包含选自下述的氨基酸序列的B表位：PVTNVRGDLQVLAQKAART(SEQID NO：2)、AVPNVRGDLQVLAQKVVRT(SEQ ID NO：3)、SGLSRRGDLGSLAARVAKAL(SEQ ID NO：4)、GGSGRRGDMGSLAARVVKQL(SEQ ID NO：5)和VPNLRGDLQVLAQKVARTLP(SEQ ID NO：6)。
在进一步的实施方式中，式(I)的肽构建体是式(Ia)、(Ib)、(Ic)或(Id)的构建体，其中T是包含氨基酸序列AAIEFFEGMVHDSIK(SEQ ID NO：1)的T表位，和B是包含选自下述的氨基酸序列的B表位：PVTNVRGDLQVLAQKAART(SEQ ID NO：2)、AVPNVRGDLQVLAQKVVRT(SEQ IDNO：3)、SGLSRRGDLGSLAARVAKAL(SEQ ID NO：4)、GGSGRRGDMGSLAARVVKQL(SEQ ID NO：5)、VPNLRGDLQVLAQKVARTLP(SEQ ID NO：6)，优选地，氨基酸序列选自PVTNVRGDLQVLAQKAART(SEQ ID NO：2)。
第二方面，本发明涉及制备式(Ia)或(Ib)的树枝状肽构建体的方法，其包含在6和7.5之间的pH下使式(II)化合物与式(III)化合物反应
其中，T、B和X如前所限定的。
可选地，式(Ic)的构建体可通过包括在6和7.5之间的pH下使式(IV)化合物与式(V)化合物反应的方法获得，
其中，T和B如前所限定的。
可选地，式(Id)的构建体可通过包括在6和7之间的pH下使式(VI)化合物与式(III)化合物反应的方法获得，
其中T和B如前所限定的。
在另一个实施方式中，对于式(II)或式(VI)的化合物，式(III)的化合物摩尔过量2-25倍，优选5-20倍。在实施方式中，对于式(IV)的化合物，式(V)的化合物摩尔过量2-25倍，优选5-20倍。
式(II)、(III)、(IV)、(V)和(VI)的化合物可通过固相肽合成获得。
在具体的实施方式中，可通过首先在自动合成仪中采用Fmoc化学，在固体载体(solid support)优选高分子树脂上合成T表位，获得式(II)的化合物，然后赖氨酸核心通过与Fmoc-Lys(Fmoc)-OH偶联引入，然后脱保护α和ε氨基并用-W-Cl基团官能化。将所得的肽脱保护，并从固体载体上切割。优选地，当W是-CH2-CO-基团时，脱保护和切割的肽在α和ε氨基处被氯乙酰化，优选通过用氯乙酸处理。
在具体的实施方式中，式(IV)的化合物可以以与对化合物(II)描述的相似方式获得，其中在与Fmoc-Lys(Fmoc)-OH偶联并脱保护后，所得的肽在α和ε氨基处用-CO-(CH2)2-SH基团官能化，优选通过用S-三苯甲基-3-巯基丙酸处理，并从固体载体上切割。
在具体的实施方式中，式(VI)的化合物可以以与对化合物(II)描述的相似方式获得，其中在与Fmoc-Lys(Fmoc)-OH偶联并去保护后，所得的多肽在α和ε氨基处通过使用N-马来酰基-β-丙氨酸官能化，并从固体载体上切割。
在具体的实施方式中，式(III)的化合物可通过在自动合成仪中采用Fmoc化学，在固体载体优选高分子树脂上肽合成获得。所得的肽可在其N末端处乙酰化或不乙酰化，然后脱保护并从固体载体上切割。
在具体的实施方式中，式(V)的化合物可以以与对化合物(III)描述的相似方式获得，但其中C末端赖氨酸在其ε氨基上脱保护，随后被氯乙酰化，优选通过用氯乙酸处理。将所得的肽脱保护，并从固体载体上切割。
另一方面，本发明涉及一种兽药组合物，其包含至少本文描述的式(I)的树枝状肽构建体和兽医学上可接受的佐剂、载体或稀释剂。常见的配方、佐剂、载体和稀释剂可被使用。合适的载体和稀释剂是本领域已知的(例如McKercher PD et al.,"A review of thecurrent status of oil adjuvants in foot-and-mouth disease",Dev.Biol.Stand.1976,vol.35,p.107-112；Dong XN et al.,"Candidate multi-peptide-vaccine against classical swine fever virus induced potent immunity withserological marker",Vaccine 2005,vol.23,p.3630-3633)并且包括例如完全和不完全弗氏佐剂、氢氧化铝、皂苷、葡聚糖、矿物油、中性油、植物油、脂质体、多元醇等。
这些组合物可适合作为免疫原性组合物或疫苗。该组合物可通过任何方便的途径施用，包括任何口服或肠胃外途径，例如皮下、静脉内或肌肉内。
式(I)的构建体已被发现呈现免疫原性性质。因此，在另一方面，本发明涉及式(I)的树枝状肽构建体，在医学上应用。
在另一方面，本发明涉及式(I)的树枝状肽构建体，在动物口蹄疫预防中应用。
本发明还描述了式(I)的树枝状肽构建体在制备预防动物中口蹄疫的药剂中的应用。
本发明还公开了预防动物中口蹄疫的方法，其包括施用有效量的式(I)的树枝状肽构建体。
待被治疗的动物包括家养和野生的二者，例如牛、猪、绵羊、山羊、水牛、羚羊、鹿、野猪、野牛或任何其它偶蹄类动物，优选是牛或猪。
下面的实施例阐明了本发明，而不应被认为是对本发明限制的。
实施例
一般的肽合成方案。
通过在ABI433肽合成仪(Applied Biosystems,Foster City,CA)中进行的自动合成Fmoc(FastMoc)方案，在Fmoc-Rink-酰胺ChemMatrix树脂上以0.1mmol的规模，合成线性肽。其侧链官能团利用tBu(天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)、Boc(赖氨酸、色氨酸)、Pbf(精氨酸)和Trt(天冬氨酰、谷氨酰胺、组氨酸)基团保护。在两倍摩尔量的DIEA存在下，以DMF为溶剂，8倍过量的Fmoc-L-氨基酸和HBTU用于偶联步骤。通过在适当的点并入Fmoc-Lys(Fmoc)-OH而引入支化。在衍生后，使用TFA/H2O/TIS(95:2.5:2.5v/v,90min,RT)，肽被完全脱保护和切割，通过添加冷冻乙醚沉淀，在AcOH水溶液(10％v/v)中摄取并冻干。然后将其纯化并通过如下所述的分析型HPLC和MALDI-TOF MS表征。
肽的官能化与缀合。
缀合物1和2。缀合物1和2分别相应于式(Ia)和(Ib)的构建体，其中T是SEQ ID NO：1和B是SEQ ID NO：2。这些分子使用标准的硫醚连接合成。
部分1a在肽的C末端具有半胱氨酸残基，且N末端被乙酰化。在2a的情况中，半胱氨酸残基位于肽的N末端部分。使用10倍过量的氯乙酸和DIPCI(1:1)，通过在位于肽N末端部分中的赖氨酸的α和ε氨基处氯乙酰化，获得支化的化合物1b。所有的化合物(1a、1b和2a)在随后的缀合前切割并通过HPLC纯化。通过在50℃下，将3.5mg氯乙酰化的核心(1b)溶解在10mL的0.02M、pH 7.5的NaHCO3中，获得缀合物1和2。然后，将8倍摩尔过量的化合物1a或1b分批加入之前的溶液中，并调节pH至7.5。该反应由HPLC和MALDI-TOF监控，每小时分析混合物的等分试样。当在HPLC图中观察不到变化时，通过制备型RP-HPLC分离反应产物，然后通过分析型HPLC和MALDI-TOF MS表征(缀合物1：[MH]+离子平均质量(Da)，计算的：6521.5；实测的：6523.5；缀合物2：[MH]+离子平均质量(Da)，对[MH]+离子计算的：6521.5；实测的：6519.1)。
缀合物3。缀合物3相应于式(Ic)的构建体，其中T是SEQ ID NO:1，B是SEQ ID NO:2。该分子通过反向硫醚方法获得。
在这种情况下，在序列的C末端部分中，合成具有Fmoc-Lys(Mmt)残基的B表位，随后其被乙酰化，利用DCM中1％TFA选择性地去除保护基Mmt，最后如肽1b描述的，氯乙酰化C末端赖氨酸残基，以生成化合物3a。通过DIPCI中Trt-MPA(1:1)的硫代官能化获得化合物3b。如前所述，将化合物3a和3b从树脂上移除和纯化，并且缀合。在与标准硫醚方法相同的溶液中(0.02M NaHCO3的溶液，pH 7.5)进行缀合。在此方法中，将3.5mg的3b溶解在10mL的所述溶液中，8倍摩尔过量的3a随后被分批加入溶液并在50℃下搅拌溶液。如上所述，监控和停止反应。混合物通过RP-HPLC纯化，并且树枝状大分子3通过HPLC和MALDI-TOF表征，如下详述(缀合物3：[MH]+离子平均质量(Da)，计算的：6749.81；实测的：6746.4)。
缀合物4。缀合物4相应于式(Id)的构建体，其中T是SEQ ID NO:1和B是SEQ ID NO:2。
缀合经由马来酰亚胺基进行。并入DIPCI中的N-马来酰基-β-丙氨酸(1:1)，在N末端赖氨酸残基的Nα和ε位进行马来酰亚胺官能化得到4b。脱保护、切割和纯化如前述相同方式进行。为使两个肽片段缀合，将4.5mg的化合物4b溶解在1mL 50mM pH6的磷酸盐缓冲液中，并且加入到含有相同化学计量的量(两倍摩尔)的1a的缓冲液中。混合溶液后，分析小量等份试样揭示反应完全完成。然后，通过RP-HPLC纯化反应产物，并且通过HPLC和MALDI-TOF表征缀合物4(缀合物4：[MH]+离子平均质量(Da)，计算的：6739.5；实测的：6737.1)。
分析和纯化。
分析型反相HPLC在模型LC-2010A系统(Shimadzu,Kyoto,Japan)中的C18或C8柱(4.6×50mm，3μm，Phenomenex，Torrance，CA)上进行。溶剂A是0.045％(v/v)TFA水溶液，溶剂B是0.036％(v/v)TFA乙腈溶液。用溶剂B到A的线性梯度，以1mL/min的流速、在15min内进行洗脱，220nm下紫外检测。制备型HPLC在Shimadzu LC-8A仪器中的C18(21.2×250mm,10μm,Phenomenex)或C8柱(10×250mm,10μm,Phenomenex)上进行。溶剂A和B分别是0.1％TFA(v/v)的水和乙腈溶液，并且再一次用溶剂B到A的线性梯度在35min内进行洗脱，C18或C8分离分别是25或5mL/min的流速，220nm下紫外检测。通过分析型HPLC令人满意纯度(>95％)的制备馏分被汇聚并冻干。纯化的肽和MAP通过Voyager DE-STR仪器(Applied Biosystems)中的MALDI-TOF MS——R羟基苯丙烯酸作为基质——表征。对于线性肽表位和二价赖氨酸核心，使用反射模式进行MS光谱；对于更大尺寸的分析物，使用线性模式。
免疫学分析。
小鼠免疫和抗体产生。用弗氏佐剂中100μg的每种缀合物皮下免疫5组瑞士小鼠。20天后施用完全相同的在不完全弗氏佐剂中乳化的附加剂。动物在首次给药后39天杀死。在第0、15、20和39天采集血样，通过ELISA研究血清中对FMDV的抗体应答。ELISA板用纯化的病毒(OUK2001)包被，以PBS(50μl/孔)中具有1/320，4℃下温育过夜。使用封闭缓冲液(具有0.05％吐温和5％奶的PBS缓冲液)37℃下温育1h，封闭自由的活性位点。封闭缓冲液中稀释的血清在室温下预温育15min，并加入板中(50μΙ/孔)，37℃下放置1小时。进一步漂洗后，加入50μL/孔的在封闭缓冲液中的酶标抗小鼠抗体，板温育45min以上。通过在室温下与100μΙ/孔的可溶性3,3',5,5'-四甲基联苯胺温育15min，测定偶联的缀合物的量。最后，使用100μL/孔的1M硫酸使反应终止，并在450nm下测量吸光度。抗体效价表示为血清稀释的log10，这给出等于平均值加2倍对阴性对照(第0天收集的血清)记录的标准差的光密度值(OD)。在所有情况下，标准差均小于1.0。
IFN-γ表达。
在体外，用自体合成肽或FMDV刺激新鲜脾细胞。24小时温育后，收集细胞并通过IFN-γELISPOT分析其活化。为了该目的，分离脾细胞，并将其转移至用100μL的5μg/ml抗小鼠Mab BD-51-2525KZ包被的Millipore(S2EM004M99)的Immobilon-P疏水性PVDF平板中。细胞在37℃下温育48小时，并使用BD Biosciences提供的试剂并依照其技术建议继续分析。斑点出现在细胞因子定位的位点处，每一个独立的斑点代表独立的IFN-γ分泌细胞。对斑点数量进行量化。

Claims (7)

1.一种树枝状肽构建体，选自式(Ia)、(Ib)、(Ic)或(Id)的构建体：
其中
T包括氨基酸序列AAIEFFEGMVHDSIK(SEQ ID NO:1)；
B包括选自PVTNVRGDLQVLAQKAART(SEQ ID NO:2)、AVPNVRGDLQVLAQKVVRT(SEQ ID NO:3)、SGLSRRGDLGSLAARVAKAL(SEQ ID NO:4)、GGSGRRGDMGSLAARVVKQL(SEQ ID NO:5)和VPNLRGDLQVLAQKVARTLP(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列；并且
Ac是酰基。
2.根据权利要求1所述的树枝状肽构建体，其选自式(Ia)、(Ib)、(Ic)或(Id)的构建体，其中T是SEQ ID NO：1并且B是SEQ ID NO：2。
3.制备权利要求1-2中任一项所限定的式(Ia)或(Ib)的树枝状肽构建体的方法，其包含在6和7.5之间的pH下使式(II)的化合物与式(III)的化合物反应
Ac-B-Cys
(III)
其中T和B是权利要求1中所限定的，并且在式(III)中，当B通过其N末端结合到Cys基团的α-羧基时，Ac不存在，或当B通过其C末端结合到Cys基团的α-氨基时，Ac是酰基。
4.一种兽药组合物，其包含权利要求1-2中任一项所限定的式(Ia)、(Ib)、(Ic)或(Id)的树枝状肽构建体和兽医学上可接受的佐剂。
5.如权利要求1-2中任一项所限定的式(Ia)、(Ib)、(Ic)或(Id)的树枝状肽构建体在制备药剂中的用途。
6.如权利要求1-2中任一项所限定的式(Ia)、(Ib)、(Ic)或(Id)的树枝状肽构建体在制备预防动物口蹄疫的药剂中的用途。
7.如权利要求6所限定的用途，其中所述药剂用于施用给选自牛和猪的动物。
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