CN106801041A

CN106801041A - 猪细小病毒的病毒样颗粒的制备及用途

Info

Publication number: CN106801041A
Application number: CN201710029075.6A
Authority: CN
Inventors: 郭慧琛; 孙世琪; 宋品; 董虎; 常艳燕; 魏衍全; 张韵; 茹嘉喜; 刘湘涛; 殷宏
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2017-01-16
Filing date: 2017-01-16
Publication date: 2017-06-06

Abstract

本发明公开一种猪细小病毒的病毒样颗粒、其制备方法及应用。本发明的猪细小病毒的病毒样颗粒的制备方法是：对猪细小病毒VP2基因进行优化，得到优化的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的猪细小病毒VP2基因，将优化的VP2基因插入到插入载体pSMK中得重组pSMK‑VP2质粒，将重组质粒转化到大肠杆菌中得重组菌，经IPTG诱导表达，收集菌体，纯化重组蛋白，再将纯化后的重组蛋白进行体外组装，得猪细小病毒病毒样颗粒。本发明的猪细小病毒病毒样颗粒可在制备用于预防猪细小病毒引起疾病的疫苗中的应用，也可在制备用于检测猪细小病毒的检测试剂中的应用。

Description

猪细小病毒的病毒样颗粒的制备及用途

技术领域

本发明涉及一种病毒样颗粒的制备方法及其用途，确切讲本发明涉及一种猪细小病毒的病毒样颗粒、其制备方法及应用。

背景技术

猪细小病毒（Porcine parvovirus，PPV）是一种常见的病原体，通常头胎怀孕母猪感染了PPV之后，可引起繁殖障碍，主要症状为流产、不孕、产死胎、木乃伊胎等,给养猪业带来重大的经济损失。成熟完整的PPV病毒粒子呈圆形或六角形的二十面体对称结构，无囊膜，平均直径20～26 nm，分子质量为5.3×10³ kb，是目前动物病毒中最小的一类单链线状DNA病毒。研究显示，PPV基因组包括2个开放阅读框（open reading fragment，ORF），ORFl编码非结构蛋白NS-1、NS-2和NS-3；ORF2主要编码结构蛋白VPl、VP2和VP3；另外PPV基因组还包含一个小的ORF，编码非结构蛋白SAT。PPV的NS序列在进化上相对保守，其编码的非结构蛋白在调控PPV DNA复制方面发挥作用。PPV结构蛋白经过规则的排列组装形成病毒衣壳蛋白，能够包裹病毒DNA入侵宿主细胞。Molitor采用SDS-PAGE方法鉴定了PPV的3个结构蛋白VP1、VP2和VP3，且证实这3种蛋白质均能诱导兔产生抑制红细胞凝集抗体。VP1蛋白能增强PPV与宿主DNA的结合，稳定病毒的单链基因组DNA，在病毒侵染细胞过程中起重要作用。VP3可能是VP2翻译后加工的产物，只出现在衣壳装配和病毒基因组包装后。VP2蛋白是构成病毒衣壳的主要成分，约占病毒衣壳蛋白总量的80％，包含PPV主要的B细胞和T细胞抗原表位。目前，发现VP2上有9个线性B细胞表位，在其N末端区域发现有病毒的中和表位。重组表达的PPV VP2蛋白能自我装配成病毒样颗粒(virus-like paritcles，VLPs)，是良好的免疫原，能够刺激机体产生高滴度抗PPV抗体，保护机体免遭病毒的攻击。因此，研究VP2蛋白和VLPs的形成对发展PPV新型疫苗具有重大意义。

发明内容

本发明提供一种猪细小病毒样颗粒的制备方法及应用。

本发明的猪细小病毒的病毒样颗粒制备方法包括以下步骤：

（1）对猪细小病毒VP2基因进行优化，得到优化的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的猪细小病毒VP2基因；

（2）重组质粒的构建：将优化的VP2基因插入到载体pSMK中，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，提取阳性质粒即为重组pSMK-VP2质粒；

（3）重组VP2蛋白的表达：将pSMK-VP2转化到原核表达系统，得到重组菌；

（4）猪细小病毒病毒样颗粒的制备：将获得的重组菌，培养至菌液OD₆₀₀值为1.0左右0.6~0.7，加入异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度为0.05 mM，在220r/min、20℃继续过夜培养，收集菌体纯化重组蛋白，再将重组蛋白纯化后进行体外组装，得到猪细小病毒病毒样颗粒。

猪细小病毒的病毒样颗粒制备方法中，在步骤（3）-（4）中使用的为原核表达系统为大肠杆菌C43(DE3)，在37℃，含50μg/mL卡那霉素的LB培养基表达，得到的大肠杆菌，培养至菌液OD₆₀₀值为1.0左右，加入异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度为0.05 mM，在220r/min、20℃继续过夜培养，收集菌体纯化重组蛋白，再将重组蛋白纯化后进行体外组装，得到猪细小病毒病毒样颗粒。

猪细小病毒病毒样颗粒的制备方法中，VP2重组蛋白纯化方式采用亲和层析纯化。

优选地，本发明的猪细小病毒病毒样颗粒的制备方法，将表达菌沉淀超声裂解后的上清转移至经buffer A，buffer A的组成为：500mM NaCl、20mM Tris-HCl、20mMImidazole、1mM DTT，pH=8.0，平衡的镍亲和层析树脂层析柱中，在室温条件下结合1h，之后用buffer A洗涤层析柱，目的蛋白用buffer B，buffer B的组成为500mM NaCl、20mMTris-HCl、500mM Imidazole、1mM DTT，pH=8.0，再经每次1ml、反复5-6次洗脱次。

优选地，本发明的猪细小病毒病毒样颗粒的制备方法，重组蛋白纯化后进行体外组装方法为：将重组融合VP2蛋白按质量比40:1加入sumo酶，再置于透析袋内，透析袋外部的缓冲液为150mM NaCl，50mM Tris-HCl，1mM CaCl₂，1mM MgCl₂，10%甘油，1mM DTT，pH 7.0，组装时整个缓冲体系置于搅拌仪上，使缓冲液轻微搅动，得到猪细小病毒病毒样颗粒。

采用本发明的上述方法可制备的猪细小病毒病毒样颗粒，可在制备用于预防猪细小病毒引起疾病的疫苗中的应用，也可在制备用于检测猪细小病毒的检测试剂中的应用。

经实验表明，采用本发明的方法制备出的猪细小病毒病毒样颗粒免疫动物可诱导更高水平的血清ELISA抗体和更高效价的血清中和抗体。

附图说明

图1 PPV VP2蛋白的SDS-PAGE分析。图中：M：蛋白质分子质量标准；1：纯化的His-SUMO-VP2蛋白；2：切除His-SUMO标签后的VP2蛋白。

图2 PPV VP2蛋白的Western-blot检测结果。图中：1：纯化的His-SUMO-VP2蛋白；2：切除His-SUMO标签后的VP2蛋白。

图3 PPVVLPs透射电镜观察照片。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例:猪细小病毒病毒样颗粒的制备及鉴定

1. 猪细小病毒结构蛋白结构基因VP2密码子优化及合成：

基于已公布的猪细小病毒毒株（GenBabnk登录号：AY459350.1）结构基因VP2序列，依据大肠杆菌密码子偏嗜性，对猪细小病毒VP2基因进行优化并合成VP2基因，优化后的猪细小病毒VP2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2. 猪细小病毒结构蛋白重组表达载体的构建

（1）酶切片段和载体

参照内切酶说明书，将合成的VP2基因酶切，反应体系如下：DNA片段（VP2）20μL或30 μL载体加入50 μL酶切反应体系中，内含内切酶buffer和内切酶BsmB I和BamH I各5 μL，其余用去离子水补足50 μL。酶切产物经琼脂糖电泳确认切开后，胶回收目的片段和切开的表达载体。

（2）酶切产物的纯化

酶切产物经琼脂糖凝胶电泳，然后用凝胶成像系统观察结果并切取目的片段，用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行目的片段的回收及纯化。具体操作步骤如下：

a)在紫外灯下切取琼脂糖凝胶中的目的DNA条带，放入干净的离心管中称重，100 mg凝胶视为100 μL体积

b)加入3倍体积溶液GSB，于55℃水浴融胶6-10 min，间断混合，确保胶块完全融化，当胶完全融化后，观察溶液颜色，若颜色为紫色，加入3 M醋酸钠（pH5.2），调整颜色和GSB颜色相同

c)待融化后的凝胶溶液降至室温，加入吸附柱静置1 min，1000×g离心1 min，弃流出液。

d)加入650 μL溶液WB，1000×g离心1 min，弃流出液。

e)1000×g离心1-2 min，去除残留的WB液。

f)将吸附柱置于干净的离心管，开盖静置1 min，使残留的乙醇挥发干净。在柱中央加入30-50 μL去离子水，室温静置1 min。

g)1000×g离心1 min，洗脱DNA，将洗脱的DNA于-20℃保存。

（3）连接反应

按照载体和回收片段摩尔比如下将两种产物进行连接。反应体系为：目的片段 2μL、载体1μL、T4 DNA 连接酶 1μL（1U/μL），10×T4 DNA 连接缓冲液1μL，补充超纯水至总体积10μL，混匀后4 ℃过夜连接或者16 ℃连接反应 3 小时。

（5）转化 JM109 克隆菌

取连接产物 5μL加入100μL JM109感受态细胞中，柔和混匀后冰浴30min，42℃热激90sec，立即冰浴 5min，加入37℃预热后的LB液体培养基 0.8ml，于37℃震荡培养 1h，将培养物均匀涂布于含有50μg/mL卡那霉素的 LB 琼脂平板上，37℃静置培养 16～18 小时。

6）重组质粒鉴定

用无菌牙签挑取LB平皿上大小均匀的菌落接于 LB 液体培养基中，37℃震荡培养 16小时。将不同编号过夜培养后的菌液接种于10μL PCR 缓冲液体系中，利用全菌PCR 法进行鉴定。将PCR反应鉴定为阳性的菌液，利用小量质粒提取试剂盒提取质粒，并进行酶切鉴定。酶切体系如下：EcoRI 0.5μL，10×H Buffer，DNA 4μL，超纯水4.5μL，37℃酶切1h。酶切反应结束后取酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，将阳性质粒命名为pSMK-VP2。

3. VP2的表达纯化及免疫印迹分析

（1）重组VP2蛋白的表达

将pSMK-VP2转化到大肠杆菌C43(DE3)菌株中。用卡那霉素筛选阳性克隆。挑选阳性克隆菌于LB培养基中，37℃ 220rpm过夜培养。将上述菌液以1:100接种于1 L LB培养基，于37℃、220 rpm摇培至菌液的OD600值1.0左右，加入异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度为0.05 mM，20℃诱导表达过夜，随后以5000rpm、30min离心收集菌体沉淀。

（2）表达蛋白的纯化

用10-20 ml冰浴处理的缓冲液 A（20 mM Tris-HCl，500 mM NaCl，20 mM Imidazol，1mM DTT，pH=8.0）重悬细菌沉淀，冰上超声破碎菌体细胞（超声时间3s，间隔时间3s，共6min，功率200W）。在4℃下，将超声后裂解菌液12000r/min离心30min，并留取上清。

将上清转移至预装有Buffer A平衡的镍亲和层析树脂的层析柱中，使上清与Ni-NTA Resins混匀，室温结合1 h左右用10倍树脂体积的BufferA和5%的Buffer B (50mMTris-HCl，500 mMNaCl，500 mMImidazol，1 mM DTT，pH=8.0）洗去非特异性结合的杂蛋白，用Buffer B洗脱目的蛋白，每次1ml，反复洗脱5-6次。将以上样品进行 SDS-PAGE 电泳，结果显示获得了与预期大小相等的蛋白，且纯化效果良好（图1）。

（3）免疫印迹实验

将洗脱下来的VP2重组蛋白进行10 % SDS-PAGE电泳，利用湿转将重组蛋白电转移至聚偏氟乙烯杂交膜（PVDF 膜），用封闭液（PBST，5%脱脂奶粉，pH7.0）37℃条封闭1h，用 PBST1:5000稀释抗猪细小病毒兔抗血清，37℃作用1小时，充分洗涤后，用PBST 1:3000稀释辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG二抗，在37 ℃条件充分作用1h， PBST充分洗涤；之后于暗室加入发光底物反应3min，在Kozak胶片下曝光，显影及定影固定后，可见其条带与预期大小相符，说明获得的蛋白能够与抗猪细小病毒抗血清反应的特异性目标蛋白（图2）。

4. 猪细小病毒的病毒样颗粒的体外自主组装

将纯化的重组融合VP2蛋白按体积比40:1加入sumo酶（Invitrogen公司产品）置于透析袋内，在500 mL冰浴处理的Tris缓冲液中缓慢匀速搅拌、4℃过夜透析。通过调节NaCl浓度（0.00 mM、150 mM、500 mM）、Tris-HCl浓度（10mM、20mM、50 mM）、pH值（6.0/7.0/8.0）、CaCl₂浓度的（1 mM、2 mM、5 mM、10 mM）、MgCl₂浓度（1 mM、2 mM、5 mM、10 mM）、甘油浓度（1%、5%、10%、20%）和DTT浓度（0.1 mM、0.5 mM、1 mM、2 mM）优化衣壳蛋白体外组装效率。组装效果通过常规透射电子显微镜观察，具体方法为，将10μL样品加到200目的铜网上，室温吸附2-3分钟，用滤纸吸干铜网，用3%的磷钨酸染色，用日立H-7100FA透射电镜观察，结果显示，150mMNaCl，50mM Tris-HCl，1mM CaCl₂，1mM MgCl₂，10%甘油，1mM DTT，pH 7.0的组装液所得的病毒样颗粒效果最好，其与猪细小病毒相似，为球形，直径为20nm左右（图3）。

5. 免疫原性研究

将15只4周龄的BALb/c鼠分为3组，第一组免疫PPV VLPs，第二组免疫未组装的PPV VP2蛋白，第三组注射PBS作为对照。在首免后第二周加强免疫一次，每两周采血分离血清，检测ELISA抗体和中和抗体。

（1）抗体效价的ELISA检测

将96孔板 (Nunc Maxisorp) 用100µL 0.05 M碳酸钠缓冲液(pH9.6) 稀释的抗PPV高免血清4℃包被过夜。PBST清洗3次，再用PPV病毒液在37℃下孵育 1 h，PBST清洗3次，孔板用含5%脱脂奶粉的PBST（100µL）37℃封闭 1 h。PBST清洗3遍后，将小鼠血清分别用含1% 脱脂奶粉PBST 按1:100稀释后，每孔100µL加于封闭孔板中，于37℃孵育 1 h。PBST清洗3次后，HRP标记的抗小鼠IgG抗体(Sigma)用含1%脱脂牛奶的PBST 按1:3000稀释并每孔100µL加于封闭孔板中，于37℃孵育 1 h，PBST清洗3次后，50µL底物溶液(TMB, Sigma) 加于各孔中于37℃孵育 15 min。然后用50µL 2N H₂SO4加于各孔终止颜色反应，于450nm检测光密度(OD值)。结果显示，与PBS对照组相比，VLPs免疫组和VP2蛋白免疫组的血清抗体水平明显升高，差异极显著（P<0.01），且VLPs免疫组比VP2蛋白免疫组的血清抗体水平高，差异显著（P<0.05）。

（2）血清中和抗体检测

以微量中和试验检测血清中和抗体滴度。将生理盐水稀释的小鼠血清56℃灭活30分钟后，在96孔微量细胞培养板上，用DMEM营养液作2倍系列稀释，每个稀释度4孔，每孔加入50μL病毒液（100TCID₅₀），37℃温箱中和1h后每孔加入100μL细胞悬液（1×10⁵个/mL），置5%CO2培养箱37℃培养，自48h观察至144h。设置阳性和阴性血清对照、病毒回归试验、血清毒性对照、正常细胞对照。按照Spearman-Karber方法，计算出能保护50%细胞孔不产生细胞病变的血清稀释度，该稀释度即为该份血清的中和抗体效价。结果显示，VLPs免疫组比VP2蛋白免疫组的血清中和抗体水平高1-2个滴度，进一步说明VLPs的免疫优势。

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 猪细小病毒的病毒样颗粒的制备及用途

<160> 1

<210> 1

<211> 1740

<212> DNA

<213> 优化的VP2基因

<400>

atgagcgaga acgtggaaca gcacaacccg atcaacgcgg gtaccgagct gagcgcgacc 60

ggtaacgaaa gcggtggcgg tggcggtggc ggtggcggtc gtggtgcggg cggtgtgggc 120

gttagcaccg gtaccttcaa caaccagacc gagtttcaat acctgggcga aggtctggtg 180

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ttcaacccgg cggattggca gctgatcagc aacaacatga ccgagattaa cctggtgagc 420

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ccgaccaaaa tttataacaa cgacctgacc gcgagcctga tggttgcgct ggataccaac 540

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atcggcggta ttcgtatgtt cccggaatac agccagctga ttccgcgtaa actgtattaa 1740

Claims

1.猪细小病毒的病毒样颗粒制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（3）重组VP2蛋白的表达：将pSMK-VP2转化到大肠杆菌，得到重组菌；

（4）猪细小病毒病毒样颗粒的制备：将获得的重组菌，培养至菌液OD₆₀₀值为1.0左右，加入异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度为0.05 mM，在220r/min、20℃继续过夜培养，收集菌体纯化重组蛋白，再将重组蛋白纯化后进行体外组装，得到猪细小病毒病毒样颗粒。

2. 根据权利要求1所述的猪细小病毒的病毒样颗粒制备方法，其特征在于步骤（3）-（4）中使用的大肠杆菌为C43(DE3)，在37℃，含50μg/mL卡那霉素的LB培养基培养至菌液OD₆₀₀值为1.0左右，加入异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度为0.05 mM，在220r/min、20℃继续过夜培养，收集菌体纯化重组蛋白，再将纯化后后的重组蛋白进行体外组装，得到猪细小病毒病毒样颗粒。

3.根据权利要求2所述的猪细小病毒的病毒样颗粒的制备方法，其特征在于VP2重组蛋白纯化方式为亲和层析纯化。

4. 根据权利要求3所述的猪细小病毒的病毒样颗粒的制备方法，其特征在于将表达菌沉淀超声裂解后的上清转移至经buffer A平衡的镍亲和层析树脂层析柱中，buffer A的组成为：500mM NaCl、20mM Tris-HCl、20mM Imidazole、1mM DTT，pH=8.0，在室温条件下结合1h，之后用buffer A洗涤层析柱，目的蛋白用buffer B洗脱，buffer B的组成为500mMNaCl、20mM Tris-HCl、500mM Imidazole、1mM DTT，pH=8.0，再经每次1ml、反复5-6次洗脱。

5. 根据权利要求4所述的猪细小病毒的病毒样颗粒的制备方法，其特征在于重组蛋白纯化后进行体外组装方法为：将重组融合VP2蛋白按质量比40:1加入sumo酶，再置于透析袋内，透析袋外部的缓冲液为150mM NaCl，50mM Tris-HCl，1mM CaCl₂，1mM MgCl₂，10%甘油，1mM DTT，pH 7.0，组装时整个缓冲体系置于搅拌仪上，使缓冲液轻微搅动，得到猪细小病毒病毒样颗粒。

6.权利要求1至5所述的任一方法制备的猪细小病毒的病毒样颗粒。

7.权利要求1至5所述的任一方法制备所述的猪细小病毒的病毒样颗粒在制备用于预防猪细小病毒引起疾病的疫苗中的应用。

8.权利要求1至5所述的任一方法制备所述的猪细小病毒的病毒样颗粒在制备用于检测猪细小病毒的检测试剂中的应用。