KR102601258B1 - 코로나바이러스감염증-19(covid-19)에 대한 재조합 아데노바이러스 백신 및 이를 이용한 병용요법 - Google Patents

코로나바이러스감염증-19(covid-19)에 대한 재조합 아데노바이러스 백신 및 이를 이용한 병용요법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 2019년 중국 우한에서 발생한 코로나바이러스감염증-19 (COVID-19)의 감염을 막기 위한 재조합 아데노바이러스 생백신 및 이를 이용한 병용요법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스를 이용하여 신종 코로나바이러스 항원에 대한 특이적인 항체를 생산함으로써 신속하고 인체에 무해한 COVID-19 백신을 개발할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스 백신과 화합물 간 병용요법을 통해 COVID-19 뿐 아니라, 단순포진바이러스(HSV) 감염증 등 바이러스 질환을 보다 효과적이며 안전하게 예방하거나 치료할 수 있다.

Description

코로나바이러스감염증-19(COVID-19)에 대한 재조합 아데노바이러스 백신 및 이를 이용한 병용요법{RECOMBINANT ADENOVIRUS VACCINE FOR CORONA VIRUS DISEASE 19 AND COMBINATION THERAPY USING THE SAME}
본 발명은 2019년 중국 우한에서 발생한 코로나바이러스감염증-19 (COVID-19)의 감염을 막기 위한 재조합 아데노바이러스 생백신 및 이를 이용하 병용요법에 관한 것이다.
코로나바이러스감염증-19 (corona virus disease 19, COVID-19)는 2019년 12월 중국 우한에서 처음 발생한 뒤 전 세계로 확산된 호흡기 감염질환으로, 세계보건기구(WHO)가 2020년 1월 9일 해당 폐렴의 원인이 새로운 유형의 코로나바이러스(SARS-CoV-2, 국제바이러스분류위원회 2월 11일 명명)라고 밝히면서 병원체가 확인되었다. 코로나바이러스감염증-19는 감염자의 비말(침방울)이 호흡기나 눈·코·입의 점막으로 침투될 때 전염된다고 알려져 있으며, 감염되면 약 2~14일(추정)의 잠복기를 거친 뒤 발열(37.5도) 및 기침이나 호흡곤란 등 호흡기 증상, 폐렴이 주증상으로 나타나지만 무증상 감염 사례도 드물게 나오고 있다.
하지만, 전 세계적으로 이에 대한 병인 기전 등에 알려진 바가 거의 없으며, 백신 및 치료제도 없는 상황이다. 예측하기 어려운 새로운 타입의 신종 바이러스가 출현함으로써 예방 백신 공급 부족 사태가 발생하고 신속한 백신용 바이러스 생산이 요구되고 있다.
이에, 본 발명자는 하나의 바이러스 입자에서 다양한 타입의 바이러스 항원을 생산하는 재조합 아데노바이러스를 이용하여 생백신을 만들고자 한다. 재조합 아데노바이러스는 비강 흡입만으로도 생체 내로 쉽게 침입이 가능하다. 따라서 항원 특이적인 항체를 쉽고 빠르게 확보 가능할 뿐 아니라 인수공통감염의 위험이 없어 인체에 사용하기에 안전하다. 지금과 같은 신종감염병 유행 시, 재조합 아데노바이러스 벡터를 기반으로 신속하고 안전하게 항체를 개발할 수 있어 예방백신 및 진단키트 공급 부족 사태를 방지할 수 있다. 신종감염병의 조기 발견 및 조기 치료는 2차 감염을 예방할 수 있고 환자의 사회복귀 시기를 앞당길 수 있다. 또한 감염병 확진자에 대한 이동경로 파악을 통한 접촉자의 2주간의 격리조치, 음식점, 영업점, 회사 등의 일시 폐쇄 등의 피해를 막아 경제 산업적인 손실을 최소화할 수 있을 것이다.
중국 공개특허 제112206318호 (2021.01.12. 공개)
본 발명의 목적은 코로나바이러스감염증-19(COVID-19)를 예방 또는 치료하기 위한 백신 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 다른 목적은 COVID-19 백신과 화합물 간의 병용 요법을 통한 COVID-19의 예방 또는 치료를 위한 약학조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또다른 목적은 아데노바이러스 감염증 또는 단순포진바이러스(HSV) 감염증 치료에 효과적인 항바이러스용 약학조성물을 제공하는 데에 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 재조합 아데노바이러스를 이용한 COVID-19의 백신 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 백신 조성물 및 특정 화합물 간의 병용요법을 통한 COVID-19의 예방 또는 치료를 위한 병용요법의 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 아데노바이러스 감염증 또는 단순포진바이러스(HSV) 감염증 치료에 효과적인 항바이러스용 약학조성물을 제공한다.
본 발명에 따라 하나의 재조합 아데노바이러스 입자에서 다양한 타입의 바이러스 항원을 생산하고 비강 흡입만으로도 생체 내로 쉽게 침입이 가능한 재조합 아데노바이러스 벡터를 기반으로 신속하고 안전하게 COVID-19의 항체를 개발할 수 있다. 이를 이용하여 예방 백신, 진단키트 등의 공급 부족 사태를 방지하고, 상기 감염증을 용이하게 진단할 수 있으며, 항바이러스 활성을 갖는 화합물 간의 병용 요법을 통해 보다 효과적이며 안전하게 COVID-19를 예방하거나 치료할 수 있다.
본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스 생백신을 이용함으로써, COVID-19의 조기 발견 및 조기 치료를 통해 2차 감염을 예방할 수 있고 환자의 사회복귀 시기를 앞당길 수 있으며, 감염병 확진자에 대한 이동경로 파악을 통한 접촉자의 2주간의 격리조치, 음식점, 영업점, 회사 등의 일시 폐쇄 등의 피해를 막아 경제 산업적인 손실을 최소화할 수 있다.
또한, 상기 재조합 아데노바이러스를 이용하여 COVID-19 외에도 신종 감염병에 적절하게 대응 가능한 실질적인 플랫폼으로써 특이 단백질 항원에 대한 항체를 개발할 수 있다.
도 1은 COVID-19의 원인 바이러스인 사스-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2)의 다른 유사 코로나 바이러스 단백질과의 서열 동일성을 확인한 것이다.
도 2는 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질 서열을 나타낸 것이다.
도 3은 중성급성호흡기증후군(SARS)의 스파이크 단백질 서열을 나타낸 것이다(이때, 붉은색 하이라이트 부분은 SARS-CoV-2의 결합 도메인 예측 부위를 표시한 것임).
도 4는 SARS-CoV-2와 SARS 바이러스 간 스파이크 단백질의 서열 유사성을 확인한 것으로, 83% 동일한 것으로 확인되었다.
도 5는 본 발명에서 이용하는 항원 유전자 정보에 관한 것으로, RBD의 330-524 부위에 5'-말단에 RBS kozak 서열, 3'-말단에 Flag/His(RBS kozak-2019 nCoV-Flag/His)를 삽입한 서열을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 단백질 발현을 나타낸 것으로, 재조합아데노바이러스 플랫폼에 COVID-19 항원을 삽입한 4개의 후보군(Lane 1-4) 모두에서 약 25kDa 크기의 COVID-19 항원이 정상적으로 발현하고 있음을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 아데노바이러스에 대한 COVID-19 항체 효능을 나타낸 것으로, 도 7a는 항체를 100 μM, 200 μM로 처리하여 24, 48, 72시간에서의 항원 작용 억제 효과를 확인한 것이고, 도 7b는 항체를 200 μM, 400 μM, 600 μM로 처리하여 24, 48, 72시간에서의 항원 작용 억제 효과를 확인한 것이다.
도 8은 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스를 흡입한 생쥐의 혈장에서 재조합 단백질과 반응하는 항체 형성을 확인한 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에서 항바이러스 활성을 검토한 화합물 구조를 나타낸 것이다.
도 10, 도 11 및 도 12에서 표 1에 따른 화합물 처리 후 각각 24시간, 48시간 및 72시간 후 항바이러스 효과를 검토한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 C2, C6, C8, C10의 24시간, 48시간 및 72시간 후 아데노바이러스에 대한 항바이러스 효과를 나타낸 것이다.
도 14는 C2, C6, C8, C10의 24시간, 48시간 및 72시간 후 단순포진바이러스(HSV)에 대한 항바이러스 효과를 나타낸 것이다.
도 15a 및 도 15b는 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스 백신과 ECCA A의 병용처리에 따른 COVID-19에 대한 항바이러스 효과를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명하기로 한다.
본 발명자는 코로나바이러스감염증-19(COVID-19)의 바이러스가 중성급성호흡기증후군(Severe Acute Respiratory Syndrome, SARS) 바이러스와 80%가 유사하며, 중화 항체에 관련된 스파이크 단백질(spike protein)은 83%가 동일함을 도 5와 같이 확인함으로써, 이를 항원으로 하여 재조합 아데노바이러스 벡터 플랫폼에 삽입하여 안전한 재조합 아데노바이러스 생백신을 개발하였고, 또한 상기 생백신과 새로운 항바이러스제를 병용함으로써 COVID-19 치료 효과를 증진시킬 수 있다는 점을 밝혀내어 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 사스-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2) 표면의 스파이크 단백질(Spike protein, S protein)의 수용체 결합 도메인(Receptor Binding Domain, RBD)의 330번부터 524번 유전자 서열과, 상기 유전자 서열의 5'-말단에 리보솜 결합 부위(ribosome binding site, RBS) 서열과 3'-말단에 태그 유전자 서열을 삽입한 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터를 제공한다.
보다 바람직하게는, 상기 재조합 발현벡터는 사스-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2) 표면의 스파이크 단백질(Spike protein, S protein)의 수용체 결합 도메인(Receptor Binding Domain, RBD)의 330번부터 524번 유전자 서열과, 상기 유전자 서열의 5'-말단에 리보솜 결합 부위(ribosome binding site, RBS) 코작(kozak) 서열과 3'-말단에 태그 유전자로서 Flag/His를 삽입하여 제조될 수 있다.
상기 리보솜 결합부위는 단백질의 해독을 도와주는 RBS/Kozak(aaggaggccgccacc) 일 수 있고, 상기 태그 유전자는 발현 목적 단백질의 정제를 쉽게 하기 위한 역할로서, Flag tag(DYKDDDDKG) 및 His tag(HHHHHH) 유전자 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 재조합 발현벡터에 도입되는 항원 유전자는 도 5와 같고, 서열번호 2의 염기서열일 수 있다.
본 발명에 있어서, "벡터"는 클론유전자(또는 클론 DNA의 다른 조각)를 운반하는데 사용되는 스스로 복제되는 DNA분자를 의미한다.
본 발명에서 있어서, “발현 벡터”는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질 전환된 세포를 비 형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 앰피실린(Ampicillin), 카나마이신(Kanamycin), 제네티신(Geneticin; G418), 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(Hygromycin), 클로람페니콜(Chloramphenicol) 과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에 의해 적절히 선택 가능하다.
본 발명의 DNA 서열을 발현시키기 위하여, 매우 다양한 발현 조절 서열 중 어느 것이라도 벡터에 사용될 수 있다. 유용한 발현 조절서열의 예에는, 예를 들어, SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, CMV의 프로모터와 인핸서, 레트로바이러스의 LTR, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코드 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터, 상기 포스파타제의 프로모터들, 예를 들어 Pho5, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 구성과 유도의 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합이 포함될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 재조합 균주를 제공한다. 바람직하게는 상기 재조합 균주는 아데노바이러스일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 균주로부터 수득된 사스-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2) 재조합 단백질을 제공한다.
본 발명에 있어서, "재조합 단백질"은, 한 개 이상의 폴리펩타이드가 펩타이드 결합을 통하여 한가닥의 폴리펩타이드로 결합되어 있는 것을 의미하며, 목적 유전자를 포함하는 한 개 이상의 유전자가 재조합 방법에 의해 융합되어 하나의 폴리펩타이드로 번역되어 만들어진 재조합 단백질을 의미한다. 본 발명에서 상기 재조합 단백질은 목적하는 단백질 또는 펩타이드 서열이 서로 융합되어 있으며, 목적하는 단백질 또는 펩타이드 서열 사이에 화학물질 또는 효소가 특이적으로 인지하여 절단할 수 있는 아미노산 절단 서열(화학물질 또는 효소 특이적 절단서열)을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터로 아데노바이러스를 형질감염시키는 단계; 및 상기 형질감염된 아데노바이러스를 배양하는 단계를 포함하는 재조합 아데노바이러스 입자 제조 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 재조합 아데노바이러스 입자는 사스-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2) 재조합 단백질을 발현할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터로 아데노바이러스를 형질감염시키고 배양하여 수득한 재조합 아데노바이러스를 포함하는 COVID-19 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 백신이 면역 반응을 일으킬 수 있는 숙주 동물은 인간, 개, 고양이, 돼지, 말, 닭, 오리, 칠면조, 페럿 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 백신은 약독화된 생독 백신 또는 사독 백신, 서브유닛 백신(subunit vaccine), 합성 백신(synthetic vaccine) 또는 유전공학 백신(genetic engineering vaccine)일 수 있으나, 효과적인 면역 반응을 유도하는 생독 백신이 바람직하다.
본 발명에 있어서, "생독 백신" 또는 "생백신(live attenuated vaccine)"이란 살아있는 바이러스 활성성분을 포함하는 백신을 의미한다. 또한, "약독화된(attenuation)" 이란 살아있는 병원체의 독성을 인공적으로 약하게 한 것으로, 병원체의 필수 대사에 관여하는 유전자를 변이시켜 체내에서 질병을 일으키지 못하고 면역 체계만을 자극해서 면역성을 유도하는 것을 의미한다. 바이러스의 약독화는 자외선(UV) 조사, 약품처리 또는 시험관 내 고차 연속 계대배양에 의해 달성될 수 있다. 약독화는 또한 명확한 유전 변화를 만듦으로써, 예를 들어 독성을 제공하는 것으로 알려진 바이러스 서열의 특정 결실 또는 바이러스 게놈 내로의 서열의 삽입에 의해 달성될 수 있다.
또한, 본 발명의 백신은 추가적으로 용매, 면역증강제(adjuvant) 및 부형제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 더 포함할 수 있다. 상기 용매로는 생리식염수 또는 증류수가 있으며, 면역증강제로는 프레운즈(Freund's) 불완전체 또는 완전체 어쥬번트, 알루미늄 하이드록사이드 겔과 식물성 및 광물성 오일 등이 있으며, 부형제로는 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 하이드록사이드 또는 알루미늄 포타슘 설페이트가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자가 기술자에게 잘 알려진 백신 제조에 사용되는 물질을 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 백신은 경구형 또는 비경구형 제제로 제조할 수 있으며, 진피내, 근육내, 복막내, 비강 또는 경막외(eidural) 경로로 투여할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 백신은 비강 투여 또는 비강 흡입될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 백신 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하여 COVID-19를 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, "개체"란 인플루엔자 바이러스에 이미 감염되었거나 감염될 수 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미한다. 본 발명의 백신 조성물을 개체에 투여함으로써, 상기 질환을 효율적으로 예방 및 치료할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물로 다양한 COVID-19 바이러스 아형 또는 변이형의 COVID-19 바이러스로 감염된 인간을 치료할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물로 다양한 COVID-19 바이러스 아형 또는 변이형의 COVID-19 바이러스로 감염된 닭 또는 돼지를 치료할 수 있다.
본 발명에 있어서, "예방"이란 백신 조성물의 투여에 의해 COVID-19를 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 또한, "치료"란 백신 조성물의 투여에 의해 COVID-19에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 백신 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 용어 "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체의 종류 및 중증도, 연령, 성별, 감염된 바이러스 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로, 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 백신 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 백신 조성물은 다음의 화합물들과 병용하여 COVID-19 치료 또는 예방 효과를 보다 증진시킬 수 있다.
즉, 본 발명은 상기 백신 조성물; 및 세아노틱산(ceanothic acid), 3-O-바닐릴 세아노틱산(3-O-vanillyl ceanothic acid), 에피세아노틱산 2-메틸에스테르(epiceanothic acid 2-methyl ester) 및 하기 화학식 1로 표시되는 화합물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 화합물을 포함하는 COVID-19 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다:
[화학식 1]
또한, 본 발명은 상기 백신 조성물; 및 세아노틱산(ceanothic acid), 3-O-바닐릴 세아노틱산(3-O-vanillyl ceanothic acid), 에피세아노틱산 2-메틸에스테르(epiceanothic acid 2-methyl ester) 및 상기 화학식 1로 표시되는 화합물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 화합물을 포함하는 단순포진바이러스(Herpes simplex virus) 감염증 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 세아노틱산(ceanothic acid), 3-O-바닐릴 세아노틱산(3-O-vanillyl ceanothic acid), 에피세아노틱산 2-메틸에스테르(epiceanothic acid 2-methyl ester) 및 상기 화학식 1로 표시되는 화합물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 화합물을 포함하는 항바이러스용 약학조성물을 제공한다.
상기 화합물은 아데노바이러스 또는 단순포진바이러스(Herpes simplex virus) 감염증에 항바이러스 활성을 나타낼 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실시예 1> COVID-19 재조합 아데노바이러스 생백신 제조
숙주 결합 능력이 있는 COVID-19의 스파이크 단백질을 확보하여 재조합 아데노바이러스에 삽입하고, in vitro 실험을 통해 세포 내 항원이 발현되는지 확인하였다.
1. 항원 유전자 제작
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 COVID-19의 다른 유사 코로나 바이러스 단백질과의 서열 동일성을 확인한 것이고, 도 2는 COVID-19의 스파이크 단백질 서열(ACCESION: QHD43416.1)을 나타낸 것으로서, 본 발명에서는 이러한 스파이크 단백질 서열에서 수용체 결합 도메인(receptor binding domain; RBD)의 330-524 부위를 항원으로 사용하였다. 도 3은 중증급성호흡기증후군(SARS)의 스파이크 단백질 서열(AAP13441.1)을 나타낸 것이다. 도 4는 SARS-CoV-2와 SARS 바이러스 간 스파이크 단백질의 서열 유사성을 확인한 것으로, 83% 동일한 것으로 확인되었다.
본 발명의 일 실시예에 따른 재조합아데노바이러스 플랫폼인 pShuttle-CMV의 DNA 서열을 서열번호 1로 표시된다.
본 발명에서 이용한 항원 유전자는 도 5와 같이 RBD의 330-524 부위에 5'-말단에 RBS kozak 서열, 3'-말단에 Flag/His(RBS kozak-2019 nCoV-Flag/His)를 삽입하여 준비하였다. 보다 상세하게는, RBD의 330-524 부위에 진핵세포나 대장균에서 효과적으로 해독되도록 이렇게 연결된 펩타이드 아미노산의 카복시터미날쪽에 발현된 단백질의 확인 및 분리과정에 사용할 수 있도록 Flag tag(DYKDDDDKG)과 His tag(HHHHHH)으로 작용하는 펩타이드를 결합시켜 총 2,690개의 아미노산으로 구성된 단백질을 설계하였다.
이와 같이 제작된 단백질을 동물세포에서 발현하는 재조합 바이러스를 제작하기 위하여, 이 단백질의 아미노산 서열에 해당하는 코돈 염기서열을 동물세포에서 가장 잘 읽을 수 있는 형태로 코돈을 최적화하여 결정하였다. 최종적으로 전체 염기서열 앞 부분에 단백질의 해독을 도와주는 리보좀 결합부위인 RBS/Kozak 염기서열을 추가하여 재조합 단백질을 발현하는 항원 유전자를 합성하였다(서열번호 2). 유전자의 합성은 코스모진텍의 유전자합성 서비스를 이용하여 제작하였다.
이렇게 준비된 RBS kozak-2019 nCoV-Flag/His를 SalⅠ과 XbaⅠ 제한효소를 이용하여 pShuttle-CMV에 삽입하였다(서열번호 3).
2. 재조합 아데노바이러스를 이용한 재조합 단백질 발현 확인
상기와 같이 제작된 항원 유전자(RBS kozak-2019 nCoV-Flag/His)로부터 재조합 단백질의 생산을 확인하기 위하여, 이 합성된 유전자를 진핵세포 발현벡터에 삽입하고, 이 발현벡터를 포함하는 재조합 아데노바이러스 입자를 제작하였다. 제작된 융합단백질 유전자는 먼저 재조합 아데노바이러스 제작에 필요한 pShuttle-CMV 셔틀벡터의 CMV promoter와 SV40 polyA site 사이에 유전자를 전사할 수 있는 방향으로 삽입한 pAd5-AI#4212 clone을 얻었다.
상기 pAd5-AI#4212 DNA를 ㈜지뉴인텍에 의뢰히여 이 플라스미드를 포함하는 재조합 아데노바이러스 입자를 제작하여 동물세포에서 융합단백질이 생산되는 지를 조사하였다. 이를 위하여, 2×105 HEK293A cell을 밤새 배양한 다음, MOU가 10,000이 되도록 pAd5-AI#4212 재조합 아데노바이러스 입자 2×09 pfu를 배양액에 섞어주어 세포에 감염시킨 다음 소태아혈청이 포함된 배지에서 24시간 배양하였다. 그 후, 배지를 소태아혈청이 없는 배지로 교환한 다음 24시간 배양한 후 배양액을 모았다. 이러한 방법으로 총 3번에 걸쳐 감염된 세포의 배양액을 모아 융합단백질을 회수하였다. 수거한 재조합 단백질이 포함된 배양액을 20배 농축한 다음, Flag tag을 이용한 western blotting 방법으로 재조합 단백질의 생산 여부를 조사하였다. 대조군으로는 재조합 단백질 대신에 녹색형광단백질(GFP)을 발현하는 재조합아데노바이러스를 사용하였다. 농축된 배양액을 SDS-PAGE로 분리한 다음, NC Membrane에 단백질을 옮긴 후, mouse anti-Flag 항체와 반응시킨 후, 이차 항체인 Rat-anti-mouse IgG1-HRP(eBioscience)와 반응시켰다. 반응이 끝나면 PBS로 세척한 다음, WEST-QueenTM kit(iNtRON)으로 반응시킨 후, 형광이미지분석기(Fusion-SL4)를 이용하여 Flag tag 항체와 반응하는 단백질의 존재유무와 그 크기를 측정하였다(도 6).
그 결과, 도 6과 같이 본 발명에 따른 재조합아데노바이러스 플랫폼에 COVID-19 항원을 삽입한 4개의 후보군(Lane 1-4) 모두에서 약 25kDa 크기의 COVID-19 항원이 정상적으로 발현하고 있음을 확인하였다.
3. 항원 항체 중합 반응에 의한 항체 효능 확인
본 발명에서는 실시예에서 준비한 COVID-19 재조합 아데노바이러스에 대한 상용 COVID-19 항체 효능을 확인하였다.
즉, 96-웰 플레이트에 1×104개의 HEK293A 세포를 분주하여 배양시켰고, 하루 후 실시예에서 준비한 COVID-19 재조합 아데노바이러스(MOI=0.5)로 감염시켰다. 그리고 하루 후, 항체를 농도별로 각각 처리하고, 1-3일 후 Cyto X를 처리하고 흡광도로 세포 생존값을 측정하였다. 이때 사용한 항체는 구매하여 사용하였다[Cat: 40592-V05H, SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike RBD-mFc Recombinant Protein (HPLC-verified)].
그 결과, 도 7a는 항체(Cat: 40592-V05H)를 100 μM, 200 μM로 처리하여 24, 48, 72시간에서의 항원 작용 억제 효과를 확인한 것이고, 도 7b는 항체를 200 μM, 400 μM, 600 μM로 처리하여 24, 48, 72시간에서의 항원 작용 억제 효과를 확인한 것이다.
4. 생쥐에서 COVID-19 재조합 아데노바이러스의 재조합 단백질에 의한 항체 생성 확인
본 발명의 일 실시예에 따른 COVID-19 재조합 아데노바이러스에 대한 상용 COVID-19 항체 효능재조합 아데노바이러스에 따른 생쥐의 혈장 내 COVID-19 항체 형성을 나타낸 것으로, 생쥐에 5×108 pfu 재조합 아데노바이러스(COVID-19 항원), 5×108 pfu GFP 및 PBS를 각각 비강 흡입으로 주입하였다. 3주 후 같은 방법으로 동일 양을 투여하였다. 1주일 후에 실험동물에서 혈액을 채취하여 혈장을 분리 후 ELISA 방법으로 항체 형성 여부를 확인하였다.
그 결과, 도 8과 같이 재조합 아데노바이러스를 흡입한 생쥐의 혈장에서 재조합 단백질과 반응하는 항체가 형성되었음을 확인하였다.
<실시예 2> 재조합 아데노바이러스 생백신과 화합물 간 병용 처리에 따른 항바이러스 효과 증진 검토
1. 재조합아데노바이러스와 재조합 HSV에 대한 항바이러스 활성을 갖는 화합물 선별
96 well plate 상에 HEK293A 세포를 10,000 cells/well로 분주한 후 24시간 동안 안정화시킨 다음, 실시예에서 준비한 재조합 아데노바이러스(GFP tagging, MOI=0.5)와 하기 표 1에 기재된 18개 화합물(50 μM)을 처리한 후 24, 48 및 72시간 동안 배양하면서 GFP 형광강도(Excitation = 485 nm, Emission = 528 nm)를 관찰하였다. 이때, 사용된 화합물의 구조는 도 9에 나타내었다.
Number Compound Name
C1 Betulinic acid
C2 Ceanothic acid
C3 Epiceanothic acid
C4 2-O-E-p-coumaroyl alphitolic acid
C5 3-O-protocatechuoyl ceanothic acid
C6 3-O-vanillyl ceanothic acid
C7 2-O-vanillyl alphitolic acid
C8 epiceanothic acid 2-methyl ester
C9 3-O-protocatechuoyl ceanothic acid 2-methyl ester
C10 ECCA A
C11 ECCA B
C12 vanillic acid
C13 6'-vanilloylisotachioside
C14 Adouetine X
C15 Jubanine F
C16 Jubanine G
C17 Jubanine H
C18 Nummularine B
이때, ECCA A는 다음 구조의 화합물이다.
[ECCA A 구조]
[ECCA B 구조]
도 10, 도 11 및 도 12에서 표 1에 따른 화합물 처리 후 각각 24시간, 48시간 및 72시간 후 항바이러스 효과를 검토한 결과를 나타내며, 특히 C2, C6, C8, C10은 HEK293A 세포에 처리 72시간 후 50% 이상의 우수한 바이러스 저해활성을 나타내었고, C4도 우수한 바이러스 저해활성을 나타내었으나 처리 72시간 후 100% 세포사멸이 확인되어 세포 독성이 확인되었다.
도 13는 C2, C6, C8, C10의 24시간, 48시간 및 72시간 후 항바이러스 효과를 정리한 것으로서, C10의 항바이러스 활성이 가장 뛰어난 것으로 확인되었다.
2. 단순포진바이러스(HSV)에 대한 항바이러스 활성을 갖는 화합물 선별
앞선 실험방법과 동일하게 실험하되, 바이러스 종류를 HSV로 변경하여 항바이러스 활성을 검토하였다. 그 결과, 도 14와 같이 C10의 항바이러스 활성이 가장 뛰어난 것으로 확인되었다.
3. ECCA A와의 병용처리에 따른 COVID19 항체-항원 중합 반응 확인
먼저, 96-웰 플레이트에 1x103개의 HEK293A 세포를 분주하여 배양시켰고, 하루 후 106/ml의 COVID-19 바이러스(COVID19 재조합아데노바이러스)로 감염시켰다. 그리고 하루 후, 200 μM의 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 아데노바이러스와 50 μM의 ECCA A를 처리하고, 1-3일 후 Cyto X를 처리하고 흡광도로 세포 생존값을 측정하였다.
그 결과, 도 15a는 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스 백신과 ECCA A의 병용처리에 따른 효과를 나타낸 그래프이다. 항바이러스 신규합성물인 ECCA A와 병용처리하여 효과적인 항원-항체 중합반응을 확인하였다. 도 15b는 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스 백신과 ECCA A를 병용처리하여 재조합아데노바이러스를 이용한 융합단백질에 결합하는 능력을 나타낸 그래프이다. ECCA A와 병용처리시 항원 융합단백질과의 결합이 우수함을 확인하였다.
이상과 같이, 본 발명은 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 본 발명은 이것에 의해 한정되지 않으며 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 본 발명의 기술 사상과 아래에 기재될 청구범위의 균등 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능함은 물론이다.
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Claims (12)

  1. 사스-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2) 표면의 스파이크 단백질(Spike protein, S protein) (ACCESION: QHD43416.1)의 수용체 결합 도메인(Receptor Binding Domain, RBD)의 330번부터 524번 유전자 서열과, 상기 유전자 서열의 5'-말단에 리보솜 결합 부위(ribosome binding site, RBS) kozak 서열과 3'-말단에 Flag/His 태그 유전자 서열을 삽입하여 합성한 서열번호 2로 이루어진 항원 유전자 서열을 서열번호 1로 이루어진 재조합 아데노바이러스 플랫폼에 삽입하여 제조한 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
  2. 제1항에 있어서, 상기 재조합 발현벡터는 서열번호 3으로 이루어진 DNA 서열인 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
  3. 제1항 또는 제2항에 따른 재조합 발현벡터로 형질전환된 재조합 균주.
  4. 제3항에 있어서, 상기 재조합 균주는 아데노바이러스인 것을 특징으로 하는 재조합 균주.
  5. 제4항에 따른 재조합 균주로부터 수득되며, 상기 사스-코로나바이러스-2 표면의 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인의 330번부터 524번 유전자 서열로부터 발현되는, 사스-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2) 재조합 단백질.
  6. 제1항 또는 제2항에 따른 재조합 발현벡터로 아데노바이러스를 형질감염시키고 배양하여 수득한 재조합 아데노바이러스를 포함하는 코로나바이러스감염증(COVID)-19 예방 또는 치료용 백신 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 재조합 아데노바이러스는 상기 사스-코로나바이러스-2 표면의 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인의 330번부터 524번 유전자 서열로부터 발현되는 사스-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2) 재조합 단백질을 발현하는 것을 특징으로 하는 코로나바이러스감염증(COVID)-19 예방 또는 치료용 백신 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 상기 조성물은 비강 투여 또는 비강 흡입되는 것을 특징으로 하는 코로나바이러스감염증(COVID)-19 예방 또는 치료용 백신 조성물.
  9. 제6항에 따른 백신 조성물; 및 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 코로나바이러스감염증(COVID)-19 예방 또는 치료용 약학조성물:
    [화학식 1]
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
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