CN101348837A - 用于猪瘟病毒实时荧光定量rt-pcr检测的探针、引物及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于猪瘟病毒实时荧光定量RT－PCR检测的探针和引物序列，以及一种包括该探针和引物序列的试剂盒。利用该试剂盒及荧光定量PCR的原理，建立了动物及动物源性食品中猪瘟病毒的实时荧光定量RT－PCR检测方法，并从敏感性、特异性等方面进行了比较研究。此检测方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好、操作简单、检测速度快、不受操作人员主观意识影响，同时检测样品通量大、生物安全风险低等优点。

Description

用于猪瘟病毒实时荧光定量RT-PCR检测的探针、引物及试剂盒

技术领域：

本发明涉及用于猪瘟病毒实时荧光定量RT-PCR检测的探针、引物序列，以及一种包括该探针和引物的试剂盒。

背景技术：

猪瘟(CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus CSFV)引起的一种急性、热性、高度接触性传染病，它的特点是发病快、流行范围广、死亡率高。不仅给养猪业造成极大的经济损失，而且严重阻碍猪及猪产品的国际贸易，OIE将其列为A类传染病，FAO和各国政府也将其列为需要严密监控和检疫的主要动物传染病之一。

目前国内传统的CSFV实验室检验方法主要包括：(1)荧光抗体试验，此方法敏感性不高，不能有效地检测低病毒含量的临床样品和动物源性食品中CSFV的存在，同时受荧光抗体质量及操作人员主观意识影响较大；(2)抗原捕获ELISA(AC-ELISA)，该方法具有快速、操作简单等特点，但敏感性较低，同时特异性也不强，不能有效地区分BVDV、BDV、CSFV；(3)病毒分离，此方法具有敏感性高，特异性较强，但存在技术要求高、检验周期长、检验过程中生物安全隐患较大等缺点，并需要借助其它方法(如荧光抗体方法)才能进行判定；(4)荧光抗体病毒中和试验，该方法为国际贸易指定的方法，主要用于样品中CSFV抗体检测，但不能有效地区分免疫猪群和感染猪群；(5)过氧化物酶联中和试验，这是国际贸易指定方法，该方法在抗体稀释倍数较低时不能有效地区分BVDV、BDV、CSFV；(6)酶联免疫吸附试验，该方法检验速度快、操作简单，但特异性和敏感性取决于试剂抗体的特异性。与此同时，后三种方法只适用于猪血清样品中CSFV抗体检测，不适用临床组织样品和动物源性食品中CSFV抗原检测。

动物源性食品(Animal Derived Food)是指全部可食用的动物组织以及蛋和奶，包括肉类及其制品(含动物脏器)、水生动物产品等。

随着现代分子生物技术在动物疫病实验室检验工作的广泛应用，目前已经建立了单管反转录套式RT-PCR、巢式PCR方法来替代抗原捕获-ELISA和病毒分离技术，国内外有关部门也相继建立了CSFV实时荧光定量PCR检测技术，该技术是根据CSFV基因组结构特点，选择5’非编码区设计一对特异性引物和荧光探针，利用荧光定量PCR的原理，建立动物及动物源性食品中CSFV real-time RT-PCR方法。该方法主要由一条两端标记有荧光基团的探针和一对引物组成，在探针完整时，两基团在空间结构上互相靠近，5’报告基团产生的荧光基团为荧光共振能量而被3’端淬灭基团淬灭，因此体系中没有荧光信号的产生，在PCR退火和延伸过程中，探针与模板特异性结合，随着引物的延伸，Taq DNA聚合酶利用5’-3’外切活性对探针进行切割，释放出报告基团，这样破坏了两基团之间的荧光共振能量转移，报告基团所释放的荧光可以被荧光PCR仪器内的光学系统检测出来，荧光量的增加与PCR的产物的积累量呈正比例关系。而PCR产物的积累与初始模板数成正线性关系，因此在PCR循环数相同的情况下，荧光量与初始模板数成正线性关系。因此可以推论出达到相同的荧光阈值(Ct)值与初始模板数的对数成负线性相关，这就是荧光定量PCR实现定量的原理。这种方法与传统的检测方法相比，荧光定量PCR方法特异性好，因为检测过程中上下游引物与探针同时保证了检测方法的特异性，而且探针与模板结合要求特异性更强。

其中的荧光修饰基团有多种。

CSFV real-time RT-PCR方法在实验感染样品、猪瘟疫苗弱毒株等样品中得到了较好地应用。所使用的PCR引物和探针是针对CSFV某一特定区域的基因组序列进行设计，能有效地区分被检样品中的BVDV、BDV、CSFV，但该技术并未在动物临床样品和动物源性食品中CSFV得到应用，其敏感性和特异性也有待进一步提高。

发明内容：

本发明提供了一种特异性、灵敏度高的用于猪瘟病毒实时荧光定量RT-PCR检测的探针，其序列为5’-tgatgggggtacgacctgatagggt-3’。

本发明还提供了与上述探针相应的引物，其序列为5-gacacaagcgcaggcaatag-3’和5’-agtgggttccaggartacat-3’。

本发明还提供一种猪瘟病毒实时荧光定量RT-PCR检测的试剂盒，其中包括上述探针和引物，具体包括：

1)阳性对照：阳性标准品：采用人工合成的含有目的检测基因的RNA作为标准样品，共4瓶，300μl/瓶，-20℃冷冻保存；标准品1：10⁷拷贝/5μl；标准品2：10⁵拷贝/5μl；标准品3：10³拷贝/5μl；标准品4：10¹拷贝/5μl；

2)阴性对照：采用无猪瘟病毒感染猪组织，按1∶5倍体积加入0.1％DEPC水，于组织匀浆器中充分研磨，然后3500rpm离心20min，取上清液提取RNA，溶解于DEPC水，分装成300μl/瓶，-20℃冷冻保存备用；

3)0.1％DEPC水：在去离子水中加入0.1％焦碳酸二乙酯，室温下过夜处理，15磅30分钟，2×10ml/瓶；

4)Trizol裂解液：50ml/瓶，棕色瓶分装，4℃保存备用；

5)RT-PCR反应液：每个反应包括5×PCR buffer 5.0μl、10mmoldNTPs 0.5μl、25mmolMgCl₂ 2.0μl以及权利要求3所述的引物对各0.5μl，共8.5μl，50个反应体系共计425μl；

6)反应酶：每个反应体系包括Reverse Transcriptase 0.2μl、Taq DNA聚合酶0.5μl，含量为3U/μl，共0.7μl，50个反应体系共计35μl，-20℃冷冻保存备用；

7)探针溶液：探针采用5’-FAM和3’-TAMRA修饰，合成后采用0.1％DEPC水稀释，浓度为10μmol/L，每个反应体系0.5μl，50个反应体系共计25μl，-20℃冷冻保存备用。

本发明也提供了一种利用上述试剂盒对猪瘟病毒进行实时荧光定量RT-PCR的检测方法，具体的检测过程为：

1)样品的采集与前处理

采样过程中样本不得交叉污染，采样器具均采用高压灭菌处理，采样及样品前处理过程中须戴一次性手套。

a活猪的采样方法

采血：取用肝素钠处理的一次性采血针管，选取猪耳静脉，按常规的采血方法采集抗凝血样。

b组织、脏器、盐渍肠衣、腌肉、分割肉等样品的采样方法

研钵的处理：将洗净的研钵用0.1％DEPC H₂O处理，高压灭菌风干后备用。

石英砂的处理：取适量的石英砂置于灭菌的玻璃瓶中，加入适量的0.1％DEPC H₂O处理，高压灭菌风干后备用。

用无菌的剪刀、镊子取待检样品2.0g于研钵，剪碎后加入少量的石英砂，充分研磨，再加10ml 0.1％DEPC水混匀，3000g离心10min后，上清液转入灭菌处理的玻璃管备用。

采集或处理的样本在2～8℃条件下保存应不超过24h，长期保存须在-70℃以下，但尽可能避免反复冻融。

将采集的样品密封并编号，以冷藏方式尽快送实验室进行检测，如暂不进行检测，必须冷冻保存。

血液样品冷藏保存，保存时间一般不超过7天。

2)CSFV RNA的制备

样品制备应在生物洁净工作室或生物安全柜内进行。取n个1.5ml经0.1％DEPC H₂O处理的Eppendorf管，其中n为待检样品数。

a组织样品RNA的提取：每管加入800μl Trizol试剂，然后加入待测样品上清液200μl，一份样本换用一个吸头，然后涡旋10s；再加入500μl氯仿，混匀器上涡旋5s，于4℃条件下，12000g离心15min。

取与上述组织样品相同数量的1.5ml经DEPC H₂O处理的Eppendorf管，每个管做好相应标记，加入500μl异丙醇，再分别加入上述经离心处理的上清液500μl(注意：移液时不能接触中间层)，颠倒混匀，置-20℃下静止15min后，于4℃条件下12000g离心15min，轻轻倾倒上清液，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品须在吸水纸不同地方吸干。

加入600μl 75％乙醇，颠倒洗涤，于4℃条件下10000g离心5min。轻轻倾倒上清液，倒置于吸水纸上，沾干液体。

5000g离心5s将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器将其吸干，一份样本用一个吸头，吸头不能碰到沉淀物，室温下干燥5min。

每个样本加入50μl DEPC H₂O，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，2000g离心5s，冰上保存备用。

b血液样品RNA的提取：取上述活猪样品抗凝血，经3000rpm离心处理15min，小心移取中间白细胞50μl，加入到950μl Trizol试剂中，再按组织样品RNA提取方法，提取受检样品RNA。

3)靶核酸的反转录和扩增

a扩增试剂的准备与配制

从试剂盒中取出相应的qRT-PCR反应液、Taq酶，待反应液室温下融化后2000g离心5s。如果所需扩增的样本为n，包括待检样品、阳性对照、阴性对照，则移取各液体的总量为以下各试液的n+1倍。

q RT-PCR反应体系如下：

5×buffer                 5.0μl

25mmol/L MgCl₂            2.0μl

Rnase Inhibitor           0.5μl

Reverse Transcriptase     0.2μl

10mmol/L dNTPs            0.5μl

10μmol/L Primer 1        0.5μl

10μmol/L Primer    20.5μl

10μmol/L Probe     0.5μl

Taq酶               0.5μl(3U/μl)

RNA                 5.0μl

DEPC H₂O            9.8μl

                                           

总计                25μl

b real-time RT-PCR反应，CSFV反应参数为：

第一阶段，反转录45℃/15min；

第二阶段，预变性95℃/5min；

第三阶段，94℃/30s，58℃/45s，40个循环。退火延伸时检测荧光信号。

4)结果判定

结果分析条件设定：阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点。Ct值≤30，而且出现明显的扩增曲线为阳性，表明样品中存在CSFV；无Ct值，并且无扩增曲线为阴性，表明样品中无CSFV。

上述对于猪瘟病毒的实时荧光定量RT-PCR检测，是对于动物和动物源性食品中的猪瘟病毒的实时荧光定量RT-PCR检测。

本发明的优点：

本发明提供的动物及动物源性食品中猪瘟病毒诊断试剂盒及real-time RT-PCR检测方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好、操作简单、检测速度快(从样品处理开始4小时内完成检测)、不受操作人员主观意识影响，同时检测样品通量大、生物安全风险低，符合国际上动物疫病诊断方法发展趋势，该方法的建立填补了国内外动物及动物源性食品中CSFV检测空白，具有广阔的应用前景。

附图说明：

图1是猪瘟疫苗和阴性组织样本实时荧光RT-PCR的检测曲线图，其中曲线1-4分别为50、25、12.5、6.5μl疫苗液提取的RNA作为模板扩增到的曲线，曲线5-7为3个阴性对照扩增曲线；

图2是猪瘟病毒和另外6种病毒实时荧光RT-PCR的检测曲线图，其中，曲线1-2分别为20、10μl猪瘟病毒培养液检测曲线，曲线3-8分别为BVDV、BDV、PRRSV、PRV、PPV、PCV-2病毒检测曲线；

图3是临床样本不同稀释度的实时荧光RT-PCR的检测曲线图，曲线1-4分别为组织样本匀浆稀释8倍、64倍、16倍及32倍时的检测曲线；

图4是不同拷贝数模板的实时荧光RT-PCR的检测曲线图，曲线1-8分别为10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹、10⁰拷贝数目的检测基因的检测曲线；

图5是3对引物和探针对不同稀释度样本的实时荧光RT-PCR的检测曲线图，其中，曲线1-3和6分别为本发明引物和探针对1∶8、1∶16、1∶32及1∶64稀释度样本的检测曲线，曲线4：为第(1)组对照引物和探针对1∶8稀释度样本的检测曲线，曲线5：为第(2)组对照引物和探针对1∶8稀释度样本的检测曲线；

图6是第(1)组对照引物和探针对不同稀释度RNA的实时荧光RT-PCR的检测曲线图，曲线1-4分别为RNA 10^-1、10^-2、10^-3、10^-4稀释时的实时荧光RT-PCR的检测曲线；

图7是本发明引物和探针对不同稀释度RNA的实时荧光RT-PCR的检测曲线图，曲线1-5分别为RNA 10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5稀释时的实时荧光RT-PCR的检测曲线；

图8是不同样本中猪瘟病毒的实时荧光RT-PCR检测的扩增曲线图，其中，曲线1和3-7分别为肉样1、肉样3、肉样4、肉样2、肠衣2及腌肉1猪瘟病毒的实时荧光RT-PCR检测曲线，曲线2为阳性对照的检测曲线。

具体实施方式：

实施例1

阳性对照：采用猪瘟兔化弱毒疫苗提取病毒RNA。

阴性对照：采用未感染CSFV猪组织，按1∶10体积加入DEPC水于组织匀浆器中研磨，3500rpm离心处理15min，取上清液提取样品RNA。

反应体系：

5×buffer              5.0μl

25mmol/L MgCl₂         2.0μl

Rnase Inhibitor        0.5μl

Reverse Transcriptase  0.2μl

10mmol/L dNTPs         0.5μl

10μmol/L Primer 1     0.5μl

10μmol/L Primer 2     0.5μl

10μmol/L Probe        0.5μl

Taq酶                  0.5μl(3U/μl)

RNA                    5.0μl

DEPC H₂O    9.8μl

                            

总计        25μl

反应条件：第一阶段，反转录45℃/15min；

第二阶段，预变性95℃/5min；

第三阶段，94℃/30s，58℃/45s，40个循环。退火延伸时检测荧光信号。

阴性对照没有特异性扩增曲线，猪瘟兔化弱毒疫苗液扩增到明显的特性异“S”曲线，且Ct值为29-31(四条曲线分别代表50、25、12.5、6.5μl疫苗液提取的RNA作为模板扩增到的曲线)，结果见附图1。

实施例2特异性研究

鉴于黄病毒科瘟病毒属的BVDV、BDV、CSFV三种病毒基因组序列具有较高的同源性，以及我国集约化养猪场广泛存在PRRSV、PRV、PPV、PCV-2等动物病毒感染，且这些疫病在流行病学、发病动物的临床症状、病理表现、组织学变化等方面存在一定的相似性，因此本发明采用了CSFV、BVDV、BDV、PRRSV、PRV、PPV、PCV-2等病毒培养液进行比较研究，以确定本发明方法的特异性。

实验结果参见附图2，其中两条阳性“S”曲线分别代表以20μl、10μl CSFV培养液提取的RNA为模板，通过Real-time RT-PCR扩增的结果，而其余六种病毒RNA均未扩增出“S”曲线，无Ct值，实验结果均为阴性，具体Ct值和结果如表1：

毒种类	BVDV	BDV	CSFV	PRRSV	PRV	PPV	PCV-2
								Ct值	无	无	29	无	无	无	无
结果	阴性	阴性	阳性	阴性	阴性	阴性	阴性

实施例3不同检测方法的对比研究

采用了RT-PCR、real-time RT-PCR和AC-ELISA三种不同的检测方法对同一样品进行检测，比较检测结果，以确定该方法的敏感性。对268份临床组织样品、324份临床血液样品、122份盐渍肠衣、96份分割肉、24份腌肉样品进行检测。

分子生物学检测方法是：将被检样品制成匀浆，用灭菌生理盐水按1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64的比例进行稀释，提取样品总RNA，再按本研究设计的方法进行CSFV RT-PCR和real-time RT-PCR检测，而不是采取样品提取RNA后，对RNA进行稀释再进行敏感性研究，这与现实工作中所需要进行检测的样品基本一致；对于AC-ELISA检测方法采用稀释后的匀浆样品按试剂盒提供的检测方法进行试验。

RT-PCR对于组织样品匀浆的敏感性为1∶8，real-time RT-PCR的敏感性为1∶64，明显高于RT-PCR和AC-ELISA。具体结果见表2：

实施例4敏感性研究

将CSF临床样品匀浆用灭菌生理盐水或DEPC H₂O按1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128等比例稀释，提取稀释后样品的总RNA，确立本发明方法的敏感性。

实验结果参见附图3，当样品匀浆按1∶8、1∶16、1∶32、1∶64比例稀释时，仍能扩增到明显的曲线，Ct值为29-32，其余稀释倍数未出现明显的扩增曲线，无Ct值，具体结果见表3：

样品稀释倍数	1∶8	1∶16	1∶32	1∶64	1∶128
						Ct值	29	29	30	31	无
结果	阳性	阳性	阳性	阳性	阴性

实施例5定量检测

采用构建含有猪瘟病毒石门株基因组5’端非编码区的重组质粒，将重组质粒按每个real-time RT-PCR反应体系模板总量为10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹、10⁰拷贝数加入反应各反应体系确立检测方法最低检测限量。(首先合成含目的片段的核苷酸序列(230bp)，两端分别引入Apall和BamH酶切位点。双酶切后连接到经Apall和BamH双酶切的pUC57的质粒中，构建重组质粒并测序进行鉴定。序列为：5’-tctaagtcct gagtacagga cagtcgtcagtagttcgacg tgagcagaag cccacctcga gatgctacgt ggacgagggc atgcccaaga cacaccttaa ccctagcgggggtcgctagg gtgaaatcac accacgtgat gggagtacga cctgataggg cgctgcagag gcccactatt aggctagtataaaaatctct gctgtacatg gcacatggag ttgaatcact-3’)。

实验结果参见附图4，通过定量检测确立了本方法的最低检测限量为10¹拷贝/反应体系。具体实验结果如表4。

反应体系质粒模板数	107	106	105	104	103	102	101	100
									Ct值	25	27	28	30	30	33	33	无
结果	阳性	阳性	阳性	阳性	阳性	阳性	阳性	阴性

实施例6相同方法不同引物、探针比较研究

本研究过程中选取了两组有文献报道的对比引物和探针进行比较研究。第(1)组为：

primer 1-F：5-CCA TGC CCA TAG TAG GAC TAG CAAA-3，

primer 2-R：5-TCA CGT CGAACT ACT GAC GAC TGT-3，

probe 1：5-Fam-TAG CCG TAG TGG CGA GCT CCC TGG GTG GT-Tamra-3(武汉大学学报(理学版)，2004，50(6)：746-750.)

第(2)组为：

primer 1-F：5-GAG CTC CCT GGG TGG TCT AAG T-3，

primer 2-R：5-CAT GCC CTC GTC CAC RTA GC-3，

probe 2：FAM 5-ACG TCG AAC TAC TGA CGA CTG TCC TGT ACT CA-Tamra-3(J.Virol.Methods，2007，139(2)：203-207.)

首先将阳性样品匀浆用灭菌生理盐水或DEPC H₂O按1∶8、1∶16、1∶32、1∶64比例稀释，提取稀释后样品总RNA，采用本研究建立的检测方法，结果为本方法当1∶8、1∶16、1∶32、1∶64比例稀释后均可扩增到特异性曲线，Ct值随着样品的稀释逐渐增大，而对照的两组引物和探针仅在样品作1∶8稀释时扩增到特异性曲线，Ct值分别为31、32，而在样品作1∶16、1∶32稀释时检测结果均为阴性，扩增曲线图见附图5，具体结果及Ct值见表5。

实施例7相同方法不同反应条件比较研究

本研究过程中采用了温国庆等(武汉大学学报(理学版)，2004，50(6)：746-750.)公布的的CSFV荧光定量PCR方法中反应条件对两种不同引物和探针进行比较研究，具体方法如下：提取样品RNA，用DEPC H₂O将RNA作10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5稀释，按照反转录45℃/15min；95℃/10min；94℃4s，60℃/30s，40个循环。退火延伸时检测荧光信号。

采用参考文献提供的反应条件、引物和探针进行检测的结果，10^-4扩增出明显曲线，10^-5无扩增曲线，参见附图6；采用参考文献提供的反应条件和发明提供的引物、探针进行检测的结果，10^-5仍能扩增出明显曲线，参见附图7。结果表明本发明提供的引物和探针检测方法的敏感性能够高出10倍。

实施例8应用范围研究

由于目前文献资料报道的CSFV实验室检测方法主要集中在CSFV实验感染样品、混合感染样品以及猪瘟病毒疫苗病毒等样品中CSFV检测，而对猪瘟病毒感染前期的临床样品、动物源性食品等低病毒含量样品报道较少，本发明除了对CSFV感染猪淋巴结、肝、肾、脾、全血等临床样品进行检测外，根据CSFV的理化特性，选取了12份盐渍肠衣、腌肉、猪分割肉(各4份)等动物源性食品作为被检材料，进行样品中CSFV检测，旨在扩大检测方法的应用范围。

阳性对照：采用人工合成的含有目的检测基因的RNA，含量为10⁴拷贝/5μl。

阴性对照：采用无猪瘟病毒感染猪组织，按1∶5倍体积加入0.1％DEPC水，于组织匀浆器中充分研磨后，取上清液提取RNA，再用DEPC水溶解后供检测。

实验结果：参见附图8，受检样品中有6份样品扩增到特异性曲线，结果为阳性，6份样品无特异性曲线，结果为阴性。具体结果见表6：

Claims (6)

1.用于猪瘟病毒实时荧光定量RT-PCR检测的探针，其序列为5’-tgatgggggtacgacctgatagggt-3’。

2.根据权利要求1的所述的探针序列，其特征在于5’端和3’端分别采用荧光基团FAM和TAMRA进行修饰。

3.用于猪瘟病毒实时荧光定量RT-PCR检测的引物对，其序列为5’-gacacaagcgcaggcaatag-3’和5’-agtgggttccaggartacat-3’。

4.一种用于猪瘟病毒实时荧光定量RT-PCR检测的试剂盒，其特征在于该试剂盒是由权利要求1或2所述的探针、权利要求3所述的引物对以及对照品所组成：

1)阳性标准品：采用人工合成的含有目的检测基因的RNA作为标准样品，共4瓶，300μl/瓶，-20℃冷冻保存，标准品1：10⁷拷贝/5μl，标准品2：10⁵拷贝/5μl，标准品3：10³拷贝/5μl，标准品4：10¹拷贝/5μl；

2)阴性对照：采用无猪瘟病毒感染猪组织，按1∶5倍体积加入0.1％DEPC水，于组织匀浆器中充分研磨，然后3500rpm离心20min，取上清液提取RNA，溶解于DEPC水，分装成300μl/瓶，-20℃冷冻保存备用；

3)0.1％DEPC水：在去离子水中加入0.1％焦碳酸二乙酯，室温下过夜处理，15磅30分钟，2×10ml/瓶；

4)Trizol裂解液：50ml/瓶，棕色瓶分装，4℃保存备用；

5)RT-PCR反应液：每个反应包括5×PCR buffer 5.0μl、10 mmoldNTPs 0.5μl、25mmol MgCl₂2.0μl以及权利要求3所述的引物对各0.5μl，共8.5μl，50个反应体系共计425μl；

6)反应酶：每个反应体系包括Reverse Transcriptase 0.2μl、Taq DNA聚合酶0.5μl，含量为3U/μl，共0.7μl，50个反应体系共计35μl，-20℃冷冻保存备用；

7)含有权利要求1所述的探针序列溶液：探针序列用0.1％DEPC水稀释，浓度为10μmol/L，每个反应体系0.5μl，50个反应体系共计25μl，-20℃冷冻保存备用。

5.一种猪瘟病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法，其特征在于使用权利要求4所述的试剂盒。

6.一种猪瘟病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法，其特征在于是对于动物及动物源性食品中的猪瘟病毒的实时荧光定量RT-PCR检测。

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