CN111321247A - 用于鉴别非洲猪瘟病毒、猪瘟野毒株与猪瘟兔化弱毒疫苗株的冻干微孔板、试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明“用于鉴别非洲猪瘟病毒、猪瘟野毒株与猪瘟兔化弱毒疫苗株的免提取超微量冻干微孔板、试剂盒及方法”，属于分子检测领域。所述试剂盒包含样本处理液，样本经简单处理即可上机。所述超微量冻干微孔板的特征是：用于鉴别非洲猪瘟病毒、猪瘟野毒株与猪瘟兔化弱毒疫苗株的荧光PCR反应体系通过冻干被固定在所述超微量冻干微孔板上；所述荧光PCR反应体系包括：下述引物和探针：非洲猪瘟、猪瘟野毒株、猪瘟兔化弱毒疫苗株上、下游引物及Taqman探针。本发明同时鉴别非洲猪瘟、猪瘟野毒株和猪瘟兔化疫苗，所述检测试剂盒检测方法准确性、特异性和敏感性高，检测时间短。

Description

用于鉴别非洲猪瘟病毒、猪瘟野毒株与猪瘟兔化弱毒疫苗株 的冻干微孔板、试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及病毒的分子生物学检测技术领域，特别是涉及一种用于鉴别非洲猪瘟病毒、猪瘟野毒株与猪瘟兔化弱毒疫苗株的免提取超微量冻干微孔板、试剂盒及方法。

背景技术

猪瘟(Classical swine fever，CSF或hog cholera)，又称经典猪瘟或古典猪瘟，是感染猪的一种高传染性疾病。猪瘟会导致患病猪发烧、厌食、腹泻、死亡等，并可能带有神经症状。母猪可能会流产或产下死猪崽。猪瘟活疫苗可预防猪瘟。市售疫苗系用猪瘟病毒兔化弱毒株接种健康家兔或乳兔，收获感染兔的脾脏及淋巴结等组织器官，加适当稳定剂，经冷冻真空干燥制成。2017年3月，俄罗斯远东地区伊尔库茨克州发生非洲猪瘟疫情，疫情发生地距离我国较近，仅为1000km左右。我国与其它国家的种猪及猪肉制品商贸往来频繁，因此，非洲猪瘟传入我国的风险日益加大，对此，2017年4月12日，我国农业部发布了关于进一步加强非洲猪瘟风险防范工作的紧急通知。2018年8月3日，经中国动物卫生与流行病学中心诊断，沈阳市沈北新区沈北街道(新城子)五五社区发生疑似非洲猪瘟疫情。随后河南、江苏、浙江、安徽等地各省、市、县相继出现非洲猪瘟疫情。非洲猪瘟与猪瘟的其他出血性疾病的症状和病变都很相似，他们的亚急性型和慢性型在生产现场实际上是不能区别的，因而必须用实验室方法才能鉴别。现场如果发现尸体解剖的猪出现脾和淋巴结严重充血，形如血肿，则可怀疑为猪瘟。

近年来，虽然各国科学家已对猪瘟病毒进行了多方面的研究，但至今还未找到有效根除猪瘟病毒的方法，而且目前暂无非洲猪瘟疫苗，其防控有赖于及时准确地检测和疫情的控制。检测是防控的基础，非洲猪瘟、猪瘟野毒株须经实验方法才能鉴别，猪瘟疫苗多为活疫苗，检测时会对猪是否感染猪瘟野毒或者非洲猪瘟病毒有一定的干扰，所以鉴别猪瘟兔化疫苗的不同分类型检测是该病防控的首要之举。目前对猪瘟病毒的检测所采用的方法主要还是传统的病毒分离鉴定、ELISA方法及普通PCR检测。病毒分离操作烦琐，耗时长，漏检率高；ELISA方法相对简便，快速，但对于微量或杂质较多的样品，其特异性和灵敏度较低，可能造成漏诊或误诊。PCR作为一种新型的分子生物学技术，自诞生以来，由于其特异性、敏感性高，能在短时间内通过基因扩增得到大量的目的片段，使之成为目前猪瘟检测的重要手段之一。但普通PCR仍存在操作繁琐、检测时间长且易污染等弊端。目前国家已有检测猪瘟病毒及非洲猪瘟的相关标准及专利，但检测时间长，需要进行病毒的核酸提取，无法进行现场检测。而且，暂无不需提取，可同时鉴别非洲猪瘟、猪瘟野毒株与猪瘟兔化疫苗的快速、准确、灵敏度高，且便携，能现场操作的检测和鉴别检测的试剂产品。

发明内容

基于本领域的上述需求，本发明的目的在于提供一种用于鉴别非洲猪瘟病毒、猪瘟野毒株与猪瘟兔化弱毒疫苗株的免提取超微量冻干微孔板、试剂盒及方法，使其能够快速、有效地对鉴别非洲猪瘟病毒、猪瘟野毒株与猪瘟兔化弱毒疫苗株，准确性、特异性和敏感性高，重复性好。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明一方面提供一种荧光RT-PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括一瓶样本处理液、一个超微量冻干微孔板、一瓶矿物油、一管阳性对照、一管阴性对照、一管稀释液及一管无核酸酶水，所述超微量冻干微孔板包含引物、探针、Taq酶、反转录酶、海藻糖、Tris-Cl、dNTP、Mg²⁺。

所述的非洲猪瘟、猪瘟野毒株与猪瘟兔化弱毒疫苗株病毒荧光超微量冻干微孔板PCR检测试剂盒，Taqman探针的核苷酸序列的3＇端标记TAMARA荧光淬灭基团。所述超微量冻干微孔板包被具有如下核苷酸序列的引物和Taqman探针：

非洲猪瘟上游引物：5＇-CAAATCATGAATGTTGCATAGGAAG-3＇，

非洲猪瘟下游引物：5＇-AAATTTTGCATCCCAGGGGATA-3＇，

非洲猪瘟Taqman探针序列：5＇-CCACTAGTTCCCTCCACCGATACCTCCTG-3＇；

猪瘟病毒野毒株上游引物：5＇-CATGGGCCCGGTCTACC-3＇，

猪瘟病毒野毒株下游引物：5＇-TCCGTCACTACCTGTCACC-3＇，

猪瘟病毒野毒株Taqman探针序列：

5＇-AGAGTTTTTCAATGAGACGCAGTTTTGTGAGGT-3＇；

猪瘟兔化疫苗上游引物：5＇-CATGGGCCCGGTCTACC-3＇，

猪瘟兔化疫苗下游引物：5＇-TCCGTCGCTACCTGTCACC-3＇，

猪瘟兔化疫苗Taqman探针序列：5＇-TTTTGACGAAGTGCAGTTCTGCGAGGT-3＇。

所述荧光定量PCR的冻干体系终浓度包括：上游引物0.4μM；下游引物0.4μM；Taqman探针0.4μM；DNA聚合酶0.5U/μL；反转录酶0.5U/μL；dNTP 0.3mM；Mg²⁺3mM；海藻糖5μM；Tris-Cl 5mM；余量为灭菌去离子水；

优选地，所述荧光定量PCR的冻干体系的总体积为36μL，每孔体积为1.2μL；

所述荧光定量PCR的YSQ30超微量冻干微孔板的整个超微量冻干微孔板上样孔为30个，将上述荧光PCR反应体系(包含猪瘟野毒株和猪瘟兔化弱毒疫苗株2套引物探针)，每个超微量冻干微孔板孔加入1.2μL。

所述荧光定量PCR的超微量冻干微孔板先于-80℃冷冻1h。设备冻干条件为：预冻阶段，隔板温度下降到-55℃，预冻时保持时间为1h，然后设备进行抽真空，保持冷冻干燥1h；解析干燥阶段，再将隔板温度升至-25℃保持1h，然后将隔板温度升至37℃并保持2h，最后将隔板降至25℃并保持1h。

猪瘟野毒株与猪瘟兔化弱毒疫苗株病毒超微量冻干微孔板荧光RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述超微量冻干微孔板荧光RT-PCR反应条件为：50℃10min，为第一步循环；95℃1min，为第二步循环；95℃5s，60℃15s，为第三步，40个循环，所述第三步每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。

猪瘟野毒株与猪瘟兔化弱毒疫苗株病毒超微量冻干微孔板荧光RT-PCR检测试剂盒，包括PCR超微量冻干微孔板，所述PCR超微量冻干微孔板包括具有如下核苷酸序列的引物和Taqman探针：

非洲猪瘟上游引物：5＇-CAAATCATGAATGTTGCATAGGAAG-3＇，

非洲猪瘟下游引物：5＇-AAATTTTGCATCCCAGGGGATA-3＇，

非洲猪瘟Taqman探针序列：

5＇FAM-CCACTAGTTCCCTCCACCGATACCTCCTG-TAMARA3＇；

猪瘟病毒野毒株上游引物：5＇-CATGGGCCCGGTCTACC-3＇，

猪瘟病毒野毒株下游引物：5＇-TCCGTCACTACCTGTCACC-3＇，

猪瘟病毒野毒株Taqman探针序列：

5＇FAM-AGAGTTTTTCAATGAGACGCAGTTTTGTGAGGT-TAMARA3＇；

猪瘟兔化疫苗上游引物：5＇-CATGGGCCCGGTCTACC-3＇，

猪瘟兔化疫苗下游引物：5＇-TCCGTCGCTACCTGTCACC-3＇，

猪瘟兔化疫苗Taqman探针序列：

5＇ROX-TTTTGACGAAGTGCAGTTCTGCGAGGT-TAMARA3＇。

作为进一步地改进，所述Taqman探针的核苷酸序列的3＇端标记TAMARA荧光淬灭基团。

所述非洲猪瘟和猪瘟野毒株病毒检测Taqman探针的核苷酸序列的5＇端标记FAM荧光报告基团；猪瘟兔化弱毒疫苗株病毒检测Taqman探针的核苷酸序列的5＇端标记ROX荧光报告基团。

所述超微量冻干微孔板试剂还包括DNA聚合酶、反转录酶、dNTP、Mg²⁺、海藻糖、Tris-Cl。

所述荧光定量PCR的冻干YSQ30超微量冻干微孔板的整个超微量冻干微孔板上样孔为30个，将上述荧光PCR反应体系(包含非洲猪瘟、猪瘟野毒株和猪瘟兔化弱毒疫苗株2套引物探针)用2×稀释液稀释，每个超微量冻干微孔板孔加入1.2μL。

所述冻干条件为荧光定量PCR的超微量冻干微孔板先于-80℃冷冻1h。设备冻干条件为：预冻阶段，隔板温度下降到-55℃，预冻时保持时间为1h，然后设备进行抽真空，保持冷冻干燥1h；解析干燥阶段，再将隔板温度升至-25℃保持1h，然后将隔板温度升至37℃并保持2h，最后将隔板降至25℃并保持1h。

所述常规试剂包括免提取样本处理液、矿物油、稀释液、无核酸酶水在内的商品化分子试剂；

所述免提取样本处理液，具体为100mmol/L Tris-HCl、1.4mol/L NaCl、1.5mmol/LMgCl2，1mmol/L BSA，0.5％NP-40，2％SDS，4％Triton。

所述商品化稀释液为10×buffer(不含Mg²⁺)，使用无核酸酶水稀释为2×buffer。

所述超微量冻干微孔板荧光定量PCR的1.2μL反应体系包括：荧光定量PCR冻干试剂孔、稀释液0.6μL；检测样品DNA/RNA 0.6μL。

所述试剂盒还包括阳性对照，所述阳性对照为非洲猪瘟VP72合成质粒、猪瘟野毒株和猪瘟兔化弱毒疫苗株病毒基因组cDNA混合物。

所述猪瘟野毒株与猪瘟兔化弱毒疫苗株病毒超微量冻干微孔板荧光RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，采用所述的引物、和/或、所述的试剂盒对待测样品进行检测。

所述检测指超微量冻干微孔板荧光定量PCR检测；所述上游引物0.4μM；下游引物0.4μM；Taqman探针0.4μM；DNA聚合酶0.5U/μL；反转录酶0.5U/μL；dNTP 0.3mM；Mg²⁺3mM；海藻糖5μM；Tris-Cl 5mM；余量为灭菌去离子水，每孔体积为1.2μL。

所述超微量冻干微孔板荧光RT-PCR的反应条件包括：50℃10min，为第一步循环；95℃1min，为第二步循环；95℃5s，60℃15s，为第三步40个循环，所述第三步每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。

本发明的另一个方面提供一种免提取样本处理液，其包括：100mmo l/L Tris-HCl、1.4mol/L NaCl、1.5mmol/L MgCl₂，1mmol/L BSA，0.5％NP-40，2％SDS，4％Triton，采用该样本处理液处理待测样本(包括液体样本和固体样本，液体样本例如：猪组织液、猪血液；固体样本包括：猪组织，例如，猪器官组织、猪肉组织等)，如果待测样本中含有病毒，可直接从待测样本中析出病毒，并将经所述免提取样本处理液处理后的所得的混合液(液体样本处理后的所得液体产物)或上清液(固体样本处理后的所得液体产物)用作后续荧光PCR的模板，直接投入本发明的冻干微孔板中进行PCR扩增，即可获得PCR鉴定结果，从而达到免提取的目的。上样时，本发明的微孔板每孔仅需加入上述模板0.6μL即可。

由于采用上述技术方案，本发明至少具有以下优点：

(1)本发明提供的免提取处理液处理血液仅需一步加入室温混匀即可上样。处理组织样本仅需简单破碎或研磨，取上清即可上样。适用于现场快速操作，无需提取核酸的耗材试剂及实验设备，节省人力物力和检测时间，样本处理时间仅需几分钟。

(2)本发明根据国内已发现的非洲猪瘟、猪瘟野毒株和猪瘟兔化弱毒疫苗株病毒的基因设计引物，合成特异性引物及Taqman探针，采用荧光定量PCR方法可同时快速灵敏地鉴别非洲猪瘟、猪瘟野毒株和猪瘟兔化弱毒疫苗株病毒，且准确性、特异性和敏感性高，重复性好。

(3)本发明一方面采用了高拷贝的靶基因，一方面采用Taqman探针荧光定量PCR检测法，使得利用Taqman探针法荧光定量PCR检测的灵敏度约是普通PCR的100倍。

(4)由于采用定量检测技术-Taqman荧光定量PCR(Real-time PCR)，该方法(Real-time PCR)具有单孔封闭操作防污染、自动化程度高、特异性强、可实时监控等优点，有效地解决了传统方法只能终点检测的局限。

(5)超微量冻干微孔板技术相对于目前使用的荧光PCR检测技术，反应体系更小，仅1.2μL，常规的反应体系为20-25μL，所以超微量冻干微孔板技术可以节省RT-PCR扩增试剂以及样品的用量。

(6)超微量冻干微孔板较小的反应体系可以保证在PCR扩增过程中体系受热更加均匀，升降温速率更快。升温速率(10-12℃/S)相比目前采用的荧光PCR检测系统升降温速率(3-5℃/S)快。样本从采集到样处理及荧光PCR整个过程(包括加样)可在40分钟内完成，计算机自动报告结果，无需电泳及其他后续的工作，即方便了操作又减少了污染。

(7)超微量冻干微孔板可进行常温保存和运输，避免试剂反复冻融，检测结果更稳定。

本发明采用的实时荧光定量PCR技术(Real-time PCR)，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

本发明采用的超微量冻干微孔板是由硅胶或者铝盘形成的带有由保护膜覆盖的微反应器(微反应器的体积和质量取决于超微量冻干微孔板的类型)的反应区域。超微量冻干微孔板的反应区有一层矿物油覆盖。试剂穿过一层矿物油通过手动或者自动的带枪头的移液器注入至微反应器上，可避免检测样本的交叉污染和反应体系蒸发。

本发明将PCR反应试剂冻干在超微量冻干微孔板上，结合Taqman探针荧光定量PCR技术，核酸的分析是超微量冻干微孔板在热循环期间同时读取在每个反应器上由PCR产物产生的荧光信号。本发明采用的超微量冻干微孔板技术不同于目前常用的塑料PCR管作为载体盛载PCR反应体系进行PCR扩增，而是采用金属载体超微量冻干微孔板，反应体系及样本直接加到金属载体上进行PCR扩增。金属载体热传导效率和升降温速率更快，可大幅度缩短反应程序时间。具有反应体系小、自动化程度高、反应时间短、特异性强、敏感性高、重复性强、反应试剂不需低温保存、可进行定量检测及超微量冻干微孔板操作污染可能性小等特点。本发明产品可在反应条件一致的情况下快速鉴定并可区分猪瘟野毒株和猪瘟兔化弱毒疫苗株病毒，操作简单，从样本处理到结果分析可在1个小时内完成。

综上，由于采用了以上技术方案，本发明通过设计特异性引物和探针并优化超微量冻干微孔板冻干条件结合免提取得样本处理液，发展了能够快速、有效地鉴别非洲猪瘟、猪瘟野毒株和猪瘟兔化弱毒疫苗株病毒的超微量冻干微孔板荧光定量PCR的反应体系，同时制备了基于该方法的检测试剂盒。本发明通过大量实验验证，本发明的引物探针/试剂盒/检测方法比常规方法准确性更高、特异性优良，同时最低检出限可达10拷贝的DNA分子含量，说明敏感性非常高，同时所述检测试剂盒批内变异系数在0.37％-1.20％之间，批间变异系数在0.27％-1.88％之间，说明重复性良好。

附图说明

图1是超微量冻干微孔板荧光RT-PCR检测非洲猪瘟病毒的特异性检测。图中，1：非洲猪瘟病毒；2：猪瘟野毒株病毒；3：猪瘟兔化弱毒疫苗株；4：猪蓝耳病毒；5：猪传染性胃肠炎病毒；6：流行性腹泻病毒；7：轮状病毒；8：猪流感病毒；9：猪圆环；10：猪细小；11：猪伪狂犬核酸；12：无核酸酶水。

图2是超微量冻干微孔板荧光RT-PCR检测猪瘟野毒株病毒的特异性检测。图中，1：猪瘟野毒株病毒；2：非洲猪瘟病毒；3：猪瘟兔化弱毒疫苗株；4：猪蓝耳病毒；5：猪传染性胃肠炎病毒；6：流行性腹泻病毒；7：轮状病毒；8：猪流感病毒；9：猪圆环；10：猪细小；11：猪伪狂犬核酸；12：无核酸酶水。

图3是超微量冻干微孔板荧光RT-PCR检测猪瘟兔化弱毒疫苗株病毒的特异性检测。。图中，1：猪瘟兔化弱毒疫苗株；2：非洲猪瘟病毒；3：猪瘟野毒株病毒；4：猪蓝耳病毒；5：猪传染性胃肠炎病毒；6：流行性腹泻病毒；7：轮状病毒；8：猪流感病毒；9：猪圆环；10：猪细小；11：猪伪狂犬核酸；12：无核酸酶水。

图4是超微量冻干微孔板荧光RT-PCR试剂检测非洲猪瘟病毒敏感性结果。图中，A：1×10⁶拷贝；B：1×10⁵拷贝；C：1×10⁴拷贝；D：1×10³拷贝；E：1×10²拷贝；F：1×10¹拷贝；G:1×10⁰拷贝；H:无核酸酶水。

图5是超微量冻干微孔板荧光RT-PCR试剂检测非洲猪瘟病毒标准曲线结果。

具体实施方式

为了能够更清楚了解本发明的技术手段，以下结合附图与具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均为分析纯级试剂，且可从正规渠道商购获得。

生物材料的来源或记载出处

本发明实验例使用的非洲猪瘟病毒，猪瘟野毒株和猪瘟兔化弱毒疫苗株均为标准灭活毒株，均由中国动物疫病预防控制中心保存。

第1组实施例：本发明的超微量冻干微孔板

本组实施例提供一种用于鉴别非洲猪瘟病毒、猪瘟野毒株与猪瘟兔化弱毒疫苗株的免提取超微量冻干微孔板，其特征在于，用于鉴别非洲猪瘟病毒、猪瘟野毒株与猪瘟兔化弱毒疫苗株的荧光PCR反应体系通过冻干被固定在所述超微量冻干微孔板上；

所述荧光PCR反应体系包括：下述引物和探针：

非洲猪瘟上游引物：5＇-CAAATCATGAATGTTGCATAGGAAG-3＇，

非洲猪瘟下游引物：5＇-AAATTTTGCATCCCAGGGGATA-3＇，

非洲猪瘟Taqman探针序列：5＇-CCACTAGTTCCCTCCACCGATACCTCCTG-3＇；

猪瘟病毒野毒株上游引物：5＇-CATGGGCCCGGTCTACC-3＇，

猪瘟病毒野毒株下游引物：5＇-TCCGTCACTACCTGTCACC-3＇，

猪瘟病毒野毒株Taqman探针序列：

5＇-AGAGTTTTTCAATGAGACGCAGTTTTGTGAGGT-3＇；

猪瘟兔化疫苗上游引物：5＇-CATGGGCCCGGTCTACC-3＇，

猪瘟兔化疫苗下游引物：5＇-TCCGTCGCTACCTGTCACC-3＇，

猪瘟兔化疫苗Taqman探针序列：

5＇-TTTTGACGAAGTGCAGTTCTGCGAGGT-3＇。

在本文中，“非洲猪瘟”、“非洲猪瘟病毒”均指非洲猪瘟病毒，“猪瘟野毒株”包含目前已经报道的所有类别和亚型的猪瘟野毒株，“猪瘟兔化疫苗株”、“猪瘟兔化疫苗”、“猪瘟兔化弱毒疫苗株”均指猪瘟兔化弱毒疫苗株，并包含目前已经报道的所有类别和亚型的猪瘟兔化弱毒疫苗株。如无特殊说明，上述各术语具备本领域技术人员通常理解的常规含义。

在具体的实施例中，所述荧光PCR反应体系还包括：Taq酶、反转录酶、海藻糖、Tris-Cl、dNTP、Mg²⁺；

优先地，所述非洲猪瘟、猪瘟野毒株和猪瘟兔化弱毒疫苗株的Taqman探针的5`端标记有荧光报告基团；3`端标记有荧光淬灭基团。

在更具体的实施例中，所述荧光PCR反应体系包括：上游引物0.4μM；下游引物0.4μM；Taqman探针0.4μM；DNA聚合酶0.5U/μL；反转录酶0.5U/μL；dNTP 0.3mM；Mg²⁺3mM；海藻糖5μM；Tris-Cl 5mM，其余为灭菌去离子水；

上述这些成分的终浓度，既是冻干前荧光PCR反应体系的终浓度，也是冻干后，加样0.6uL并加入0.6μL 2×稀释液后的终浓度。

冻干前配制的荧光PCR反应体系，每孔体积为1.2μL。

所述免提取样本处理液，具体为100mmo l/L Tris-HCl、1.4mo l/L NaCl、1.5mmol/L MgCl2，1mmo l/L BSA，0.5％NP-40，2％SDS，4％Triton。

优先地，所述非洲猪瘟和猪瘟野毒株的Taqman探针的5`端标记的荧光报告基团为FAM荧光报告基团；

所述猪瘟兔化弱毒疫苗株的Taqman探针的5`端标记的荧光报告基团为ROX荧光报告基团；

所述猪瘟野毒株和猪瘟兔化弱毒疫苗株的Taqman探针3`端标记的荧光淬灭基团为TAMARA淬灭基团。

在一些实施例中，所述超微量冻干微孔板上设置有若干个加样孔；所述荧光PCR反应体系通过冻干被固定在所述加样孔内；

优选地，所述超微量冻干微孔板上的加样孔为30个；所述超微量冻干微孔板的结构与PCR仪的加样板结构相适配。所述超微量冻干微孔板的结构类似于一块PCR板，但本发明的超微量冻干微孔板是无盖的，需使用矿物油进行加样孔的封闭，在加样时候不容易串孔，不容易污染。因此不会出现PCR体系流动溢出或者串孔污染现象。

在另一些实施例中，所述冻干包括如下步骤：将装有所述荧光PCR反应体系的超微量冻干微孔板置于-80℃冷冻1h后再进行设备冻干；

将装有所述荧光PCR反应体系的超微量冻干微孔板先置于-80℃冷冻1h的目的是预冷冻，使第一步预冻阶段时，体系能保持固体状态，并且这一步还可以缩短干燥时间。

设备冻干指的是在专门的冻干设备中通过设定设备的工作条件来进行冻干；优选地，所述冻干设备指真空冷冻干燥机。

优选地，所述设备冻干包括：预冻阶段，隔板温度下降到-55℃，预冻时保持时间为1h，然后设备进行抽真空，保持冷冻干燥1h；解析干燥阶段，再将隔板温度升至-25℃保持1h，然后将隔板温度升至37℃并保持2h，最后将隔板降至25℃并保持1h。

所述隔板温度指冷冻干燥机内的托盘隔板的温度，需要在所述托盘隔板上放置装有所述荧光PCR反应体系的超微量冻干微孔板；预冻阶段这一步的作用在于使荧光PCR反应体系能保持固体状态。“对设备抽真空，保持冷冻干燥1h”这一步的主要目的是真空冷冻干燥机，需要把内部空气抽干，使固体中的水分升华，从而达到冻干效果。接下来的2步“将隔板温度升至-25℃保持1h”和“将隔板温度升至37℃并保持2h”均为了保持干燥升华过程；最后“将隔板降至25℃并保持1h”的作用是将冻干成品在25℃并保持稳定，至此，基本完成了整个冻干过程。

上述“设备冻干”过程是本发明针对装有所述荧光PCR反应体系的超微量冻干微孔板独创的一套冻干工艺。由于冻干试剂共晶点不同，需要进行分别测定，而且干燥过程中的升温时间、干燥时间中的干燥时间需要进行优化。冻干试剂里面的组分对共晶点的影响都需要调整试剂组分浓度来摸索。特别是反应体系里的酶，在常温长时间放置，酶的活性是会降低的，需要加入保护剂和稳定剂组分，例如海藻糖5μM；Tris-Cl 5mM，而且其浓度对PCR反应是否有抑制需要通过实验验证和调整，才能保证超微量冻干微孔板用来进行荧光PCR检测时获得本发明记载的优良的高灵敏度、高重复性、高准确性、高特异性等优异效果。另外，还需要同时兼顾冻干工艺冻干后使用稀释液的复溶效果，这也需要经过调整冻干工艺的才能使超微量冻干微孔板的达到最终的本发明的检测方法获得的高灵敏度、高重复性、高准确性、高特异性等优异效果。

本领域技术人员可根据本发明的公开，合成所述引物，将它们用来定性或定量检测非洲猪瘟、猪瘟野毒株和猪瘟兔化弱毒疫苗株病毒，能获得如本发明所述的预期效果，因此任何基于商业目的合成的引物，并将其放入标有“检测非洲猪瘟、猪瘟野毒株和猪瘟兔化弱毒疫苗株病毒”用途的商品包装盒内的行为，或采用上述序列的引物用于商业检测非洲猪瘟、猪瘟野毒株和猪瘟兔化弱毒疫苗株病毒的行为，均落入本发明请求保护的范围。

第2组实施例：本发明的试剂盒

本组实施例提供一种用于鉴别非洲猪瘟病毒、猪瘟野毒株与猪瘟兔化弱毒疫苗株的试剂盒，包括第1组实施例任一项所述的超微量冻干微孔板。

在进一步的实施例中，所述试剂盒还包括：免提取样本处理液，稀释液。

所述免提取样本处理液，具体为100mmol/L Tris-HCl、1.4mol/L NaCl、1.5mmol/LMgCl₂，1mmol/L BSA，0.5％NP-40，2％SDS，4％Triton。

所述样本可以选自：猪组织液、猪血液、猪淋巴液、猪尿液、猪器官组织、猪肉组织等。

所述稀释液，用于滴入超微量冻干微孔板的加样孔中，再将超微量冻干微孔板置于荧光PCR仪上进行荧光PCR扩增。具体为PCR 10×buffer，具体成分不含Mg²⁺，含500mMKCl，100mM Tris-HCl，0.1％明胶，该稀释液可商购获得。在使用时，需使用无核酸酶水将该稀释液稀释成2×buffer，在超微量冻干微孔板的每孔内加入0.6μL。

在更进一步的实施例中，所述试剂盒还包括：矿物油，用于对所述超微量冻干微孔板上的加样孔进行封闭，由于体系非常微量，不封油很容易风干，封油相当于盖住PCR管的管盖，使样本不容易污染。

阳性对照，具体为非洲猪瘟VP72合成质粒、猪瘟野毒株和猪瘟兔化弱毒疫苗株基因组cDNA混合物；

阴性对照，具体为无核酸酶水。

在具体的实施例中，所述探针的核苷酸序列的3＇端标记TAMARA淬灭基团，5＇端标记FAM或ROX荧光报告基团。上述“TAMARA”、“FAM”和“ROX”基团均为本领域常见的荧光基团，本领域技术人员还可以选用其它本领域常见的荧光淬灭基团和荧光报告基团来替换本文的“TAMARA”、“FAM”和“ROX”，例如，常见的荧光淬灭基团还包括：BHQ-1、BHQ-2、Dabcyl 2；常见的荧光报告基团还可以选自：TET、HEX、5-TAMRA、Texas Red-X、Cy3(TYETM 563)、Cy5(TYETM 665)、JOE。

在进一步的实施例中，所述试剂盒还包括用于进行荧光定量PCR检测的YSQ30超微量冻干微孔板及常规试剂。

所述超微量冻干微孔板试剂还包括DNA聚合酶、反转录酶、dNTP、Mg²⁺、海藻糖、Tris-Cl。

在优选的实施例中，所述常规试剂包括DNA聚合酶、反转录酶、dNTP、Mg²⁺、海藻糖、Tris-Cl；和/或，包括所述矿物油、稀释液、无核酸酶水在内的商品化分子试剂；

在进一步优选的实施例中，所述商品化稀释液为10×buffer(不含Mg²⁺)，使用无核酸酶水稀释为2×buffer。本领域商品化的DNA聚合酶、反转录酶、dNTP、10×buffer还有多种，本领域技术人员可以选用其它品牌和其它类型的分子试剂。

第3组实施例：本发明的检测方法

本组实施例提供一种用于鉴别非洲猪瘟、猪瘟野毒株和猪瘟兔化弱毒疫苗株的免提取超微量冻干微孔板荧光RT-PCR检测方法。本组所有实施例都具有如下特征：所述方法包括：采用第1组实施例任一所述的超微量冻干微孔板，和/或，第2组实施例任一所述的试剂盒对待测样品进行荧光PCR扩增。

在一些实施例中，血液样本需加入至样本处理液中，振荡混匀，组织样本需加入至样本处理液中进行组织研磨，经1000rpm高速离心1min后，取上清作为样本。

优选地，在超微量冻干微孔板的加样孔中加入待测样品及稀释液后，将超微量冻干微孔板置于荧光PCR仪上进行所述荧光PCR扩增；

优选地，所述稀释液2×buffer的加入量为0.6μL，阳性对照、阴性对照或样本的加入量为0.6μL；

进一步优选地，所述荧光PCR扩增的反应程序为：50℃10min；95℃1min；以95℃5s，60℃15s为1个循环，进行40个循环，每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。

在一些实施例中，所述检测指荧光定量PCR检测；所述非洲猪瘟、猪瘟野毒株和猪瘟兔化弱毒疫苗株的超微量冻干微孔板包括：上游引物0.4μM；下游引物0.4μM；Taqman探针0.4μM；DNA聚合酶0.5U/μL；反转录酶0.5U/μL；dNTP 0.3mM；Mg²⁺3mM；海藻糖5μM；Tris-Cl5mM；余量为灭菌去离子水，总体积为36μL，每孔体积为1.2μL。

所述荧光定量PCR的超微量冻干微孔板的整个超微量冻干微孔板上样孔为30个，将上述荧光定量PCR 2套体系，1套包含非洲猪瘟1套引物探针，加入到15个孔内，每孔加入1.2μL。另1套猪瘟野毒株和猪瘟兔化弱毒疫苗株2套引物探针)，加入到15个孔内，每孔加入1.2μL。

在一些实施例中，所述冻干条件为荧光定量PCR的超微量冻干微孔板先于-80℃冷冻1h。设备冻干条件为：预冻阶段，隔板温度下降到-55℃，预冻时保持时间为1h，然后设备进行抽真空，保持冷冻干燥1h；解析干燥阶段，再将隔板温度升至-25℃保持1h，然后将隔板温度升至37℃并保持2h，最后将隔板降至25℃并保持1h。

在进一步的实施例中，所述荧光定量PCR的反应程序包括：50℃10min，为第一步循环；95℃1min，为第二步循环；95℃5s，60℃15s，为第三步40个循环，所述第三步每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。

实验例1用于鉴别非洲猪瘟、猪瘟野毒株与猪瘟兔化弱毒疫苗株病毒超微量冻干 微孔板荧光RT-PCR检测试剂盒特异性验证

1、设计引物和Taqman探针

根据国内已发现检测非洲猪瘟、猪瘟野毒株和猪瘟兔化弱毒疫苗株病毒，找出非洲猪瘟、猪瘟野毒株和猪瘟兔化弱毒疫苗株病毒基因的特异性保守序列，并设计多对引物和探针。经过比对筛选，最终各确定一组最佳引物和一条Taqman探针。

非洲猪瘟上游引物：5＇-CAAATCATGAATGTTGCATAGGAAG-3＇，

非洲猪瘟下游引物：5＇-AAATTTTGCATCCCAGGGGATA-3＇，

非洲猪瘟Taqman探针序列：

5＇FAM-CCACTAGTTCCCTCCACCGATACCTCCTG-TAMARA3＇；

猪瘟病毒野毒株上游引物：5＇-CATGGGCCCGGTCTACC-3＇，

猪瘟病毒野毒株下游引物：5＇-TCCGTCACTACCTGTCACC-3＇，

猪瘟病毒野毒株Taqman探针序列：

5＇FAM-AGAGTTTTTCAATGAGACGCAGTTTTGTGAGGT-TAMARA3＇；

猪瘟兔化疫苗上游引物：5＇-CATGGGCCCGGTCTACC-3＇，

猪瘟兔化疫苗下游引物：5＇-TCCGTCGCTACCTGTCACC-3＇，

猪瘟兔化疫苗Taqman探针序列：

5＇ROX-TTTTGACGAAGTGCAGTTCTGCGAGGT-3TAMARA＇。

其中非洲猪瘟和猪瘟野毒株Taqman探针的核苷酸序列的5＇端标记FAM荧光报告基团；猪瘟兔化弱毒疫苗株Taqman探针的核苷酸序列的5＇端标记ROX荧光报告基团。3＇端标记TAMARA淬灭荧光基团。淬灭荧光基团选择TAMARA的原因在于，Taqman探针与传统的TaqMan-TAMRA探针比较具有以下优势：(1)提高TM值--平均15bases可提高18℃，这样可以使探针的长度缩短，尤其对AT含量高的序列设计有很大的帮助，并且提高配对与非配对模板间的TM值差异。(2)提高信噪比--由于在探针的3＇端的淬灭基团为不发光的荧光基团，并且与报告基团在空间的位置更接近，实验结果更精确，分辨率更高。

2、样本前处理

利用总RNA提取试剂盒(北京亿森宝生物科技有限公司，货号EAR002)提取猪蓝耳病毒、猪传染性胃肠炎病毒、流行性腹泻病毒、轮状病毒、猪流感病毒基因组RNA。利用总DNA提取试剂盒(北京亿森宝生物科技有限公司，货号EAD001)提取猪圆环、猪细小、猪伪狂犬基因组DNA。非洲猪瘟血液样本和猪瘟兔化疫苗需加入至样本处理液中，振荡混匀。猪瘟野毒株组织样本需加入至样本处理液中进行组织研磨，经1000rpm高速离心1min后，取上清作为样本。放置于-20℃备用。

3、超微量冻干微孔板制备

按照如下反应体系进行超微量冻干微孔板RT-PCR体系配制：

荧光定量PCR的YSQ30超微量冻干微孔板(北京亿森宝生物科技有限公司)的整个超微量冻干微孔板上样孔为30个，将上述荧光定量PCR体系(包含非洲猪瘟1套引物探针)分别加入15孔内，每孔加入1.2μL。

荧光定量PCR的YSQ30超微量冻干微孔板(北京亿森宝生物科技有限公司)的整个超微量冻干微孔板上样孔为30个，将上述荧光定量PCR体系(包含猪瘟野毒株和猪瘟兔化弱毒疫苗株2套引物探针)分别加入15孔内，每孔加入1.2μL。

将包被有PCR试剂的超微量冻干微孔板先于-80℃冷冻1h。设备冻干条件为：预冻阶段，隔板温度下降到-55℃，预冻时保持时间为1h，然后设备进行抽真空，保持冷冻干燥1h；解析干燥阶段，再将隔板温度升至-25℃保持1h，然后将隔板温度升至37℃并保持2h，最后将隔板降至25℃并保持1h。

4、超微量冻干微孔板特异性验证

将10×buffer稀释液加入24μL无核酸酶水振荡混匀后，每孔加入0.6μL，在超微量冻干微孔板表面加入600μL矿物油，待其覆盖所有上样孔后。再分别加入0.6μL非洲猪瘟、猪瘟野毒株病毒、猪瘟兔化弱毒疫苗株、猪蓝耳病毒、猪传染性胃肠炎病毒、流行性腹泻病毒、轮状病毒、猪流感病毒、猪圆环、猪细小、猪伪狂犬等病毒培养液经本发明免提取样本处理液处理后得到的液体产物，或它们的核酸提取物，最后一孔加入0.6μL无核酸酶水作为阴性对照。

所述处理指将所述免提取样本处理液与所述病毒液进行混合。

超微量冻干微孔板荧光RT-PCR反应条件如下：50℃10min，为第一步循环；95℃1min，为第二步循环；95℃5s，60℃15s，为第三步40个循环，所述第三步每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。

实验结果如图，超微量冻干微孔板包被的是非洲猪瘟荧光PCR试剂及猪瘟野毒株和猪瘟兔化弱毒疫苗株双重荧光RT-PCR试剂，图1结果显示非洲猪瘟病毒通道检测非洲猪瘟病毒DNA为阳性扩增，Ct值为17.32，有扩增曲线。猪瘟野毒株、猪瘟兔化弱毒疫苗株、猪蓝耳病毒、猪传染性胃肠炎病毒、流行性腹泻病毒、轮状病毒、猪流感病毒、猪圆环、猪细小、猪伪狂犬以及阴性对照样品无非特异性扩增。图2结果显示猪瘟野毒株病毒通道检测猪瘟野毒株病毒RNA为阳性扩增，Ct值为18.97，有扩增曲线。非洲猪瘟病毒、猪瘟兔化弱毒疫苗株、猪蓝耳病毒、猪传染性胃肠炎病毒、流行性腹泻病毒、轮状病毒、猪流感病毒、猪圆环、猪细小、猪伪狂犬以及阴性对照样品无非特异性扩增。图3结果显示，猪瘟兔化弱毒疫苗株通道检测猪瘟兔化弱毒疫苗株RNA为阳性扩增，Ct值为22.87，有扩增曲线。非洲猪瘟病毒、猪瘟野毒株病毒、猪蓝耳病毒、猪传染性胃肠炎病毒、流行性腹泻病毒、轮状病毒、猪流感病毒、猪圆环、猪细小、猪伪狂犬以及阴性对照样品无非特异性扩增。所得结果与预期完全吻合。从所有样本的扩增曲线上可以看到，在扩增的前期，特别是在荧光临界值(threshold)附近，曲线重合性较好。

实验例2、用于鉴别非洲猪瘟、猪瘟野毒株与猪瘟兔化弱毒疫苗株病毒超微量冻干 微孔板荧光RT-PCR检测试剂盒敏感性验证

将浓度为1×10⁷拷贝的非洲猪瘟VP72合成质粒进行10倍梯度稀释作为模板，无核酸酶水作为阴性对照，进行超微量冻干微孔板荧光RT-PCR试剂敏感性检测。

超微量冻干微孔板荧光RT-PCR体系按实施例1进行制备，将10×buffer稀释液加入24μL无核酸酶水振荡混匀后，每孔加入0.6μL，在超微量冻干微孔板表面加入600μL矿物油，待其覆盖所有上样孔后。在孔中分别加入1×10⁶拷贝～1×10⁰拷贝各梯度浓度非洲猪瘟病毒的VP72合成质粒，最后1孔加入0.6μL无核酸酶水作为阴性对照。

超微量冻干微孔板荧光RT-PCR反应条件如下：50℃10min，为第一步循环；95℃1min，为第二步循环；95℃5s，60℃15s，为第三步40个循环，所述第三步每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。

图4结果显示，超微量冻干微孔板荧光RT-PCR，最低检测样本浓度为1×10¹拷贝的DNA分子，Ct值为37.12，因此反应循环数40可大大满足最低检测要求。从不同浓度起始模板的扩增曲线可以看出，曲线基线平整，指数区明显，斜率较大，这些均说明在该条件下模板的扩增是较为理想的。由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用Ct值和模板其实浓度制作标准曲线，列出线性关系方程。图5结果显示，超微量冻干微孔板荧光RT-PCR扩增效率为90.33％，超微量冻干微孔板荧光RT-PCR扩增效率高。超微量冻干微孔板荧光RT-PCR的相关系数均为0.9985，所以超微量冻干微孔板荧光RT-PCR的相关性很好。超微量冻干微孔板荧光RT-PCR反应体系为1.2μL，常规荧RT-PCR体系为25μL，超微量冻干微孔板荧光RT-PCR反应体系缩小了20多倍。超微量冻干微孔板荧光RT-PCR反应运行时间不到40分钟，常规荧光RT-PCR反应时间为120分钟，运行时间缩短2/3。

实验例3：用于鉴别非洲猪瘟、猪瘟野毒株与猪瘟兔化弱毒疫苗株病毒超微量冻干 微孔板荧光RT-PCR检测试剂盒的制备及检测

1、试剂盒的制备：

超微量冻干微孔板荧光RT-PCR体系按实施例1进行制备。

试剂1：稀释液Taq Buffer(10×)(Thermo Scientific，货号B650060)，30μL；

试剂2：矿物油(Sangon Biotech，货号A630217)1mL；

试剂3：阳性对照(非洲猪瘟VP72合成质粒、猪瘟兔化弱毒疫苗株、猪瘟野毒株病毒基因组cDNA混合物)30μL；

试剂4：阴性对照(无核酸酶)30μL；

试剂5：无核酸酶水50μL。

试剂6：样本处理液30mL。

2、试剂盒的重复性分析

选取3个已知阳性的样品，分别进行批内重复检测和批间重复检测。批内重复检测：将3个已知阳性样品在同一批实验中进行，每个样品设置3个重复。批间重复实验：将3个已知阳性样品分批次检测，每个样品单独检测，每个样品设置3个重复。

每孔超微量冻干微孔板荧光RT-PCR反应体系为1.2μL：试剂1使用前需吸取24μL试剂5加入试剂1内振荡混匀后，每孔加入0.6μL。在超微量冻干微孔板表面加入600μL试剂2，待其覆盖所有上样孔后。每孔再分别加入阳性样品、试剂3(阳性对照)或试剂4(阴性对照)各0.6μL。

超微量冻干微孔板荧光RT-PCR反应条件如下：50℃10min，为第一步循环；95℃1min，为第二步循环；95℃5s，60℃15s，为第三步40个循环，所述第三步每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测，并记录实验结果。

从表1中的检测结果可以看出，批内变异系数在0.37％～1.20％之间，批间变异系数在0.27％～1.88％之间，说明本试剂盒重复性良好。

表1试剂盒重复性分析

由于采用了以上技术方案，本发明通过设计特异性引物和探针并优化超微量冻干微孔板冻干条件结合免提取样本处理液，发展了能够快速、有效地鉴别非洲猪瘟、猪瘟野毒株和猪瘟兔化弱毒疫苗株病毒的超微量冻干微孔板荧光定量PCR检测的反应体系，同时制备了基于该方法的检测试剂盒，所述检测方法特异性和敏感性高，所述检测试剂盒重复性好。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，本领域技术人员利用上述揭示的技术内容做出些许简单修改、等同变化或修饰，均落在本发明的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京亿森宝生物科技有限公司

<120> 用于鉴别非洲猪瘟病毒、猪瘟野毒株与猪瘟兔化弱毒疫苗株的冻干微孔板、试剂盒及方法

<130> P180882/YSB

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 非洲猪瘟上游引物

<400> 1

caaatcatga atgttgcata ggaag 25

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 非洲猪瘟下游引物

<400> 2

aaattttgca tcccagggga ta 22

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 非洲猪瘟Taqman探针序列

<400> 3

ccactagttc cctccaccga tacctcctg 29

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 猪瘟病毒野毒株上游引物

<400> 4

catgggcccg gtctacc 17

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 猪瘟病毒野毒株下游引物

<400> 5

tccgtcacta cctgtcacc 19

<210> 6

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 猪瘟病毒野毒株Taqman探针序列

<400> 6

agagtttttc aatgagacgc agttttgtga ggt 33

<210> 7

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 猪瘟兔化疫苗上游引物

<400> 7

catgggcccg gtctacc 17

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 猪瘟兔化疫苗下游引物

<400> 8

tccgtcgcta cctgtcacc 19

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 猪瘟兔化疫苗Taqman探针序列

<400> 9

ttttgacgaa gtgcagttct gcgaggt 27

Claims (10)

1.用于鉴别非洲猪瘟病毒、猪瘟兔化疫苗与猪瘟病毒野毒株的免提取超微量冻干微孔板，其特征在于，用于鉴别非洲猪瘟、猪瘟兔化疫苗与猪瘟病毒野毒株的荧光PCR反应体系通过冻干被固定在所述超微量冻干微孔板上；

所述荧光PCR反应体系包括：下述引物和探针：

非洲猪瘟上游引物：5＇-CAAATCATGAATGTTGCATAGGAAG-3＇，

非洲猪瘟下游引物：5＇-AAATTTTGCATCCCAGGGGATA-3＇，

非洲猪瘟Taqman探针序列：5＇-CCACTAGTTCCCTCCACCGATACCTCCTG-3＇；

猪瘟病毒野毒株上游引物：5＇-CATGGGCCCGGTCTACC-3＇，

猪瘟病毒野毒株下游引物：5＇-TCCGTCACTACCTGTCACC-3＇，

猪瘟病毒野毒株Taqman探针序列：

5＇-AGAGTTTTTCAATGAGACGCAGTTTTGTGAGGT-3＇；

猪瘟兔化疫苗上游引物：5＇-CATGGGCCCGGTCTACC-3＇，

猪瘟兔化疫苗下游引物：5＇-TCCGTCGCTACCTGTCACC-3＇，

猪瘟兔化疫苗Taqman探针序列：5＇-TTTTGACGAAGTGCAGTTCTGCGAGGT-3＇。

2.根据权利要求1所述的超微量冻干微孔板，其特征在于，所述荧光PCR反应体系还包括：Taq酶、反转录酶、海藻糖、Tris-Cl、dNTP、Mg²⁺；

优先地，所述非洲猪瘟、猪瘟野毒株和猪瘟兔化弱毒疫苗株的Taqman探针的5`端标记有荧光报告基团；3`端标记有荧光淬灭基团。

3.根据权利要求1或2所述的超微量冻干微孔板，其特征在于，所述荧光PCR反应体系包括：上游引物0.4μM；下游引物0.4μM；Taqman探针0.4μM；DNA聚合酶0.5U/μL；反转录酶0.5U/μL；dNTP 0.3mM；Mg²⁺3mM；海藻糖5μM；Tris-Cl 5mM，其余为灭菌去离子水，总体积为36μL，每孔体积为1.2μL；

优先地，所述非洲猪瘟和猪瘟野毒株的Taqman探针的5`端标记的荧光报告基团为FAM荧光报告基团；

所述猪瘟兔化弱毒疫苗株的Taqman探针的5`端标记的荧光报告基团为ROX荧光报告基团；

所述非洲猪瘟、猪瘟野毒株和猪瘟兔化弱毒疫苗株的Taqman探针3`端标记的荧光淬灭基团为TAMARA淬灭基团。

4.根据权利要求1-3任一所述的超微量冻干微孔板，其特征在于，所述超微量冻干微孔板上设置有若干个加样孔；所述荧光PCR反应体系通过冻干被固定在所述加样孔内；

优选地，所述超微量冻干微孔板上的加样孔为30个；所述超微量冻干微孔板的结构与PCR仪的加样板结构相适配。

5.根据权利要求1-4任一所述的超微量冻干微孔板，其特征在于，所述冻干包括如下步骤：将装有所述荧光PCR反应体系的超微量冻干微孔板置于-80℃冷冻1h后再进行设备冻干；

优选地，所述设备冻干包括：预冻阶段，隔板温度下降到-55℃，预冻时保持时间为1h，然后设备进行抽真空，保持冷冻干燥1h；解析干燥阶段，再将隔板温度升至-25℃保持1h，然后将隔板温度升至37℃并保持2h，最后将隔板降至25℃并保持1h。

6.用于鉴别非洲猪瘟病毒、猪瘟野毒株与猪瘟兔化弱毒疫苗株的试剂盒，包括权利要求1-5任一所述的超微量冻干微孔板。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，还包括：稀释液，10×稀释液使用无核酸酶水稀释成2×稀释液用于滴入超微量冻干微孔板的加样孔中，再将超微量冻干微孔板置于荧光PCR仪上进行荧光PCR扩增。

8.根据权利要求6或7所述的试剂盒，还包括：

免提取样本处理液，具体为100mmol/L Tris-HCl、1.4mol/L NaCl、1.5mmol/L MgCl₂，1mmol/L BSA，0.5％NP-40，2％SDS，4％Triton；

矿物油，封闭所述超微量冻干微孔板上的加样孔；

阳性对照，具体为非洲猪瘟DNA及猪瘟野毒株和猪瘟兔化弱毒疫苗株基因组cDNA混合物；

阴性对照，具体为无核酸酶水。

9.用于鉴别非洲猪瘟病毒、猪瘟野毒株与猪瘟兔化弱毒疫苗株的方法，其特征在于，采用权利要求1-5任一所述的超微量冻干微孔板，和/或，权利要求6-8任一所述的试剂盒对待测样品进行荧光PCR扩增。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，在超微量冻干微孔板的加样孔中加入待测样品及稀释液后，将超微量冻干微孔板置于荧光PCR仪上进行所述荧光PCR扩增；

优选地，所述稀释液为10×buffer；

进一步优选地，所述荧光PCR扩增的反应程序为：50℃10min；95℃1min；以95℃5s，60℃15s为1个循环，进行40个循环，每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。

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