CN112899408A - 一种非洲猪瘟病毒的荧光pcr检测试剂 - Google Patents

一种非洲猪瘟病毒的荧光pcr检测试剂 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种非洲猪瘟病毒的荧光PCR检测试剂。所述的非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂为冻干型，可常温保存和运输，避免了常规液体荧光PCR检测试剂因保存温度变化或反复冻融而失效的风险，能适应地理位置偏远、冷链条件较差的用户的使用需要；非洲猪瘟病毒冻干型荧光PCR检测试剂中的引物、探针序列是基于最新的非洲猪瘟病毒核酸序列信息设计筛选所得，具有良好的包容性、特异性和反应性能，所用的反应程序能实现快速检测。

Description

一种非洲猪瘟病毒的荧光PCR检测试剂
技术领域
本发明涉及动物病原微生物的检测技术，具体地说涉及非洲猪瘟病毒的核酸检测试剂和方法。
背景技术
非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)感染猪及野猪引起的一种急性、热性、高度接触性传染病。临床症状以高热、皮肤充血、内脏器官广泛出血、病程短、死亡率高(可达100％)以及呼吸系统和神经系统功能改变为主要特征，是目前对世界养猪业危害最严重的烈性传染病之一。非洲猪瘟自1921由肯尼亚首次报道后已蔓延世界各地。非洲猪瘟于2018年首次发现传入我国，随后引发严重的非洲猪瘟疫情，对养殖业造成了重大损失。该病是世界动物卫生组织(OIE)的法定报告动物疫病，我国农业部将其列为一类动物疫病。
ASFV是一种有囊膜的单分子线状双链DNA病毒，属于非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)、非洲猪瘟病毒属(Asfivirus)，是该属的唯一已知物种。ASFV基因组为线性双链DNA，大小约为170～193kb。整个基因组含151～167个开放阅读框架，可以编码150～200种蛋白质。基因组中段有125kb左右的保守区，两端为可变区，含有末端反转重复序列，这些重复序列的增加或者缺失是造成不同分离株基因组长度差异的主要原因。
非洲猪瘟的主要传播途径有：(1)虫媒传播：ASFV是目前已知唯一的虫媒DNA病毒，蜱类是ASFV的天然宿主，非洲猪瘟可通过携带ASFV的蜱(主要是软体蜱科(Argasidae)下钝缘蜱属(Ornithodoros)的软壁虱)经叮咬猪和野猪直接传播；(2)污染的饲料传播：受ASFV污染的潲水、剩菜或肉屑经由食物传染给了生猪；(3)物体传播：ASFV附着的物体通过车辆、人员、工具、衣物等在不同养殖场之间传播。(4)猪只之间传播：非洲猪瘟病猪的组织器官、体液、分泌物、排泄物中含有高滴度的ASFV，经接触可传播非洲猪瘟。非洲猪瘟病毒在感染猪后侵入血流并通过血细胞而散播至全身，在冻肉内可以存活15周,在骨髓中达6个月，因此，隐性感染猪只和被ASFV污染的猪肉制品是非洲猪瘟向健康猪群的重要传播媒介。
目前对ASFV的检测和诊断方法主要有疫学检测和核酸检测两大类。免疫学方法可以了解疾病发生、发展的进程，但免疫学检测有一定的空窗期，在疫情防控方面存在局限性；基于荧光PCR的核酸检测方法可以检测出各种样本(血液、粪便、分泌物、组织器官切片)中ASFV的DNA，从而实现早期诊断，在ASFV的诊断和防控中具有重要作用。一般荧光PCR检测试剂均为液体试剂，有严格的冷链要求，需要在-20℃以下保存才能保持检测活性，保存、运输和使用过程中的温度升高、反复冻融都会降低试剂的检测性能。对地理位置偏远、冷链条件较差的农村和基层养殖场、屠宰场和检测机构来说，液体试剂的冷链是个巨大的风险，这些用户更需要一种快速、可靠，且可常温保存的ASFV荧光PCR检测试剂。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速、可靠，且可常温保存的ASFV荧光PCR检测试剂。
本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案来实现：
1.引物和探针的设计及反应体系
为从设计上提高准确性，本发明中用于检测非洲猪瘟病毒核酸的荧光PCR引物探针组合是基于GenBank数据库最新的ASFV核酸序列信息设计、筛选而得出。其核酸序列如下：
正向引物：5’-CGTTAATATGACCACTGGGTTGG-3’；
反向引物：5’-CCTTCCACTACGGAGGCAAT-3’；
探针：5’-CCGTGGCTTCAAAGCAAAGGTAATCATCA-3’。
该引物、探针的序列在已知ASFV的核酸序列中高度保守，且对其它物种具有排他性，从而最大可能地防止了漏检和错检。探针的5’端用荧光报告基团修饰，3’端用荧光淬灭修饰。报告荧光基团优选FAM，还可以选用HEX、TET、JOE、ROX和CY5中的任意一种；淬灭荧光基团优选BHQ1，还可以选用BHQ2、BHQ3、TAMRA和Eclipse中的任意一种。
2.ASFV荧光PCR检测试剂的反应体系的建立
本发明的ASFV荧光PCR检测试剂包含了除核酸模板外的所有荧光PCR反应组分(见表1)，反应体积为25μl，可配成2×(即12.5μl/反应)的预混液保存于-20℃，使用时加水和待测样本核酸至25μl的反应体积即可上机检测。试剂的反应体积可按比例在5μl-100μl范围内扩大或缩小。
表1.ASFV荧光PCR检测试剂成分(按25μl反应体积计算)
成分 每反应含量 每反应优选含量
无核酸酶水 至8-16μl 至10μl
200mM Tris-HCl缓冲液 2.5μl 2.5μl
氯化钾 1-2μmol 1.55μmol
氯化镁 0.03-0.1μmol 0.075μmol
dATP、dTTP、dCTP、dGTP 3-6pmol 5pmol
热启动Taq DNA聚合酶 1-5U 2U
正向引物 0.5-1.5×10<sup>-11</sup>mol 1×10<sup>-11</sup>mol
反向引物 0.5-1.5×10<sup>-11</sup>mol 1×10<sup>-11</sup>mol
探针 1-10×10<sup>-12</sup>mol 5×10<sup>-12</sup>mol
PCR促进剂 1-10μg 7.5μg
冻干赋形剂(仅用于试剂冻干) 1.5-4mg 2.25mg
3.ASFV荧光PCR检测试剂
本发明所述的ASFV荧光PCR检测试剂可以是常规的液体剂型，优选地，也可以通过冷冻干燥技术制成冻干型试剂。冻干型试剂的优点是：常温下稳定，无需冷链运输和保存，从而避免了常规液体荧光PCR检测试剂因保存温度变化或反复冻融而失效的风险。
本发明所述的ASFV荧光PCR检测试剂是由表1的成分冻干而成，可按单个或多个反应的分量冻干在容器中，优选地，可按1份/管冻干在可直接上机的PCR管或由PCR管组合成的多连管或反应板中。冻干所得的ASFV荧光PCR检测试剂为白色颗粒，可在遮光、防潮条件下常温保存。每个反应的分量所含干物质的体积约2μl，使用时直接加总体积为23μl的水和待测核酸样本即可配成25μl的反应体系，优选地，可直接加23μl适当浓度的核酸样本。试剂加水和核酸样本后经慢速震荡可快速溶解，溶解后即可上机检测。
4.ASFV荧光PCR检测试剂的反应程序及结果判定
本发明的ASFV荧光PCR检测试剂的反应程序按表2设置，根据探针荧光报告基团设置荧光信号。
表2.ASFV荧光PCR检测试剂反应程序
Figure BDA0003028635360000031
Figure BDA0003028635360000041
反应后ASFV的检测结果分别根据以下条件进行判定：
a)阴性对照品(无核酸酶水)的Ct≥40或无Ct，且阳性对照的Ct值≤30，为有效结果。否则结果无效，须排除错误因素后重检。
b)检测样品Ct≤35，可报告为ASFV阳性。
c)检测样品35＜Ct＜40，报告为ASFV疑似阳性，需重复实验或通过独立方法进行确定。
d)检测样品Ct≥40或无Ct，则报告为ASFV阴性。
本发明的有益效果：
本发明所述的ASFV冻干型荧光PCR检测试剂可常温保存和运输，避免了常规液体荧光PCR检测试剂因保存温度变化或反复冻融而失效的风险，能适应地理位置偏远、冷链条件较差的用户的使用需要；ASFV冻干型荧光PCR检测试剂中的引物、探针序列是基于最新的ASFV核酸序列信息设计筛选所得，具有良好的包容性、特异性和反应性能。
附图说明
图1显示本发明所述的ASFV的检测目标序列以及引物和探针的位置。
图2显示冻干于PCR八连管中的ASFV荧光PCR检测试剂的形态。
图3显示本发明所述的ASFV冻干型荧光PCR检测试剂对梯度稀释的模板的扩增曲线及重复性。
图4显示本发明所述的ASFV冻干型荧光PCR检测试剂标准曲线。
具体实施方式
以下实施例仅为对本发明的进一步说明，本发明的保护范围应以权利要求书的保护范围为准。
实施例1：本实施例提供一种用于检测ASFV核酸的荧光PCR引物及探针的设计方案。
本发明所述的检测ASFV的荧光PCR引物探针的基本设计原则如下：
1)引物和探针的位置选择在ASFV保守序列区域，以避免漏检(假阴性)，而该区域对其它物种必须具有排他性，以防止假阳性(非特异扩增)。
2)探针和引物的位置距离最好不超过10bp，较短的距离有利于Taq DNA聚合酶对探针进行高效外切从而产生荧光信号。
3)GC含量30-80％；引物的Tm值约58-60℃，探针的Tm值约68-70℃。两条引物的Tm差别应尽量小，以有利于两条引物的同时退火；探针的Tm应比引物高足够多(8℃以上)以保证探针早于引物完成退火。
4)引物和探针的发夹结构自由能dG≥-1.0，自身及二聚体自由能dG≥-6.0，优选dG≥-3.6。
5)扩增片段长度50-150bp，较短的扩增子有利于提高PCR反应效率。
对GenBank中的ASFV的核酸序列进行排序，并根据上述的设计原则，选取出用于检测ASFV的p72基因作为检测的目标基因，正向引物的核苷酸序列为5’-CGTTAATATGACCACTGGGTTGG-3’，反向引物的核苷酸序列为5’-CCTTCCACTACGGAGGCAAT-3’，探针的核苷酸序列为5’-CCGTGGCTTCAAAGCAAAGGTAATCATCA-3’。探针的5’端用报告荧光基团FAM修饰，3’端荧光淬灭基团BHQ1修饰。
如图1所示，上述引物和探针对ASFV的目标检测序列长度为111bp，引物和探针序列在已知ASFV序列中高度保守。通过BLAST检查确定，该目标检测序列和其它物种没有相似性，这将有效保证对其它物种的排他性。运用Primer Express V3.0及DNAStar软件对这些引物探针的Tm值及二级结构进行分析，结果均基本符合上述的设计原则，影响检测灵敏度的参数均较理想，表明这些引物和探针理论上对扩增资源的利用率较高，有利于提高检测灵敏度。
实施例2：本实施例演示通过真空冷冻干燥技术将本发明所述的ASFV荧光PCR检测试剂制成冻干型试剂。
按表1中所述的优选成分及含量配制ASFV荧光PCR液体检测试剂，按1份/管分装于200μl PCR八连管中后进行真空冷冻干燥，得到的ASFV冻干型荧光PCR检测试剂为白色颗粒(图2)。向一份试剂中加入23μl无核酸酶水，慢速震荡10s，试剂即完全溶解，用移液枪测得体积为25μl，可知试剂复溶前体积相当于2μl。为防止试剂受潮和曝光，ASFV冻干型荧光PCR检测试剂先和硅胶干燥剂一起作真空处理，再包装于铝箔袋中，在常温中保存。
实施例3：本实施例演示用本发明所述的ASFV冻干型荧光PCR检测试剂对ASFV核酸阳性参考品的检测效果。
ASFV核酸阳性参考品用无核酸酶水进行10倍梯度稀释，每个浓度取5μl和18μl无核酸酶水混合，然后加到1份按实施例2制备的ASFV冻干型荧光PCR检测试剂中；另外以23μl无核酸酶水作为阴性对照品。得到体积为25μl的反应混合液，慢速震荡溶解、离心后在荧光PCR仪上机检测，反应程序按表2设置。每个处理做3个重复。
检测结果如图3所示，本发明所述的ASFV冻干型荧光PCR检测试剂对低至107倍稀释的ASFV核酸阳性参考品的检测结果均显阳性，重复之间Ct的差异系数(CV)＜5％，阴性对照品没有扩增信号。模板浓度的常用对数及其Ct之间呈良好的线性关系(R2＝0.994)，ASFV核酸的扩增效率达96.533％(图4)。
可见，本发明的ASFV冻干型荧光PCR检测试剂对ASFV核酸的检测表现良好，同时具有多项优点：(1)可常温保存，无传统液体试剂对保存温度(-20℃)的要求；(2)使用前无需解冻，完全避免了反复冻融对试剂活性的影响；(3)已按单份分装，使用时无需配液、分装步骤，减少了试剂损耗和试剂污染的风险。
序列表
<110>
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 1
cgttaatatg accactgggt tgg 23
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 2
ccttccacta cggaggcaat 20
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 3
ccgtggcttc aaagcaaagg taatcatca 29

Claims (2)

1.一种非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂，其特征在于，所述的非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂为冻干型试剂，由Tris-HCl缓冲液、氯化钾、氯化镁、dNTPs、Taq DNA聚合酶、赋形剂以及下述用于检测非洲猪瘟病毒的引物、探针冻干而成：
正向引物的核苷酸序列为：5’-CGTTAATATGACCACTGGGTTGG-3’；
反向引物的核苷酸序列为：5’-CCTTCCACTACGGAGGCAAT-3’；
探针的核苷酸序列为：5’-CCGTGGCTTCAAAGCAAAGGTAATCATCA-3’。
2.权利要求1所述的非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂，其特征在于，按1份/管冻干在PCR反应管或由其组合成的多连管中，可直接用于上机检测。
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