CN101570796B - 用于鉴别诊断不同牛泰勒虫的试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种可鉴别诊断牛环形泰勒虫、瑟氏泰勒虫和中华泰勒虫的试剂盒，及这种试剂盒的制备和使用方法。本发明的试剂盒内至少包括有：环形泰勒虫上游引物和环形泰勒虫下游引物、瑟氏泰勒虫上游引物和瑟氏泰勒虫下游引物，以及中华泰勒虫上游引物和中华泰勒虫下游引物。
Description
技术领域
本发明涉及一种可鉴别诊断牛环形泰勒虫、瑟氏泰勒虫和中华泰勒虫的试剂盒，及这种试剂盒的制备和使用方法。
背景技术
牛泰勒虫病是牛的蜱传性疾病，感染牛的泰勒虫有6种，其中致病性最强和引起严重经济问题的有两种，一种是小泰勒虫，另一种是环形泰勒虫。在中国境内存在的牛泰勒虫主要有环形泰勒虫、瑟氏泰勒虫，水牛泰勒虫/东方泰勒虫和中华泰勒虫。中华泰勒虫是白启等发现的一种由青海血蜱传播的新的牛泰勒虫种，主要分布在中国的甘肃和青海省。牛泰勒虫的主要传播媒介牛蜱广泛存在于热带和亚热带国家，鉴于本类疾病的严重危害，国际兽医局(OIE)国际委员会于1985年通过议案，建议各成员国加强蜱传性血液原虫病的协作研究，建立国际性防制措施，以减少经济损失。我国是世界上泰勒虫病流行最严重的国家之一，在该病的防治方面仍有大量工作要做。
随着科学技术的不断更新，牛泰勒虫病检测技术也有了迅速的发展。现在应用最广泛的是国际贸易组织指定的间接免疫荧光(IFA)试验(陆生动物诊断试验和疫苗手册)。IFA试验敏感性好，并具有较强特异性，一般容易操作。但是，由于一些泰勒虫种间的交叉反映问题，在多种泰勒虫感染的地区进行大规模普查时，它的应用受到限制。酶联免疫吸附试验(ELISA)的血清学试验正日益广泛的用于检测寄生虫特异性抗体，但是该方法只能单独的检验某种特定得虫种，主要因各种检测泰勒虫抗体的ELISA存在特异性差，同时ELISA作为一种血清学检测方法，有时只能说明被检动物是否感染过病原。
发明内容
本发明提供一种可克服现有技术不足，用于鉴别检测牛环形泰勒虫、瑟氏泰勒虫和中华泰勒虫的试剂盒，以及这种试剂盒的制备方法和使用方法。
本发明的试剂盒内至少包括有：环形泰勒虫上游引物和环形泰勒虫下游引物、瑟氏泰勒虫上游引物和瑟氏泰勒虫下游引物，以及中华泰勒虫上游引物和中华泰勒虫下游引物。
本发明的试剂盒内的各引物分别为：
a.环形泰勒虫上游引物：
AnS 5’一GAGTTCAAGGACTAGAACC-3’
b.环形泰勒虫下游引物：
AnR 5’-GAGTCTACTGGACATTGAAG-3’
c.瑟氏泰勒虫上游引物：
SerS 5’-TGAATGCCTGCTCTACG-3’
d.瑟氏泰勒虫下游引物：
SerR 5’-GCACACAGACACGAGTT-3’
e.中华泰勒虫上游引物：
SinS 5’-AGTGTCGTCGAAGCGG-3’
f.中华泰勒虫下游引物：
SinR 5’-GCACACAGACACGAGTT-3’
本发明实际上是一种多重PCR检测方法，以及这种检测方法的具体操作步骤。聚合酶链式反应(PCR)技术现在可将微量的寄生虫DNA放大一百万倍，本发明中根据转录间隔区核苷酸片断设计的针对三种泰勒虫的特异性引物使本检测方法具有非常好的鉴别诊断性，能够准确的鉴定区分环形泰勒虫、瑟氏泰勒虫和中华泰勒虫的感染情况。根据泰勒虫传播媒介的固定性，检测结果同时能够反映该地区媒介蜱的分布情况。由于本发明方法检测的是寄生虫DNA，所以能够实时反应动物感染寄生虫的情况。
附图说明
图1为本发明扩增的环形泰勒虫，瑟氏泰勒虫和中华泰勒虫基因片段电泳图。该结果证明在同一反应体中，本方法能够同时检测到三种泰勒虫基因组的存在情况。本图中：M为DNA Marker DL2000；1为牛环形泰勒虫，2为瑟氏泰勒虫，3为中华泰勒虫混合基因组样品。
图2为牛环形泰勒虫引物AnS/AnR特异性检测的电泳图，其中：M为DNAMarker DL2000；1为环形泰勒虫DNA；2为瑟氏泰勒虫DNA；3为中华泰勒虫DNA；4为牛巴贝斯虫DNA；5为双芽巴贝斯虫DNA；6为大巴贝斯虫DNA；7为卵形巴贝斯虫DNA；8：巴贝斯虫未定种DNA；9：阴性牛DNA。
图3为牛瑟氏泰勒虫引物SerS/SerR特异性检测电泳图，其中：M为DNAMarker DL2000；1为瑟氏泰勒虫DNA；2为环形泰勒虫DNA；3为中华泰勒虫DNA；4为牛巴贝斯虫DNA；5为双芽巴贝斯虫DNA；6为大巴贝斯虫DNA；7为卵形巴贝斯虫DNA；8为巴贝斯虫未定种DNA；9为阴性牛DNA。
图4为牛中华泰勒虫引物SerS/SerR特异性检测电泳图，其中：M为DNAMarker DL2000；1为中华泰勒虫DNA；2为环形泰勒虫DNA；3为瑟氏泰勒虫DNA；4为牛巴贝斯虫DNA；5为双芽巴贝斯虫DNA；6为大巴贝斯虫DNA；7为卵形巴贝斯虫DNA；8为巴贝斯虫未定种DNA；9为阴性牛DNA。
具体实施方式
以下提供本发明的一个具体实施例，本实施例所用的试剂包括：
(1)提取血液中基因组所用试剂：
a.红细胞裂解液(Gentra公司)
b.细胞裂解液(Gentra公司)
c.蛋白沉淀剂(Gentra公司)
d.DNA水合剂(Gentra公司)
e.异丙醇(市售)
f.70％乙醇(市售)
(2)PCR反应所用试剂：
a.5×Buffer缓冲液(TakaRa公司)
b.2.5mM dNTP混合液(TakaRa公司)
c.rTaq酶(TakaRa公司)
d.基因组DNA
e.50pM引物
f.灭菌水去离子水
本发明所用的各引物分别为：
b.环形泰勒虫上游引物：
AnS 5’-GAGTTCAAGGACTAGAACC-3’
b.环形泰勒虫下游引物：
AnR 5’-GAGTCTACTGGACATTGAAG-3’
c.瑟氏泰勒虫上游引物：
SerS 5’-TGAATGCCTGCTCTACG-3’
d.瑟氏泰勒虫下游引物：
SerR 5’-GCACACAGACACGAGTT-3’
e.中华泰勒虫上游引物：
SinS 5’-AGTGTCGTCGAAGCGG-3’
f.中华泰勒虫下游引物：
SinR 5’-GCACACAGACACGAGTT-3’
在实际的应用中可用上述内容组成试剂盒，这样将更方便实际的检测工作。
具体检测与操作步骤：
1)感染牛环形泰勒虫、瑟氏泰勒虫和中华泰勒虫的牛血液的获得：
用液氮中保存的含虫血液分别接种实验动物，当染虫率达到5％以上，静脉采血，将所采血液4℃条件下4000rpm离心10分钟，弃去上清，尽量将红细胞吸去。2％枸橼酸钠洗涤三次4000rpm离心10分钟，最后将上清去掉，红细胞分装入1.5ml离心管中，-20℃保存。
2)从血液中提取基因组的方法：
a.加900ul BRC Cell Lysis Solution于盛300ul血液1.5的离心管中，颠倒10次，在室温下放置到液体澄清透明。
b.3000g离心3分钟，弃上清，保留下面的可见的白细胞沉淀和大约10～20μl液体，涡旋20秒。
c.每管中加入300ulCell Lysis Solution，吹打混匀
d.加入100ul Protein Preciptation Solution。
e.蜗旋20秒，至出现棕褐色沉淀颗粒。
f.13000g离心3分钟。
g.将上清液移至新标记的离心管中，加入300ul异丙醇，颠倒50次。
h.13000g离心5分钟。
i.弃上清，在干净的纸巾上放置，将剩余的液体吸干。
j.加入300ul 70％乙醇。
k.13000g离心3分钟，小心除去乙醇，在吸水纸上吸干剩余液体。
l.在Speedcac真空干燥。
m.加入100μl DNA Hydration Solution。
n.4℃过夜或60℃温育1小时。
p.-20℃保存备用。
3)基因片段PCR扩增的反应体系及程序如下(所用试剂购自TakaRa公司)：
a.10×PCR buffer(plus Mg2+) 5μl
b.2.5mM dNTP Mixture 4μl
c.AnS 0.5μl
d.AnR 0.5μl
e.SerR 0.5μl
d.SerS 0.5μl
e.SinS 0.5μl
f.SinR 0.5μl
g.Genomic DNA 1μl
h.rTaq酶(5U/ul) 0.3μl
i.灭菌去离子水补足50nl体系
4)多重PCR检测方法反应程序：
a.96℃ 3min
e.72℃ 5min
f.4℃ 保存
5)PCR产物琼脂糖凝胶电泳观察结果：
取PCR产物10μl在1.5％的琼脂糖凝胶(含0.5μg/ml溴化乙锭)中，在75伏的电压下进行电泳分析，观察PCR扩增结果。电泳图中出现三条不同大小的条带，分别在1000bp、750bp和500bp附近，与设计的环形泰勒虫目的扩增片断417bp，瑟氏泰勒虫目的扩增片断854bp，中华泰勒虫目的扩增片段650bp基本相符。
6)特异性检验
分别用环形泰勒虫特异性引物扩增环形泰勒虫、瑟氏泰勒虫、中华泰勒虫、牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、卵形巴贝斯虫、大巴贝斯虫、巴贝斯虫未定种和阴性牛血基因组；用瑟氏泰勒虫特异性引物扩增瑟氏泰勒虫、环形泰勒虫、中华泰勒虫、牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、卵形巴贝斯虫、大巴贝斯虫、巴贝斯虫未定种和阴性牛血基因组；用中华泰勒虫特异性引物扩增中华泰勒虫、环形泰勒虫、瑟氏泰勒虫、牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、卵形巴贝斯虫、大巴贝斯虫、巴贝斯虫未定种和阴性牛血基因组，将所得的扩增产物进行电泳，所得到的电泳图分别见图2、3和图4，其中图2中仅有环形泰勒虫条带，图3中仅有瑟氏泰勒虫条带，图4中仅出现中华泰勒虫条带，而其余基因组DNA中均没有扩增条带出现，也就是针对此三种泰勒虫的引物只能从环形泰勒虫、瑟氏泰勒虫和中华泰勒虫DNA中扩增出固定大小的目的条带，这也说明本发明有特异性。
Claims (1)
1.一种用于鉴别诊断不同牛泰勒虫的试剂盒，其特征是试剂盒内至少包括有：环形泰勒虫上游引物和环形泰勒虫下游引物、瑟氏泰勒虫上游引物和瑟氏泰勒虫下游引物，以及中华泰勒虫上游引物和中华泰勒虫下游引物，各引物分别为：
a.环形泰勒虫上游引物：
AnS 5’-GAGTTCAAGGACTAGAACC-3’
b.环形泰勒虫下游引物：
AnR 5’-GAGTCTACTGGACATTGAAG-3’
c.瑟氏泰勒虫上游引物：
SerS 5’-TGAATGCCTGCTCTACG-3’
d.瑟氏泰勒虫下游引物：
SerR 5’-GCACACAGACACGAGTT-3’
e.中华泰勒虫上游引物：
SinS 5’-AGTGTCGTCGAAGCGG-3’
f.中华泰勒虫下游引物：
SinR 5’-GCACACAGACACGAGTT-3’。
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| 许应天等.以p33重组蛋白为抗原建立牛瑟氏泰勒虫病间接ELISA诊断方法.《中国兽医杂志》.2007,第43卷(第4期),13-14. * |
| 金春梅等.牛瑟氏泰勒虫病PCR诊断方法的建立.《畜牧与兽医》.2007,第39卷(第5期),46-48. * |
| 高旭等.瑟氏泰勒虫病诊断技术的研究进展.《延边大学农学学报》.2005,第27卷(第2期),147-151. * |
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