CN112226534B - 用于检测新型冠状病毒增殖活动的引物组、试剂盒及其应用 - Google Patents

用于检测新型冠状病毒增殖活动的引物组、试剂盒及其应用 Download PDF

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CN112226534B CN202010994889.5A CN202010994889A CN112226534B CN 112226534 B CN112226534 B CN 112226534B CN 202010994889 A CN202010994889 A CN 202010994889A CN 112226534 B CN112226534 B CN 112226534B
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Abstract

本发明公开了用于检测新型冠状病毒增殖活动的引物组、试剂盒及其应用，该引物组包括接头引物、带接头引物的反向引物、带接头引物的正向引物、病毒正链引物、病毒负链引物。其引物组能有效识别出新型冠状病毒及其增殖情况，以此分辨出样品中新型冠状病毒是否处于复制期，及时有效地确认宠物，家畜，野生动物或水产等中的易感动物，有助于缩小疫情防控范围，减少对动物源性新型冠状病毒传播不必要的恐慌，减少错误扑杀。

Description

用于检测新型冠状病毒增殖活动的引物组、试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及基因检测领域，具体涉及用于检测新型冠状病毒增殖活动的引物组、试剂盒及其应用。
背景技术
研究人员发现新型冠状病毒（SARS-CoV-2）还具有感染宠物的能力（相关文章先后发表在《科学》杂志，Science. 2020;368(6494):1016-1020和《新英格兰医学》杂志上，NEngl J Med 2020; 383:592-594上），这将进一步使综合防治新冠肺炎面临更巨大的挑战。动物水产等是否可以被人类新型冠状病毒感染，病毒是否可以在其体内复制，动物感染源是否会成为病毒储存库是世界流行病防治方面所亟需关注的问题。
目前，全球新型冠状病毒核酸检测技术已经非常成熟，均检测病毒总RNA，或基因组正链RNA。比如，硕世生物、华大基因、达安基因等先后推出针对2019新型冠状病毒的核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）。但目前没有专门用于检测新型冠状病毒增殖活动的试剂盒。临床上确认动物体内检测到的病毒是否具有感染性通常需要分离病毒并培养，耗时长，成本高，需要P3实验室等设备，这极大的影响了病毒的防控进度和检测成本。
因此，及时开发出专门检测新型冠状病毒增殖活动的引物组、试剂盒及其对应的检测方法，对确认病毒复制活动，筛查新型冠状病毒的动物水产宿主具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供用于检测新型冠状病毒增殖活动的引物组；
本发明的另一目的在于提供用于检测新型冠状病毒增殖活动的试剂盒
本发明的另一目的在于提供一种检测新型冠状病毒增殖活动的方法；
本发明的另一目的在于提供上述引物组在制备新型冠状病毒增殖活动检测制剂中的应用；
本发明的另一目的在于提供上述方法在检测样品中新型冠状病毒增殖活动中的应用。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供：
用于检测新型冠状病毒增殖活动的引物组，该引物组包括接头引物、带接头引物的反向引物、带接头引物的正向引物、病毒正链引物、病毒负链引物；
上述接头引物的核苷酸序列为：
接头引物1：5’-GACCTGGATAGGCTGTGTGATA-3’（SEQ ID NO.1）；
接头引物2：5’-ACAGCACCCTAGCTTGGTAG-3’（SEQ ID NO.2）；
上述接头引物还包括接头引物3，其核苷酸序列为：5’-TTCCGATTAGAGGCGATA-3’（SEQ ID NO.3）；
上述带接头引物的反向引物的核苷酸序列为：
5’-GACCTGGATAGGCTGTGTGATAATTGTCCTCACTGCCGTCTT-3’（SEQ ID NO.4）；
上述带接头引物的正向引物的核苷酸序列为：
5’-ACAGCACCCTAGCTTGGTAGCCGAACAACTGGACTTTATTGA-3’（SEQ ID NO.5）；
上述病毒正链引物的核苷酸序列为：5’-TGCCACTTCTGCTGCTCTT-3’（SEQ IDNO.6）；
上述病毒正链引物还包括核苷酸序列为：5’-CCGAACAACTGGACTTTATTGA-3’（SEQID NO.7）的病毒正链引物2。
上述病毒负链引物的核苷酸序列为：5’-AGGTGTCTGCAATTCATAGC-3’（SEQ IDNO.8）。
上述新型冠状病毒特异性引物用于检测病毒的保守基因，ORF1ab基因，参考序列2019-nCoV_MT007544.1。
当然，上述用于检测病毒的基因还可以包括新型冠状病毒E基因、M基因、N基因、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8a、ORF8b中的一种或几种。
当然，本发明实施例中还包括其他可匹配的带接头引物的反向引物，包括：
5’-ACAGCACCCTAGCTTGGTAGATTGTCCTCACTGCCGTCTT-3’（SEQ ID NO.9）；
5’-TTCCGATTAGAGGCGATAATTGTCCTCACTGCCGTCTT-3’（SEQ ID NO.10）；
5’-CCTAACCTTCGTGATGAGCAATATTGTCCTCACTGCCGTCTT-3’（SEQ ID NO.11）。
本发明实施例中还包括其他可匹配的带接头引物的正向引物，包括：
5’-TTCCGATTAGAGGCGATACCGAACAACTGGACTTTATTGA-3’（SEQ ID NO.12）；
5’-CCTAACCTTCGTGATGAGCAATCCGAACAACTGGACTTTATTGA-3’（SEQ ID NO.13）。
接头引物为与新型冠状病毒无关中的DNA序列，其在被检测的样品DNA和RNA中均不存在。接头引物在扩增时，可直接使用这段无关DNA序列作为一侧引物，和病毒特异性的另外一侧引物做PCR，可保证扩增产物的模板一定是反转录而来的cDNA。
本发明的第二个方面，提供：
用于检测新型冠状病毒增殖活动的试剂盒，该试剂盒包括上述的引物组、阳性对照品、RT-PCR试剂；上述阳性对照品为含有新型冠状病毒ORF1ab基因的pUC57质粒。
进一步地，上述阳性对照品包括病毒正链阳性对照pUC57质粒（阳1）和病毒负链阳性对照pUC57质粒（阳2）。
阳1的序列长度为2895 bp，含有的病毒序列为：
5’-ACAGCACCCTAGCTTGGTAGTTCCGATTAGAGGCGATATGCCACTTCTGCTGCTCTTCAACCTGAAGAAGAGCAAGAAGAAGATTGGTTAGATGATGATAGTCAACAAACTGTTGGTCAACAAGACGGCAGTGAGGACAATTATCACACAGCCTATCCAGGTCATTGCTCATCACGAAGGTTAGG-3’（SEQ ID NO.14）；
阳2的序列长度为2908 bp，含有的病毒序列为：
5’-ACAGCACCCTAGCTTGGTAGTTCCGATTAGAGGCGATACCGAACAACTGGACTTTATTGACACTAAGAGGGGTGTATACTGCTGCCGTGAACATGAGCATGAAATTGCTTGGTACACGGAACGTTCTGAAAAGAGCTATGAATTGCAGACACCTTATCACACAGCCTATCCAGGTCATTGCTCATCACGAAGGTTAGG-3’（SEQ ID NO.15）；
动物水产如果只是单纯被新冠病毒污染，其并不能被确定可以成为病毒的储存库或传播源，因为病毒在动物体表的温度和湿度条件下，存活时间有限，只有当病毒在其体内产生复制活动，才能确认此类动物或水产具有复制子代病毒并传播病毒的潜在威胁。因此，及时鉴别动物水产中污染的新型冠状病毒是否具有复制活动，可以有效鉴定病毒潜在中间宿主，区分被污染动物和易感动物，减少社会恐慌，对综合防控新冠疫情具有重大意义。而新型冠状病毒是单股正链RNA病毒，病毒负链RNA只有在细胞中复制时才会产生，本发明中的试剂盒仅针对病毒负链RNA进行检测，而该类试剂盒并未有任何公开。
本发明的第三个方面，提供：
一种检测新型冠状病毒增殖活动的方法，包括以下步骤：
（1）提取样品中的RNA，分别使用上述的带接头引物的反向引物和上述的带接头引物的正向引物逆转录合成病毒正链cDNA模板和病毒负链cDNA模板；
（2）使用RNA酶消化病毒正链cDNA模板和病毒负链cDNA模板；
（3）使用上述引物组中的接头引物2和上述引物组中的病毒负链引物扩增病毒负链cDNA模板，得到病毒负链扩增产物，使用上述引物组中的接头引物1和上述引物组中的病毒正链引物扩增病毒正链cDNA模板，得到病毒正链扩增产物，检测病毒正链扩增产物和负链扩增产物含量，判断样品是否含有新型冠状病毒及其增殖情况。
进一步地，上述RNA酶包括RNase A。
进一步地，上述样品包括但不仅限于感染病毒的细胞培养物或疑似被病毒感染的动物或水产的组织。
更进一步地，上述感染病毒的细胞培养物包括但不仅限于Vero细胞、VERO-E6细胞、CHO细胞、293T细胞中的一种或几种；上述疑似被病毒感染的动物或水产的组织包括但不仅限于宠物、家畜、家禽、鱼类、虾类等水产、野生动物的机体组织或分泌物、排泄物。
进一步地，上述步骤（1）中提取样品中的RNA可以采用本领域常规手段或RNA提取试剂盒提取。
进一步地，上述方法还包括使用本发明实施例中的引物组采用一步法或其他可替代检测技术或设备进行检测。
进一步地，上述步骤（3）中判断样品是否含有新型冠状病毒及其增殖情况的方法为：
若检测到病毒负链扩增产物，则样品含有新型冠状病毒且处于复制期；
若仅检测到病毒正链扩增产物，则样品含有新型冠状病毒但未进行复制；
若未检测到病毒正链扩增产物；则样品不含有新型冠状病毒。
进一步地，上述步骤（1）中逆转录合成病毒正链cDNA模板的逆转录PCR反应体系为：
Figure 168832DEST_PATH_IMAGE001
加入无核酸酶水后加热（65℃）反应4-5 min；冷却，再加入以下体系2继续逆转录合成病毒正链cDNA模板：
Figure 137925DEST_PATH_IMAGE002
逆转录PCR体系2的反应条件为42℃-50℃逆转录60min；95℃失活5min；；冷却，反应结束。
进一步地，上述步骤（1）中逆转录合成病毒负链cDNA模板的逆转录PCR反应体系为：
Figure 355280DEST_PATH_IMAGE003
加入无核酸酶水后加热（65℃）反应4-5 min；冷却，再加入以下体系2继续逆转录合成病毒负链cDNA模板：
Figure 359008DEST_PATH_IMAGE004
逆转录PCR体系2的反应条件为42℃-50℃逆转录60min；95℃失活5min；冷却，反应结束。
进一步地，上述步骤（3）中病毒负链cDNA模板的扩增反应体系为：
Figure 255813DEST_PATH_IMAGE005
PCR扩增反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火30s，循环40次。
进一步地，上述步骤（3）中病毒正链cDNA模板的扩增反应体系为：
Figure 977781DEST_PATH_IMAGE006
PCR扩增反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火30s，循环40次。
更进一步地，上述10 μM上述的接头引物1（SEQ ID NO.1）与10 μM上述的病毒正链引物（SEQ ID NO.8）可同时替换为10 μM上述的接头引物3（SEQ ID NO.3）与10 μM上述的SEQ ID NO.6。
更进一步地，上述反转录合成可以使用本领域的常规试剂盒，包括但不限于：
TAKARA 6210A PrimeScript™ II 1st StrandcDNA Synthesis Kit；
Invitrogen™ SuperScript™ IV VILO™ Master Mix系列；
New England Biolabs First Strand cDNA Synthesis系列；
Takara PrimeScript™ 1st Strand cDNA Synthesis Kit系列；
Vazyme HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit 系列。
更进一步地，上述步骤（3）中PCR扩增可以使用本领域的常规试剂盒，包括但不限于：
TAKARA RR420Q TB Green® Premix Ex Taq™ (Tli RNaseH Plus)；
Takara TB Green® Premix Ex Taq™系列；
New England Biolabs Luna® Universal qPCR Master Mix系列；
Applied Biosystems™ Power™ SYBR™ Green系列；
Vazyme ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix系列；
Vazyme AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 系列。
本发明实施例中的方法仅针对病毒负链RNA进行检测，而该类试剂盒并未有任何公开，其可以及时鉴别动物水产中污染的新型冠状病毒是否具有复制活动，可以有效鉴定病毒潜在中间宿主，区分被污染动物和易感动物，减少社会恐慌，对综合防控新冠疫情具有重大意义。
本发明的第四个方面，提供：
上述引物组在制备新型冠状病毒增殖活动检测制剂中的应用。
动物水产如果只是单纯被新冠病毒污染，其并不能被确定可以成为病毒的储存库或传播源，因为病毒在动物体表的温度和湿度条件下，存活时间有限，只有当病毒在其体内产生复制活动，才能确认此类动物或水产具有复制子代病毒并传播病毒的潜在威胁。本发明实施例中的引物组制备得到的制剂能有效鉴定病毒潜在中间宿主，区分被污染动物和易感动物。
本发明的第五个方面，提供：
上述方法在检测样品中新型冠状病毒增殖活动中的应用。
本发明实施例中的方法仅针对病毒负链RNA进行检测，而该类试剂盒并未有任何公开，其可以及时鉴别动物水产中污染的新型冠状病毒是否具有复制活动，可以有效鉴定病毒潜在中间宿主，区分被污染动物和易感动物，减少社会恐慌，对综合防控新冠疫情具有重大意义。
本发明的有益效果是：
利用本发明的引物组可以检测细胞培养物中是否有新型冠状病毒复制，可以确认宠物，家畜，野生动物或水产等体内是否有冠状病毒繁殖，从而为及时有效地确认易感动物提供新的检测手段，节约了时间和成本。有助于缩小疫情防控范围，减少对动物源性新型冠状病毒传播不必要的恐慌，减少错误或盲目扑杀动物的情况。
附图说明
图1为检测病毒正链的引物设计原理图；
图2为检测病毒负链的引物设计原理图；
图3为不同组合正链和负链PCR扩增溶解曲线图；
图4为引物模板组合2、3在不同模板浓度下的溶解曲线图；其中，A为病毒正链引物模板组合2的溶解曲线；B为病毒正链引物模板组合3的溶解曲线；
图5为使用本发明实施例负链引物扩增不同样品的PCR产物溶解曲线图；
图6为新型冠状病毒反转录阴性对照实验设计原理图。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。
引物设计
本发明实施例中的新型冠状病毒特异性引物用于检测病毒的保守基因，ORF1ab基因，新型冠状病毒参考序列为2019-nCoV_MT007544.1。以下所有基因序列的位置均是在ORF1ab基因序列中的位置。
检测病毒正链的引物设计原理如图1所示，第一步反转录：用带接头的病毒特异性反向引物，结合病毒正链RNA反转录出cDNA；第二步定量PCR：RNA酶消化后，用病毒正链特异性引物和接头1引物，以第一步获得的cDNA为模板，采用相对法定量检测。
检测病毒正链的引物具体序列如下：
接头引物1（接头1）：5’-GACCTGGATAGGCTGTGTGATA-3’（SEQ ID NO.1）；
带接头引物1的反向引物的核苷酸序列为：
5’-GACCTGGATAGGCTGTGTGATAATTGTCCTCACTGCCGTCTT-3’（SEQ ID NO.4）（针对ORF1ab基因2978-2998bp）；
病毒正链特异性引物（正链）：5’-TGCCACTTCTGCTGCTCTT-3’（SEQ ID NO.6）（针对ORF1ab基因2896-2915bp）。
其PCR产物序列为：
5’-ACAGCACCCTAGCTTGGTAGTTCCGATTAGAGGCGATATGCCACTTCTGCTGCTCTTCAACCTGAAGAAGAGCAAGAAGAAGATTGGTTAGATGATGATAGTCAACAAACTGTTGGTCAACAAGACGGCAGTGAGGACAATTATCACACAGCCTATCCAGGTCATTGCTCATCACGAAGGTTAGG-3’（SEQ ID NO.14）。
对应本发明实施例中设计的病毒正链的引物，设计阳性对照质粒1（阳1），序列长度为2895bp，载体为pUC57，含有的病毒序列为：
5’-ACAGCACCCTAGCTTGGTAGTTCCGATTAGAGGCGATATGCCACTTCTGCTGCTCTTCAACCTGAAGAAGAGCAAGAAGAAGATTGGTTAGATGATGATAGTCAACAAACTGTTGGTCAACAAGACGGCAGTGAGGACAATTATCACACAGCCTATCCAGGTCATTGCTCATCACGAAGGTTAGG-3’（SEQ ID NO.14）。
检测病毒负链的引物设计原理与检测病毒正链的引物设计原理相同，如图2所示。
检测病毒负链的引物设计原理具体序列如下：
接头引物2（接头2）：5’-ACAGCACCCTAGCTTGGTAG-3’（SEQ ID NO.2）；
上述带接头引物2的正向引物的核苷酸序列为：
5’-ACAGCACCCTAGCTTGGTAGCCGAACAACTGGACTTTATTGA-3’（SEQ ID NO.5）（针对ORF1ab基因647-668bp）；
上述病毒负链引物的核苷酸序列为：5’-AGGTGTCTGCAATTCATAGC-3’（SEQ IDNO.8）（针对ORF1ab基因743-762bp）。
其PCR产物序列为：
5’-ACAGCACCCTAGCTTGGTAGTTCCGATTAGAGGCGATACCGAACAACTGGACTTTATTGACACTAAGAGGGGTGTATACTGCTGCCGTGAACATGAGCATGAAATTGCTTGGTACACGGAACGTTCTGAAAAGAGCTATGAATTGCAGACACCTTATCACACAGCCTATCCAGGTCATTGCTCATCACGAAGGTTAGG-3’（SEQ ID NO.15）。
对应本发明实施例中设计的病毒负链的引物，设计阳性对照质粒2（阳2），序列长度为2908 bp，载体为pUC57，含有的病毒序列为：
5’-ACAGCACCCTAGCTTGGTAGTTCCGATTAGAGGCGATACCGAACAACTGGACTTTATTGACACTAAGAGGGGTGTATACTGCTGCCGTGAACATGAGCATGAAATTGCTTGGTACACGGAACGTTCTGAAAAGAGCTATGAATTGCAGACACCTTATCACACAGCCTATCCAGGTCATTGCTCATCACGAAGGTTAGG-3’（SEQ ID NO.15）。
为探究检测效果最佳的特异性引物，本发明实施中还列举了其他设计得到的接头引物3-4、病毒正链引物2、病毒负链引物2、其他可匹配的带接头引物的反向引物以及带接头引物的正向引物作为对比，具体序列如下：
接头引物3，其核苷酸序列为：5’-TTCCGATTAGAGGCGATA-3’ （SEQ ID NO.3）；
接头引物4，其核苷酸序列为：5’-CCTAACCTTCGTGATGAGCAAT-3’（SEQ ID NO.16）；
病毒正链引物2，其核苷酸序列为：5’-CCGAACAACTGGACTTTATTGA-3’（SEQ IDNO.7）（针对ORF1ab基因2896-2915bp）；
病毒负链引物2，其核苷酸序列为：5’-AGTAAGGTCAGTCTCAGTCCAA-3’（SEQ IDNO.17）（针对ORF1ab基因15569-15591bp）；
其他可匹配的带接头引物的反向引物，包括：
5’-ACAGCACCCTAGCTTGGTAGATTGTCCTCACTGCCGTCTT-3’（SEQ ID NO.9）；
5’-TTCCGATTAGAGGCGATAATTGTCCTCACTGCCGTCTT-3’（SEQ ID NO.10）；
5’-CCTAACCTTCGTGATGAGCAATATTGTCCTCACTGCCGTCTT-3’（SEQ ID NO.11）。
其他可匹配的带接头引物的正向引物，包括：
5’-TTCCGATTAGAGGCGATACCGAACAACTGGACTTTATTGA-3’（SEQ ID NO.12）；
5’-CCTAACCTTCGTGATGAGCAATCCGAACAACTGGACTTTATTGA-3’（SEQ ID NO.13）。
引物筛选与配置优化
根据表1分配PCR引物和模板配制，以筛选最佳引物配置。
表1 PCR引物和模板配制
Figure 733248DEST_PATH_IMAGE007
阳1和阳2，2种质粒模板均系列稀释至浓度为104、103、102、101、100拷贝/μL，作为验证用阳性标准品。
正链和负链PCR反应体系配制如下表2所示：
表2 正链和负链PCR反应体系
Figure 76636DEST_PATH_IMAGE008
正链和负链PCR扩增反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火30s，循环40次。反应完成后，检测正链和负链PCR扩增Ct值。
正链和负链PCR扩增结果如下表3所示：
表3 正链和负链PCR扩增Ct值
Figure 157724DEST_PATH_IMAGE009
*表示无非特异性扩增。
PCR产物的溶解曲线如图3所示。从PCR的Ct值和溶解曲线结果中可以发现，第2、3、7组无非特异性扩增（表中标注星号），扩增灵敏度均达到102拷贝/微升，可以作为用于检测新型冠状病毒增殖活动的引物。
正负链引物组合及反应条件优化
以阳1、阳2作为阳性对照，水为阴性对照模板，PCR试剂为TAKARA RR420Q TBGreen® Premix Ex Taq™（Tli RNaseH Plus），使用ABI QuantStudio™ 3荧光定量PCR系统对上述设计的无非特异性扩增的第2、3、7组进行引物组合及反应条件优化。
PCR引物和模板配制如下表4所示：
表4 无非特异性扩增的第2、3、7组PCR引物和模板配制
Figure 366988DEST_PATH_IMAGE010
阳1和阳2，2种质粒模板均系列稀释至浓度为104、103、102、101、100拷贝/μL，作为验证用阳性标准品。PCR设为4个组，分别含有引物终浓度为0.2，0.4，0.8，1 μM。PCR反应体系配制如下表5-8所示：
表5 引物为0.2 μM组的PCR反应体系配制
Figure 175413DEST_PATH_IMAGE011
表6 引物为0.4 μM组的PCR反应体系配制
Figure 888154DEST_PATH_IMAGE012
表7 引物为0.8 μM组的PCR反应体系配制
Figure 608986DEST_PATH_IMAGE013
表8 引物为1 μM组的PCR反应体系配制
Figure 39967DEST_PATH_IMAGE014
正链和负链PCR扩增反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火30s，循环40次。反应完成后，检测正链和负链PCR扩增Ct值。
正链和负链PCR扩增结果如下表9所示：
表9 病毒正链引物模板组合2的Ct值
Figure 887969DEST_PATH_IMAGE015
病毒正链引物模板组合2的溶解曲线如图4中A所示。
病毒正链引物模板组合3的溶解曲线如图4中B所示。
表11 病毒负链引物模板组合7的Ct值
Figure 986375DEST_PATH_IMAGE016
结果发现，病毒正链引物模板组合2在引物0.4μM浓度下扩增效率最合适，灵敏度达到101拷贝/微升。病毒正链引物模板组合3出现了非特异扩增，病毒负链引物模板组合7在低浓度有极低的扩增曲线，但在引物浓度为0.8μM的试验浓度下无非特异扩增，灵敏度达到101拷贝/微升。因此，选择病毒正链引物模板组合2，引物浓度0.4μM检测病毒正链；病毒负链引物模板组合7，引物浓度0.8μM检测病毒负链。
新型冠状病毒正负链引物的物种特异性鉴定
以阳1、阳2作为阳性对照，水为阴性对照模板，从未感染病毒的Vero细胞提取的RNA，伪狂犬病毒、蓝耳病病毒、猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒、和圆环病毒阳性的病猪组织提取的RNA混合物，大口黒鲈病毒、鳜鱼弹状病毒和传染性脾肾坏死病毒阳性的病鱼组织提取的RNA混合物，PCR试剂为TAKARA 6210A PrimeScript™ II 1st StrandcDNA SynthesisKit和TAKARA RR420Q TB Green® Premix Ex Taq™(Tli RNaseH Plus)，使用ABIQuantStudio™ 3荧光定量PCR系统对上述设计的无非特异性扩增的第2、7组进行特异性鉴定。
检测样品的制备：用含量为106 TCID50的新型冠状病毒感染提前一天培养在12孔板中的一个孔的Vero-E6单层细胞，37度，培养48小时后，除去上清，收集被感染细胞，提取总RNA，备用。
逆转录合成病毒正链cDNA模板的逆转录PCR反应体系为：
表12 病毒正链cDNA模板的逆转录PCR反应体系
Figure 878107DEST_PATH_IMAGE017
加热反应4-5 min；冷却，再加入以下体系继续逆转录合成病毒正链cDNA模板：
表13 病毒正链cDNA模板的逆转录PCR反应体系
Figure 325880DEST_PATH_IMAGE018
逆转录PCR反应条件为42℃-50℃逆转录60min；95℃失活5min；；冷却，反应结束。
逆转录合成病毒负链cDNA模板的逆转录PCR反应体系为：
表14 病毒负链cDNA模板的逆转录PCR反应体系
Figure 492419DEST_PATH_IMAGE019
加热反应4-5 min；冷却，再加入以下体系继续逆转录合成病毒负链cDNA模板：
表15 病毒负链cDNA模板的逆转录PCR反应体系
Figure 179752DEST_PATH_IMAGE020
逆转录PCR反应条件为42℃-50℃逆转录60min；95℃失活5min；；冷却，反应结束。
病毒正链PCR扩增反应体系为：
表16 病毒正链的PCR反应体系
Figure 258698DEST_PATH_IMAGE021
PCR扩增反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火30s，循环40次。反应完成后，检测正链PCR扩增Ct值。
病毒正链PCR扩增反应体系为：
表17 病毒负链的PCR反应体系
Figure 398692DEST_PATH_IMAGE022
PCR扩增反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火30s，循环40次。反应完成后，检测负链PCR扩增Ct值。
结果如下表（表18）及图5的PCR产物溶解曲线所示，只有新型冠状病毒感染的细胞才有病毒复制活动，才能特异性地扩增出病毒的正链和负链，说明本发明所设计的检测方法具有针对新型冠状病毒正负链基因的特异性，对水产类和动物组织，及其常见病毒没有非特异性扩增。
表18 不同样品的特异性扩增结果
Figure 634501DEST_PATH_IMAGE023
新型冠状病毒逆转录正负链特异性的鉴定
以阳1、阳2作为阳性对照，水为阴性对照模板，PCR试剂为TAKARA 6210APrimeScript™ II 1st StrandcDNA Synthesis Kit和TAKARA RR420Q TB Green®Premix Ex Taq™(Tli RNaseH Plus)，使用ABI QuantStudio™ 3荧光定量PCR系统对上述设计的无非特异性扩增的第2、7组进行逆转录特异性鉴定。
检测样品的制备：用含量为106 TCID50的新型冠状病毒感染提前一天培养在12孔板中的一个孔的Vero-E6单层细胞，37度，培养48小时后，除去上清，收集被感染细胞，提取总RNA，备用。
检测病毒正链逆转录特异性：
使用带接头引物的反向引物（SEQ ID NO.4）与病毒正链引物（SEQ ID NO.6）配对扩增正链，无扩增产物，证明反转录产物是正链特异性的（设计原理如图6）。
同理，检测病毒正链逆转录特异性：
使用带接头引物的正向引物（SEQ ID NO.5）与病毒负链引物（SEQ ID NO.8）配对扩增正链，无扩增产物，证明反转录产物是负链特异性的（设计原理如图6）。
逆转录体系及其逆转录反应条件、PCR体系及其反应条件如上述实施例中所述。
结果如表19所示，正链反转录引物特异性结果显示只有位于cDNA内部的引物才可以扩增出产物。负链反转录引物特异性结果显示只有位于cDNA内部的引物才可以扩增出产物。
表19 正链反转录引物特异性结果
Figure 425609DEST_PATH_IMAGE024
新型冠状病毒复制活动的鉴定
材料和检测样品的制备如上述实施例中所述。
逆转录体系及其逆转录反应条件、PCR体系及其反应条件如上述实施例中所述，对感染新型冠状病毒的细胞培养物（感染病毒的细胞、病毒上清）进行检测。
如下表21所示，只有病毒感染的细胞培养物中同时检测出了新型冠状病毒特异性的正链RNA和负链RNA，细胞培养上清中的病毒游离于细胞外，不具有复制活动，所以只检测到病毒基因组正链RNA，而没有复制活动中才能产生的负链RNA。
表21 病毒感染的细胞培养物中感染病毒的细胞和病毒上清的检测结果
Figure 190302DEST_PATH_IMAGE025
结果说明，本发明实施例中的引物组、试剂盒能够有效的鉴别出正处于复制复制活动中的新型冠状病毒，可用于细胞培养物、宠物、家畜、野生动物及水生动物的新型冠状病毒的易感性判定。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东省农业科学院动物卫生研究所
华南农业大学
广东海大畜牧兽医研究院有限公司
<120> 用于检测新型冠状病毒增殖活动的引物组、试剂盒及其应用
<130>
<160> 17
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gacctggata ggctgtgtga ta 22
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
acagcaccct agcttggtag 20
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ttccgattag aggcgata 18
<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gacctggata ggctgtgtga taattgtcct cactgccgtc tt 42
<210> 5
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
acagcaccct agcttggtag ccgaacaact ggactttatt ga 42
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tgccacttct gctgctctt 19
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ccgaacaact ggactttatt ga 22
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
aggtgtctgc aattcatagc 20
<210> 9
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
acagcaccct agcttggtag attgtcctca ctgccgtctt 40
<210> 10
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ttccgattag aggcgataat tgtcctcact gccgtctt 38
<210> 11
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
cctaaccttc gtgatgagca atattgtcct cactgccgtc tt 42
<210> 12
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ttccgattag aggcgatacc gaacaactgg actttattga 40
<210> 13
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
cctaaccttc gtgatgagca atccgaacaa ctggacttta ttga 44
<210> 14
<211> 185
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
acagcaccct agcttggtag ttccgattag aggcgatatg ccacttctgc tgctcttcaa 60
cctgaagaag agcaagaaga agattggtta gatgatgata gtcaacaaac tgttggtcaa 120
caagacggca gtgaggacaa ttatcacaca gcctatccag gtcattgctc atcacgaagg 180
ttagg 185
<210> 15
<211> 198
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
acagcaccct agcttggtag ttccgattag aggcgatacc gaacaactgg actttattga 60
cactaagagg ggtgtatact gctgccgtga acatgagcat gaaattgctt ggtacacgga 120
acgttctgaa aagagctatg aattgcagac accttatcac acagcctatc caggtcattg 180
ctcatcacga aggttagg 198
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
cctaaccttc gtgatgagca at 22
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
agtaaggtca gtctcagtcc aa 22

Claims (7)

1.用于检测新型冠状病毒增殖活动的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由用于检测新型冠状病毒增殖活动的引物组、阳性对照品、RT-PCR试剂组成；所述阳性对照品为含有新型冠状病毒ORF1ab基因的pUC57质粒；
所述引物组包括接头引物、带接头引物的反向引物、带接头引物的正向引物、病毒正链引物、病毒负链引物；
所述接头引物的核苷酸序列为：
接头引物1：5’-GACCTGGATAGGCTGTGTGATA-3’；
接头引物2：5’-ACAGCACCCTAGCTTGGTAG-3’；
所述带接头引物的反向引物的核苷酸序列为：
5’-GACCTGGATAGGCTGTGTGATAATTGTCCTCACTGCCGTCTT-3’；
所述带接头引物的正向引物的核苷酸序列为：
5’-ACAGCACCCTAGCTTGGTAGCCGAACAACTGGACTTTATTGA-3’；
所述病毒正链引物的核苷酸序列为：
5’-TGCCACTTCTGCTGCTCTT-3’；
所述病毒负链引物的核苷酸序列为：
5’-AGGTGTCTGCAATTCATAGC-3’。
2.一种检测新型冠状病毒增殖活动的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）提取样品中的RNA，分别使用带接头引物的反向引物和带接头引物的正向引物逆转录合成病毒正链cDNA模板和病毒负链cDNA模板；
（2）使用RNA酶消化病毒正链cDNA模板和病毒负链cDNA模板；
（3）使用接头引物2和病毒负链引物扩增病毒负链cDNA模板，得到病毒负链扩增产物，使用接头引物1和病毒正链引物扩增病毒正链cDNA模板，得到病毒正链扩增产物，检测所述病毒正链扩增产物和所述病毒负链扩增产物的含量，判断样品是否含有新型冠状病毒及其增殖情况；
若检测到病毒负链扩增产物，则样品含有新型冠状病毒且处于复制期；
若仅检测到病毒正链扩增产物，则样品含有新型冠状病毒但未进行复制；
若未检测到病毒正链扩增产物和病毒负链扩增产物，则样品不含有新型冠状病毒；
所述接头引物的核苷酸序列为：
接头引物1：5’-GACCTGGATAGGCTGTGTGATA-3’；
接头引物2：5’-ACAGCACCCTAGCTTGGTAG-3’；
所述带接头引物的反向引物的核苷酸序列为：
5’-GACCTGGATAGGCTGTGTGATAATTGTCCTCACTGCCGTCTT-3’；
所述带接头引物的正向引物的核苷酸序列为：
5’-ACAGCACCCTAGCTTGGTAGCCGAACAACTGGACTTTATTGA-3’；
所述病毒正链引物的核苷酸序列为：
5’-TGCCACTTCTGCTGCTCTT-3’；
所述病毒负链引物的核苷酸序列为：
5’-AGGTGTCTGCAATTCATAGC-3’
所述方法不用于疾病的诊断。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1）中逆转录合成病毒正链cDNA模板的逆转录PCR反应体系为：
样品中的RNA > 5μg
10μM权利要求2中的带接头引物的反向引物 0.1-1 μL
10mM dNTP 1 μL
无核酸酶水加至10 μL；
加入无核酸酶水后加热反应4-5 min；冷却，再加入以下体系2继续逆转录合成病毒正链cDNA模板：
5×Prime Script II Buffer 4 μL
40 U/μL RNase抑制剂 0.5 μL
200 U/μL PrimeScript II RTase 1 μL
无核酸酶水加至20 μL；
逆转录PCR体系2的反应条件为42℃-50℃逆转录60min；95℃失活5min；冷却，反应结束。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1）中逆转录合成病毒负链cDNA模板的逆转录PCR反应体系为：
样品中的RNA > 5μg
10μM权利要求2中的带接头引物的正向引物 0.1-1 μL
10mM dNTP 1 μL
无核酸酶水加至10 μL；
加入无核酸酶水后加热反应4-5 min；冷却，再加入以下体系继续逆转录合成病毒负链cDNA模板：
5×Prime Script II Buffer 4 μL
40 U/μL RNase抑制剂 0.5 μL
200 U/μL PrimeScript II RTase 1 μL
无核酸酶水加至20μL；
逆转录PCR体系的反应条件为42℃-50℃逆转录60min；95℃失活5min；冷却，反应结束。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（3）中扩增病毒负链cDNA模板的反应体系为：
2X TB Green® Premix Ex Taq™ 10 μL
10 μM权利要求2中的接头引物2 0.8 μL
10 μM权利要求2中的病毒负链引物 0.8 μL
步骤（2）中的所述病毒负链cDNA模板 2 μL
ddH2O 加至20 μL；
扩增病毒负链cDNA模板的反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火30s，循环40次。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（3）中扩增病毒正链cDNA模板的反应体系为：
2X TB Green® Premix Ex Taq™ 10 μL
10 μM权利要求2中的病毒正链引物 0.8 μL
10 μM权利要求2中的接头引物1 0.8 μL
步骤（2）中的所述病毒正链cDNA模板 2 μL
ddH2O 加至20 μL；
扩增病毒正链cDNA模板的反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火30s，循环40次。
7.权利要求2至6任一项所述的方法在非诊断目的新型冠状病毒易感样品筛查中的应用；所述新型冠状病毒易感样品为细胞培养物。
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