CN111154919A - 一种新型冠状病毒的试剂盒及其单独闭管一步法检测新型冠状病毒核酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新型冠状病毒的试剂盒及其单独闭管一步法检测新型冠状病毒核酸的方法，本发明的一种单独闭管一步法检测新型冠状病毒核酸的试剂盒，包括引物、挂锁探针和RCA标准品，所述的RCA标准品具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；所述的挂锁探针具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；所述引物具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。本发明的2019‑CoV核酸的现场快速检测产品，缩短检测用时，提升便捷程度，推动诊断前移下移，实现疑似患者的快速诊断和密切接触人群的现场筛查。
Description
技术领域
本发明涉及生物科学技术领域，具体涉及新型冠状病毒的试剂盒及其单独闭管一步法检测新型冠状病毒核酸的方法。
背景技术
新型冠状病毒肺炎(NCP)疫情暴发以来，对病毒的早发现和早识别一直都是疫情防控的源头，这期间快速诊断检测技术在NCP患者临床诊断和疑似患者排查中显示出了极大的应用价值。
目前正在临床使用的实时定量荧光PCR(qPCR)核酸检测试剂盒的迅速上市和临床应用在NCP疫情防控期间发挥了重要作用，但是，受操作繁琐、耗时长、阳性率低、需要集中送检等限制，还不能满足当前快速增长的大量疑似患者、无症状感染者等排查诊断的检测需求。一方面qPCR所需的试剂和设备并不总是容易获得，具有对人员和场所的特殊要求。另一方面该检测技术步骤复杂，操作过程中样品多次暴露于空气中，操作不当容易造成二次污染。
近期随着IgM/IgG抗体检测试剂的研发成功，有望能够弥补核酸检测的缺陷。抗体检测的方法属于免疫学诊断，对病毒感染具有重要的诊断意义。但是在2019-CoV感染初期，病人抗体含量很低，容易导致漏检而造成假阴性。NCP 的早期筛查能够最大程度的阻断病原的更大规模的扩散，防止造成更多人的感染，并且可以让患者第一时间接受治疗，增加治愈率。因此，核酸检测试剂仍是诊断早筛的主要手段。
根据上述分析，想要实现对NCP的早期快速筛查，首先检测装置要一体化，一管式反应，其次该检测技术不应需要精密仪器和严苛的实验条件，最后在结果显示上应直观明了。目前的检测技术利用qPCR过程大量扩增目的片段，并利用标记有荧光的特异性探针检测大量扩增的目的片段。该扩增过程是变温过程，需要反复的热循环及精密仪器。近年来出现及迅猛发展的等温核酸扩增技术有望成为未来发展的新趋势，在恒温条件下可发生快速且高效的扩增反应。其中滚环扩增(RCA)技术和杂交级联扩增技术(HCR)作为常用的等温核酸扩增方法,可以实现目标核酸的短时大量扩增,有着操作简便、特异性强和灵敏度高的特点。并且RCA过程中用到的酶在室温条件下依旧具有较高的活性，可以满足不需要调温设备常温扩增的需求，而HCR过程不需要酶的参与。据大量的研究成果可知在疾病的早期核酸检测和检测分析中RCA和HCR已经成为很有潜力的分析工具。核酸检测的信号输出方式有荧光、颜色、电化学信号等，其中比色具有直观、简便、快速和适合于现场监测的优点。G四链体作为信号输出模块，比色是其最常用的信号输出方式之一。Hemin(氯化血红素)是过氧化氢酶的活性辅助因子，Hemin可以与G四链体结构结合形成G四链体/Hemin拟酶，该拟酶可以替代辣根过氧化酶催化氧化比色反应，如催化H2O2氧化TMB发生变色反应。
为了推进对NCP的诊断，目前急需2019-CoV核酸的现场快速检测产品，缩短检测用时，提升便捷程度，推动诊断前移下移，实现疑似患者的快速诊断和密切接触人群的现场筛查。如何实现单独闭管进行核酸检测一体化，实现“样本进，结果出”的现场快速检测，解决“开盖”问题，是目前亟待解决的一大瓶颈。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速检测的新型冠状病毒的试剂盒及其单独闭管一步法检测新型冠状病毒核酸的方法。
本发明的技术方案如下：本发明的一种单独闭管一步法检测新型冠状病毒核酸的试剂盒，包括引物、挂锁探针和RCA标准品，所述的RCA标准品具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；所述的挂锁探针具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；所述引物具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。
所述的试剂盒包括：引物、挂锁探针、RCA标准品、T4 DNA连接酶、Phi29 DNA聚合酶、RCA缓冲液、dNTP、Hemin和显色液，显色液包括TMB和H2O2。
本发明的一种由2019-CoV RNA驱动的单独闭管一步法检测新型冠状病毒核酸的方法，包括如下步骤：(1)一个用于等温扩增的磷酸化的线性挂锁探针，探针的两端可被2019-CoV RNA的保守序列(即RCA标准品)特异性识别并结合；
(2)当样品中有靶标2019-CoV RNA存在时，挂锁探针与靶标的保守序列特异性杂交，此时溶液中的T4 DNA连接酶将该线性探针连接成环状模板；
(3)以该环状DNA为模板，发生RCA的高效扩增反应，产生富含大量G4 链体的长纳米线，在Hemin的触发下形成Hemin/G4链体拟酶，具有拟酶作用的Hemin/G4链体催化TMB与H2O2溶液的氧化还原反应，进而发生肉眼可辨的颜色变化。
本发明的所述的单独闭管一步法检测新型冠状病毒核酸的试剂盒在检测新型冠状病毒肺炎病中的应用。
有益效果：本发明的2019-CoV核酸的现场快速检测产品，缩短检测用时，提升便捷程度，推动诊断前移下移，实现疑似患者的快速诊断和密切接触人群的现场筛查。为新型冠状病毒肺炎爆发时的快速、准确地诊断大批临床样品，并尽快地控制本病提供了坚实的基础。与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明能被2019-CoV RNA启动的比色生物传感器，用于生物样品中 2019-CoV的直接分析。
(2)本发明实现了单独闭管进行核酸检测一体化，实现“样本进，结果出”的现场快速检测。
(3)本发明由新冠状病毒核酸(2019-CoV RNA)特异性触发的，基于核酸等温扩增的比色生物传感方式的构建及应用。具体为设计一种通过滚环扩增 (RCA)产生大量G4链体纳米线，进而催化显色反应的生物传感技术，该过程被2019-CoV RNA保守序列特异性识别并驱动，实现在复杂的生物样本中对新冠状病毒核酸的快速直接检测与分析。
附图说明
图1为本发明的基于滚环扩增的一步新冠病毒核酸检测原理示意图；
图2为本发明的新冠状病毒RNA特异性识别分析的示意图；
图3为本发明的新冠状病毒RNA检测可行性分析的示意图；
图4为本发明的新冠状病毒RNA检测灵敏度初步分析的示意图；
图5为本发明的基于滚环扩增单独闭管一步检测新冠状病毒核酸的装置模拟图。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明。应该理解的是，这些实施例是本发明的阐释和举例，并不以任何形式限制本发明的范围。
实施例1
本发明的一种单独闭管一步法检测新型冠状病毒核酸的试剂盒，包括引物、挂锁探针和RCA标准品，所述的RCA标准品具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；所述的挂锁探针具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；所述引物具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。
所述的试剂盒包括：引物、挂锁探针、RCA标准品、T4 DNA连接酶、Phi29 DNA聚合酶、RCA缓冲液、dNTP、Hemin和显色液，显色液包括TMB和H2O2。
本发明的一种由2019-CoV RNA驱动的单独闭管一步法检测新型冠状病毒核酸的方法，包括如下步骤：(1)一个用于等温扩增的磷酸化的线性挂锁探针，探针的两端可被2019-CoV RNA的保守序列(即RCA标准品)特异性识别并结合；
(2)当样品中有靶标2019-CoV RNA存在时，挂锁探针与靶标的保守序列特异性杂交，此时溶液中的T4 DNA连接酶将该线性探针连接成环状模板；
(3)以该环状DNA为模板，发生RCA的高效扩增反应，产生富含大量G4 链体的长纳米线，在Hemin的触发下形成Hemin/G4链体拟酶，具有拟酶作用的Hemin/G4链体催化TMB与H2O2溶液的氧化还原反应，进而发生肉眼可辨的颜色变化。
本发明的所述的单独闭管一步法检测新型冠状病毒核酸的试剂盒在检测新型冠状病毒肺炎病中的应用。
试验例1
材料与来源
核酸：核酸序列合成于上海生工生物工程有限公司。
试剂：T4 DNA连接酶和Phi29 DNA聚合酶购于大连宝生物工程有限公司。TMB，H2O2，Tris，HCl,H2SO4,KCl,NaCl和其它一些试剂均购于Sigma-Aldrich 贸易有限公司。
其它器材：Millipore纯水仪；F-7000分光光度计；BioTek酶标仪；Nonodropone 超微量分光光度计。
1、2019-CoV RNA的特异性识别
均一溶液中：将4μL的磷酸化挂锁探针(100nM)，4μL的10×T4连接缓冲液，4μL的靶标RNA溶液(1μM)，27.5μL的DEPC-H2O和0.5μL的 T4 DNA连接酶(5UμL-1)充分混合，于30℃持续反应30min。挂锁探针与靶标杂交，并在T4 DNA连接酶的辅助下环化成滚环扩增所需的模板。
2、RCA产生G4链体纳米线
在上述连接产物中加入10μL的RCA反应混合液，该混合液包含：4μL的 dNTPs(dATP,dGTP,dCTP和dTTP各10mM)，0.5μL的DEPC-H2O和0.5μL 的phi29 DNA聚合酶(10UμL-1)。RCA反应在30℃下持续60min后，于65℃加热10min至酶灭活，然后加入Hemin触发RCA产物折叠成hemin/G4链体 DNA纳米线。
3、Hemin/G4链体拟酶催化显色反应
在比色测定中，将TMB-H2O2底物(分别为1.17mM和2.82mM)加入RCA 产物溶液中，黑暗中孵育30min。经hemin/G-四链体拟酶催化后，TMB溶液由无色逐渐变为蓝色。然后加入75μL的1M H2SO4以停止催化反应。同时，溶液颜色由蓝色变为黄色，在450nm处出现特征吸收峰。用TU-1901紫外可见分光光度计和1cm长的石英比色杯测量吸光度。在550nm～350nm的波长范围内，每隔5s测定溶液的吸收光谱，并在450nm处监测比色法检测2019-CoV RNA 的效率。
试验例2
新冠状病毒RNA检测体系的良好构建是实现灵敏比色检测的基础。完整的病毒RNA检测体系包括以下四部分：RNA的特异性识别，滚环扩增反应体系，信号输出和检测装置的构建。这几个部分的独立运行以及相互之间的有机组合对于构建完整的新冠状病毒检测体系至关重要，我们着重从这四个部分研究其构建及运行机制，并对其各项性能进行全面的评估和优化(附图1)。
根据上述机理，本发明所涉及的这种基于等温扩增的比色生物传感器的构建和应用，其具体实施过程如下：
1、2019-CoV RNA的特异性识别过程研究
能够高特异性的识别样品中的目标病毒RNA是检测准确率的前提与保障。我们将主要采用目前比较认可度高的保守序列作为识别对象，设计一条线性 DNA，该DNA只有在靶标序列存在的情况下才能利用常见的T4连接酶闭合成环。该DNA链在识别目标RNA的同时，设计其特殊的可形成G四链体结构的序列。在该部分我们通过琼脂糖凝胶电泳证实了项目申请中设计的核酸序列可以特异性识别新冠状病毒核酸序列，并顺利进行滚环扩增反应(表1，附图2)。
2、基于滚环扩增产生Hemin/G4链体拟酶的过程研究
通过RCA的高效扩增或产生大量的重复G4序列，这些序列能够在Hemin 的触发下形成Hemin/G4链体拟酶。在该部分，我们将重点从RCA动力学过程，产物的性状鉴定，外界条件对反应的影响等方面研究其运行机制。在本部分我们还将从灵敏度，温和性等几个重要的检测性能角度对体系进行全面改进和优化。我们初步测试了检测体系中有新冠状病毒核酸RNA和新冠状病毒核酸RNA 的紫外可见光吸收光谱，显示出该方法的可行性(附图3)。
3、比色反应过程的研究
在产物解析的基础上，通过引入氧化底物、纳米探针、分子信标、等策略，积极探索和研究适合直接观测的比色信号输出方案。例如TMB/H2O2体系是成熟的用于比色反应的体系，也可以发展小型化便携检测设备的电化学信号输出方案，从而为临床的多元化诊断需求服务。我们利用检测体系对不同浓度的新冠状病毒RNA进行初步比色分析，结果可以看出该体系能够灵敏的分析出低含量的冠状病毒RNA(附图4)。
4、2019-CoV RNA检测装置的构建研究
在该部分，根据上述的研究成果，构建适合于现场检测的便携式装置。为实现单独闭管进行核酸检测一体化，达到“样本进，结果出”的现场快速检测目的，解决“开盖”问题，我们将设备设计成进行分仓反应，混合出结果的模式。一种设想是在试管盖上安装一个反应仓，反应后将反应仓中的液体挤入试管显色；第二种是开关模式，即将试管分成两部分，样品加入左边反应液，反应后打开开关让左右仓混合显色(附图5)。
在本发明的技术构思范围内，可以对本发明中的靶标2019-CoV RNA进行变换，该变换属于本发明的保护范围内。另外需要说明的是，只要不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。
序列表
<110> 南京大学
<120> 一种新型冠状病毒的试剂盒及其单独闭管一步法检测新型冠状病毒核酸的方法
<130> 2019
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 47
<212> RNA
<213> 人工序列(RCA标准品)
<400> 1
cagucuguac cgucugcggu auguggaaag guuauggcug uaguugu 47
<210> 2
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列(挂锁探针)
<400> 2
cataccgcag acggcccgcc ctacccaaaa ctgaacccgc cctaccaaaa cccaacccgc 60
cctaccataa cctttcca 78
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(引物)
<400> 3
tggtgggcgg gttcagtt 18
Claims (4)
1.一种单独闭管一步法检测新型冠状病毒核酸的试剂盒，包括引物、挂锁探针和RCA标准品，其特征在于：所述的RCA标准品具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；所述的挂锁探针具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；所述引物具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的单独闭管一步法检测新型冠状病毒核酸的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包括：引物、挂锁探针、RCA标准品、T4 DNA连接酶、Phi29 DNA聚合酶、RCA缓冲液、dNTP、Hemin和显色液，显色液包括TMB和H2O2。
3.一种由2019-CoV RNA驱动的单独闭管一步法检测新型冠状病毒核酸的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)一个用于等温扩增的磷酸化的线性挂锁探针，探针的两端可被2019-CoV RNA的保守序列(即RCA标准品)特异性识别并结合；
(2)当样品中有靶标2019-CoV RNA存在时，挂锁探针与靶标的保守序列特异性杂交，此时溶液中的T4 DNA连接酶将该线性探针连接成环状模板；
(3)以该环状DNA为模板，发生RCA的高效扩增反应，产生富含大量G4链体的长纳米线，在Hemin的触发下形成Hemin/G4链体拟酶，具有拟酶作用的Hemin/G4链体催化TMB与H2O2溶液的氧化还原反应，进而发生肉眼可辨的颜色变化。
4.权利要求1-3任一项所述的单独闭管一步法检测新型冠状病毒核酸的试剂盒在检测新型冠状病毒肺炎病中的应用。
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