CN113789370B - 一种斑点叉尾鮰养殖池塘施肥方式的鉴别方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种斑点叉尾鮰养殖池塘施肥方式的鉴别方法，通过提取养殖池塘内的斑点叉尾鮰肠道微生物总DNA，以总DNA为模板，针对乳杆菌属Lactobacillus种群16S rDNA基因的DNA序列设计引物，进行PCR扩增，若扩增产物没有1054bp条带，则判定养殖池塘使用的是无机肥。本发明斑点叉尾鮰池塘施肥方式的鉴别方法，可以快速、简便、准确、有效地鉴别斑点叉尾鮰养殖池塘的施肥方式，且操作简单，费用低廉，准确度高，鉴别结果稳定、可靠，能够解决斑点叉尾鮰施肥方式鉴别难的问题。

Description

一种斑点叉尾鮰养殖池塘施肥方式的鉴别方法
技术领域
本发明涉及水产生物鉴定技术领域，具体涉及一种斑点叉尾鮰养殖池塘施肥方式的鉴别方法。
背景技术
斑点叉尾鮰又称沟鲇，原产于北美，是美国最主要的淡水养殖鱼类，其肉质鲜、抗病力强、生长迅速、易起捕、适温较广，1980年代引入我国后，产业发展迅速，年产量已经突破30万吨，经过我国水产养殖业的不断改进和创新，我国斑点叉尾鮰的养殖规模、单位养殖产出等方面已经全面超越美国，取得较好的经济效益。在我国水产科技工作者总结出来的养殖八字经中第一个就是强调水，养鱼先养水已经成为水产养殖的先决条件。所谓养水就是通过不同的管理措施，保证池塘养殖水体肥、活、爽。这其中，施肥是水产养殖中普遍使用的操作，其目的是通过有机肥或无机肥的使用，增加浮游植物的生物量，提高池塘生产力，经过食物网复杂的吸收和循环过程，最终提高养殖鱼类的产量。
使用有机肥和无机肥会对养殖水体浮游动、植物群落产生不同的影响。无机肥施用池塘，总藻类生物量、绿藻生物量和硅藻生物量显著高于有机肥施用池塘。桡足类和枝角类等浮游动物是浮游群落中初级生产者向更高营养水平转移能量的主要通道。桡足类被发现会根据藻类的营养状况对食物颗粒进行主动的鉴别与选择，而枝角类主要根据食物的颗粒大小和形状进行选择。由于食草浮游动物群落与浮游植物群落直接相关，因此施用不同的肥料也会对浮游动物群落的组成造成影响。美国相关研究通过斑点叉尾鮰池塘施用不同肥料对浮游动、植物群落结构的影响分析，形成了斑点叉尾鮰养殖施肥推荐方案，即，使用无机肥可以使斑点叉尾鮰生长和养殖经济效益最大化。但是，在中国，肥料的成本、人工成本与美国存在差异，因此，养殖池塘的无机肥和有机肥使用情况都有存在。目前对于斑点叉尾鮰无法对其养殖过程中的施肥方式进行鉴别。因此建立斑点叉尾鮰施肥方式的鉴别方法，将对养殖斑点叉尾鮰的养殖过程追溯提供技术支撑。
发明内容
发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种斑点叉尾鮰养殖池塘施肥方式的鉴别方法。
技术方案：为实现上述目的，本发明提供一种斑点叉尾鮰养殖池塘施肥方式的鉴别方法，其包括以下步骤，(1)提取养殖池塘内的斑点叉尾鮰肠道微生物总DNA；(2)以总DNA为模板，针对乳杆菌属Lactobacillus种群16S rDNA基因的DNA序列设计引物，进行PCR扩增，若扩增产物没有1054bp条带，则判定养殖池塘使用的是无机肥。
优选的，步骤(1)中所述提取，其为通过采集养殖池塘内的斑点叉尾鮰肠道微生物，提取微生物总DNA。
优选的，步骤(2)中，所述引物，其正向引物SEQ ID NO:1序列为5'-TCTGGTATTGATTGGTGCTTG-3'，反向引物SEQ ID NO:2序列为5'-GCGGGACTTAACCCAACATC-3'。
优选的，步骤(2)中，所述进行PCR扩增，其反应体系为50μL：1μL模板DNA(50ng/μL)；PCR缓冲液5μL(10mmol/L Tris-HCl，pH9.0，0.5mmol/L KCl，30mmol/L MgCl 2，0.01％明胶)；dNTP混合液4μL(每种dNTP 0.1mmol/L)；上、下游引物(10μmol/L)各1μL，2μL Taq酶(2IU)；双蒸水36μL。
优选的，步骤(2)中，所述进行PCR扩增，其扩增反应程序为：94℃预变性2min，94℃变性45s，60℃退火1min，72℃延伸1min，经30个循环后再72℃延伸10min。
作为本发明的另一方面，本发明提供一种用于斑点叉尾鮰养殖池塘施肥方式的鉴别引物或试剂盒，其包含正向引物和反向引物，其中正向引物SEQ ID NO:1序列为5'-TCTGGTATTGATTGGTGCTTG-3'，反向引物SEQ ID NO:2序列为5'-GCGGGACTTAACCCAACATC-3'。
本发明的有益效果如下：
本发明斑点叉尾鮰养殖池塘施肥方式的鉴别方法，可以快速、简便、准确、有效地鉴别斑点叉尾鮰养殖的施肥方式，且操作简单，费用低廉，准确度高，鉴别结果稳定、可靠，能够解决斑点叉尾鮰养殖池塘的施肥方式鉴别难题，对养殖斑点叉尾鮰的养殖过程追溯提供技术支撑。
附图说明
图1为微生物物种组成分析的Ternary三元相图；
图2为本发明中施用有机肥池塘的个体和施用无机肥池塘的个体肠道菌群DNA的PCR扩增产物电泳图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本申请作进一步说明。
实施例1：
试验池塘1.5亩共9口，分为有机肥、无机肥和不施肥3组，每组各3个平行。池塘养殖开始前，排干，强氯精泼洒清塘，杀除野杂鱼后，加水至1.2m。一周后，5月30日开始施肥。无机肥组按照20kg/公顷N和2kg/公顷P施加尿素(江苏灵谷化工集团有限公司，TN≥46％)和复合肥(河南保利化肥有限公司，N:P 2 O 5:K 2 O＝16:16:16)；有机肥组施加多功能生物1型水产专用肥(江苏立华生物肥料有限公司，总养分≥5％，有机质≥54％)，按照用量说明每口池塘施用120kg。肥料颗粒水溶开后，全池均匀泼洒，第2-4周用量减半每周继续施肥一次。6月28日每口池塘放入8000尾斑点叉尾鮰鱼种(平均21g/尾)。每日早晚两次投喂漂浮性颗粒配合饲料(蛋白含量35％)，饲料投喂量为鱼体重4％左右。养殖2个半月后，9月14日撒旋网采集9口池塘的斑点叉尾鮰，每口池塘5尾，合计每组15尾个体。采集肠道微生物，取样前使用60mg/L丁香酚对斑点叉尾鮰进行麻醉，解剖取出肠道，用镊子去除肠道外壁多余的脂肪组织后再用生理盐水漂洗，漂洗完成后，将肠道组织剪短放入无菌离心管，液氮中冻存。实验室里利用Qiagen DNeasy Blood&Tissue Kit试剂盒提取微生物总DNA。对总DNA的浓度和纯度利用NanoDrop2000进行检测，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量；以总DNA为模板，用338F和806R为上下游引物对16S rRNA基因的V3-V4可变区进行PCR扩增。扩增体系为20μl，4μl 5×FastPfu缓冲液，2μl 2.5mM dNTPs，0.8μl引物(5μM)，0.4μlFastPfu聚合酶；10ng DNA模板。扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共25个循环；最后72℃退火6min。使用2％琼脂糖凝胶回收PCR产物，利用AxyPrepDNA Gel Extraction Kit进行纯化，Tris-HCl洗脱，2％琼脂糖电泳检测，利用QuantiFluorT M-ST进行检测定量，根据Illumina MiSeq平台标准操作规程将纯化后的扩增片段构建PE 2×300的文库。原始测序序列使用Trimmomatic软件质控，使用FLASH软件进行拼接，去除长度低于50bp及以下的序列、错配序列以及无法拼接的序列；使用UPARSE软件，根据97％的相似度对序列进行OTU聚类；使用UCHIME软件剔除嵌合体；利用RDPclassifier对每条序列进行物种分类注释。
将处理的数据进行物种组成分析，Ternary三元相图，如图2和表1，发现，在属水平上，无机肥、有机肥和不施肥组三组中，微生物乳杆菌属Lactobacillus种群特异性的出现在有机肥和不施肥组中，其中有机肥组相对含量83.4％，不施肥组相对含量16.6％，而无机肥组不含有乳杆菌属Lactobacillus种群。
表1三种施肥方法下斑点叉尾鮰肠道菌群属级组成
菌属含量占比％有机肥组Y不施肥组C无机肥组W Romboutsia 15.8 57.2％2.73％ 40.1％ Turicibater 7.26 37.3％ 16.4％ 46.3％ Bateroidales 6.77 86.7％1.3％ 12.0％ Lactobacillus 4.45 83.4％ 16.6％ 0％ Clostridium 3.26 23.1％1.2％ 75.7％ Terrisporobacter 2.84 16.5％ 4.2％ 79.3％ Odoribacter 2.2311.5％ 1.4％ 87.1％ Chloroplast 1.89 50.5％ 27.8％ 21.7％ Escherichina-Shigella 1.50 0.2％ 61.8％ 38.0％ Geitlerinema_PCC-7105 1.31 99.7％ 0.1％0.2％ Acinetobacter 1.07 32.7％ 30.3％ 37.0％ Mycobacterium 1.03 0.3％ 90.8％8.9％ Bacteroides 1.02 4.4％ 42.1％ 53.5％ Others(<1％)49.57 28.7％ 56.1％15.2％
Others包含相对含量<1％的菌属，主要包括Epulopiscium(0.84％)、Aeromonas(0.80％)、Klesiella(0.67％)和Clostridium_Sensus_stricto_1(0.61％)等菌属。
针对使用无机肥/不施肥池塘组特异性的肠道微生物乳杆菌属Lactobacillus种群16SrDNA基因的DNA序列(SEQ ID NO:3)设计一对扩增用的特异性引物，使用上述的引物对进行PCR扩增，如果所提斑点叉尾鮰肠道DNA不能扩增出16S rDNA基因长度1054bp的条带，则证明该斑点叉尾鮰养殖过程施肥使用的为无机肥。
特异性引物和乳杆菌属Lactobacillus种群16S rDNA基因的DNA序列信息如下：
正向引物F:5'-TCTGGTATTGATTGGTGCTTG-3'(SEQ ID NO:1)；
反向引物R:5'-GCGGGACTTAACCCAACATC-3'(SEQ ID NO:2)
>Lactobacillus sp.16S rRNA gene(SEQ ID NO:3)
AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAACGAACTCTGGTATTGATTGGTGCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGTTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGCATTGACGGTATTTAACCAGAGAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAAATCTAAGAGATTAGACGTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGGTGGTGCATGATTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTATCAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAACTCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTAGGAACCAGCCGCCTAAGGTGGGACAGATGATTAGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTAGGAGAACCTGCGGCTGGATCACCTCCTT
实施例2：
从江苏浦口、扬中斑点叉尾鮰养殖池塘采集施用有机肥的斑点叉尾鮰20尾，从大丰、建湖、响水、东台、海安、如东等地斑点叉尾鮰养殖池塘采集施用无机肥的斑点叉尾鮰60尾。养殖开始时前，按照常规养殖管理施肥。所使用的有机肥为市场销售的正规厂家生产的袋装有机肥颗粒，无机肥为市售农用常规袋装尿素和复合肥。采样塘口养殖开始时间从3月中下旬到4月中旬不等，起始放养重量50g左右。采样时间为5-7月中旬，为施肥后2-3个月，平均体重267g。
在塘口采集每尾斑点叉尾鮰肠道内容物，装入离心管液氮快速冷冻，回实验室后提取肠道菌群DNA，用特异性引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2进行PCR扩增。
PCR反应体系为50μL：1μL模板DNA(50ng/μL)；PCR缓冲液5μL(10mmol/LTris-HCl，pH9.0，0.5mmol/L KCl，30mmol/L MgCl 2，0.01％明胶)；dNTP混合液4μL(每种dNTP0.1mmol/L)；上、下游引物(10μmol/L)各1μL，2μLTaq酶(2IU)；双蒸水36μL。扩增反应程序为：94℃预变性2min，94℃变性45s，60℃退火1min，72℃延伸1min，经30个循环后再72℃延伸10min。#
PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶电泳中检测分离，120V电压下电泳30min之后，经凝胶成像分析系统确定PCR扩增产物的大小及纯度。
根据凝胶电泳图谱(图2)判断养殖池塘方法，养殖过程中使用有机肥的池塘的斑点叉尾鮰全部有1054bp的条带，使用无机肥池塘的斑点叉尾鮰个体没有条带。
本发明提供一种斑点叉尾鮰养殖池塘施肥方式的鉴别方法。通过采集有机肥、无机肥和不施肥池塘的斑点叉尾鮰，通过肠道菌群分析，筛选出特异性微生物乳杆菌属Lactobacillus种群。针对该种群的特征DNA序列综合设计特异性的引物对(上游引物SEQIDNO.1、下游引物SEQ ID NO.2)，PCR扩增获得鉴别使用无机肥池塘斑点叉尾鮰的“分子指纹图谱”，并开发成试剂盒。本发明斑点叉尾鮰养殖池塘施肥方式的鉴别方法，可以快速、简便、准确、有效地鉴别养殖过程的施肥方式，且操作简单，费用低廉，准确度高，鉴别结果稳定、可靠，能够解决斑点叉尾鮰养殖池塘的施肥方式鉴别难题，对养殖斑点叉尾鮰的养殖过程追溯提供技术支撑。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (3)

1.一种斑点叉尾鮰养殖池塘施肥方式的鉴别方法，其特征在于：包括以下步骤，
（1）池塘分为有机肥池塘、无机肥和复合肥池塘和不施肥池塘，均投放斑点叉尾鮰鱼种后投喂漂浮性颗粒配合饲料，养殖两个半月后收集斑点叉尾鮰样本，采集斑点叉尾鮰肠道微生物，提取微生物总DNA；所述有机肥池塘施加多功能生物1型水产专用肥，总养分≥5％，有机质≥54％；所述无机肥和复合肥池塘按照20kg/公顷N和2kg/公顷P施加尿素和复合肥，所述复合肥元素比N:P2O5:K2O＝16:16:16；
（2）以总DNA为模板，针对乳杆菌属 Lactobacillus 种群16S rDNA基因的V3-V4可变区进行设计引物，进行PCR扩增，若扩增产物没有1054bp条带，则判定养殖池塘使用的是无机肥；所述引物，其正向引物SEQ ID NO:1序列为5'-TCTGGTATTGATTGGTGCTTG-3'，反向引物SEQ ID NO:2序列为5'-GCGGGACTTAACCCAACATC-3'。
2.如权利要求1所述的斑点叉尾鮰养殖池塘施肥方式的鉴别方法，其特征在于：步骤（2）中，所述进行PCR扩增，其反应体系为50 mL：1 mL 50ng/μL模板DNA；PCR缓冲液 5 mL；dNTP混合液4mL；10 μmol/L上、下游引物各1 mL，2mL 2 IU Taq酶；双蒸水36mL；
所述PCR缓冲液由10mmol/L Tris-HCl，pH9.0， 0.5mmol/L KCl，30mmol/L MgCl2 ，0.01%明胶组成；
所述dNTP混合液4mL，其中每种dNTP 0.1mmol/L。
3.如权利要求1所述的斑点叉尾鮰养殖池塘施肥方式的鉴别方法，其特征在于：步骤（2）中，所述进行PCR扩增，其扩增反应程序为：94 ℃预变性2 min，94 ℃变性45 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，经30个循环后再72 ℃延伸10 min。
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