CN101624633A

CN101624633A - 牙鲆弹状病毒的逆转录-聚合酶链式反应快速检测方法

Info

Publication number: CN101624633A
Application number: CN200910013172A
Authority: CN
Inventors: 孙颖杰; 岳志芹; 刘荭; 吴斌; 李叶
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2009-08-13
Filing date: 2009-08-13
Publication date: 2010-01-13
Anticipated expiration: 2029-08-13
Also published as: CN101624633B

Abstract

本发明涉及生物技术领域。一种牙鲆弹状病毒的逆转录－聚合酶链式反应检测方法，牙鲆弹状病毒的逆转录－聚合酶链式反应快速检测方法，首先设计特异性引物，然后提取待测样品的RNA，再进行逆转录－聚合酶链式反应，最后通过琼脂糖凝胶电泳进行结果判定。本发明具有快速，准确、特异性好、灵敏度高的优点，适合对牙鲆弹状病毒的快速检验检疫，可以应用于水产养殖场以及检验检疫部门，应用前景广泛。

Description

牙鲆弹状病毒的逆转录-聚合酶链式反应快速检测方法

技术领域：

本发明属于水产动物病原的检测与诊断技术，特别是牙鲆弹状病毒的检测方法。

背景技术：

牙鲆弹状病毒(Hirame rhabdovirus，简称HRV)病毒粒子呈枪弹形，大小为80nm×160-180nm，1986年日本首次报道。我国黄海、渤海近岸等地养殖的牙鲆已被发现有此病症。发病季节为冬季和早春，鱼体发病时，水温一般都在15℃以下。本病主要危害牙鲆，人工感染对真鲷、黑鲷有强烈的致病性，从香鱼和无备平鮋中也分离到此病毒，对虹鳟也有致病作用。幼苗期和仔鱼期的鱼体易患此病。感染牙鲆弹状病毒的病鱼体表和鳍充血或出血，腹部膨胀，内有腹水。解剖鱼体，肌肉、肠黏膜的固有层出血，生殖腺的结缔组织充血或出血。

中国国家质量监督检验检疫总局与韩国海洋水产部于2005年发布的《中韩进出口活水生动物检验检疫协议》中规定，我国出口到韩国的鲈鱼、真鲷、大菱鲆、牙鲆等鱼类必须进行牙鲆弹状病毒的检验检疫。因此，迫切需要建立快速、灵敏、准确的牙鲆弹状病毒的检测方法，打破国外技术壁垒，为国家贸易服务。目前鱼类病毒的检测方法主要包括细胞学诊断技术、免疫学诊断技术、分子生物学诊断技术三大类：细胞学诊断技术主要包括采用细胞培养分离病毒、组织病理切片及电镜观察，其操作繁琐，检测周期长，且灵敏度低；免疫学诊断技术主要包括免疫荧光检测、免疫点杂交，其方法具有特异性强、敏感性高的优点，但方法相当繁琐，不适宜对大量样品进行检测；分子生物学诊断技术主要包括聚合酶链式反应(PCR)，比较快速、灵敏，目前被广泛应用于检测鱼类病毒，如传染性造血器官坏死病毒、锦鲤疱疹病毒、传染性胰脏坏死病毒、真鲷虹彩病毒等，据检索，目前尚未见采用RT-PCR技术检测牙鲆弹状病毒的报道。

发明内容：

本发明的目的是克服上述不足问题，提供一种牙鲆弹状病毒的逆转录-聚合酶链式反应快速检测方法，利用RT-PCR快速检测牙鲆弹状病毒，该方法灵敏度高，特异性好，准确度高，可以应用于水产养殖业和国际鱼类贸易中对牙鲆弹状病毒进行快速检测。

本发明为实现上述目的所采用的技术方案是：牙鲆弹状病毒的逆转录-聚合酶链式反应快速检测方法，首先设计特异性引物，然后提取待测样品的RNA，再进行逆转录-聚合酶链式反应，最后通过琼脂糖凝胶电泳进行结果判定。

所述特异性引物对GF/GR，扩增的目的核酸带大小为515bp，其序列如下：

GF：5′-GTGCCAATGGTACACGGACAA-3′

GR：5′-TGATCTCCGCATGTGCCTCTA-3′。

所述提取待测样品的RNA：解剖待检测的鱼类样品，取脑、肾、脾等组织进行匀浆，采用传统的TRIZOL法或者商业化的RNA提取试剂盒提取RNA，之后用核酸分析仪进行OD₂₆₀/OD₂₈₀检测纯度，调整RNA浓度为100ng/μL。

所述逆转录-聚合酶链式反应：

(1)逆转录合成cDNA：取待测样品的RNA模板10μL，加入PCR反应管中，再加入引物GF 1μL、GR 1μL，水3μL；充分混匀后70℃温浴10min，迅速冰浴5min；再加入5×AMV buffer(缓冲剂)5μL，dNTPs(各10mM)2μL，RNase Inhibitor(核糖核酸酶抑制剂，浓度20U/μL)1μL，水1μL，AMV Reverse Transcriptase(反转录酶，浓度5U/μL)1μL，使反应总体积为25μL，轻弹管壁混匀，稍离心后42℃保温30-60min，得到cDNA产物；

(2)PCR扩增：取10×PCR buffer(10mM)5μL，dNTPs(10mM)1μL，25mM的MgCl₂ 3μL，引物GF 1-2μL、GR 1-2μL，cDNA产物2μL，Taq DNA Polymerase(聚合酶，浓度5U/μL)1μL，水34-36μL，使反应总体积为50μL，轻弹管壁混匀，稍离心后，进行PCR反应，反应程序为：94℃，预变性5min；94℃变性1min、52-58℃退火1min、72℃延伸2min，共35个循环，最后72℃延伸10min。

所述电泳检测：取5μL逆转录-聚合酶链式反应的PCR产物，与2μL浓度0.25％溴酚蓝上样缓冲液混合，在含有溴化乙锭浓度为0.5g/ml的1.0％琼脂糖凝胶中进行电泳和染色，在透射紫外灯下观察，如果有515bp的核酸条带，说明样品中有牙鲆弹状病毒，反之如果没有515bp的核酸条带，说明样品中没有牙鲆弹状病毒。

本发明采用逆转录-聚合酶链式反应(reversetranscription-polymerase chain reaction，简称RT-PCR)技术检测鱼类牙鲆弹状病毒的方法，适用于对牙鲆弹状病毒进行快速检测，可广泛应用于鱼类特别是牙鲆、鲈鱼、大菱鲆、真鲷等养殖场的疫病监控及进出口贸易中牙鲆弹状病毒的检测。与现有技术相比，本发明的有益效果包括：(1)检测快速、效率高：从核酸提取、逆转录(RT)和聚合酶链反应(PCR)到结果判定仅需要6小时；一次可以进行多个样品的检测，具有高效性。(2)检测准确：特异性引物只与牙鲆弹状病毒特异性地结合，与其他鱼类病毒都没有交叉反应。(3)灵敏度高。

附图说明

图1是牙鲆弹状病毒的电泳检测图。

图中1：分子量标准2：牙鲆弹状病毒515bp的扩增片段。

具体实施方式：

下面通过具体实施例对本发明作进一步阐述。

实施例1：以牙鲆样品为例对牙鲆弹状病毒进行检测。

牙鲆样品采自黄海岸某养殖场，具有感染疫病的临床症状，体表和鳍充血或出血，腹部膨胀，内有腹水。解剖鱼体，肌肉、肠黏膜的固有层出血，生殖腺的结缔组织充血或出血。

具体检测步骤如下：

1.设计特异性引物：

在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/中搜索牙鲆弹状病毒的序列，利用已有的DNA LASERGENE 7.1软件分析比较各个基因序列的保守性，结果表明牙鲆弹状病毒的糖蛋白基因序列比较保守；因此，以糖蛋白基因为目标基因，利用Primer Express2.0软件设计特异性引物序列；设计的引物其退火温度(melting temperature，简称Tm)值在57℃-63℃之间，不具有二级结构，两条引物的Tm值相差2℃以内，且不形成引物二聚体。引物序列如下：

GF：5′-GTGCCAATGGTACACGGACAA-3′

GR：5′-TGATCTCCGCATGTGCCTCTA-3′。

扩增片断长度为515bp。

设计好特异性引物序列和荧光探针序列后，通过TAKARA商业公司，采用β-乙腈亚磷酸胺化学合成法，使用全自动DNA合成仪进行特异性引物的合成。

2.提取待测样品的RNA：

解剖待检测的鱼类样品，取脑、肾、脾等组织进行匀浆，采用商业化的试剂盒PureLink^TM Viral RNA/DNA Mini Kit(invitrogen)提取RNA，之后用核酸分析仪进行D₂₆₀/OD₂₈₀检测，调整RNA浓度为100ng/μL。

3.逆转录-聚合酶链式反应：

(1)逆转录合成cDNA：取待测样品的RNA模板10μL，加入PCR反应管中，再加入引物GF 1μL、GR 1μL，水3μL；充分混匀后70℃温浴10min，迅速冰浴5min；再加入5×AMV buffer 5μL，dNTPs(各10mM)2μL，RNase Inhibitor(20U/μL)1μL，水1μL，AMVReverse Transcriptase(5U/μL)1μL，使反应总体积为25μL。轻弹管壁混匀，稍离心后42℃保温30-60min，得到cDNA产物。

(2)PCR扩增：取10×PCR buffer 5μL，dNTPs(各10mM)1μL，25mM MgCl₂ 3μL，引物GF 1μL、GR 1μL，cDNA产物2μL，Taq DNA Polymerase(5U/μL)1μL，水34-36μL，使反应总体积为50μL。轻弹管壁混匀，稍离心后，进行PCR反应，反应程序为：94℃，预变性5min；94℃变性1min、52℃退火1min、72℃延伸2min，共35个循环，最后72℃延伸10min。

4.电泳检测：

取5μL PCR产物，与2μL0.25％溴酚蓝上样缓冲液混合，在含有溴化乙锭浓度为0.5μg/ml的1.0％琼脂糖凝胶中进行电泳和染色，在透射紫外灯下观察，有515bp的核酸条带，说明牙鲆样品中感染牙鲆弹状病毒。

实施例2：分析外观健康的真鲷是否感染牙鲆弹状病毒。

真鲷样品采自黄海南边岸某养殖场，外观正常，检测体内是否携带牙鲆弹状病毒。

1.设计特异性引物：同实施例1。

2.提取待测样品的RNA：

采用传统的TRIZOL法进行RNA的提取。解剖真鲷，取脑、肾、脾等组织进行匀浆，加入600μL裂解液，颠倒混匀，再加入200μL氯仿，混匀器上震荡混匀5sec。于4℃12000rpm离心15min。吸取上清液500μL，加入400μL异丙醇，-20℃放置30分钟。12000rpm离心15min，倒去上清；然后加入600μL75％乙醇，洗涤沉淀，于12000rpm离心5min，轻轻倒去上清。将RNA沉淀室温干燥3min后，加入20μL水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA。2000rpm离心5sec，在冰上保存备用。之后用核酸分析仪进行检测，结果表明样品核酸的OD₂₆₀/OD₂₈₀在1.8-2.0之间，调整RNA浓度为100ng/μL。

3.逆转录-聚合酶链式反应

(2)PCR扩增：取10×PCR buffer 5μL，dNTPs(各10mM)1μL，25mM MgCl₂ 3μL，引物GF 2μL、GR 2μL，cDNA产物2μL，Taq DNA Polymerase(5U/μL)1μL，水34μL，使反应总体积为50μL。轻弹管壁混匀，稍离心后，进行PCR反应，反应程序为：94℃，预变性5min；94℃变性1min、58℃退火1min、72℃延伸2min，共35个循环，最后72℃延伸10min。

4.电泳检测：

取5μL PCR产物，与2μL0.25％溴酚蓝上样缓冲液混合，在含有溴化乙锭浓度为0.5μg/ml的1.0％琼脂糖凝胶中进行电泳和染色，在透射紫外灯下观察，没有515bp的核酸条带，说明真鲷样品中没有感染牙鲆弹状病毒。

SEQUENCE LISTING

<110>孙颖杰、岳志芹、刘荭、吴斌、李叶

<120>牙鲆弹状病毒的逆转录-聚合酶链式反应快速检测方法

<160>2

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<221>prim_bind

<222>(1)...(21)

<223>根据PCR反应要求设计，用于检测牙鲆弹状病毒的正向引物

<400>1

gtgccaatgg tacacggaca a 21

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<221>prim_bind

<222>(1)...(21)

<223>根据PCR反应要求设计，用于检测牙鲆弹状病毒的反向引物

<400>2

tgatctccgc atgtgcctct a 21

Claims

1、一种牙鲆弹状病毒的逆转录-聚合酶链式反应检测方法，其特征是：牙鲆弹状病毒的逆转录-聚合酶链式反应快速检测方法，首先设计特异性引物，然后提取待测样品的RNA，再进行逆转录-聚合酶链式反应，最后通过琼脂糖凝胶电泳进行结果判定。

2、根据权利要求1所述的一种牙鲆弹状病毒的逆转录-聚合酶链式反应检测方法，其特征是：特异性引物对GF/GR，扩增的目的核酸带大小为515bp，其序列如下：

GF：5′-GTGCCAATGGTACACGGACAA-3′

GR：5′-TGATCTCCGCATGTGCCTCTA-3′。

3、根据权利要求1所述的一种牙鲆弹状病毒的逆转录-聚合酶链式反应检测方法，其特征是：提取待测样品的RNA：解剖待检测的鱼类样品，取脑、肾、脾等组织进行匀浆，采用传统的TRIZOL法或者商业化的RNA提取试剂盒提取RNA，之后用核酸分析仪进行OD₂₆₀/OD₂₈₀检测纯度，调整RNA浓度为100ng/μL。

4、根据权利要求1所述的一种牙鲆弹状病毒的逆转录-聚合酶链式反应检测方法，其特征是：逆转录-聚合酶链式反应：

(2)PCR扩增：取10×PCR buffer(10mM)5μL，dNTPs(10mM)1μL，25mM MgCl₂3μL，引物GF 1-2μL、GR 1-2μL，cDNA产物2μL，Taq DNA Polymerase(聚合酶，浓度5U/μL)1μL，水34-36μL，使反应总体积为50μL，轻弹管壁混匀，稍离心后，进行PCR反应，反应程序为：94℃，预变性5min；94℃变性1min、52-58℃退火1min、72℃延伸2min，共35个循环，最后72℃延伸10min。

5、根据权利要求1所述的一种牙鲆弹状病毒的逆转录-聚合酶链式反应检测方法，其特征是：电泳检测：取5μL逆转录-聚合酶链式反应的PCR产物，与2μL浓度0.25％溴酚蓝上样缓冲液混合，在含有溴化乙锭浓度为0.5μg/ml的1.0％琼脂糖凝胶中进行电泳和染色，在透射紫外灯下观察，如果有515bp的核酸条带，说明样品中有牙鲆弹状病毒，反之如果没有515bp的核酸条带，说明样品中没有牙鲆弹状病毒。