CN115267185A - 幽门螺旋杆菌抗原胶体金检测试剂条 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于检测幽门螺旋杆菌的中空银铂纳米颗粒免疫层析试纸条，旨在提供一种实现胃幽门螺旋杆菌的灵敏特异、快速地检测的试纸条；其技术方案包括底板，所述的底板表面从加样端开始依次排列的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述结合垫上包被中空银铂纳米颗粒标记幽门螺杆菌多克隆抗体，所述硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线；所述检测线上包被有抗幽门螺旋杆菌单克隆抗体；所述质控线上包被有羊抗兔IgG多克隆抗体；涉及生物检测领域。

Description

幽门螺旋杆菌抗原胶体金检测试剂条
技术领域
本发明涉及生物检测领域，特别是涉及一种幽门螺旋杆菌抗原胶体金检测试剂条。
背景技术
幽门螺旋杆菌(Helicobacter Pylori，简称HP)是一种生活在人胃黏膜的多鞭毛、螺旋形的革兰氏阴性细菌。幽门螺旋杆菌专性微需氧，生长营养要求高，且生长缓慢，通常需要3～5天才形成菌落，对低PH比一般细菌有较强耐受力。HP对胃上皮细胞有特殊的亲和性，自然条件下，大量HP主要出现在胃上皮细胞表面、细胞间隙及胃小凹中。
胃幽门螺旋杆菌在世界不同种族、不同地区的人群中均有感染，可以说是成年人中最广泛的慢性细菌性感染。感染率随年龄增加而上升，发展中国家约为80％，发达国家约为40％。我国20岁-40岁的感染率为45.4％-63.6％，70岁以上的感染率高达78.9％。因此，检测人血液中是否存在HP抗体对于诊断HP感染具有非常现实的临床意义。
免疫层析技术是上世纪八十年代发展起来的一种快速免疫分析技术。免疫层析技术的基本原理是，被检测的样品通过毛细作用，在条状纤维(如硝酸纤维素膜、玻璃纤维等)制成的膜.上移动，其中的待测物与膜上一定区域的配体(一般为抗原、抗体、核酸等物质)结合，然后通过酶促显色反应或直接使用着色标记物，短时间内便可得到直观的结果。
抗原和对应抗体在一定条件下特异结合形成可逆性的抗原-抗体复合物的过程被称为抗原一抗体生物学反应，亦称免疫反应。抗原和抗体反应具有高度的特异性，该反应是分子表面的结合，反应产物相对比较稳定，但因抗体和抗原本身并未受到破坏，它们依旧可以分离。抗原抗体反应主要可以分为两个阶段。首先是抗原和抗体的特异性结合阶段，该阶段使亲水系统变更为疏水系统，反应一般较快，一般耗时数秒钟到数分钟，无可见反应。第二阶段为免疫反应的可见阶段，一般会出现沉淀和凝集等宏观现象，该反应时间一般为几分钟到几十分钟，易受电解质、温度和酸碱度等外界因素的影响。
现有检测幽门螺旋杆菌的常用方法如碳14呼气试验需要专用设备，废弃物需特殊处理，存在放射线，不适合儿童和孕妇检查，不能自查。唾液PCR技术需要专用设备并在实验室完成，时间长，费用高，不能自查。幽门螺旋杆菌IgG系列抗体血清学检测以血液为标本，需在实验室完成，实验结果不能判断是现症感染或是既往感染，不适合治疗后复查，不能自查。以双抗夹心法制备的粪便幽门螺杆菌抗原检测试剂条，以两种抗幽门螺杆菌多克隆抗体或单克隆抗体为基础，制备复杂，生产成本较高，不利于大规模生产。
所以，本发明基于竞争法，制备了一种幽门螺旋杆菌抗原检测试纸条，该种方法快速、准确、灵敏度高、生产成本更低且不需要任何大型设备就能检测HP，有利于幽门螺杆菌检测在基层的普及与推广应用，对胃幽门螺旋杆菌导致的慢性胃炎、胃溃疡以及十二指肠溃疡甚至胃癌的防治具有重大的临床意义。
发明内容
针对以上现有技术存在的缺点和不足，本发明的目的是提供一种用于检测幽门螺旋杆菌的中空银铂纳米颗粒免疫层析试纸条，实现胃幽门螺旋杆菌(HP)的灵敏特异、快速地检测。
为此，本发明提供的技术方案是这样的：
一种幽门螺旋杆菌抗原胶体金检测试剂条，包括底板，所述的底板表面从加样端开始依次排列的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述结合垫上包中空银铂纳米颗粒标记幽门螺杆菌多克隆抗体，所述硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线；所述检测线上包被有抗幽门螺旋杆菌单克隆抗体；所述质控线上包被有羊抗兔IgG多克隆抗体。
进一步的，上述的幽门螺旋杆菌抗原胶体金检测试剂条，所述抗幽门螺杆菌多克隆抗体通过下述方法制备的：
1)用经灭活纯化的幽门螺杆菌抗原去多次免疫新西兰白兔，取血，获得多克隆抗体；该多克隆抗体经过电泳分析，效价测定及特异性的比较后，得多克隆抗体，冷冻备用；
2)将步骤1)制备的多克隆抗体经硫酸铵分级抽提、PBS透析、离心、收集后即得纯化多克隆抗体。
进一步的，上述的幽门螺旋杆菌抗原胶体金检测试剂条，所述的中空银铂纳米颗粒通过下述方法制备的：
1)将50μL 0.1M抗坏血酸倒入49mL沸水，1min后加入1mL含有0.01g柠檬酸钠的溶液和1mL含有2.5mg AgNO3的溶液混合，继续煮沸1h形成含球形银纳米颗粒的浑浊液，冷却备用；
2)将10mg聚氧乙烯十六烷基醚加入10ml步骤1)含球形银纳米颗粒的浑浊液中，超声分散均匀，然后加入300uL 20mM氯金酸和75μL 0.1M抗坏血酸，混合均匀继续搅拌5小时，获得了中空银铂纳米颗粒粗品；
3)步骤2)所制备的中空银铂纳米颗粒粗品依次采用乙醇和去离子水离心除去过量的聚氧乙烯十六烷基醚，再在真空条件下干燥。
进一步的，上述的幽门螺旋杆菌抗原胶体金检测试剂条，所述结合垫上包被幽门螺杆菌多克隆抗体胶体结合记物的方法是将含中空银铂纳米颗粒的浑浊液和抗幽门螺旋杆菌多克隆抗体按照体积比100∶2混匀，采用缓冲液稀释后喷涂到结合垫上，干燥后获得。
进一步的，上述的幽门螺旋杆菌抗原胶体金检测试剂条，所述的100毫升缓冲液为含20毫克磷酸氢二钠、290毫克磷酸二氢钠、800毫克氯化钠加、1克牛血清白蛋白、0.025克吐温、1克PEG2000、5克蔗糖和2克海藻糖配置而成。
进一步的，上述的幽门螺旋杆菌抗原胶体金检测试剂条，所述的表面活性剂为聚氧乙烯十六烷基醚。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供的幽门螺旋杆菌抗原胶体金检测试剂条适用于体外检测人粪便的幽门螺杆菌抗原，性能良好，不需要任何特殊仪器设备，检测成本低；操作简便，不需要专业人员操作，检测灵敏度高，可用于临床检测。
附图说明
图1是本发明试纸条定量检测幽门螺杆菌抗体试剂条的结构示意图；
图中标记：1-底板，2-样品垫，3-结合垫，4-吸水垫，5-硝酸纤维素膜，6-检测线，7-质控线；
图2是中空银铂纳米颗粒免疫层析试纸条测定；
图3是增强型中空银铂纳米颗粒免疫层析试纸条测定；
图4是中空银铂纳米颗粒免疫层析试纸条特异性测定；
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
羊抗兔多克隆抗体采购于广州一科有限公司；抗幽门螺杆菌单克隆抗体采购于Abnova。
实施例1
本发明提供的一种幽门螺杆菌抗原检测试剂条，包括中空银铂纳米颗粒检测试纸、阴性样品、阳性样品；所述检测试纸包括PVC材质的底板1，在所述底板1上依次粘贴有样品垫2，包被幽门螺杆菌多克隆抗体胶体结合记物的结合垫3，硝酸纤维素膜5，吸水垫4。
结合垫3一端与样品垫1搭接，另一端与硝酸纤维素膜5的一端搭接，所述硝酸纤维素膜5的另一端与吸水垫4搭接；所述硝酸纤维素膜3上设置检测线6和质控线7；检测线6位于离加样端较近一侧，质控线位于离加样端较远一侧，更具体的，所述的检测线6距离硝酸纤维素膜的边缘10mm；所述的质控线7距离硝酸纤维素膜的边缘14mm；所述的检测线T与质控线C距离为4mm。
所述的检测线T上包被有抗幽门螺旋杆菌单克隆抗体；所述的质控线C包被羊抗兔IgG多克隆抗体。
上述幽门螺杆菌抗原检测试剂条的制备方法，将样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜5、吸水垫4依次粘贴在底板5上，切裁制得检测。
其中：结合垫3上包被幽门螺杆菌多克隆抗体胶体结合记物的制备方法为：
A：制备幽门螺杆菌多克隆抗体：
1)用经灭活纯化的幽门螺杆菌抗原去多次免疫新西兰白兔，收集免疫后兔血，静置，过夜，收集上层血清；
2)边搅拌边缓慢向步骤1)收集的血清中滴加等体积饱和硫酸铵，滴加完毕继续搅拌30min使得混合充分，然后转移至4℃冰箱静置沉淀过夜；
3)30次日，同样条件离心弃上清，3)30次日，同样条件离心弃上清液，收集沉淀物，向沉淀物中加入PBS溶液，直到沉淀物完成溶解，停止加入PBS，再次滴加饱和硫酸铵溶液，确保溶液体系硫酸铵终体积浓度为33％即可。滴加完毕继续搅拌30min使得混合充分，然后转移至4℃冰箱静置沉淀1h，随后立即离心弃上清，用PBS溶解使得沉淀溶解；
4)将上述纯化后R-HP-Ab溶液装入透析袋(MW＝14000)在PBS缓冲液中透析3天，每10h左右更换一次PBS以充分去除硫酸铵；最终获得纯化除盐后的R-HP-Ab，分装之后短期保存于-20℃，长期保存于-80℃。
B：制备中空银铂纳米颗粒，
1)将50μL 0.1M抗坏血酸倒入沸水(49mL)中1min后，加入1mL含有0.01g柠檬酸钠的溶液和1mL含有2.5mg AgNO3的溶液；混合溶液的颜色立即由无色变为黄色，再煮沸1h的含球形银纳米颗粒的浑浊有液，冷却备用；
2)取10ml步骤1)制备的含球形银纳米颗粒的浑浊有液，加入10mg聚氧乙烯十六烷基醚Brij58超声分散均匀(超声频率40KHZ，超声10秒)，加入30μL氯金酸(20mM)和75μL抗坏血酸(0.1M)；然后，将混合溶液搅拌5小时常温，所制备的中空银铂纳米颗粒粗品依次采用乙醇和去离子水离心除去过量的聚氧乙烯十六烷基醚，再在真空条件下干燥，得的中空银铂纳米颗粒粗品。
C：将步骤B制备的含中空银铂纳米颗粒和步骤A制备的抗幽门螺旋杆菌多克隆抗体按照体积比100：2混匀，采用缓冲液稀释后喷涂到结合垫上，干燥后即得。
所述的100毫升缓冲液为含20毫克磷酸氢二钠、290毫克磷酸二氢钠、800毫克氯化钠加、1克牛血清白蛋白、0.025克吐温、1克PEG2000、5克蔗糖和2克海藻糖配置而成。
利用金标仪进行划线在硝酸纤维素膜3的检测线T包埋抗幽门螺旋杆菌单克隆抗体。
利用金标仪进行划线在硝酸纤维素膜3的质控线上包埋羊抗兔IgG。
实施例2检测试剂条的灵敏度实验
取实施例1制得的幽门螺旋杆菌抗原检测试剂条，将试剂条放置在水平台面上，分别检测10CFU/ml、101CFU/ml、102CFU/ml、103CFU/ml、104CFU/ml、5×104CFU/ml、105CFU/ml、106CFU/ml、107CFU/ml、108CFU/ml的幽门螺旋杆菌抗原标准品，每个浓度重复5次。用吸管吸取样品液60微升加入到样品槽中，在滴加样品后8-15分钟判读结果，若为阳性，则T线c线均出现条带，随细菌浓度的下降，T线颜色逐渐变浅；若为阴性，则T线无条带，C线有条带。
实施例3检测试剂条的灵敏度增强实验
取实施例1制得的幽门螺旋杆菌抗原检测试剂条，将试剂条放置在水平台面上，分别检测10CFU/ml、101CFU/ml、102CFU/ml、103CFU/ml、104CFU/m1、5×104CFU/ml、105CFU/ml、106CFU/ml、107CFU/ml、108CFU/ml的幽门螺旋杆菌抗原标准品，每个浓度重复5次。用吸管吸取样品液60微升加入到样品槽中，在滴加样品后8-15分钟后，待多余探针全部流向吸水垫，向检测线T上分多次滴加TMB显色液，直至检测线T上显现淡蓝色，随后读取结果。若为阳性，则T线C线均出现条带，随细菌浓度的下降，T线颜色逐渐变浅；若为阴性，则T线无条带，C线有条带。
实施例4检测试剂条的特异性实验
取实施例1制得的幽门螺旋杆菌抗原检测试纸条，将试纸条放置在水平台面上，分别检测金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、蜡状芽孢杆菌、大肠杆菌和创伤弧菌抗原标准品每种抗原重复5次。用吸管吸取样品液60微升加入样品槽中，在滴加样品后8-15分钟判读结果。当添加幽门螺旋杆菌时，T线C线均出现条带，当添加金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、蜡状芽孢杆菌、大肠杆菌和创伤弧菌抗原时，T线无条带，C线有条带。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包被在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种幽门螺旋杆菌抗原胶体金检测试剂条，包括底板，所述的底板表面从加样端开始依次排列的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其特征在于，所述结合垫上包被有中空银铂纳米颗粒标记幽门螺杆菌多克隆抗体，所述硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线；所述检测线上包被有抗幽门螺旋杆菌单克隆抗体；所述质控线上包被有羊抗兔IgG多克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的幽门螺旋杆菌抗原胶体金检测试剂条，其特征在于，所述硝酸纤维素膜上通过划线包抗幽门螺杆菌单克隆抗体。
3.根据权利要求1所述的幽门螺旋杆菌抗原胶体金检测试剂条，其特征在于，所述抗幽门螺杆菌多克隆抗体通过下述方法制备的：
1)用经灭活纯化的幽门螺杆菌抗原去多次免疫新西兰白兔，取血，获得多克隆抗体；该多克隆抗体经过电泳分析，效价测定及特异性的比较后，得多克隆抗体，冷冻备用；
2)将步骤1)制备的多克隆抗体经硫酸铵分级抽提、PBS透析、离心、收集后即得纯化多克隆抗体。
4.根据权利要求1所述的幽门螺旋杆菌抗原胶体金检测试剂条，其特征在于，所述的中空银铂纳米颗粒通过下述方法制备的：
1)将50μL 0.1M抗坏血酸倒入49mL沸水，1min后加入1mL含有0.01g柠檬酸钠的溶液和1mL含有2.5mg AgNO3的溶液混合，继续煮沸1h形成含球形银纳米颗粒的浑浊液，冷却备用；
2)将10mg聚氧乙烯十六烷基醚加入10ml步骤1)含球形银纳米颗粒的浑浊液中，超声分散均匀，然后加入300μL 20mM氯金酸和75μL 0.1M抗坏血酸，混合均匀继续搅拌5小时，获得了中空银铂纳米颗粒粗品；
3)步骤2)所制备的中空银铂纳米颗粒粗品依次采用乙醇和去离子水离心除去过量的聚氧乙烯十六烷基醚，再在真空条件下干燥。
5.根据权利要求1所述的幽门螺旋杆菌抗原胶体金检测试剂条，其特征在于，所述结合垫上包被幽门螺杆菌多克隆抗体胶体结合记物的方法是将权利要求4制备的含中空银铂纳米颗粒和权利要求3抗幽门螺旋杆菌多克隆抗体按照体积比100∶2混匀，采用缓冲液稀释后喷涂到结合垫上，干燥后即得。
6.根据权利要求5所述的幽门螺旋杆菌抗原胶体金检测试剂条，其特征在于，100毫升缓冲液为含20毫克磷酸氢二钠、290毫克磷酸二氢钠、800毫克氯化钠、1克牛血清白蛋白、0.025克吐温、1克PEG2000、5克蔗糖和2克海藻糖配置而成。
7.根据权利要求2所述的幽门螺旋杆菌抗原胶体金检测试剂条，其特征在于，所述的表面活性剂为聚氧乙烯十六烷基醚。
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