CN113049803A - 一种新型冠状病毒蛋白标记方法及检测试剂盒 - Google Patents

一种新型冠状病毒蛋白标记方法及检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种新型冠状病毒蛋白标记方法及检测试剂盒。具体，采用生物素标记新型冠状病毒重组抗原，用吖啶酯标记鼠抗人IgG；所述试剂盒包括试剂R1、试剂R2、试剂M、校准品1、校准品2、质控品，其中，试剂R1包括生物素标记的新型冠状病毒重组抗原、缓冲液1，所述的R2包括吖啶酯标记的鼠抗人IgG、缓冲液2。本发明提供的检测试剂盒，相对核酸检测简化了采样流程、降低了实验人员门槛、提高了检测效率，相对同类型的新型冠状病毒IgG抗体检测显著提高了检测灵敏度。

Description

一种新型冠状病毒蛋白标记方法及检测试剂盒
技术领域
本申请属于免疫分析技术领域，尤其是涉及一种新型冠状病毒蛋白标记方法及检测试剂盒。
背景技术
新型冠状病毒临床表现为发热、乏力等全身症状，伴有干咳、呼吸困难等，可迅速发展为重症肺炎、呼吸衰竭、急性呼吸窘迫综合征、脓毒休克、多器官功能衰竭、严重酸碱代谢紊乱等，甚至危及生命。冠状病毒可分为α、β、γ、δ4个属，而新型冠状病毒属于β属，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，直径60-140nm。其基因特征与SARS-CoV和MERSr-CoV有明显的区别。现针对新型冠状病毒的治疗仍无特效药，当前处理新型冠状病毒最好的方法即为早发现、早隔离，切断传播源。
核酸检测以其速度快、采样方便的优势作为新型冠状病毒的早期检测的重要手段；现有的核酸检测但因其技术本身的限制、采样样本的质量差异等，导致结果出现假阳性/假阴性较高。
而免疫诊断是机体受病原体感染后出现的免疫应答反应，状态稳定且随病毒感染时间出现固定变化趋势。因此，免疫诊断不仅可用于早起临床筛查，同时可用于治疗过程观察。
免疫诊断的结果不仅是由配对的抗原抗体特异性决定，同时在整个反应体系中涉及到的标记物、反应条件等均影响试剂测试结果的灵敏度和特异性。
发明内容
为解决现有技术中新型冠状病毒检测手段存在操作步骤繁琐、采样差异、灵敏度低等问题，本发明提供了一种新型冠状病毒蛋白标记方法及检测试剂盒。
本发明第一方面，提供了一种新型冠状病毒蛋白标记方法，包括以下步骤：
(1)用PB或TRIS缓冲液分别置换新型冠状病毒重组抗原和鼠抗人IgG的缓冲液；
(2)将新型冠状病毒重组抗原与生物素以摩尔比为1～10:1进行偶联反应，反应结束后进行纯化，得到生物素标记的新型冠状病毒重组抗原；
将鼠抗人IgG与吖啶酯以摩尔比为1～15:1进行偶联反应，反应结束后进行纯化，得到吖啶酯标记的鼠抗人IgG。
优选地，所述新型冠状病毒重组抗原为新型冠状病毒S抗原或新型冠状病毒N抗原。
进一步优选地，步骤(2)所述纯化选自通过透析、超滤或凝胶吸附方法进行纯化。
进一步的，上述方法中，优选地的，将得到生物素标记的新型冠状病毒重组抗原和吖啶酯标记的鼠抗人IgG分别加入甘油进行保存。
本发明第二方面，还提供了一种新型冠状病毒蛋白检测试剂盒，所述试剂盒包括：试剂R1、试剂R2、试剂M、校准品1、校准品2、质控品；
其中，所述试剂R1包括生物素标记的新型冠状病毒重组抗原，和缓冲液1；
所述试剂R2包括吖啶酯标记的鼠抗人IgG，和缓冲液2；
所述校准品1为缓冲液3；
所述校准品2和质控品均包括新型冠状病毒IgG抗体，和缓冲液 3；
其中，所述生物素标记的新型冠状病毒重组抗原和吖啶酯标记的鼠抗人IgG由本发明前述方法制备得到；
所述缓冲液1为0.05mM-0.5mM的PB缓冲液；优选地，所述缓冲液1为0.05mM-0.5mM的PB缓冲液，其中包含0.05％(w/w)-0.5％ (w/w)的表面活性剂，10mg/L-70mg/L的阻断剂，0.5％(w/w)-2％ (w/w)的封闭剂；更优选地，所述的表面活性剂选自吐温20或曲拉通；所述的封闭剂选自牛血清白蛋白、胎牛血清、鱼明胶或酪蛋白；所述阻断剂优选为鼠IgG、山羊IgG、兔IgG或绵羊IgG；
所述缓冲液2为0.05mM-0.5mM的PB缓冲液；优选地，所述缓冲液2为0.05mM-0.5mM的PB缓冲液，其中包含0.5％(w/w)-2％ (w/w)的氯化钠，2％(w/w)-10％(w/w)的甘油，0.05％(w/w) -0.5％(w/w)的表面活性剂，0.1％(w/w)-1％(w/w)的防腐剂， 1％(w/w)-10％(w/w)的封闭剂；更优选地，所述表面活性剂选自吐温20或曲拉通；所述封闭剂选自牛血清白蛋白、胎牛血清、鱼明胶、或酪蛋白；所述防腐剂，例如可以是叠氮化钠或Prolin300。
所述缓冲液3包括PB缓冲液、Tris缓冲液或MES缓冲液中的一种，和牛血清白蛋白。
进一步的，所述试剂盒，其中，生物素标记的新型冠状病毒重组抗原与吖啶酯标记的鼠抗人IgG的蛋白浓度比为35～45:1。
术语解释：
本发明所述的“PB缓冲液”是指磷酸缓冲液(PB，Phosphate Buffer)；
所述“TRIS缓冲液”是指Tris-HCl缓冲液，中文别名：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐；Tris盐酸盐；
所述“MES缓冲液”其中的MES是2-(N-吗啉)乙磺酸的缩写；
所述“校准品”，即校准物质，指在校准函数中用作独立变量值的参考物质，在体外诊断临床检测中起到检测和监督检验结果具有准确性和一致性的作用。“校准品”可以包括阳性校准品(含有新型冠状病毒IgG抗体)和阴性校准品(不含新型冠状病毒IgG抗体)。
本发明中所述“w/w”是指重量比；举例说明的，例如“所述缓冲液1为0.05mM-0.5mM的PB缓冲液，其中包含0.05％(w/w)-0.5％ (w/w)的表面活性剂，10mg/L-70mg/L的阻断剂，0.5％(w/w)-2％ (w/w)的封闭剂；”其中所述“0.05％(w/w)-0.5％(w/w)的表面活性剂”是指表面活性与缓冲液1的重量比为0.05％-0.5％；所述“0.5％ (w/w)-2％(w/w)的封闭剂”是指封闭剂与缓冲液1的重量比为 0.5％-2％。
所述“新型冠状病毒重组抗原”优选地为“新型冠状病毒S抗原”或“新型冠状病毒N抗原”；
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的氨基酸序列及其编码核酸序列已在NCBI上公开，其基因组排列顺序为5'-复制酶多聚糖蛋白(orf1/ab)- 结构蛋白[刺突糖蛋白(spike,S)-小包膜糖蛋白(envelope,E)-膜糖蛋白 (membrane,M)-核衣壳蛋白(nucleocapsid,N)]-3'。
新型冠状病毒基因结构由刺突蛋白(S)，小包膜蛋白(E)，膜蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)组成，其中，S蛋白由膜外蛋白(S1) 和穿膜蛋白(S2)组成，S1包含了受体结合区(receptor-binding domain， RBD)用于特异性结合ACE2(angiotensin-convertingenzyme 2)，是靶细胞上的受体；N蛋白是冠状病毒最丰富的蛋白，与核酸有紧密联系。
新型冠状病毒的重组抗原已有许多市售产品，本发明所述的“新型冠状病毒S抗原”、“新型冠状病毒N抗原”可以是这些市售的重组抗原，例如四川迈克生物新材料技术有限公司生产的重组新型冠状病毒N抗原(货号为XCL1829)，北京孚博生物科技有限公司生产的重组新型冠状病毒S1抗原(货号为FB2019HIS/FB2019RBD)；南京金斯瑞生物技术有限公司新型冠状病毒N抗原或S1抗原(货号： T80307/T80302/T80103)、生物梅里埃、吉钠邦盛(北京)生物科技有限公司也有新型冠状病毒N抗原(货号：GM2009)和新型冠状病毒S抗原销售(货号：GM2005)。
本发明中所述的“新型冠状病毒”、“SARS-CoV-2”、“新冠病毒”可互换，均为被国际病毒分类委员会命名为“SARS-CoV-2”的新型冠状病毒。
本发明提供了一种新型冠状病毒蛋白标记方法及检测试剂盒，其用于检测新型冠状病毒时，能够快速、准确的检测新型冠状病毒抗体，可用于血清、血浆的检测，特异性更高，有利于新型冠状病毒的防控、治疗工作。
本发明提供的新型冠状病毒蛋白标记方法及检测试剂盒，相对核酸检测大大简化了采样流程、降低了实验人员门槛、提高了检测效率；相对同类型的新型冠状病毒IgG抗体检测能够显著提高检测灵敏度。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
以下具体实施例中涉及的试剂成分均为市售产品，例如新型冠状病毒IgG抗体、新型冠状病毒S抗原和新型冠状病毒N抗原可购自南京金斯瑞生物技术有限公司(货号：T80307，T80302，或T80103)、生物梅里埃、吉钠邦盛(北京)生物科技有限公司(新型冠状病毒N 抗原，货号：GM2009，新型冠状病毒S抗原，货号：GM2005)、北京孚博生物科技有限公司等公司；鼠抗人IgG抗体可购自生物梅里埃、菲鹏生物股份有限公司、或佰泰科生物技术有限公司；牛血清白蛋白购自纽英伦生物技术有限公司/北京霍尔姆斯生物技术有限公司 /Bovogen Biologicals。
实施例1、一种新型冠状病毒蛋白标记方法
所述标记方法包括如下步骤：
步骤1，先用PB缓冲液置换新型冠状病毒S抗原、鼠抗人IgG 缓冲液；
步骤2，将新型冠状病毒S抗原与生物素按摩尔比6.5：1进行偶联反应，将鼠抗人IgG与吖啶酯按摩尔比10:1进行偶联反应；
步骤3，偶联反应结束后分别进行透析纯化，最后将得到生物素标记的新型冠状病毒S抗原，以及吖啶酯标记的鼠抗人IgG分别加入甘油进行保存。
实施例2、一种新型冠状病毒蛋白检测试剂盒
所述试剂盒包括：试剂R1、试剂R2、试剂M、校准品1、校准品2、质控品，
其中，试剂R1包括实施例1制备的生物素标记的新型冠状病毒 S抗原、和缓冲液1；
试剂R2包括实施例1制备的吖啶酯标记的鼠抗人IgG、和缓冲液2；
校准品1为缓冲液3；
校准品2和质控品均分别包括新型冠状病毒IgG抗体、和缓冲液 3。
其中，生物素标记的新型冠状病毒S抗原与吖啶酯标记的鼠抗人 IgG的蛋白浓度比为40:1。
缓冲液1包括：0.1mM的PB，其中含有0.2％(w/w)的吐温20， 50mg/L的鼠IgG，1％(w/w)的牛血清白蛋白；
缓冲液2包括：0.2mM的PB，其中含有1％(w/w)的氯化钠， 5％(w/w)的甘油，0.2％(w/w)的吐温20，0.5％(w/w)的防腐剂叠氮化钠，2％(w/w)的牛血清白蛋白。
缓冲液3包括PB缓冲液和牛血清白蛋白。
实施例3、一种新型冠状病毒蛋白标记方法
所述标记方法包括如下步骤：
步骤1，先用TRIS缓冲液置换新型冠状病毒N抗原、鼠抗人IgG 缓冲液；
步骤2，将新型冠状病毒N抗原与生物素按摩尔比1:1进行偶联反应，将鼠抗人IgG与吖啶酯按摩尔比1:1进行偶联反应；
步骤3，偶联反应结束后分别进行透析纯化，最后将得到生物素标记的新型冠状病毒N抗原，以及吖啶酯标记的鼠抗人IgG分别加入甘油进行保存。
实施例4、一种新型冠状病毒蛋白检测试剂盒
所述试剂盒包括试剂R1、试剂R2、试剂M、校准品1、校准品 2、质控品，
其中，试剂R1包括实施例3制备的生物素标记的新型冠状病毒 N抗原、缓冲液1；
试剂R2包括实施例3制备的吖啶酯标记的鼠抗人IgG、缓冲液2；
校准品1为缓冲液3；
校准品2、质控品分别包括新型冠状病毒IgG抗体、缓冲液3。
其中，生物素标记的新型冠状病毒N抗原与吖啶酯标记的鼠抗人IgG的蛋白浓度比为35:1。
缓冲液1包括：0.05mM的PB，其中含有0.05％(w/w)的曲拉通，70mg/L的兔IgG，2％(w/w)的胎牛血清；
缓冲液2包括：0.05mM的PB，其中含有0.5％(w/w)的氯化钠， 2％(w/w)的甘油，0.05％(w/w)的曲拉通，0.1％(w/w)的防腐剂 Prolin300，1％(w/w)的胎牛血清。
缓冲液3包括Tris缓冲液和牛血清白蛋白。
实施例5、一种新型冠状病毒蛋白标记方法
所述标记方法包括如下步骤：
步骤1，先用PB缓冲液置换新型冠状病毒N抗原、鼠抗人IgG 缓冲液；
步骤2，将新型冠状病毒N抗原与生物素按摩尔比10:1进行偶联反应，将鼠抗人IgG与吖啶酯按摩尔比15:1进行偶联反应；
步骤3，偶联反应结束后分别进行透析纯化，最后将得到生物素标记的新型冠状病毒N抗原，以及吖啶酯标记的鼠抗人IgG分别加入甘油进行保存。
实施例6、一种新型冠状病毒蛋白检测试剂盒
所述试剂盒包括试剂R1、试剂R2、试剂M、校准品1、校准品 2、质控品，
其中，试剂R1包括实施例5制备的生物素标记的新型冠状病毒 N抗原、缓冲液1；
试剂R2包括实施例5制备的吖啶酯标记的鼠抗人IgG、缓冲液2；
校准品1为缓冲液3；
校准品2、质控品分别包括新型冠状病毒IgG抗体、缓冲液3。
其中，生物素标记的新型冠状病毒N抗原与吖啶酯标记的鼠抗人 IgG的蛋白浓度比为45:1。
缓冲液1包括：0.5mM的PB，其中含有0.5％(w/w)的吐温20， 10mg/L的鼠IgG，0.5％(w/w)的牛血清白蛋白；
缓冲液2包括：0.5mM的PB，其中含有2％(w/w)的氯化钠， 10％(w/w)的甘油，0.5％(w/w)的吐温20，1％(w/w)的防腐剂叠氮化钠，10％(w/w)的牛血清白蛋白。
缓冲液3包括MES缓冲液和牛血清白蛋白。
为节约成本，以下通过以本发明实施例2方法获得的新型冠状病毒蛋白检测试剂盒为例，对本发明制备的试剂盒检测灵敏度、性能等进行验证，用以阐明本发明技术方案所取得有益效果。
检测效果验证
将本发明实施例2方法获得的新型冠状病毒蛋白检测试剂盒与市面上已销售的试剂盒在对应的检测条件下测定不同核酸确诊时间的阳性样本，比对其灵敏度，其结果如表1：
表1不同厂家新型冠状病毒IgG检测试剂盒灵敏度比对
Figure RE-GDA0003044323900000101
性能测试
另以本发明实施例2制备的新型冠状病毒蛋白检测试剂盒为例，单独验证本发明方法获得的新型冠状病毒蛋白检测试剂盒的性能，包括热稳定性、重复性、天间变异、开瓶稳定性、交叉影响。
热稳定性：试剂于37℃下加速0/1/3/5/7天后，分别验证试剂的最低检出限、阳性参考品、阴性参考品、准确度、重复性。
最低检出限：企业最低检测限参考品用基质S0进行2倍稀释(1 份样本+1份S0)，依次共完成9个稀释系列，将原倍的最低检测限参考品和9个稀释梯度的样品依次标记为L1～L10，检测结果L1/L2有反应性，L3-L10可为有反应性或无反应性；
阴性参考品：企业参考品中阴性参考品当作样品检测1次，不得出现假阳性；
阳性参考品：企业参考品中阳性参考品当作样品检测1次，不得出现假阴性。
检测结果如表2所示。
表2试剂热稳定性
Figure RE-GDA0003044323900000111
准确度：检测内部质控品QC1/QC2/QC3各3次，计算S/C0平均值，应在范围内；重复性：测定企业参考品中的精密性参考品10次，计算S/CO的平均值(Mean)和标准差(SD)，CV％＝SD/Meanx100％，应不大于10％。
重复性：测定内部质控品QC1/QC2/QC3各10次，计算S/CO的平均值(Mean)和标准差(SD)，CV％＝SD/Meanx100％，应不大于10％。检测结果如表3所示。
表3、重复性检测结果
Figure RE-GDA0003044323900000121
天间变异：测定内部质控品QC1/QC2和QC3，每天上午和下午各检测1次，检测5天，至少20次测试，计算S/CO的平均值(Mean) 和标准差(SD)，CV％＝SD/Meanx100％，应不大于10％。
检测结果如表4所示。
表4、天间变异测定结果
Figure RE-GDA0003044323900000122
Figure RE-GDA0003044323900000131
开瓶稳定性：将试剂在0天进行定标，于1/4/7/14/21/28/35分别测定内部质控品QC1/QC2/QC3，用0天的定标曲线计算S/CO，其测值与0天比对偏差应在±15％以内。测定结果如表5所示。
表5、开瓶稳定性检测结果
Figure RE-GDA0003044323900000132
Figure RE-GDA0003044323900000141
交叉实验：测定下表A中相关病例的阳性样本，其测值应均为阴性。
表A：相关病例样本
风疹病毒(Rubella)IgG 风疹病毒(Rubella)IgM
巨细胞病毒(CMV)IgG 巨细胞病毒(CMV)IgM
弓形虫(TOXO)IgG 弓形虫(TOXO)IgM
乙型肝炎病毒(HBV) 丙型肝炎病毒(HCV)
戊型肝炎病毒(HEV) 梅毒(TP)
交叉试验测定结果如表6所示。
表6、交叉影响
Figure RE-GDA0003044323900000142
Figure RE-GDA0003044323900000151
采用上述同样方法对实施例2和6制备的试剂盒进行灵敏度和性能测试，试验结果与实施例7和8测试的结果类似。
以上述依据本申请的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项申请技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项申请的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。

Claims (10)

1.一种新型冠状病毒蛋白标记方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)用PB或TRIS缓冲液分别置换新型冠状病毒重组抗原和鼠抗人IgG的缓冲液；
(2)将新型冠状病毒重组抗原与生物素以摩尔比为1～10:1进行偶联反应，反应结束后进行纯化，得到生物素标记的新型冠状病毒重组抗原；
将鼠抗人IgG与吖啶酯以摩尔比为1～15:1进行偶联反应，反应结束后进行纯化，得到吖啶酯标记的鼠抗人IgG。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述新型冠状病毒重组抗原为新型冠状病毒S抗原或新型冠状病毒N抗原。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(2)所述纯化选自通过透析、超滤或凝胶吸附方法进行纯化。
4.根据权利要求1～3任一项所述方法，其特征在于，还包括将得到生物素标记的新型冠状病毒重组抗原和吖啶酯标记的鼠抗人IgG分别加入甘油进行保存。
5.一种新型冠状病毒蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：试剂R1、试剂R2、试剂M、校准品1、校准品2、质控品；
其中，所述试剂R1包括生物素标记的新型冠状病毒重组抗原和缓冲液1；
所述试剂R2包括吖啶酯标记的鼠抗人IgG和缓冲液2；
所述校准品1为缓冲液3；
所述校准品2和质控品均包括新型冠状病毒IgG抗体和缓冲液3；
其中，所述生物素标记的新型冠状病毒重组抗原和吖啶酯标记的鼠抗人IgG由权利要求1～3任一项所述方法中步骤(1)和步骤(2)制备得到；
所述缓冲液1为0.05mM-0.5mM的PB缓冲液；
所述缓冲液2为0.05mM-0.5mM的PB缓冲液，
所述缓冲液3包括PB缓冲液、Tris缓冲液或MES缓冲液中的一种，和牛血清白蛋白。
6.根据权利要求5所述的新型冠状病毒蛋白检测试剂盒，其特征在于，生物素标记的新型冠状病毒重组抗原与吖啶酯标记的鼠抗人IgG的蛋白浓度比为35～45:1。
7.根据权利要求5所述的新型冠状病毒蛋白检测试剂盒，其特征在于，
所述缓冲液1为0.05mM-0.5mM的PB缓冲液，其中包含0.05％(w/w)-0.5％(w/w)的表面活性剂，10mg/L-70mg/L的阻断剂，0.5％(w/w)-2％(w/w)的封闭剂；
所述缓冲液2为0.05mM-0.5mM的PB缓冲液，其中包含0.5％(w/w)-2％(w/w)的氯化钠，2％(w/w)-10％(w/w)的甘油，0.05％(w/w)-0.5％(w/w)的表面活性剂，0.1％(w/w)-1％(w/w)的防腐剂，1％(w/w)-10％(w/w)的封闭剂。
8.根据权利要求7所述的新型冠状病毒蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述表面活性剂独立的选自吐温20或曲拉通。
9.根据权利要求7所述的新型冠状病毒蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述的封闭剂独立的选自牛血清白蛋白、胎牛血清、鱼明胶或酪蛋白。
10.根据权利要求7所述的新型冠状病毒蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述阻断剂为鼠IgG、山羊IgG、兔IgG或绵羊IgG。
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