JP2018084524A - 疥癬の検査方法、並びにそれに用いる薬剤及びデバイス - Google Patents
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<1> 被検体から分離された試料に、ヒトヒゼンダニ由来のビテロジェニン様たん白質を認識する抗体を接触させ、該試料における該ビテロジェニン様たん白質を免疫学的に検出することを特徴とする、疥癬の検査方法。
<2> 前記免疫学な検出をイムノクロマトグラフィーにより行う、<1>に記載の方法。
<3> ヒトヒゼンダニ由来のビテロジェニン様たん白質を認識する抗体を含む、疥癬を検査するための薬剤。
<4> 前記抗体に標識物質が付加されている、<3>に記載の薬剤。
<5> ヒトヒゼンダニ由来のビテロジェニン様たん白質を認識する抗体が固定化されている担体を含む、疥癬を検査するためのデバイス。
<6> イムノクロマトグラフィーにより疥癬を検査するためのデバイスであって、前記担体がクロマト展開用膜担体であり、前記抗体が該担体に固定化されて検出部を構成する、<5>に記載のデバイス。
本発明は、被検体から分離された試料に、ヒトヒゼンダニ由来のビテロジェニン様たん白質を認識する抗体(以下、「抗ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質抗体」とも称する)を接触させ、該試料における該ビテロジェニン様たん白質を免疫学的に検出することを特徴とする、疥癬の検査方法を提供する。
本発明は、疥癬を検査するための薬剤であって、上述の抗ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質抗体を含む薬剤を提供する。本発明の薬剤に含まれる抗ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質抗体は、上述の通り、標識物質が結合したものであってもよい。
本発明の疥癬を検査するためのデバイスの好適な一態様として、抗ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質抗体が固定化されているクロマト展開用膜担体を含み、前記抗体が該担体に固定化されて検出部を構成する、イムノクロマトグラフィー用デバイス(以下「イムノクロマトグラフィー用デバイス」とも称する)が挙げられる。
(a) 試料添加用部材
(b) 標識抗体含有部材
(c) 吸収用部材
(d) 支持体。
1.ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質抗原の調製
疥癬の感染部位である表皮中には、ヒゼンダニが産んだ卵及びその抜け殻が残存していることが想定される。そこで先ず、この卵を構成するたん白質として推定されるビテロジェニン様たん白質を検出対象として選択し、それを抗原とする抗体の作製を試みた。
前記KLH−ペプチド抗原をウサギ(日本白色種)に免疫して抗血清を取得した。取得した抗血清については、前記抗原を固相化したプレートを用いたELISA法により抗体価を測定した。そして、抗体価の上昇が認められた抗血清(以下「抗ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質抗体含有抗血清」とも称する)については、後述のウエスタンブロッティング及びイムノクロマトグラフィー等に供するまで、凍結保存した。
前記にて調製したポリクローナル抗体によってビテロジェニン様たん白質を検出できるかを試験するために、後述の通り、ウエスタンブロッティング及びイムノクロマトグラフィーを行った。そのために先ず、それら方法における検出対象として、以下の通りにリコンビナントたん白質を調製した。
PSTTTRNGKYSVPIYEPFSRLMDKWSAETRTNNLRQIARQAAQEEAARQQQMNLERIMARQHKIVQQQEQEQEQQKQEQKMEHYRLRTMAVQQTDKI。
抗ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質抗体を用いたウエスタンブロッティングによって、ヒトヒゼンダニ由来のビテロジェニン様たん白質を検出できるかについて、以下の通りに検証した。
ヒトのみならず、疥癬は他の動物でも生じる。例えば、日本国内に棲息するホンドタヌキにおいて疥癬が蔓延していることが複数の論文及び各種マスメディアにて報告されている。特に、日本の横浜市においては、年間約100頭のホンドタヌキが捕獲、保護されるが、すべての個体が疥癬であり、多くが重症化している。また、疥癬罹患のホンドタヌキ皮膚断片には、数cm3あたり数万匹のヒゼンダニ成虫とヒゼンダニの卵が検出される。
×g、1分間、25℃)にて、ダニの成虫と卵をペレットとして回収し、10%SDS溶液を除去した。
免疫学的手法の一つであるイムノクロマトグラフィーは、短時間で一連の抗原・抗体反応を同時に行うことができる方法であるため、精度の点のみならず、抗原を、簡便、容易かつ迅速に検出できるという利点を有する。
上述の抗ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質抗体含有抗血清1mLに対し、1M トリス塩酸緩衝(pH8)を10μL添加し、500μLずつ分けた。チューブ1本に対して0.2%硫酸デキストラン溶液500μLと1M 塩化カルシウム溶液20μLを添加し、室温で10分間撹拌した。遠心(20,000xg、5分間、4℃)にて上清1mLに80%硫安溶液を終濃度が40%になるように添加し、4℃で1時間回転混和した。遠心(5,000xg、5分間、4℃)にて上清を除去し、40%硫安溶液を添加し、4℃で一晩回転混和した。遠心(20,000xg、5分間、4℃)にて上清を十分に除去し、ペレットにTNE緩衝液(10mM トリス塩酸緩衝液(pH8)、10mM 塩化ナトリウム及び1mM EDTA)を500μL添加し、4℃で一晩溶解させた。硫安沈殿後の溶解サンプル約1.1mLをPD−10脱塩カラムを用いて、10mM NaCl含有TN緩衝液(10mM トリス塩酸緩衝液(pH8)及び10mM 塩化ナトリウム)へと置換した。
クロマトグラフィー用膜担体としてニトロセルロースからなるシートを用いた。0.1質量%のアジ化ナトリウムを含む100mMのリン酸緩衝液(pH7.4)で2.0mg/mlの濃度になるように抗ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質抗体(捕捉用抗体)を調製し、その希釈された溶液15μLを15cmのメンブレン上に抗体塗布機により塗布し、検出ラインを作製した。コントロールラインは、抗ウサギIgG抗体を該検出ラインと5mmの間隔をあけ前記同様に塗布することにより、作製した。55℃で30分間乾燥させ、続いてブロッキング試薬にて25℃で2時間緩やかに振とうさせブロッキングをおこない、1質量%スクロースと0.01質量%SDSを含む5mMリン酸緩衝液(pH7.2)に浸漬させ、25℃で30分間緩やかに浸とうをおこなった。その後、55℃で40分間乾燥させ、クロマトグラフィー用膜担体に、検出ラインとコントロールラインとを備えた判定部を作製した
3)標識抗体溶液の作製
AλMax=1.0になるよう精製水にて希釈した金コロイド懸濁液4.5mLにpH調整液(20mM Borax−HCl(pH9.0))を0.5mL添加し、pHを調整した。その金コロイド懸濁液に、0.1質量%アジ化ナトリウムを含む100mMリン酸緩衝液(pH7.4)で0.7mg/mLの濃度になるように希釈した後、精製水にて70μg/mLの濃度になるように調整した抗ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質抗体0.5mLを加え、室温で一晩静置した。次いで、10質量%の牛血清アルブミン溶液(pH8.5)を終濃度1%となるように添加した。その後、十分撹拌した後、9800×gで15分間遠心分離を行い、上清を除去した後、AλMax=1.2となるように、1質量%の牛血清アルブミンと1質量%濃度のスクロースを含む5mM トリス塩酸緩衝液(pH8.2)を加え、標識抗体溶液を作製した。
前記にて作製した標識抗体溶液750μLを8mm×150mmのグラスファイバーパッドに均一になるように添加した後、真空凍結乾燥機にて乾燥させ、標識抗体含有部材を作製した。次に、バッキングシートからなる支持体に、上記にて作製した判定部を有するクロマトグラフィー用膜担体及び標識抗体含有部材、試料を添加する部分に用いるサンプルパッド(試料添加用部材)、展開した試料や標識抗体を吸収するための吸収パッド(吸収用部材)を貼り合わせた。そして、裁断機で幅が5mmとなるように裁断し、イムノクロマトグラフィー用試験片とした。
前記にて作製したイムノクロマトグラフィー用試験片の試料添加用部材に、下記表1に記載の各試料(溶媒はTBSTであり、それを用いてたん白質濃度が10ng〜1mg/mLになるよう調整してある)100μL(たん白質量:ng〜μg)を添加し、展開させ、該試験片における検出ラインにおいて呈色(金の集積)が生じるか否かを観察した。得られた結果を下記表1に示す。なお、表1における「ヤケヒョウダニ・コナヒョウダニ抽出成分」は、鳥居薬品株式会社製、製品名:ダニアレルゲンエキス皮下注「トリイ」100,000JAU/mLを示す。
Claims (6)
- 被検体から分離された試料に、ヒトヒゼンダニ由来のビテロジェニン様たん白質を認識する抗体を接触させ、該試料における該ビテロジェニン様たん白質を免疫学的に検出することを特徴とする、疥癬の検査方法。
- 前記免疫学な検出をイムノクロマトグラフィーにより行う、請求項1に記載の方法。
- ヒトヒゼンダニ由来のビテロジェニン様たん白質を認識する抗体を含む、疥癬を検査するための薬剤。
- 前記抗体に標識物質が付加されている、請求項3に記載の薬剤。
- ヒトヒゼンダニ由来のビテロジェニン様たん白質を認識する抗体が固定化されている担体を含む、疥癬を検査するためのデバイス。
- イムノクロマトグラフィーにより疥癬を検査するためのデバイスであって、前記担体がクロマト展開用膜担体であり、前記抗体が該担体に固定化されて検出部を構成する、請求項5に記載のデバイス。
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