JP6176741B2 - 乳腺疾患の検査方法 - Google Patents
乳腺疾患の検査方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6176741B2 JP6176741B2 JP2014524659A JP2014524659A JP6176741B2 JP 6176741 B2 JP6176741 B2 JP 6176741B2 JP 2014524659 A JP2014524659 A JP 2014524659A JP 2014524659 A JP2014524659 A JP 2014524659A JP 6176741 B2 JP6176741 B2 JP 6176741B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cypa
- milk
- mastitis
- antibody
- mammary gland
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/99—Isomerases (5.)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/36—Gynecology or obstetrics
- G01N2800/365—Breast disorders, e.g. mastalgia, mastitits, Paget's disease
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
(1)被験体の乳房または乳分房から採取された乳汁におけるシクロフィリンAを検出することにより乳汁中のシクロフィリンA量を得る工程
(2)前記乳汁中のシクロフィリンA量に基づいて、被験体の乳房または乳分房における乳腺疾患の発症または乳腺疾患の発症可能性を判定する工程
(1’)被験体の乳房または乳分房から採取された乳腺におけるシクロフィリンAを検出することにより乳腺中のシクロフィリンA量を得る工程
(2’)前記乳腺中のシクロフィリンA量に基づいて、被験体の乳房または乳分房における乳腺疾患の発症または乳腺疾患の発症可能性を判定する工程
ラフィー法からなる群から選択される手法により実施される。
1.乳腺疾患の検査方法
本発明の方法は、乳腺または乳汁におけるシクロフィリンA量を指標とした、乳腺疾患の検査方法である。
(1)被験体の乳房または乳分房から採取された乳汁におけるシクロフィリンAを検出することにより乳汁中のシクロフィリンA量を得る工程
(2)前記乳汁中のシクロフィリンA量に基づいて、被験体の乳房または乳分房における乳腺疾患の発症または乳腺疾患の発症可能性を判定する工程
(1’)被験体の乳房または乳分房から採取された乳腺におけるシクロフィリンAを検出することにより乳腺中のシクロフィリンA量を得る工程
(2’)前記乳腺中のシクロフィリンA量に基づいて、被験体の乳房または乳分房における乳腺疾患の発症または乳腺疾患の発症可能性を判定する工程
本発明の乳腺疾患検査用試薬は、抗シクロフィリンA抗体(抗CyPA抗体)からなる。抗CyPA抗体は、CyPAに対する特異的親和性を有する限り、その種類や由来などは特に限定されない。また、抗CyPA抗体は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体のいずれであってもよい。ポリクローナル抗体としては、免疫動物から採取した抗血清由来のIgG画分のほか、抗血清からCyPAを抗原とするアフィニティー精製して得た抗体を使用できる。また、市販されている抗体、たとえば、abcam(登録商標) rabbit−anti human CyPA(ポリクローナル抗体)を使用できる。なお、上記市販抗体は、ヒトCyPA抗体を認識する抗体ではあるが、ウシの乳汁中のCyPAに特異的に結合することができる。このように、抗CyPA抗体としては、抗原認識部位が異種のものであっても、被験体におけるCyPAに特異的に結合することができれば、使用することができる。
本発明のキットは、主要構成要素として本発明の試薬を含む。乳腺疾患の検査法を実施する際に使用するその他の試薬(緩衝液、ブロッキング用試薬、酵素の基質、発色試薬など)に加えて、器具や装置(容器、反応装置、蛍光リーダーなど)などをキットに含めてもよい。また、標準試料としてCyPAをキットに含めることが好ましい。さらには、CyPAの検出以外の乳腺疾患の検査法に用いるための試薬、器具、装置などをキットに含めることも可能である。たとえば、乳腺疾患の判定精度を高めるために、PLテスト用の試薬、器具および/または装置をキットに含めることができる。本発明のキットには、通常の市販されているキットと同様に、取り扱い説明書が添付されることが好ましい。
本発明のハイブリドーマは、抗シクロフィリンA抗体を産生する能力を有する。本発明の抗体は、本発明のハイブリドーマによって生産される抗シクロフィリンA抗体である。本発明のハイブリドーマは抗CyPA抗体を産生する能力を有する抗体産生細胞と骨髄腫細胞などの腫瘍細胞または不死化細胞とを融合させて得られる融合細胞であれば特に限定されない。本発明の抗体は、CyPAに対して特異的親和性を有する抗体であれば特に限定されない。本発明のハイブリドーマや抗体の構造および機能、確認方法、製造方法ならびに使用方法については、上記した抗CyPA抗体や抗CyPA抗体を産生するハイブリドーマに関する記載を参照できる。
本発明のマーカーは、シクロフィリンAからなる、乳腺疾患検出用マーカーである。本発明のマーカーは、乳腺疾患、特に感染性の乳腺疾患である乳房炎の発症またはその発症可能性の指標となる生体分子のことをいう。本発明のマーカーは、生体中に存在するシクロフィリンAそのものではなく、生体から採取された乳腺や乳汁から分離されたシクロフィリンAが本発明のマーカーとして利用される。本発明のマーカーは、乳房炎の早期検出に特に有用である。
1.材料および方法
(1)試料
乳房炎発症乳腺組織として、下記A〜Cに示す三種の実験区のホルスタイン泌乳牛のうち、実験的乳房炎または潜在性乳房炎の発症が認められた乳房から採取した乳腺組織を用いた。乳腺組織は、ウシを屠殺した後直ちに採取し、すみやかにPLP固定液またはリン酸緩衝ホルマリン固定液を用いて、4℃で一晩固定した。固定後70%エタノール、80%エタノール、90%エタノール、95%エタノールにそれぞれ12時間浸し、さらに100%エタノールに24時間組織を浸し、段階的に脱水を行った。脱水後、トルエン、パラフィンにそれぞれ6時間浸した後、パラフィンに包埋した。また、各実験区のホルスタイン泌乳牛のうち、PBSを投与して処理した乳房から採取した乳腺組織を対照正常乳腺組織として用いた(Toshinobu Kuroishiら、Clin Diagn Lab Immunol.2003;10:1011−1018;Kai Kら、J Vet Med Sci.2002;64:873−8を参照、該文献の記載はここに開示として援用される)。乳酸菌産生ペプチドは、カワイらの文献(Kawai Yら,Biosci Biotechnol Biochem.1997;61:179−82、該文献の記載はここに開示として援用される)に記載の方法にしたがって精製した。
Staphylococcal Endotoxins C(SEC)をPBS 10mLに溶かした0.1μg/μl SEC溶液を乳頭よりホルスタイン泌乳牛の乳分房へ投与して乳房炎を発症させた実験的乳房炎(PLP固定パラフィン包埋乳腺組織;ホルスタイン泌乳牛;分娩後日数 約300日)をSEC投与実験区とした。
Staphylococcas aureus(S.A)をPBS 10mLに溶かした154cfu/ml S.A溶液を乳頭よりホルスタイン泌乳牛の乳分房へ投与して乳房炎を発症させた実験的乳房炎(リン酸緩衝ホルマリン固定パラフィン包埋乳腺組織およびバイオプシーより得た乳腺組織;ホルスタイン泌乳牛;分娩後日数 約60日)をS.A投与実験区とした。
ラクトフェリン(Lf)または乳酸菌産生ペプチドをPBS 10mLに溶かした10mg/mLまたは20mg/mL Lf溶液を乳頭よりホルスタイン泌乳牛の乳分房へ投与した潜在性乳房炎(PLP固定パラフィン包埋乳腺組織;ホルスタイン泌乳牛;分娩後日数 約305日:乾乳導入5日)をLf投与実験区とした。
本発明者らが作製した抗CyPA抗体(2H5−F3抗体)を用いて、免疫組織化学染色により、乳腺組織におけるCyPAの局在を確認した。2H5−F3抗体は以下[i]および[ii]の手順により作製した。
本発明者らは、ウシ腸管上皮細胞株(BIE細胞)の樹立とそのin vitro M細胞(M−BIE細胞)への分化誘導法を確立している。(Characterization of newly established bovine intestinal epithelial cell line,K.Miyazawa,Histochem Cell Biol (2010)vol.133,p125−134、該文献の記載はここに開示として援用される)。M−BIE細胞を2.7×106cells/ml−PBSの濃度に調整し、BALB/cマウスの腹腔内に0.5mlを免疫した。14日後、4.0×106cells/ml−PBSに調整したM−BIE細胞の0.3mlを同一マウスの尾静脈から投与し、追加免疫した。その5日後に、免疫したマウスより脾細胞を採取し、50%(w/v) ポリエチレングリコール(PEG4000)を用いて、SP2/0−ag14−K13マウスミエローマ細胞と融合した。融合したハイブリドーマは、HAT培地 (2mM glutamate,0.2% glucose,10% FBS,100μM hypoxanthine,0.4μM aminopterine,16μM thymidineを含むRPMI−1640)を用いて選抜した。選抜したハイブリドーマから、下記の免疫組織化学染色によってウシ腸管上皮においてFAEを特異的に認識する抗体を産生するウェルを選抜し、限界希釈法によって更なるクローニングを行った。クローニングにより最終的に得られたクローン化細胞をBALB/cマウスの腹腔に投与した。BALB/cマウスの腹水由来のモノクローナル抗体は、HiTrap IgM Purification HP(GE Healthcare Bio−Science AB,Uppsala,Sweden)を用いて精製した。抗体のサブクラスはmouse monoclonal antibody isotyping kit(Dainippon Sumitomo Pharma)で決定し、2H5−F3モノクローナル抗体とした。
Transmembrane Protein Extraction Kit(Novagen)を用いてM−BIE細胞の細胞質画分および細胞膜画分、それぞれのタンパク質を回収した。抽出した細胞膜画分のタンパク質を60μl(2.0μg/μl)と2H5−F3モノクローナル抗体1.0μl(2.45μg/μl)を混合し、4℃で一晩静置した。次にμMACS protein G(Milteny Biotech)50μlと混合し、4℃で1時間静置した後、免疫沈降を行った。免疫沈降で得られたタンパク質溶解液をSDS−PAGEで分離し、Silver Stain MS Kit(Wako)で染色した。2H5−F3モノクローナル抗体特異的なバントを抽出し、LC−MS/MS解析を行った。また、免疫沈降で得られたタンパク質をウェスタンブロッティングして、2H5−F3モノクローナル抗体との反応性を解析した。その結果、2H5−F3抗体の認識する抗原はシクロフィリンAであることを同定した。
各実験区のパラフィン包埋乳腺組織から厚さ4μmの切片を作製し、以下の手順でCyPAについて免疫組織化学染色を行った。
切片を脱パラフィン化して得た乳腺組織を5分間水洗し、次いでTarget Retrieval Solution Low pH(Dako)を用いて121℃で5分間の抗原賦活化処理に供した。処理後の乳腺組織を、PBSで3分間洗浄し、これを3回繰り返した。洗浄後の乳腺組織を、3% 正常ヤギ血清/PBSを用いて20分間のブロッキング処理に供した。処理後の乳腺組織を、抗CyPA抗体2,000倍希釈/PBSを用いて、4℃で14時間の一次抗体反応に供した。
反応後の乳腺組織を、PBSで3分間洗浄し、これを3回繰り返した。洗浄後の乳腺組織を、Histofine Simplestain MAX−PO(M)(Nichirei)を用いて室温で20分間の二次抗体反応に供した。反応後の乳腺組織を、PBSで3分間洗浄し、これを3回繰り返した。洗浄後の乳腺組織を、0.0025% 3.3’−diaminobenzidine(同仁、熊本、日本)+0.006% H2O2/0.05M Tris−HCl(pH 7.5)を用いて、室温で1分間のDAB発色反応に供した。反応後の乳腺組織を蒸留水(DW)で数秒間洗浄した。洗浄後の乳腺組織を、室温にて20秒間のヘマトキシリン対比染色に供した。染色後の乳腺組織を、60分間、流水により洗浄した。洗浄後の乳腺組織を、脱水および透徹し、マリノール(武藤化学)を用いて封入した。
(1)SEC投与実験区の乳腺組織の観察
ウシ乳腺におけるCyPAの発現を免疫組織化学染色により観察した。SEC投与実験区の対照正常乳腺組織において、CyPAは乳腺胞に局在していた(図1A)。乳腺胞の乳腺上皮細胞で均一にCyPAが発現していた(図1B)。微量であるが乳腺胞内にある乳汁でCyPAが弱く発現していた(図1C)。
ウシ乳腺におけるCyPAの発現を免疫組織化学染色により観察した。S.A投与実験区の対照正常乳腺組織において、SEC投与実験区の対照正常乳腺組織と同様に、乳腺胞の乳腺上皮細胞でCyPAが均一に発現していたこと、および乳汁で微量にCyPAが発現していたことが確認された(図3A〜3C)。
ウシ乳腺におけるCyPAの発現を免疫組織化学染色により観察した。治療のためにラクトフェリンを投与したLf投与実験区の対照正常乳腺組織において、SECおよびS.A投与実験区のPBS投与乳腺組織(対照正常乳腺組織)と同様に、乳腺上皮細胞および乳汁でCyPAの発現が確認された(図5A〜B、図6A〜C)。間質が肥大し萎縮した乳腺胞および乳腺上皮細胞のCyPA発現は、SA投与実験区の乳房炎発症乳腺と同様に、萎縮していない乳腺胞および乳腺上皮細胞と比べて減少していた(図6C)。また潜在性乳房炎発症した乳腺組織では、上記の実験的乳房炎組織と同様に、正常乳腺組織と比較すると、乳腺上皮細胞、乳汁および免疫細胞浸潤部位でCyPAが高発現していた。(図7A〜C)。
上記の結果から、正常な乳房から採取した乳腺組織において、CyPAが細胞内タンパク質として乳腺上皮細胞および乳汁に存在することが確認された。また、細菌毒素であるSECおよび細菌であるS.Aを投与して乳房炎を発症させた乳房から採取した乳腺組織においても、同様にCyPAが発現した。特に、正常乳腺組織と比べて、乳房炎発症乳腺組織における乳腺上皮細胞、乳汁および免疫細胞浸潤部位のCyPA発現は強かった。搾乳最後期などに見られる間質が肥大化することにより萎縮した乳腺胞および乳腺上皮細胞では、萎縮していない乳腺胞や乳腺上皮細胞と比較すると、それぞれCyPAの発現量が低下した。
1.材料および方法
(1)試料
供試牛として宮城県畜産試験場で飼育されたホルスタイン泌乳牛を用いた。PLテスターおよびCL能の結果より乳房炎を発症していると診断されたホルスタイン泌乳牛8頭および罹患歴がない健常ホルスタイン泌乳牛4頭の合計12頭の供試牛を用いた。乳汁サンプルとして全分房乳、計48サンプル(内1分房は盲乳処置中)を使用した。表1に、試験で使用した乳汁サンプルのデータを示した。
ウェスタンブロット法でのCyPAの解析には、市販のポリクローナル抗体である抗CyPA抗体(rabbit−anti human CyPA;Abcam(登録商標))を用いた。
A.乳汁サンプル中の乳清タンパク質の抽出およびタンパク定量
次の手順で乳汁サンプル中の乳清タンパク質を抽出および定量した。乳汁サンプルを1,100G、4℃、20分間の遠心処理に供した。処理後の乳汁サンプルから乳脂肪および沈殿物を除去し、乳清を採取した。採取した乳清をPierce(登録商標)BCA Protein Assay Kit(Thermo Sientific)を用いて、37℃で30分間インキュベートした。インキュベート後の乳清について、DS PHARMA BIOMEDICALを用いてタンパク濃度を測定したところ、14μg/μlとの定量結果を得た。
タンパク定量した後の乳清サンプルを用いて、以下の手順でCyPAタンパク質の解析を行った。
1日目として、タンパク定量した後の乳清サンプル中のタンパク質を、PAGEL(ATTO;E−T520L)を用いて、タンパク質濃度が21μg/laneになるようにSDS−PAGEによって分離した。分離したタンパク質をImmobion−P Transfer membrames(Millipore)のメンブランとセラミドライシステム(Bio−Rad)を用いて、60分間、1.2mA/cm2で該メンブランへ転写した。転写後のメンブランをTBS−Tweenで、10分間を3回繰り返すことにより洗浄(0.1%Tween20/TBS;TBS−T)した。洗浄後のメンブランを、60分間のブロッキング処理(3% normal goat serum/TBS−T)に供した。処理後のメンブランを、TBS−Tweenにて、10分間を3回繰り返すことにより洗浄した。洗浄後のメンブランを、4℃で14時間の一次抗体反応(抗CyPA抗体1,000倍希釈/TBS−T)に供した。
1日目として、5% 2MEを加えたタンパク定量後の乳清サンプル中のタンパク質を、PAGEL(ATTO;E−T520L)を用いて、タンパク質濃度が21μg/laneになるように、SDS−PAGEによって分離した。分離したタンパク質をImmobion−P Transfer membrames(Millipore)のメンブランとセラミドライシステム(Bio−Rad)を用いて、60分間、1.2mA/cm2でメンブランへ転写した。転写後のメンブランをTBS−Tween(0.1%Tween20/TBS;TBS−T)で10分間を3回繰り返すことにより洗浄した。洗浄後のメンブランを、60分間のブロッキング処理(3% normal goat serum/TBS−T)に供した。TBS−Tweenを用いて10分間を3回繰り返すことにより洗浄した。洗浄後のメンブランを4℃で14時間の一次抗体反応(抗CyPA抗体1,000倍希釈/TBS−T)に供した。
タンパク定量した乳清サンプルを用いて、次の手順で乳清中のタンパク質の解析を行った。乳清サンプル中のタンパク質を、PAGEL(ATTO;E−T520L)を用いてタンパク質濃度が21μg/laneになるようにSDS−PAGEによって分離した。分離後のゲルを、5分間のMQ洗浄を3回繰り返した。洗浄後のゲルを、ULTRA−FAST Coomassie Stain(NRV,USA)を用いて、室温で20分間の発色処理に供した。処理後のゲルにおけるバンドを確認した。
上記(3)B(B)の手順で、乳清サンプル中のタンパク質を分離した。分離後のゲルから、Molecular Imager FXを用いてバンドを検出および撮影した。撮影して得たイメージファイルを、Photshop 5.0 LE.を用いてグレースケールにより白黒反転させた。白黒反転させて得たイメージファイルを、NIHイメージ(NIH imager Ver.1.62,USA)のgel plotting Macrosを用いて解析し、バンド強度を測定した。バンド強度を測定して得たCyPAの濃度は、表1の牛体番号108の右後分房の乳汁サンプル(解析番号42)を基準として数値化した。また、得られたCyPA濃度とCL値との相関関係を解析した。
(1)乳汁中CyPAの検出方法の確立
牛体番号81の分房別乳汁サンプル(解析番号9−12)を用いて、タンパク質解析を行った。Coomassie Brilliant Blue(CBB)染色を行った結果、還元処理した非感染分房乳汁サンプル(解析番号10−12)および乳房炎発症分房乳汁サンプル(解析番号9)の解析結果として、65kDa付近にてバンドが検出された(図8)。これは本来160kDa程度のIgGが還元されて得たものと推測される。また、非還元処理で見られた50kDa付近のタンパク質は、還元処理後には検出されなかった。
上記(1)から、乳房炎に罹患している泌乳牛に由来する乳汁サンプル中にCyPAタンパク質が検出されたことから、全乳汁サンプル(解析番号1−48、ただし解析番号19は盲乳処置中)について還元処理を行い、得られた乳清サンプル中のCyPAタンパク質を解析した。健常牛分房乳汁サンプル(解析番号33−48)および乳房炎発症乳汁サンプル(解析番号1−32)を用いた解析では、CyPAタンパク質が検出された(図10A〜C)。健常牛分房乳は乳房炎発症分房乳と比べ、CyPAタンパク質が少なかった。一方、乳房炎発症乳の非感染分房乳(解析番号1,3−6,10−12,14,16,18−22,24−26,29)は、乳房炎発症分房乳(解析番号2,7−9,13,15,17,23,27,28,30−32)より、CyPAタンパク質が少なかった。
健常牛の分房乳汁サンプルで乳性状、PLテストおよびCL能が低かった牛体番号108の解析番号42の乳汁サンプルを標準として、全乳汁サンプルのCyPA発現強度を測定した。解析番号1−48(ただし解析番号19は盲乳処置中)のCyPA発現の相対値を算出した(表2)。CL能とCyPA発現強度には相関関係が見られた(p<0.0001)(図11)。CL能の上昇に伴い、CyPA発現強度も増加することが明らかになった。
非還元処理した乳清サンプルのウェスタンブロットでは、非感染分房乳汁サンプルにおいてCyPAは検出されなかった。しかし、高いCL能を示す乳房炎発症分房乳汁サンプルからは、CyPAを大量に検出した。一方、乳清タンパク質の還元処理を行ったところ、健常牛由来乳汁サンプルおよび乳房炎発症牛由来乳汁サンプルの乳清中にCyPAが検出された。
Claims (8)
- 乳腺または乳汁におけるシクロフィリンA量を指標とした、乳房炎の検査方法。
- 下記(1)および(2)の工程を含む、乳房炎の検査方法。
(1)被験体の乳房または乳分房から採取された乳汁におけるシクロフィリンAを検出することにより乳汁中のシクロフィリンA量を得る工程
(2)前記乳汁中のシクロフィリンA量に基づいて、被験体の乳房または乳分房における乳房炎の発症または乳房炎の発症可能性を判定するためのデータを提供する工程 - 前記工程(2)は、前記乳汁中のシクロフィリンA量が、健常な乳房または乳分房から採取した乳汁中のシクロフィリンA量よりも大きい場合に、被験体の乳房または乳分房において乳房炎が発症している、または乳房炎が発症する可能性があると判定するためのデータを提供する工程である、請求項2に記載の方法。
- 前記工程(2)は、前記乳汁中のシクロフィリンA量が、健常な乳房または乳分房から採取した乳汁中のシクロフィリンA量の2倍以上である場合に、被験体の乳房または乳分房において乳房炎が発症している、または乳房炎が発症する可能性があると判定するためのデータを提供する工程である、請求項2に記載の方法。
- 抗シクロフィリンA抗体からなる、乳房炎検査用試薬。
- 前記抗シクロフィリンA抗体が、不溶性担体に固相化されている抗シクロフィリンA抗体である、請求項5に記載の試薬。
- 請求項5〜6のいずれか1項に記載の試薬を含む、乳房炎検査用キット。
- シクロフィリンAからなる、乳房炎検出用マーカー。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2012156163 | 2012-07-12 | ||
JP2012156163 | 2012-07-12 | ||
PCT/JP2013/052955 WO2014010261A1 (ja) | 2012-07-12 | 2013-02-08 | 乳腺疾患の検査方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2014010261A1 JPWO2014010261A1 (ja) | 2016-06-20 |
JP6176741B2 true JP6176741B2 (ja) | 2017-08-09 |
Family
ID=49915740
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2014524659A Active JP6176741B2 (ja) | 2012-07-12 | 2013-02-08 | 乳腺疾患の検査方法 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10012649B2 (ja) |
JP (1) | JP6176741B2 (ja) |
WO (1) | WO2014010261A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US10012649B2 (en) * | 2012-07-12 | 2018-07-03 | Tohoku University | Detection method of mammary gland disease |
JP2016088918A (ja) * | 2014-11-11 | 2016-05-23 | 大山乳業農業協同組合 | 乳房炎治療・予防用組成物、並びに、乳房炎の治療・予防方法 |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7105306B1 (en) * | 2000-08-10 | 2006-09-12 | Trustees Of The University Of Pennsylvania | Methods and compositions for modulating somatolactogenic functions |
US20110207156A1 (en) * | 2008-10-29 | 2011-08-25 | The Regents Of The University Of Colorado | Biomarkers for Diagnosis of Breast Cancer |
US10012649B2 (en) * | 2012-07-12 | 2018-07-03 | Tohoku University | Detection method of mammary gland disease |
-
2013
- 2013-02-08 US US14/413,855 patent/US10012649B2/en active Active
- 2013-02-08 JP JP2014524659A patent/JP6176741B2/ja active Active
- 2013-02-08 WO PCT/JP2013/052955 patent/WO2014010261A1/ja active Application Filing
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20150192585A1 (en) | 2015-07-09 |
WO2014010261A1 (ja) | 2014-01-16 |
US10012649B2 (en) | 2018-07-03 |
JPWO2014010261A1 (ja) | 2016-06-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5710699B2 (ja) | オートタキシン測定による慢性肝疾患の検査方法および検査薬 | |
US10126312B2 (en) | Diagnostic method for urinary tract infection | |
US11892457B2 (en) | Proteoliposome-based ZnT8 self-antigen for type 1 diabetes diagnosis | |
JP2016527483A (ja) | 前立腺癌を検出する方法 | |
EP2054443B1 (en) | Antibodies to an epitope of agr2, assays and hybridomas | |
WO2014192974A1 (ja) | 抗lgr6抗体を含む癌の検出用又は診断用試薬 | |
EP2692735B1 (en) | Antibody reacting with native cochlin-tomoprotein (ctp) and method for measuring ctp using same | |
JP6176741B2 (ja) | 乳腺疾患の検査方法 | |
WO2020184409A1 (ja) | 生体試料中のβ-D-グルカンの免疫学的分析方法、及びβ-D-グルカン分析用キット | |
CN106153935A (zh) | 一种定量检测CD79α的酶联免疫试剂盒 | |
US11746146B2 (en) | Antibody composition specifically recognizing an immunogenic fragment peptide of EN2 protein | |
JP2010281725A (ja) | ラクトフェリンの催炎性フラグメントの測定方法 | |
WO2020205299A1 (en) | Detecting cancer biomarker proteins in blood | |
JP6749221B2 (ja) | 疥癬の検査方法、並びにそれに用いる薬剤及びデバイス | |
JP7306661B2 (ja) | 消化管間質腫瘍を検出する方法および検出試薬 | |
CN115819548B (zh) | 一种检测炎症相关疾病的标志物和方法 | |
JP2016114360A (ja) | ヒトt細胞白血病ウイルスhbz蛋白質の検出方法 | |
WO2022054753A1 (ja) | 敗血症原因細菌の免疫学的分析キット | |
US20230133318A1 (en) | Novel biomarkers of membranous glomerulonephritis | |
JP2023138363A (ja) | 妊孕性を判定するためのバイオマーカー及びそれを用いた判定方法 | |
KR20200082651A (ko) | 디프테리아 독소에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 이의 용도 | |
JP2013203733A (ja) | イヌ糸状虫22kDaタンパク質を利用したイヌ糸状虫感染の検出 | |
JP2001289859A (ja) | 多発性硬化症の診断方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20170228 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170428 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20170613 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20170706 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6176741 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |