WO2022107737A1 - ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出キットおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法 - Google Patents

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出キットおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法 Download PDF

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cov
sars
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大 氏原
順一 片田
明秀 梁
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富士フイルム株式会社
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    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/10—Detection of antigens from microorganism in sample from host

Definitions

  • the present invention relates to a SARS-CoV-2 detection kit and a SARS-CoV-2 detection method using silver amplification of detection information.
  • SARS (Severe acute regression syndrome) -CoV-2 which is the causative virus of COVID-19 that caused a pandemic in 2020, is described in, for example, Non-Patent Document 1 as a main method used for diagnosis.
  • RT-PCR reverse transcription polymerase chain reaction
  • a small amount of RNA can be detected by converting a small amount of RNA into cDNA using reverse transcriptase and then amplifying it to a detectable concentration, which enables highly sensitive and definitive diagnosis. It is an inspection method.
  • Non-Patent Document 2 an antigen test kit for detecting nucleocaside protein (NP), which is said to have a protective function for genomic RNA, and diagnosing COVID-19 has been developed.
  • the antigen test is a test method that mainly detects the presence of proteins contained together with the SARS-coronavirus gene, and among those test methods, a detection method by an immunochromatographic method that can be easily performed is used. Has been done.
  • Patent Document 1 describes antisera derived from non-human animals and / or immunoglobulins derived from non-human animals against the 2019-nCOV (SARS-CoV-2) virus.
  • Patent Document 2 describes a monoclonal antibody against a novel coronavirus or a derivative thereof, in which antigen complementarity determining regions CDR1, CDR2 and CDR3 are defined.
  • Patent Document 3 describes a technique that enables highly sensitive detection by increasing the size of labeled particles by using a compound containing silver and a reducing agent for silver ions. Is disclosed.
  • the RT-PCR test which is a method for detecting genomic RNA information
  • the method of detecting by the immunochromatographic method of the antigen test is a simple simple test method capable of measuring in a short time, but the sensitivity is lower than that of the RT-PCR test.
  • the present invention has been set as a problem to be solved to provide a detection kit for SARS-CoV-2 and a detection method for SARS-CoV-2, which enables simpler and more sensitive detection of SARS-CoV-2. ..
  • the present inventors used an antibody that detects SARS-CoV-2 nucleocapsid protein (NP), a compound containing silver, and a reducing agent capable of reducing silver ions. Therefore, they have found that simple and highly sensitive measurement can be performed by amplifying the information of the SARS-CoV-2 nucleocapsid protein (NP) detected by the above antibody, and have completed the present invention.
  • NP SARS-CoV-2 nucleocapsid protein
  • NP nucleocapsid protein
  • a biological sample which contains at least one antibody that specifically reacts with SARS-CoV-2 nucleocapsid protein (NP).
  • NP nucleocapsid protein
  • NP nucleocapsid protein
  • a detection kit for SARS-CoV-2 comprising a first container containing a compound containing silver and a second container containing a reducing agent capable of reducing silver ions.
  • ⁇ 2> The SARS-CoV-2 detection kit according to ⁇ 1>, wherein the antibody is a fragmented antibody.
  • ⁇ 3> The SARS-CoV-2 detection kit according to ⁇ 2>, wherein the fragmented antibody is an antibody produced by protease treatment.
  • the fragmented antibody is an antibody produced by protease treatment.
  • ⁇ 4> Any of ⁇ 1> to ⁇ 3>, wherein the antibody is labeled with a labeling substance, and the information obtained by the labeling substance is amplified and detected by a compound containing silver and a reducing agent capable of reducing silver ions.
  • ⁇ 5> The SARS-CoV-2 detection kit according to ⁇ 4>, wherein the labeling substance is colloidal gold.
  • ⁇ 6> The SARS-CoV-2 detection kit according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 5>, wherein the reducing agent is a metal salt of Fe 2+ .
  • ⁇ 7> The SARS-CoV-2 detection kit according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 6>, further comprising an insoluble carrier.
  • ⁇ 8> The SARS-CoV-2 detection kit according to ⁇ 7>, wherein the insoluble carrier has a capture region for capturing the test substance and a coloring region for detecting the reducing agent.
  • SARS-CoV-2 of SARS-CoV-2 that specifically detects nucleocapsid protein (NP) contained in a biological sample using at least one antibody that specifically reacts with SARS-CoV-2 nucleocapsid protein (NP). It ’s a detection method, As the above antibody, at least one antibody having a subclass of IgG2b is used, and the antibody is used. The detection method comprises amplifying the detection information of the nucleocapsid protein (NP) with a compound containing silver and a reducing agent capable of reducing silver ions. SARS-CoV-2 detection method. ⁇ 10> The method for detecting SARS-CoV-2 according to ⁇ 9>, wherein the antibody is a fragmented antibody.
  • ⁇ 11> The method for detecting SARS-CoV-2 according to ⁇ 10>, wherein the fragmented antibody is an antibody produced by protease treatment.
  • the fragmented antibody is an antibody produced by protease treatment.
  • the antibody is labeled with a labeling substance, and the information obtained by the labeling substance is amplified and detected by a compound containing silver and a reducing agent capable of reducing silver ions.
  • ⁇ 13> The method for detecting SARS-CoV-2 according to ⁇ 12>, wherein the labeling substance is colloidal gold.
  • ⁇ 14> The method for detecting SARS-CoV-2 according to any one of ⁇ 9> to ⁇ 13>, wherein the reducing agent is a metal salt of Fe 2+ .
  • the detection method is an immunochromatographic method.
  • SARS-CoV-2 detection kit and the SARS-CoV-2 detection method of the present invention SARS-CoV-2 can be easily detected with high sensitivity.
  • FIG. 1 is a perspective view showing an embodiment of an embodiment of an immunochromatographic kit of the present invention.
  • FIG. 2 is an exploded schematic perspective view showing an embodiment of an embodiment of an immunochromatographic kit of the present invention.
  • FIG. 3 is a schematic side view showing the positional relationship between the inspection strip and the first and second pots.
  • the numerical range indicated by using “-” means a range including the numerical values before and after "-" as the minimum value and the maximum value, respectively.
  • Coronavirus The new coronavirus to be detected in the present invention is a single-strand plus-strand RNA virus that belongs to the order Nidovirus and has an envelope and a large genome with a length of about 30 kbp. Its name is SARS-CoV-2, and the official name of the infectious disease caused by this new coronavirus is "COVID-19" and WHO (World Health Organization). It is known that the proteins constituting this SARS-CoV-2 include at least four structural proteins of spike (S) protein, envelope (E) protein, membrane (M) protein, and nucleocapsid (N) protein. There is.
  • S spike
  • E envelope
  • M membrane
  • N nucleocapsid
  • the nucleocapsid (N) protein has the function of packaging the viral RNA genome within the envelope of the virus into a liponucleoprotein complex called capsid, is an immunogenic phosphate protein, and has sequence conservation. And has strong immunogenicity.
  • Antigens The above four structural proteins can be used for antigens, but in the present invention, as immunogenic phosphate proteins, they have sequence conservation and strong immunogenicity. , Nucleocapsid (N) protein is used as an antigen to be detected.
  • the antibody used in the present invention is an antibody against the nucleocapsid (N) protein.
  • antibody subclasses can generally be classified into five classes, IgA, IgD, IgE, IgM, and IgG, of which IgG is the most abundant antibody class found in serum. It is further classified into 5 subclasses (IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4).
  • at least one anti-NP antibody whose subclass is IgG2b is used in the present invention as an antibody capable of detecting an antigenic nucleocapsid protein (hereinafter, also referred to as NP) with high sensitivity.
  • NP antigenic nucleocapsid protein
  • an antiserum prepared from the serum of an animal immunized with an antigen (test substance) or an immunoglobulin fraction purified from the antiserum may be used. That is, by immunizing an experimental animal with an antigen, a polyclonal antibody produced in serum can be utilized. Alternatively, a monoclonal antibody produced by a fused cell (hybridoma) obtained by fusing B cells or a cell group containing B cells collected from the spleen of an animal immunized with an antigen in the abdomen with myeloma cells is used. May be good. Alternatively, a monoclonal antibody produced by the cell by introducing the plasmid into the host cell may be utilized. In the present invention, it is preferable to use a method for producing a monoclonal antibody.
  • a fragmented antibody [for example, F (ab') 2 , Fab, Fab', or Fv] obtained by fragmenting the obtained antibody as described above can also be used.
  • an antibody produced by protease treatment can be used as the fragmented antibody. The following two are typical methods for producing a fragmented antibody. First, when the antibody is treated with papain enzyme, it is decomposed into two Fab fragments and one Fc fragment. In addition, when the antibody is treated with a pepsin enzyme, it is decomposed into F (ab') 2 in which two Fab fragments are bound and an Fc fragment fragmented.
  • F (ab') 2 can be made into Fab'by treating with a reducing agent such as 2-mercaptoethylamine.
  • enzymes for producing fragmented antibodies include ficin, lysylendopeptidase, V8 protease, bromelain, clostripain, metalloendopeptidase, and activated papain obtained by activating papain.
  • the Fab fragment, F (ab') 2 fragment and Fab'fragment obtained by these enzyme treatments have an antigen binding site, but an unnecessary Fc fragment is removed. Therefore, by using these fragments in antigen detection, non-specific adsorption is reduced and noise is also reduced.
  • the fragmented antibody used in the present invention is not limited to the one produced by the above method, and any antibody from which the Fc fragment has been removed can be used.
  • the detection information can be amplified by an immunochromatographic method.
  • the immunochromatographic method is a method for determining and measuring a test substance easily, quickly, and specifically by the following method, and is a method using information on a labeling substance as detection information. More specifically, it is the method described below. That is, it corresponds to a binding substance that can bind to the test substance (corresponding to a second binding substance that can bind to the test substance, or a substance that has a binding property to the first binding substance below.
  • an antibody is a binding substance that can bind to the test substance.
  • a chromatograph carrier (a part of an insoluble carrier) having a labeling substance capture region containing at least one test region having an antigen or the like is used as a stationary phase.
  • a liquid containing a labeling substance modified by a first binding substance capable of binding to a test substance is chromatographically moved as a moving layer.
  • the test substance and the labeling substance are specifically bound to reach the labeling substance capture region having the inspection region.
  • the complex of the test substance and the labeling substance is specifically specific to the immobilized binding substance (substance having binding property to the second binding substance or the first binding substance).
  • the labeling substance is concentrated in the binding substance (the second binding substance or the substance having the binding property to the first binding substance) only when the test substance is present in the test sample.
  • the presence of the test substance in the test sample is qualitatively and quantitatively analyzed by measuring the labeled amount visually or using an appropriate device.
  • the complex of the test substance and the labeling substance is bound to the immobilized binding substance (second binding substance or binding to the first binding substance).
  • the reaction site is washed with a washing solution, and then the signal is amplified using an amplifying solution.
  • Amplification reagents used to amplify the signal of the labeling substance preferably two amplification reagents, for example, a reducing agent capable of reducing silver ions and a compound containing silver) are used on the labeling substance capture region.
  • the signal can be amplified by the amplification reaction, and as a result, high sensitivity can be achieved.
  • the measurement can be carried out with a rapid high-sensitivity chromatograph.
  • Test sample As the test sample in the detection kit and detection method of the present invention, a biological sample containing the new coronavirus SARS-CoV-2 virus (for example, runny nose, nasal discharge, or saliva) is used. be able to.
  • As the test substance those capable of detecting the new coronavirus SARS-CoV-2 are preferable, and the nuclear protein nucleocapsid protein (NP) can be detected as the test substance.
  • Coronavirus is known to contain at least four structural proteins: spike (S) protein, envelope (E) protein, membrane (M) protein, and nucleocapsid (N) protein, of which nucleocapsid (N).
  • S spike
  • E envelope
  • M membrane
  • N nucleocapsid
  • N nucleocapsid
  • N nucleocapsid
  • the test sample is extracted as it is, or the test sample is extracted using an appropriate extraction solvent, and further extracted in the form of an extract. It can be used in the form of a diluted solution obtained by diluting the solution with an appropriate diluent, or in the form of concentrating the extract by an appropriate method.
  • the extraction solvent used in the present invention is a solvent used in ordinary immunological analysis methods (for example, water, physiological saline, buffer solution, etc.), or a direct antigen-antibody reaction by diluting with such a solvent. It is also possible to use a water-miscible organic solvent capable of carrying out the above.
  • a strip for a chromatograph can be incorporated and used.
  • the chromatographic strip that can be used is not particularly limited as long as it is a chromatographic strip that can be used in a conventional immunochromatographic method.
  • the chromatograph strip that can be used in the present invention has a labeled substance holding region and a labeled substance trapping region from the upstream direction to the downstream direction in the development direction of the test sample containing the test substance. ..
  • a sample addition pad e.g, a labeling substance retention pad with a labeling substance retention area (eg, a colloidal gold antibody retention pad), a binding substance-immobilized membrane that is an insoluble carrier (eg, a chromatograph carrier with a labeling substance capture region), and absorption.
  • a mode in which the pads are arranged on the pressure-sensitive adhesive sheet in this order is preferably used.
  • the chromatograph carrier (insoluble carrier) on which the binding substance is immobilized has at least one test region (also referred to as a test line) which is a reaction site on which an antibody or antigen specifically bound to the test substance is immobilized. It may further have a region having at least one confirmation region (also referred to as a control region) on which a control antibody or antigen is immobilized, which has a labeling substance capture region. Further, an amplification index region may be provided downstream of the labeling substance capture region.
  • a labeling substance retention pad having a labeling substance retention region that can be used in the present invention, after preparing a suspension containing the labeling substance and applying the suspension to a suitable absorption pad (for example, a glass fiber pad). , Can be prepared by drying it.
  • a suitable absorption pad for example, a glass fiber pad.
  • labeling substance used in the present invention label used to label the first binding substance that specifically binds to the test substance (antigen)
  • a labeling substance containing a metal is used.
  • a metal such as gold, silver and platinum, iron, lead, copper, cadmium, bismuth, antimony, tin and mercury can be preferably used, and more preferably. It is preferably a noble metal of gold, silver or platinum.
  • a metal colloidal label or a metal sulfide label can be used as a preferred form of the metal-containing labeling substance that can be used in the present invention.
  • metal colloid label platinum colloid, gold colloid, silver colloid, iron colloid, aluminum hydroxide colloid and the like can be preferably used, and as the metal sulfide label, iron, silver, lead and copper are preferable. , Cadmium, bismuth, antimony, tin, or mercury sulfides can be used. In the present invention, platinum colloid, gold colloid, silver colloid, and most preferably gold colloid can be used more preferably. When gold colloidal particles are used as the metal colloidal label, commercially available ones may be used. Alternatively, colloidal gold particles can be prepared by a conventional method, for example, a method of reducing gold chloride acid with sodium citrate (Nature Physical Science, 241 (1973) 20, etc.).
  • the average particle size of the metal colloid is preferably about 1 nm to 500 nm, more preferably 3 to 100 nm, and particularly preferably 5 to 60 nm.
  • the average particle size of the metal colloid used in the present invention can be measured with a commercially available particle size distribution meter or the like.
  • As the method for measuring the particle size distribution optical microscopy, confocal laser microscopy, electron microscopy, interatomic force microscopy, static light scattering method, laser diffraction method, dynamic light scattering method, centrifugal sedimentation method, electric pulse Measurement methods, chromatography methods, ultrasonic attenuation methods, etc. are known, and devices corresponding to each principle are commercially available.
  • the dynamic light scattering method can be preferably used in the present invention because of the particle size range and the ease of measurement.
  • Commercially available measuring devices using dynamic light scattering include Nanotrack UPA (Nikkiso Co., Ltd.), dynamic light scattering type particle size distribution measuring device LB-550 (Horiba Seisakusho Co., Ltd.), and concentrated particle size analyzer.
  • FPAR-1000 Oleuka Denshi Co., Ltd.
  • it is determined as the value of the median diameter (d 50) measured at a measurement temperature of 25 ° C.
  • a metal-based label In a chromatograph using a metal colloid label or a metal sulfide label as a labeling substance for detection, another metal alloy label (hereinafter, may be referred to as a metal-based label), or a polymer particle label containing a metal, the metal-based label is used. It is characterized by amplifying a signal. Specifically, after the complex of the test substance and the labeling substance is formed, silver ions supplied from a silver-containing compound such as an inorganic silver salt or an organic silver salt are brought into contact with a reducing agent capable of reducing silver ions.
  • a silver-containing compound such as an inorganic silver salt or an organic silver salt
  • the silver particles When silver ions are reduced by a reducing agent to generate silver particles, the silver particles are deposited on the metal-based label with the metal-based label as the nucleus, so that the metal-based label is amplified and the analysis of the test substance is highly performed. Can be carried out with sensitivity. Therefore, in the immunochromatographic method of the present invention, a reaction of depositing on a label of an immune complex is carried out using silver particles generated by the reducing action of silver ions by a reducing agent, and the signal amplified in this way is analyzed. Except for the above, the conventionally known chromatograph method can be applied as it is in other respects.
  • the labeling substance is modified with the first binding substance that can bind to the test substance.
  • the first binding substance has an affinity for a test substance such as an antibody against a test substance (antibody), an antigen against a test substance (antibody), and an aptamer against a test substance (protein, low molecular weight compound, etc.). Any compound having the above can be used, but in the present invention, it is preferable to use an antibody that specifically reacts with the SARS-CoV-2 nucleocapsid protein (NP).
  • an antibody whose subclass of antibody is IgG2b is used as at least one of the second binding substance and the first binding substance described below.
  • the detection kit of the present invention preferably has an insoluble carrier (chromatographic carrier), and has a labeling substance trapping region on this strip.
  • This labeled substance capture region has an inspection region having a second binding substance that can bind to the test substance, and further has a confirmation region having a binding substance having a binding property to the first binding substance.
  • the above-mentioned aspect is preferable.
  • Examples of the second binding substance that can bind to the test substance include an antibody against the test substance (antigen), an antigen against the test substance (antibody), and an aptamer against the test substance (protein, low molecular weight compound, etc.). Any compound having an affinity for the test substance can be used, but in the present invention, it is preferable to use an antibody that specifically reacts with the SARS-CoV-2 nucleocapsid protein (NP).
  • NP SARS-CoV-2 nucleocapsid protein
  • an antibody whose subclass of antibody is IgG2b is used as at least one of the above-mentioned first binding substance and second binding substance.
  • the second binding substance and the first binding substance may be different or the same.
  • the substance having the binding property to the first binding substance may be the test substance itself or a compound having a site recognized by the first binding substance, for example, a derivative and a protein of the test substance (for example, BSA). (Bovine Serum Albamin, etc.)) and the like can be mentioned.
  • the first binding substance is an antibody and / or the second binding substance is an antibody. More preferably, the first binding agent is an antibody that specifically reacts with the SARS-CoV-2 nucleocapsid protein (NP), and the second binding agent specifically reacts with the SARS-CoV-2 nucleocapsid protein (NP). It is an antibody that reacts.
  • the labeling substance trapping region of the insoluble carrier of the present invention has an amplification index region.
  • the amplification index region is a region for determining that the development of the amplification reagent has reached the amplification index region due to color development or color change in response to the amplification reagent described later.
  • the amplification index region is preferably a color-developing region for detecting the reducing agent.
  • the amplification index region is formed by a color-developing reagent-immobilized line in which (manufactured) is immobilized in a line shape.
  • the second amplification liquid reaches the amplification index region, the region changes from green to orange. This discoloration can be taken as an index that the amplification index region and the region developed so far are sufficiently filled with the second amplification liquid.
  • the methods for modifying a labeling substance using the first binding substance for example, as a method for binding a metal colloid and a specifically binding substance, a conventionally known method described below (for example, The) is used. Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 30,7, (1982) 691-696).
  • the metal colloid and the specific binding substance for example, an antibody
  • the desired substance can be obtained by dispersing the precipitate obtained by centrifugation in a solution containing a dispersant such as polyethylene glycol.
  • insoluble carrier As the insoluble carrier that can be used in the present invention, a porous carrier is preferable.
  • nitrocellulose membrane, cellulose membrane, acetylcellulose membrane, polysulfone membrane, polyethersulfone membrane, nylon membrane, glass fiber, non-woven fabric, cloth, thread and the like are preferable, and nitrocellulose membrane is more preferable.
  • a confirmation region having a second binding substance capable of binding to the test substance and immobilizing a substance having binding property to the first binding substance is provided in the labeling substance trapping region of the insoluble carrier. It is preferable to have.
  • the second binding substance that can bind to the test substance, or the substance that has the binding property to the first binding substance is directly immobilized on a part of the insoluble carrier by physical or chemical binding to capture the labeled substance.
  • a region may be formed, or the fine particles may be physically or chemically bound to fine particles such as latex particles, and the fine particles may be trapped and immobilized in a part of an insoluble carrier to form a labeled substance trapping region. good.
  • the insoluble carrier should be used after immobilizing a second binding substance or a substance having a binding property to the first binding substance, and then subjecting it to a non-specific adsorption prevention treatment by treatment with an inert protein or the like. Is preferable.
  • the insoluble carrier of the present invention may preferably have an embodiment having a plurality of types of inspection regions, and may further have the above-mentioned confirmation region as a part of the labeling substance capture region, if desired.
  • the insoluble carrier is preferably used by incorporating a labeling substance holding pad having a labeling substance holding region.
  • the labeling substance holding pad include a pad holding gold colloid.
  • the material of the labeling substance holding pad for example, cellulose filter paper, glass fiber, non-woven fabric and the like can be preferably used.
  • the labeling substance holding pad can be produced by impregnating the above-mentioned material with a certain amount of the labeling substance prepared as described above and then drying it.
  • sample Addition Pad It is preferable to further incorporate and use the sample addition pad for the insoluble carrier. It is preferable that the sample addition pad not only accepts a sample (test sample) containing the added test substance, but also has a function of filtering insoluble particles and the like in the sample.
  • the material of the sample addition pad include those having uniform characteristics such as cellulose filter paper, glass fiber, polyurethane, polyacetate, cellulose acetate, nylon, and cotton cloth.
  • the material constituting the sample addition portion is previously non-specific. It can also be used after being treated to prevent target adsorption.
  • the sample addition pad may also serve as the labeling substance holding pad having the labeling substance holding region described in (9-4).
  • the absorption pad can be preferably incorporated into an insoluble carrier and used.
  • the absorption pad is a site that physically absorbs the added test sample that has been chromatographed and absorbs and removes labeling substances and the like that are not captured by the reaction site of the chromatograph carrier, and is a cellulose filter paper, non-woven fabric, cloth, or cellulose.
  • a water-absorbent material such as acetate is used.
  • the speed of chromatographic movement after the added test sample is chromatographically moved and reaches the absorption pad varies depending on the material and size of the absorption pad, so the speed suitable for the measurement of the test substance is set according to the selection. can do.
  • the cleaning liquid has a function of cleaning the labeling substance remaining in the insoluble carrier (that is, non-specifically remaining) other than the specific binding reaction, and is intended to improve the cleaning effect.
  • the pH may be adjusted, or a cleaning solution containing a surfactant component or a polymer compound such as a protein such as BSA may be used.
  • a cleaning solution containing a surfactant component or a polymer compound such as a protein such as BSA may be used.
  • the amplification liquid of one of the two types of amplification liquids (described later) used also serves as a cleaning liquid.
  • the cleaning liquid Since the cleaning liquid is developed while washing the labeling substance remaining non-specifically during the development, it is developed while containing the labeling substance, but the cleaning liquid before the development is labeled in order to enhance the cleaning effect. It is preferable to use a liquid containing no substance.
  • the cleaning solution is added to the insoluble carrier after the test sample (specimen solution) is developed, and the labeling substances other than the labeling substances bound by the specific binding reaction remaining in the insoluble carrier are washed.
  • a method of sending the cleaning liquid a method of adding the sample liquid to the sample dropping part as it is after developing the sample liquid, an insoluble carrier for sending the cleaning liquid to the insoluble carrier in advance (cleaning liquid addition pad), and an insoluble carrier for absorption (cleaning liquid addition pad).
  • a method of attaching a water absorption pad) adding it to the insoluble carrier for liquid feeding, and sending the liquid toward the insoluble carrier for absorption.
  • the method of adding the cleaning liquid to the addition site, or after developing the sample liquid on the insoluble carrier, the insoluble carrier for sending the cleaning liquid and the insoluble carrier for absorption may be attached to the insoluble carrier.
  • the angle formed by the development direction of the test sample (specimen liquid) and the development direction of the washing liquid is not particularly limited and can be performed at 0 to 180 degrees, but is preferably 0 to 90 degrees. It is preferable to do it in.
  • the insoluble carrier for liquid feeding is not particularly limited as long as a cleaning liquid can be added, and a glass fiber pad, a cellulose membrane, a nitrocellulose membrane or the like can be used.
  • the insoluble carrier for absorption is not particularly limited as long as it is a substance capable of absorbing water, and cellulose, nitrocellulose, glass fiber, a mixture thereof and the like can be used.
  • the sandwich method which is a specific embodiment of the immunochromatographic method, will be described.
  • the sandwich method is not particularly limited, but for example, the analysis of the test substance can be carried out by the following procedure.
  • a first binding substance for example, a first antibody
  • a second binding substance for example, a second antibody
  • the labeling substance is modified in advance with the first binding substance.
  • the second binding substance is fixed on a suitable insoluble carrier (for example, nitrocellulosic film, glass fiber film, nylon film, cellulosic film, etc.) to serve as a detection region of the labeling substance capture region, and the test substance is used as a detection region.
  • a suitable insoluble carrier for example, nitrocellulosic film, glass fiber film, nylon film, cellulosic film, etc.
  • a complex consisting of an immobilized second binding substance, a test substance (antigen) and a labeling substance modified with the first binding substance is formed.
  • an immune complex is formed after the reaction between the immobilized second binding substance and the test substance (antigen) and the reaction between the test substance and the first binding substance modified with the labeling substance is completed.
  • the missing labeling substance is removed, and then, for example, the labeling substance capture region of the insoluble carrier is observed as it is, the labeling substance is detected or quantified, and the presence / absence or amount of the test substance in the test sample is measured.
  • the present invention for example, by supplying a reducing agent and a silver ion-containing compound, a signal from a labeling substance forming such a complex is amplified and detected.
  • the amplification solution used in the present invention is a solution containing an amplification reagent.
  • Amplification reagents are reagents that can cause signal amplification by reacting catalytically with the action of labeling substances and test substances to produce colored compounds and luminescence, and are in the state of a solution containing the reagents. That is, it can be used as an amplification liquid.
  • a silver ion solution that causes precipitation of metallic silver by physical development on a metal label a solution of a phenylenediamine compound and a naphthol compound that becomes a dye by the action of a peroxidase label and hydrogen peroxide, and the like can be mentioned.
  • the first amplification reagent is used as the first amplification solution and the second amplification reagent is used as the second amplification reagent. It is preferable to keep it contained in the liquid and perform amplification by sequentially adding the second amplification liquid and the first amplification liquid.
  • the amplification liquid As a specific example of the amplification liquid, a combination of a second amplification liquid containing a reducing agent capable of reducing silver ions and a first amplification liquid containing a compound containing silver can be used.
  • a reducing agent capable of reducing silver ions contained in the second amplification liquid, a compound containing silver contained in the first amplification liquid, and the like will be described.
  • a silver ion-containing compound for example, an organic silver salt, an inorganic silver salt, or a silver complex
  • a silver ion-containing compound having high solubility in a solvent such as water and examples thereof include silver nitrate, silver acetate, silver lactate, silver butyrate, and silver thiosulfate.
  • silver nitrate Particularly preferred is silver nitrate.
  • the silver complex is preferably a silver complex coordinated to a ligand having a water-soluble group such as a hydroxyl group or a sulfone group, and examples thereof include hydroxythioether silver.
  • the inorganic silver salt or silver complex may contain 0.001 mol / m 2 to 0.2 mol / m 2 , preferably 0.01 mol / m 2 to 0.05 mol / m 2 , as silver. preferable.
  • the reducing agent that can reduce silver ions can be any inorganic or organic material or a mixture thereof as long as the silver ions can be reduced to silver.
  • Preferred examples of the inorganic reducing agent include reducing metal salts and reducing metal complex salts whose valences can be changed by metal ions such as Fe 2+ , V 2+ , and Ti 3+ .
  • an inorganic reducing agent it is necessary to complex or reduce oxidized ions to remove or detoxify them.
  • citric acid or EDTA can be used to form a complex of Fe 3+ , which is an oxide, to make it harmless.
  • the developer used in the wet silver halide photographic photosensitive material for example, methyl gallic acid, hydroquinone, substituted hydroquinone, 3-pyrazolidones, p-aminophenols, p-phenylenediamines, hindered phenols, amidoxime).
  • Adins, catechols, pyrogallols, ascorbic acid (or derivatives thereof), and leuco pigments and other materials apparent to those skilled in the art, such as US Pat. No. 6,020,117. Materials that have been used can also be used.
  • an ascorbic acid reducing agent is also preferable.
  • useful ascorbic acid reducing agents include ascorbic acid analogs, isomers and derivatives thereof, such as D- or L-ascorbic acid and sugar derivatives thereof (eg, ⁇ -lactoascorbic acid, glucoascorbic acid, fucoascorbic acid). , Glucoheptoascorbic acid, maltoascorbic acid), sodium salt of ascorbic acid, potassium salt of ascorbic acid, isoascorbic acid (or L-erythroascorbic acid), salts thereof (eg alkali metal salt, ammonium salt or the art).
  • Endiol type ascorbic acid enaminol type ascorbic acid, thioenoal type ascorbic acid and the like can be mentioned as preferable ones, and in particular, D, L or D, L-ascorbic acid.
  • D, L or D, L-ascorbic acid a mixture of these reducing agents can be used.
  • auxiliaries of the amplification liquid may include buffers, preservatives (eg, antioxidants or organic stabilizers), and speed regulators.
  • buffers for example, acetic acid, citric acid, sodium hydroxide or a salt thereof, a buffer using tris (hydroxymethyl) aminomethane, or other buffers used in general chemical experiments may be used. Can be done.
  • These buffers can be appropriately used to adjust the pH to the optimum pH for the amplified solution.
  • an alkylamine can be used as an additive as an antifog agent, and dodecylamine is particularly preferable.
  • a surfactant can be used, and particularly preferably C 9 H 19 -C 6 H 4 -O- (CH 2 CH 2 O) 50 H.
  • the reducing agent solution as the second amplification solution is instilled on the pad for sending the reducing agent solution, and the reducing agent solution is applied to the labeled substance capture region.
  • a method of infiltrating the silver ion solution in the thickness direction of the insoluble carrier by instilling the silver ion solution as the first amplification solution from the upper part of the insoluble carrier into the region including the labeling substance trapping region. ..
  • a pot (container) containing each amplification reagent As a method of incorporating the two types of amplification reagents in the immunochromatography kit, as a pot (container) containing each amplification reagent, a second amplification liquid storage pot (second container) containing a reducing agent solution, and a first A method of arranging the amplification liquid storage pot (first container) on the upper part of the site where each amplification reagent is instilled can be mentioned.
  • a second amplification liquid storage pot (second container) containing the reducing agent solution is placed on the top of a pad for feeding the reducing agent solution, and a first containing a silver ion solution (first amplification solution) is placed.
  • the amplified liquid storage pot (first container) is installed immediately above the silver ion solution filling hole.
  • the liquid can flow by pushing each pot and can be spotted on a predetermined site.
  • Another method of instilling the amplification reagent into the immunochromatography kit is to place a second amplification solution storage pot containing the reducing agent solution on the insoluble carrier opposite the labeling substance capture region with respect to the sample addition pad.
  • the test sample is developed in the same direction as the development direction of the test sample.
  • a silver ion solution which is the first amplification solution
  • the liquid flows by pushing each convex deformed portion, and the liquid is spotted at a predetermined position. can do.
  • the detection method of the present invention comprises a labeling substance modified with a first binding substance capable of binding to a test substance, a second binding substance capable of binding to a test substance, or a test substance. It can be carried out using a kit for immunochromatography including an insoluble carrier containing a substance having a binding property to a first binding substance capable of binding to.
  • the kit for an immunochromatography may be provided with a labeling substance modified with a first binding substance capable of binding to the test substance on an insoluble carrier in advance.
  • a labeling substance modified with a first binding substance that can bind to the test substance may be provided separately from the insoluble carrier.
  • the measurement can be carried out by a method such as mixing a labeling substance provided separately from the insoluble carrier with the test sample and then developing it on the insoluble carrier.
  • the kit for immunochromatography of the present invention comprises a cleaning liquid and an amplification liquid, and preferably functions as a cleaning liquid containing a first amplification liquid containing a compound containing silver and a reducing agent capable of reducing silver ions. It is possible to provide a second amplification liquid that also serves as.
  • the example and a range described in the immunochromatographic method and the like can be preferably used.
  • the example chromatograph kit is an immunochromatography kit for detecting SARS-CoV-2 antigen for detecting NP antigen.
  • hybridoma culture supernatant After blocking the membrane with a 2% skim milk solution, 5 mL of the hybridoma culture supernatant was added and reacted, and the reaction was carried out with a peroxidase-labeled anti-mouse immunoimmunoglobulin antibody. Then, a peroxidase substrate solution was added to cause light emission for detection. By cloning the hybridomas identified by these screenings, hybridoma cells producing monoclonal antibodies showing high reactivity with the antigen protein were obtained.
  • the antibody was trapped in a protein A carrier by adding to a column (volume 1.04 mL), and the components non-specifically adsorbed on the carrier were washed away with 10 mL of equilibration / washing buffer. Next, the antibody adsorbed on the column was eluted with 10 mL of elution buffer (100 mmol / L sodium citrate, pH 3.0). The recovered eluate was concentrated using Amicon Ultra (Merck Millipore). The concentration of the obtained purified antibody was quantified by a UV absorption method at 280 nm.
  • the subclass was identified using the ISO-GOLD Rapid Isotyping Kit.
  • the purified antibody was diluted 100-fold with Sample Dimension Buffer. 150 ⁇ L of this solution was added to the lateral flow kit and allowed to stand for 5 minutes. The detected line was read and the subclass was identified. Multiple antibodies were prepared. From the above, four kinds of antibodies, IgG2b (No1), IgG2b (No2), IgG1 (No1), and IgG1 (No2) were obtained.
  • an aqueous solution containing 1% by mass of polyethylene glycol (PEG (polyethylene glycol); weight average molecular weight (Mw.): 20000, product number: 168-11285, manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added. 550 ⁇ L was added and stirred for 10 minutes, and then 1.1 mL of an aqueous solution of 10 mass% bovine serum albumin (BSA (Bovine Serum Albumin); Fraction V, product number: A-7906, manufactured by SIGMA) was added and stirred for 10 minutes. This solution was centrifuged at 8000 ⁇ g at 4 ° C.
  • BSA Bovine Serum Albumin
  • Fraction V product number: A-7906, manufactured by SIGMA
  • Centrifugation was performed again using the same centrifuge under the same conditions, the supernatant was removed, and after ultrasonic dispersion, the mixture was dispersed in a colloidal gold storage solution to obtain an antibody-modified colloidal gold (50 nm) solution.
  • the anti-NP antibody-modified colloidal gold prepared in (2-1) had a concentration of 20 mmol / in Tris-HCl buffer (pH 8.2). With water so that the concentration of L, PEG (Mw. 20000) is 0.05% by mass, the concentration of sucrose is 5% by mass, and the optical concentration of colloidal gold at 520 nm is 0.1 when the optical path length is 10 mm. It was diluted to give a colloidal gold coating solution.
  • An anti-NP monoclonal antibody (antibody whose subclass is IgG2b (No2)) solution prepared to be 1.5 mg / mL is applied in a line at a position 15 mm from the downstream side of the short side of 60 mm of the nitrocellulose membrane. It was designated as an inspection area. Further, an anti-mouse IgG antibody solution prepared to be 0.5 mg / mL was applied in a line at a position 11 mm from the downstream side of the short side of 60 mm to serve as a confirmation region.
  • bromocresol green (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) prepared at 30 mmol / L was applied in a line at a position 9 mm from the downstream side of the short side of 60 mm to serve as an amplification index region.
  • the nitrocellulose membrane was dried in a warm air dryer at 50 ° C. for 30 minutes.
  • 500 mL of blocking solution 50 mmol / L boric acid buffer (pH 8.5) containing 0.5% by mass casein (milk-derived, product number 030-01505, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)).
  • the nitrogen membrane dried as described above was immersed in the bat containing the above-mentioned material and allowed to stand for 30 minutes.
  • the nitrocellulose membrane was taken out, and a washing / stabilizing solution prepared in another vat (50 mmol / L Tris-HCl (pH 7.5) buffer containing 0.5 mass% sucrose and 0.05 mass% sodium cholic acid).
  • the nitrocellulose membrane was immersed in 500 mL and allowed to stand for 30 minutes. Then, the nitrocellulose membrane was taken out from the liquid and dried in an environment of 25 ° C. for 24 hours.
  • the portion on which the anti-NP antibody is immobilized contains a second substance that binds to the test substance, and the portion on which the anti-mouse IgG antibody is immobilized contains a confirmation region that contains a substance that can bind to the first substance.
  • the portion where the bromocresol green is fixed corresponds to the amplification index region containing the substance that reacts with the first amplification solution.
  • a liquid feeding pad (glass fiber pad cut into 25 mm ⁇ 300 mm (Glass Fiber Conjugate Pad, manufactured by Millipore)) was attached to the upstream side of the chromatograph carrier so that the liquid feeding pad and the chromatograph carrier overlapped by 7 mm. ..
  • the member thus produced was cut with a guillotine cutter (CM4000, manufactured by Nippon Flour Mills) so that the width was 5 mm parallel to the direction perpendicular to the long side of 300 mm, and 60 inspection strips (CM4000, manufactured by Nippon Techno Cluster Co., Ltd.) were cut. However, the absorption pad is not included.) was prepared.
  • nitric acid 10% by weight
  • dodecylamine manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 123-00246
  • surfactant C 12 H 25 -C 6 H 4 -O A solution prepared by dissolving 0.1 g of-(CH 2 CH 2 O) 50 H in 47.6 g of water in advance was mixed, and this was used as a silver ion solution as the first amplification solution to be sealed in the first pot.
  • Each pot 45 was manufactured by injection molding using polypropylene as a material.
  • the upper case was manufactured by injection molding using polypropylene containing 50% by mass of tough selenium (registered trademark), which is an olefin elastomer manufactured by Sumitomo Chemical Co., Ltd., as a material.
  • the upper case 10 includes two deformable portions (a first convex deformed portion and a second convex deformed portion), and the two deformed portions have no portion separated from the upper case 10. Made by injection molding as part of the upper case 10 at all boundaries.
  • the first convex deformed portion 12 shown in FIGS. 1 and 2 has two protrusions, and the second convex deformed portion 14 has one protrusion. It was configured.
  • the second pot 45 is placed in the lower case 20 with the sheet member 48 facing up, and the first pot 40 is placed in the intermediate member with the sheet member 43 facing down. It was attached to 30. Then, in a state where the upper case 10 and the lower case 20 are fitted so that the outer circumferences are in contact with each other, the contact portion between the upper case and the lower case is joined by ultrasonic welding. At this time, it was confirmed that the welded parts were uniformly welded in all parts in a sealed state. In this way, an immunochromatographic kit was produced.
  • Example 2 In the preparation of the anti-NP antibody-modified colloidal gold described in Example 1 (2-1), an antibody having a subclass of IgG2b (No2) was used instead of an antibody having an IgG2b (No1) subclass, and an implementation was carried out. In the preparation of the chromatograph carrier described in Example 1 (2-3), all the exceptions were that the subclass used the IgG2b (No1) antibody instead of the IgG2b (No2) antibody. Similarly, the gold chromatograph kit of Example 2 was prepared.
  • Example 3 In the preparation of the chromatographic carrier described in Example 1 (2-3), all except that the subclass used the IgG1 (No2) antibody instead of the IgG2b (No2) antibody was used in Example 1. In the same manner as above, the gold chromatograph kit of Example 3 was prepared.
  • Example 1 In the preparation of the anti-NP antibody-modified colloidal gold described in Example 1 (2-1), an antibody having a subclass of IgG1 (No1) was used instead of an antibody having an IgG2b (No1) subclass, and ( In the preparation of the chromatographic carrier described in 2-3), all the same as in Example 1 except that the antibody of the subclass was IgG1 (No2) instead of the antibody of IgG2b (No2) was used. A gold chromatograph kit of Comparative Example 1 was prepared.
  • Example 2 In the preparation of the anti-NP antibody-modified colloidal gold described in Example 1 (2-1), an antibody having a subclass of IgG1 (No2) was used instead of an antibody having an IgG2b (No1) subclass, and ( In the preparation of the chromatographic carrier described in 2-3), all the same as in Example 1 except that the antibody of the subclass was IgG1 (No1) instead of the antibody of IgG2b (No2) was used. A gold chromatograph kit of Comparative Example 2 was prepared.
  • the first convex deformation portion 12 is pressed to move the first pot 40 toward the break portion 34 of the first pot accommodating portion 32 of the intermediate member 30.
  • the aluminum foil of the sheet member 43 sealing the first pot 40 is crushed by the broken portion 34, and the silver ion solution which is the first amplification liquid 41 is introduced through the opening of the intermediate member 30 to the insoluble carrier. It was supplied to No. 2 and a silver amplification reaction was carried out.
  • the silver amplification reaction is completed in tens of seconds. After the silver amplification reaction was completed, it was visually judged to be positive or negative. For the determination, the capture amount increased or decreased in proportion to the NP amount, and the degree of coloration of the black color of the anti-NP antibody coating line was photographed with LAS4000 (manufactured by GE) to calculate the signal.
  • the detection sensitivity was high when at least one IgG2b antibody was used as the anti-NP monoclonal antibody of the immunochromatographic kit.
  • the minimum detection sensitivity described in the package insert of the SARS-CoV-2 antigen detection reagent "Spline SARS-CoV-2" manufactured by Fujirebio Corporation is described as 25 pg / mL, which is superior to the detection sensitivity. It was found that high sensitivity could be achieved.
  • Experiment B Fragment of antibody Dissolve disodium phosphate 2 in pure water and adjust the pH to 7.8 with 1 mol / L hydrochloric acid to prepare a digestive solution.
  • the antibody buffer was replaced with digestive juice using a desalting column (Zebatm Spin Desalting Colons, 7K MWCO).
  • Endoproteinase Glu-C (V8 Protease) (manufactured by Sigma-Aldrich or Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was measured at 2.0 mg, and 300 ⁇ L of digestive juice was added to prepare an enzyme solution.
  • an aqueous solution containing 1% by mass of polyethylene glycol (PEG (polyethylene glycol); weight average molecular weight (Mw.): 20000, product number: 168-11285, manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added. 550 ⁇ L was added and stirred for 10 minutes, and then 1.1 mL of an aqueous solution of 10 mass% bovine serum albumin (BSA (Bovine serum albumin); Fraction V, product number: A-7906, manufactured by SIGMA) was added and stirred for 10 minutes. This solution was centrifuged at 8000 ⁇ g at 4 ° C.
  • BSA Bovine serum albumin
  • Fraction V product number: A-7906, manufactured by SIGMA
  • the anti-NP antibody-modified colloidal gold prepared in (2-1) had a concentration of 20 mmol / in Tris-HCl buffer (pH 8.2). With water so that the concentration of L, PEG (Mw. 20000) is 0.05% by mass, the concentration of sucrose is 5% by mass, and the optical concentration of colloidal gold at 520 nm is 0.1 when the optical path length is 10 mm. It was diluted to give a colloidal gold coating solution.
  • IgG1 No2
  • bromocresol green (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) prepared at 30 mmol / L was applied in a line at a position 9 mm from the downstream side of the short side of 60 mm to serve as an amplification index region.
  • the nitrocellulose membrane was dried in a warm air dryer at 50 ° C. for 30 minutes.
  • 500 mL of blocking solution 50 mmol / L boric acid buffer (pH 8.5) containing 0.5% by mass casein (milk-derived, product number 030-01505, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)).
  • the nitrogen membrane dried as described above was immersed in the bat containing the above-mentioned material and allowed to stand for 30 minutes.
  • the nitrocellulose membrane was taken out, and a washing / stabilizing solution prepared in another vat (50 mmol / L Tris-HCl (pH 7.5) buffer containing 0.5 mass% sucrose and 0.05 mass% sodium cholic acid).
  • the nitrocellulose membrane was immersed in 500 mL and allowed to stand for 30 minutes. Then, the nitrocellulose membrane was taken out from the liquid and dried in an environment of 25 ° C. for 24 hours.
  • the portion on which the anti-NP antibody is immobilized contains a second substance that binds to the test substance, and the portion on which the anti-mouse IgG antibody is immobilized contains a confirmation region that contains a substance that can bind to the first substance.
  • the portion where the bromocresol green is fixed corresponds to the amplification index region containing the substance that reacts with the first amplification solution.
  • a liquid feeding pad (glass fiber pad cut into 25 mm ⁇ 300 mm (Glass Fiber Conjugate Pad, manufactured by Millipore)) was attached to the upstream side of the chromatograph carrier so that the liquid feeding pad and the chromatograph carrier overlapped by 7 mm. ..
  • the member thus produced was cut with a guillotine cutter (CM4000, manufactured by Nippon Flour Mills) so that the width was 5 mm parallel to the direction perpendicular to the long side of 300 mm, and 60 inspection strips (CM4000, manufactured by Nippon Techno Cluster Co., Ltd.) were cut. However, the absorption pad is not included.) was prepared.
  • nitric acid (10% by weight) 5.9 mL, dodecylamine (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 123-00246) 0.1 g, surfactant C 12 H 25 -C 6 H 4 -O -(CH 2 CH 2 O)
  • a solution prepared by dissolving 0.1 g of 50 H in 47.6 g of water in advance was mixed, and this was used as a silver ion solution as a first amplification solution to be sealed in a first pot.
  • Each pot 45 was manufactured by injection molding using polypropylene as a material.
  • the upper case was manufactured by injection molding using polypropylene containing 50% by mass of tough selenium (registered trademark), which is an olefin elastomer manufactured by Sumitomo Chemical Co., Ltd., as a material.
  • the upper case 10 includes two deformable portions (a first convex deformed portion and a second convex deformed portion), and the two deformed portions have no portion separated from the upper case 10. Made by injection molding as part of the upper case 10 at all boundaries.
  • the first convex deformed portion 12 shown in FIGS. 1 and 2 has two protrusions, and the second convex deformed portion 14 has one protrusion. It was configured.
  • FIGS. 1 and 2 Preparation of the Lateral Flow Test Graph Kit
  • the lower case 20, the inspection strip 1 prepared in (2-4) and the absorption pad 6 prepared in (2-6) are shown in FIGS. 1 and 2. Fixed as shown.
  • the first pot 40 and the second pot 45 are sealed in the first pot 40 prepared in (1-5-2) and (1-5-1), respectively.
  • the first amplification liquid 41 and the second amplification liquid 46 to be sealed in the second pot 45 are filled, and the second pot 45 is filled with the aluminum foil as the sheet member 48, and the second pot 45 is filled with the aluminum foil as the sheet member 43.
  • the pot 40 of 1 is sealed, and as shown in FIGS.
  • the second pot 45 is placed in the lower case 20 with the seat member 48 facing up, and the first pot 40 is placed in the seat member 43.
  • the intermediate member 30 was attached to the head down.
  • the contact portion between the upper case and the lower case is joined by ultrasonic welding.
  • the welded parts were uniformly welded in all parts in a sealed state. In this way, an immunochromatographic kit was produced.
  • Example 5 An immunochromatographic kit of Example 5 was prepared in the same manner as in Example 4 except that the antibody was changed to the antibody shown in Table 2 below in Example 4.
  • the second convex deformation portion 14 is pressed to break the aluminum foil which is the sheet member 48 sealing the second amplification liquid 46 sealed in the second pot 45.
  • the second amplified liquid 46 was supplied to the insoluble carrier 2 by utilizing the capillary phenomenon.
  • the first convex deformation portion 12 is pressed to move the first pot 40 toward the break portion 34 of the first pot accommodating portion 32 of the intermediate member 30.
  • the aluminum foil which is the sheet member 43 sealing the first pot 40, is crushed by the broken portion 34, and the silver ion solution, which is the first amplification liquid 41, is insoluble from the opening of the intermediate member 30. It was supplied to the carrier 2 and a silver amplification reaction was carried out. The silver amplification reaction is completed in tens of seconds. After the silver amplification reaction was completed, it was visually judged to be positive or negative. For the determination, the capture amount increased or decreased in proportion to the NP amount, and the degree of coloration of the black color of the anti-NP antibody coating line was photographed with LAS4000 (manufactured by GE) to calculate the signal.
  • E When the signal concentration is 0.045 or more, it can be detected at a sufficiently high concentration.
  • F When the signal concentration is 0.025 to 0.045, the concentration increase can be detected and the presence of the sample is confirmed.
  • G The signal concentration is 0.015 to 0.025, and the concentration is slightly discriminated.
  • H The signal concentration is 0.010 to 0.015, and the concentration can be barely discriminated.
  • I Signal concentration 0.010 or less. No concentration detected.
  • Example 4 which is an antibody in which the gold colloidal antibody is fragmented, is a sample in which SARS-CoV-2 is not contained in the evaluation solution ( It was found that the signal concentration of NP concentration 0 pg / mL) was low and false positives were unlikely to occur. In addition, even if it is fragmented, it may be possible to achieve significantly higher sensitivity than the detection sensitivity of the SARS-CoV-2 antigen detection reagent "Spline SARS-CoV-2" manufactured by Fujirebio Corporation. Do you get it.
  • Example 6 Using the anti-NP monoclonal antibody having subclasses IgG1 and IgG2b prepared in Example 1, an assay device was prepared and evaluated according to Example 1 described in Japanese Patent No. 5430995, and the same concentration measurement as in Example 1 was performed. As a result, the effect of the present invention was confirmed as in Example 1.

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Abstract

本発明は、簡易的により高感度でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出が可能となる、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出キットおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を提供することを課題とする。本発明によれば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）と特異的に反応する少なくとも１種の抗体を含む、生体試料に含まれるヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）を特異的に検出するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出キットであって、上記抗体が、サブクラスがＩｇＧ２ｂである抗体を少なくとも一種含み、銀を含む化合物を収容する第一の容器と、銀イオンを還元し得る還元剤を収容する第二の容器とを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出キットが提供される。

Description

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出キットおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法
　本発明は、検出情報の銀増幅を利用した、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出キットおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法に関する。
　２０２０年にパンデミックを起こしたＣＯＶＩＤ－１９の原因ウイルスであるＳＡＲＳ(Severe acute respiratory syndrome）－ＣｏＶ－２では、診断に用いられている主な手法として、例えば、非特許文献１に記載されているように、ゲノムＲＮＡを検出するＲＴ－ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）が広く市販されている。ＲＴ－ＰＣＲによる検出は、逆転写酵素を用いてわずかなＲＮＡをｃＤＮＡに変換した後に検出可能な濃度まで増幅することにより、少量のＲＮＡが検出可能であり、高感度で確定診断が可能となる検査方法である。
　一方で、非特許文献２に記載されているように、ゲノムＲＮＡの保護機能を持つとされているヌクレオカシドプロテイン(ＮＰ)を検出し、ＣＯＶＩＤ－１９を診断するための抗原検査キットが開発された。抗原検査は、主にＳＡＲＳ－コロナウイルスの遺伝子と共に含まれるタンパク質の存在を検出する検査方法であり、それらの検査方法の中で簡便に検査を行うことが可能なイムノクロマトグラフ法による検出方法が使用されている。
　特許文献１には、２０１９－ｎＣＯＶ（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ウイルスに対する非ヒト動物由来の抗血清および／または非ヒト動物由来の免疫グロブリンが記載されている。特許文献２には、新規コロナウイルスまたはその誘導体に対するモノクローナル抗体であって、抗原相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が規定されているモノクローナル抗体が記載されている。
　また、免疫反応を用いて測定する方法の中でもイムノクロマトグラフ法は、操作が簡便で短時間での測定が可能であることから、一般的に開業医や、診療所の医師により広く利用されている。このイムノクロマトグラフ法の感度を上げる方法として、特許文献３には、銀を含む化合物および銀イオンのための還元剤を用いて標識粒子のサイズを増加させることで高感度な検出を可能とする技術が開示されている。
中国特許公開ＣＮ１１１４７１１０３Ａ号公報 中国特許公開ＣＮ１１１５６００７０Ａ号公報 特許第５０９１０７５号公報
国立感染研究所　病原体検出マニュアル 2019-nCoV Ver.2.9.1 医学と薬学７７巻６号イムノクロマト法を用いた新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原検出試薬の開発ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２
　上記のように、ゲノムＲＮＡ情報を検出する方法であるＲＴ－ＰＣＲによる検査は、抗原検査に比べて感度が高く確定診断が可能であるが、測定に長時間を要し迅速に結果を得ることが難しい。一方、抗原検査のイムノクロマトグラフ法により検出する方法は、短時間で測定が可能な簡便な簡易検査方法であるが、ＲＴ－ＰＣＲ検査に比べて感度が低いことが指摘されていた。
　本発明は、簡易的により高感度でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出が可能となる、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出キットおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法を提供することを解決すべき課題とした。
　本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）を検出する抗体を使用し、銀を含む化合物および銀イオンを還元し得る還元剤を用いて、上記抗体で検出されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）の情報を増幅することによって、簡易的で高感度な測定を行うことができることを見出し、本発明を完成するに至った。
　即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
＜１＞　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）と特異的に反応する少なくとも１種の抗体を含む、生体試料に含まれるヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）を特異的に検出するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出キットであって、
　上記抗体が、サブクラスがＩｇＧ２ｂである抗体を少なくとも一種含み、
　銀を含む化合物を収容する第一の容器と、銀イオンを還元し得る還元剤を収容する第二の容器とを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出キット。
＜２＞　上記抗体が、断片化抗体である、＜１＞に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出キット。
＜３＞　上記断片化抗体が、プロテアーゼ処理により作製された抗体である、＜２＞に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出キット。
＜４＞　上記抗体が標識物質により標識されており、標識物質による情報を、銀を含む化合物と銀イオンを還元し得る還元剤により増幅して検出する、＜１＞から＜３＞のいずれか一に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出キット。
＜５＞　上記標識物質が金コロイドである、＜４＞に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出キット。
＜６＞　上記還元剤が、Ｆｅ２＋の金属塩である、＜１＞から＜５＞のいずれか一に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出キット。
＜７＞　不溶性担体をさらに含む、＜１＞から＜６＞のいずれか一に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出キット。
＜８＞　上記不溶性担体が、被検物質を捕捉する捕捉領域と、還元剤を検出する発色領域を有する、＜７＞に記載の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出キット。
＜９＞　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）と特異的に反応する少なくとも１種の抗体を用いた、生体試料に含まれるヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）を特異的に検出するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法であって、
　上記抗体として、サブクラスがＩｇＧ２ｂである抗体を少なくとも一種使用し、
　上記検出する方法が、ヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）の検出情報を、銀を含む化合物と、銀イオンを還元し得る還元剤により増幅することを含む、
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法。
＜１０＞　上記抗体が、断片化抗体である、＜９＞に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法。
＜１１＞　上記断片化抗体が、プロテアーゼ処理により作製された抗体である、＜１０＞に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法。
＜１２＞　上記抗体が標識物質により標識されており、標識物質による情報を、銀を含む化合物と銀イオンを還元し得る還元剤により増幅して検出する、＜９＞から＜１１＞のいずれか一に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法。
＜１３＞　上記標識物質が金コロイドである、＜１２＞に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法。
＜１４＞　上記還元剤がＦｅ２＋の金属塩である、＜９＞から＜１３＞のいずれか一に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法。
＜１５＞　上記検出方法が、イムノクロマト法である、＜９＞から＜１４＞のいずれか一に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法。
　本発明のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出キットおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法によれば簡易的に高感度でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出することができる。
図１は、本発明のイムノクロマトグラフキットの一実施形態の態様を示す斜視図である。 図２は、本発明のイムノクロマトグラフキットの一実施形態の態様を示す分解概略斜視図である。 図３は、検査用ストリップ、第１および第２のポットの位置関係を示す模式側面図である。
　以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
　本発明において「～」を用いて示された数値範囲は、「～」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を意味する。
（１）コロナウイルス
　本発明で検出対象となる新型コロナウイルスは、ニドウイルス目に属し、エンベロープと長さ約３０ｋｂｐの大きなゲノムを持つ一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルスである。その名称はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２であり、この新型コロナウイルスによる感染症の正式名称を「ＣＯＶＩＤ－１９」とＷＨＯ（世界保健機関）により命名されている。このＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を構成するタンパク質としては、スパイク（Ｓ）タンパク質、エンベロープ（Ｅ）タンパク質、膜（Ｍ）タンパク質、ヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質の少なくとも４つの構造タンパク質が含まれることが知られている。このうちのヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質は、ウイルスのエンベロープ内のウイルスＲＮＡゲノムを、カプシドと呼ばれるリポ核タンパク質複合体にパッケージ化する機能を持ち、免疫原性のリン酸タンパク質であり、配列の保存性と、強い免疫原性を持つ。
（２）抗原
　上記の４つの構造タンパクは、抗原に用いることが可能であるが、本発明においては、免疫原性のリン酸タンパク質として、配列の保存性と、強い免疫原性を持つことから、ヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質を検出対象とする抗原として使用する。
（３）抗体
　本発明で用いる抗体は、ヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質に対する抗体である。このタンパク質に限らず、一般に抗体のサブクラスは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＧと５つのクラスに分類することができ、この中で、ＩｇＧは、血清中で最も豊富に認められる抗体クラスでさらに５種類のサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）に分類されている。これらのサブクラスの中で、抗原となるヌクレオカプシドタンパク質（以下、ＮＰとも称す）を高感度に検出できる抗体として、本発明においてはサブクラスがＩｇＧ２ｂである抗ＮＰ抗体を少なくとも一種使用する。
（４）抗体の製造
　抗体としては、抗原（被検物質）によって免疫された動物の血清から調製する抗血清、または抗血清から精製された免疫グロブリン画分を使用してもよい。即ち、実験動物に抗原を免疫することで、血清中に産生されるポリクローナル抗体を利用することができる。
　または、腹腔内に抗原で免疫された動物の脾臓から採取したＢ細胞またはＢ細胞を含む細胞群をミエローマ細胞と融合させることで得られた融合細胞（ハイブリドーマ）が産生するモノクローナル抗体を利用してもよい。または、プラスミドを宿主細胞に導入することで細胞が産生するモノクローナル抗体を利用してもよい。本発明では、モノクローナル抗体を産生する方法を用いることが好ましい。
（５）抗体の断片化
　上記で述べたように取得した抗体を断片化することにより得られる断片化抗体［例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦｖ］を利用することも好ましい。
　断片化抗体としては、プロテアーゼ処理により作製された抗体を使用することができる。　断片化抗体の作製方法として代表的なものは、次の２つである。まず、抗体をパパイン酵素で処理した場合、２つのＦａｂフラグメントと１つのＦｃフラグメントに分解される。また、抗体をペプシン酵素で処理した場合、Ｆａｂフラグメントが２つ結合したＦ（ａｂ’）２と断片化されたＦｃフラグメントに分解される。更に、Ｆ（ａｂ’）２は２－メルカプトエチルアミンなどの還元剤で処理することにより、Ｆａｂ’にすることもできる。これら以外にも、断片化抗体を作製する酵素としては、フィシン、リシルエンドペプチダーゼ、Ｖ８プロテアーゼ、ブロメライン、クロストリパイン、メタロエンドペプチダーゼ、パパインを活性化処理した活性化パパインなどがある。これらの酵素処理で得られるＦａｂフラグメントとＦ（ａｂ’）２フラグメントおよびＦａｂ’フラグメントには抗原結合部位があるが、不要なＦｃフラグメントが除去されている。従って、抗原検出でこれらのフラグメントを使用することで、非特異吸着が減少しノイズも減少する。本発明で用いる断片化抗体は、上記の方法によって作製されたものに限定されず、Ｆｃフラグメントが除去された抗体であれば、いずれも用いることが可能である。
（６）イムノクロマトグラフ法　
　本発明の一例においては、検出情報（検出シグナル）をイムノクロマトグラフ法において増幅させることができる。一般には、イムノクロマトグラフ法とは以下のような手法で被検物質を簡便かつ迅速に、また特異的に、判定や測定を行う手法で、検出情報として、標識物質の情報を用いる方法である。より具体的には以下に記載する方法である。すなわち、被検物質と結合可能な結合物質（被検物質と結合し得る第二の結合物質、または下記の第一の結合物質への結合性を有する物質に相当する。具体的には抗体、抗原等）を有する検査領域を少なくとも１つ含む標識物質捕捉領域を備えたクロマトグラフ担体（不溶性担体の一部）を固定相として用いる。このクロマトグラフ担体上で、被検物質と結合し得る第一の結合物質によって修飾された標識物質を含む液を移動層として、クロマトグラフ的に移動させる。これにより、被検物質と標識物質とが特異的に結合しながら、検査領域を有する標識物質捕捉領域まで到達する。標識物質捕捉領域の検査領域において、被検物質と標識物質の複合体が、固定化された結合物質（第二の結合物質または第一の結合物質への結合性を有する物質）に特異的に結合することにより、被検試料中に被検物質が存在する場合にのみ、結合物質（第二の結合物質または第一の結合物質への結合性を有する物質）に標識物質が濃縮される。目視または適当な機器を用いて標識量を測定することにより、被検試料中に被検物質が存在することを定性および定量的に分析する。
　本発明におけるイムノクロマトグラフ方法においては、標識物質捕捉領域の検査領域において、被検物質と標識物質の複合体が、固定化された結合物質（第二の結合物質または第一の結合物質への結合性を有する物質）に特異的に結合した後に、洗浄液を用いて反応部位を洗浄し、その後、増幅液を使用してシグナルを増幅する。標識物質のシグナルを増幅するために使用する増幅試薬（好ましくは２種の増幅試薬、例えば、好ましくは銀イオンを還元し得る還元剤および銀を含む化合物）を使用し、標識物質捕捉領域上の固定化試薬に結合した被検物質と標識物質との複合体を核として、増幅反応によってシグナルを増幅し、結果として高感度化を達成することができる。本発明によれば、迅速な高感度クロマトグラフで測定を実施することができる。
（７）被検試料
　本発明の検出キットおよび検出方法における被検試料としては、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルスを含む、生体試料（例えば、鼻水、鼻汁、または唾液など）を使用することができる。被検物質としては、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出が可能となるものが好ましく、核タンパクであるヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）を被検物質として検出することが可能である。コロナウイルスには、スパイク（Ｓ）タンパク質、エンベロープ（Ｅ）タンパク質、膜（Ｍ）タンパク質、ヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質の少なくとも４つの構造タンパク質が含まれることが知られており、このうちのヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質は、免疫原性のリン酸タンパク質で、ウイルスゲノム複製や細胞シグナル伝達調節に関わっている。ヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質は、配列の保存性と、強い免疫原性から、診断の被検物質として選ばれている。
（８）被検試料の前処理
　本発明においては、被検試料をそのままで、あるいは、被検試料を適当な抽出用溶媒を用いて抽出して得られる抽出液の形で、更には、抽出液を適当な希釈剤で希釈して得られる希釈液の形で、若しくは抽出液を適当な方法で濃縮した形で、用いることができる。本発明で用いられる抽出用溶媒としては、通常の免疫学的分析法で用いられる溶媒（例えば、水、生理食塩液、または緩衝液等）、あるいは、かかる溶媒で希釈することにより直接抗原抗体反応を実施することができる水混和性有機溶媒を用いることもできる。
（９）構成
　本発明をイムノクロマトグラフ方法において実施する場合におけるイムノクロマトグラフ用キットにおいては、クロマトグラフ用ストリップを組み込んで使用することができる。使用することのできるクロマトグラフ用ストリップとしては、通常のイムノクロマトグラフ法に用いることができるクロマトグラフ用ストリップである限り、特に限定されるものではない。
　本発明において使用することができるクロマトグラフ用ストリップとしては、被検物質を含む被検試料の展開方向の上流方向から下流方向に向かって、標識物質保持領域、標識物質捕捉領域を有している。例えば、試料添加パッド、標識物質保持領域を有する標識物質保持パッド（例えば金コロイド抗体保持パッド）、不溶性担体である結合物質固定化メンブレン（例えば、標識物質捕捉領域を有するクロマトグラフ担体）、および吸収パッドをこの順に、粘着シート上に配置する態様が好ましく用いられる。結合物質を固定化したクロマトグラフ担体（不溶性担体）としては、被検物質と特異的に結合する抗体または抗原を固定化した反応部位である検査領域（テストラインともいう）を少なくとも１つ有する領域である標識物質捕捉領域を有し、所望により、コントロール用抗体または抗原を固定化した確認領域（コントロール領域ともいう）を少なくとも１つ有する領域を更に有していてもよい。更に、標識物質捕捉領域の下流に、増幅指標領域を有していても良い。
　本発明で用いることができる標識物質保持領域を有する標識物質保持パッドは、標識物質を含む懸濁液を調製し、その懸濁液を適当な吸収パッド（例えば、グラスファイバーパッド）に塗布した後、それを乾燥することにより調製することができる。
（９－１）標識物質
　本発明で用いる標識物質（被検物質（抗原）と特異的に結合する第一の結合物質を標識するのに用いる標識）として、金属を含む標識物質を用いるのが好ましい。本発明で用いることができる金属の種類としては、好ましくは、金、銀、白金の貴金属や、鉄、鉛、銅、カドミウム、ビスマス、アンチモン、錫、または水銀を用いることができ、更に好ましくは金、銀、白金の貴金属であることが好ましい。本発明において使用できる金属を含む標識物質の好ましい形態としては、金属コロイド標識または金属硫化物標識を用いることができる。金属コロイド標識としては、好ましくは、白金コロイド、金コロイド、銀コロイド、鉄コロイド、または水酸化アルミニウムコロイドなどを用いることができ、金属硫化物標識としては、好ましくは、鉄、銀、鉛、銅、カドミウム、ビスマス、アンチモン、錫、または水銀の各硫化物を用いることができる。本発明においては更に好ましくは、白金コロイド、金コロイド、銀コロイド、最も好ましくは金コロイドを用いることができる。金属コロイド標識として金コロイド粒子を用いる場合には、市販のものを用いてもよい。あるいは、常法、例えば塩化金酸をクエン酸ナトリウムで還元する方法（Nature Physical Science，241(1973)20等）により金コロイド粒子を調製することができる。
　金属コロイドの平均粒径としては、約１ｎｍ～５００ｎｍが好ましく、３～１００ｎｍがさらに好ましく、５～６０ｎｍが特に好ましい。本発明に用いられる金属コロイドの平均粒径は、市販の粒度分布計等で計測することができる。粒度分布の測定法としては、光学顕微鏡法、共焦点レーザー顕微鏡法、電子顕微鏡法、原子間力顕微鏡法、静的光散乱法、レーザー回折法、動的光散乱法、遠心沈降法、電気パルス計測法、クロマトグラフィー法、超音波減衰法等が知られており、それぞれの原理に対応した装置が市販されている。
　粒径範囲および測定の容易さから、本発明においては動的光散乱法を好ましく用いることができる。動的光散乱を用いた市販の測定装置としては、ナノトラックＵＰＡ（日機装（株））、動的光散乱式粒径分布測定装置ＬＢ－５５０（（株）堀場製作所）、濃厚系粒径アナライザーＦＰＡＲ－１０００（大塚電子（株））等が挙げられ、本発明においては、２５℃の測定温度で測定したメジアン径（ｄ＝５０）の値として求める。
　検出用の標識物質として金属コロイド標識または金属硫化物標識、その他金属合金標識（以下、金属系標識と称することがある）、また金属を含むポリマ－粒子標識を用いるクロマトグラフでは、金属系標識の信号を増幅させることを特徴とする。具体的には、被検物質と標識物質の複合体の形成後に、無機銀塩や有機銀塩などの銀を含む化合物から供給される銀イオンと銀イオンを還元し得る還元剤とを接触させ、還元剤によって銀イオンを還元して銀粒子を生成させると、その銀粒子が金属系標識を核として金属系標識上に沈着するので、金属系標識が増幅され、被検物質の分析を高感度に実施することができる。従って、本発明のイムノクロマトグラフ方法においては、還元剤による銀イオンの還元作用により生じた銀粒子を用いて、免疫複合体の標識に沈着させる反応を実施し、こうして増幅された信号を分析することを除けば、それ以外の点では従来公知のクロマトグラフ法をそのまま適用することができる。
（９－２）結合物質
　標識物質は、被検物質と結合し得る第一の結合物質で修飾されている。第一の結合物質としては、例えば被検物質（抗原）に対する抗体、被検物質（抗体）に対する抗原、被検物質（たんぱく質、低分子化合物等）に対するアプタマーなど、被検物質に対して親和性を持つ化合物であれば用いることが可能であるが、本発明ではＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）と特異的に反応する抗体を用いることが好ましい。本発明においては、下記で述べる第二の結合物質と第一の結合物質のうちの少なくとも一方として、抗体のサブクラスがＩｇＧ２ｂである抗体を用いる。
　本発明の検出キットは、好ましくは、不溶性担体（クロマトグラフ担体）を有し、このストリップに標識物質捕捉領域を有している。この標識物質捕捉領域には、被検物質と結合し得る第二の結合物質を有する検査領域を有しており、第一の結合物質への結合性を有する結合物質を有する確認領域を更に有している態様が好ましい。
　被検物質と結合し得る第二の結合物質としては、例えば被検物質（抗原）に対する抗体、被検物質（抗体）に対する抗原、被検物質（たんぱく質、低分子化合物等）に対するアプタマーなど、被検物質に対して親和性を持つ化合物であれば用いることが可能であるが、本発明ではＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）と特異的に反応する抗体を用いることが好ましい。
　本発明においては、上記した第一の結合物質と第二の結合物質の少なくとも一方として、抗体のサブクラスがＩｇＧ２ｂである抗体を用いる。また、第二の結合物質と第一の結合物質とは異なるものでもよいし、同一のものでもよい。第一の結合物質への結合性を有する物質とは、被検物質そのものでもよいし、第一の結合物質が認識する部位を持つ化合物でもよく、たとえば被検物質の誘導体とタンパク質（例えば、ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ　Ａｌｂｕｍｉｎ）など）とを結合させたような化合物などが挙げられる。
　好ましくは、第一の結合物質が抗体であり、および／または第二の結合物質が抗体である。より好ましくは、第一の結合物質がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）と特異的に反応する抗体であり、第二の結合物質がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）と特異的に反応する抗体である。
　また、本発明の不溶性担体の標識物質捕捉領域には、増幅指標領域を有する態様も好ましい。増幅指標領域は、後述する増幅試薬と反応して発色もしくは色が変化して増幅試薬の展開が増幅指標領域に達したことを判定する領域である。増幅指標領域は、好ましくは、還元剤を検出する発色領域である。例えば、第２の増幅液として、硝酸鉄水溶液とクエン酸（富士フイルム和光純薬株式会社製、０３８－０６９２５）の混合水溶液を使用する場合には、ブロモクレゾールグリーン(富士フイルム和光純薬株式会社製)がライン状に固定化された発色試薬固定化ラインにより増幅指標領域を構成する態様が好ましい。このとき第２の増幅液が増幅指標領域に到達すると、領域は緑色からオレンジ色へと変化する。この変色は、増幅指標領域およびそれまでに展開した領域が第２の増幅液により十分に満たされたことの指標として捕えることができる。
　本発明において、第一の結合物質を用いて標識物質を修飾する方法のうち、例えば、金属コロイドと特異結合物質とを結合させる方法としては、以下に記載されている従来公知の方法（例えばＴｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０,７,（１９８２）６９１－６９６）が挙げられる。具体例としては、金属コロイドと特異結合物質（例えば抗体）を適当な緩衝液中で室温下にて５分以上混合する。反応後、遠心分離により得た沈殿を、ポリエチレングリコ－ル等の分散剤を含む溶液中に分散させることにより、目的とする物質を得ることができる。
（９－３）不溶性担体
　本発明で用いることができる不溶性担体としては、多孔性担体が好ましい。特に、ニトロセルロース膜、セルロース膜、アセチルセルロース膜、ポリスルホン膜、ポリエーテルスルホン膜、ナイロン膜、ガラス繊維、不織布、布、または糸等が好ましく、ニトロセルロース膜がより好ましい。
　本発明においては、不溶性担体の標識物質捕捉領域に、被検物質と結合し得る第二の結合物質を有し、第一の結合物質への結合性を有する物質を固定化させた確認領域を有することが好ましい。被検物質と結合し得る第二の結合物質、または第一の結合物質への結合性を有する物質は、不溶性担体の一部に物理的または化学的結合により、直接固定化させて標識物質捕捉領域を形成させてもよいし、あるいはラテックス粒子などの微粒子に物理的または化学的に結合させ、この微粒子を不溶性担体の一部にトラップさせて固定化させ、標識物質捕捉領域を形成してもよい。なお、不溶性担体は、第二の結合物質、または第一の結合物質への結合性を有する物質を固定化した後、不活性タンパク質による処理等により非特異的吸着防止処理を施して使用することが好ましい。本発明の不溶性担体は、検査領域を複数種有している態様も好ましく用いることができ、更には標識物質捕捉領域の一部として、所望により、上述の確認領域を有していてもよい。
（９－４）標識物質保持パッド
　不溶性担体は、標識物質保持領域を有する標識物質保持パッドを組み込んで使用することが好ましい。標識物質保持パッドとしては、金コロイドを保持するパッドが挙げられる。標識物質保持パッドの素材としては、例えば、セルロース濾紙、グラスファイバー、および不織布等を好ましく使用することができる。標識物質保持パッドは、上記素材に、前述のように調製した標識物質を一定量含浸させ、次いで乾燥させて作製できる。
（９－５）試料添加パッド
　不溶性担体は更に、試料添加パッドを組み込み使用することが好ましい。試料添加パッドは、添加された被検物質を含む試料（被検試料）を受入れるだけでなく、試料中の不溶物粒子等を濾過する機能をも兼ねる態様が好ましい。試料添加パッドの材質としては、セルロース濾紙、ガラス繊維、ポリウレタン、ポリアセテート、酢酸セルロース、ナイロン、および綿布等の均一な特性を有するものが挙げられる。また、分析の際、試料中の被検物質が試料添加パッドの材質に非特異的に吸着し、分析の精度を低下させることを防止するため、試料添加部を構成する材質は、予め非特異的吸着防止処理して用いることもできる。本発明においては、試料添加パッドは、（９－４）で述べた標識物質保持領域を有する標識物質保持パッドを兼ねていてもよい。
（９－６）吸収パッド
　本発明においては、吸収パッドを不溶性担体に好ましく組み込んで用いることができる。吸収パッドは、クロマト移動した、添加された被検試料を物理的に吸収すると共に、クロマトグラフ担体の反応部位に捕捉されない標識物質等を吸収除去する部位であり、セルロース濾紙、不織布、布、セルロースアセテート等吸水性材料が用いられる。添加された被検試料がクロマト移動して吸収パッドに届いてからのクロマト移動の速度は、吸収パッドの材質、大きさなどにより異なるので、その選定により被検物質の測定に合った速度を設定することができる。
（１０）洗浄液（第２の増幅液）
　本発明では、洗浄液は、特異的な結合反応以外で不溶性担体中に残存している（つまり非特異的に残存している）標識物質を洗浄する機能を有する液であり、洗浄効果を上げるためにそのｐＨを調整したり、界面活性剤成分やＢＳＡなどのタンパク質などの高分子化合物を加えた洗浄液を用いてもよい。本発明においては、洗浄液として、以下に説明する銀イオンを還元し得る還元剤を含有する液を用いることが好ましい。その場合、使用される２種類の増幅液（後述する）のうちの一方の増幅液は、洗浄液としての役割をも担うことになる。
　洗浄液は、展開途中に非特異的に残存した標識物質を洗浄しながら展開するので標識化物質を含みながら展開されることになるが、展開される前の洗浄液は洗浄効果を高めるために、標識物質を含んでいない液を用いることが好ましい。
　洗浄液は、被検試料（検体液）を展開した後に、不溶性担体に添加されるものであり、不溶性担体中に残存する、特異的な結合反応で結合した標識物質以外の標識物質を洗浄する。洗浄液の送液方法としては、検体液を展開した後にそのまま試料滴下部に添加する方法や、予め不溶性担体に洗浄液送液の為の送液用不溶性担体（洗浄液添加パッド）、吸収用不溶性担体（吸水パッド）を付着させておき、その送液用不溶性担体に添加し吸収用不溶性担体方向へ送液する方法、予め不溶性担体に洗浄液の添加部位を備えておき、検体液の展開後にその洗浄液の添加部位に洗浄液を添加する方法、または、検体液を不溶性担体に展開した後に洗浄液送液の為の送液用不溶性担体、吸収用不溶性担体を不溶性担体に付着させても良い。
　本発明においては、被検試料（検体液）の展開方向と洗浄液の展開方向との成す角は特に限定されず、０度から１８０度で行うことができるが、好ましくは、０度から９０度で行うことが好ましい。送液用不溶性担体は、洗浄液を添加できれば特に制限はなく、グラスファイバーパッドやセルロースメンブレン、ニトロセルロースメンブレンなどを用いることができる。吸収用不溶性担体は、吸水することが可能な物質であれば特に制限はなく、セルロース、ニトロセルロース、グラスファイバー、それらの混合体などを用いることができる。
（１１）免疫検査の方法
　以下、イムノクロマトグラフ方法について、その具体的な実施態様であるサンドイッチ法について説明する。
　サンドイッチ法では、特に限定されるものではないが、例えば、以下の手順により被検物質の分析を実施することができる。まず、被検物質（抗原）に対して特異性を有する第一の結合物質（例えば、第１抗体）および第二の結合物質（例えば、第２抗体）を、先に述べた方法により予め調製しておく。また、第一の結合物質で、予め標識物質を修飾しておく。第二の結合物質を、適当な不溶性担体（例えば、ニトロセルロ－ス膜、ガラス繊維膜、ナイロン膜、またはセルロ－ス膜等）上に固定して標識物質捕捉領域の検出領域とし、被検物質（抗原）を含む可能性のある被検試料（またはその抽出液）と接触させると、その被検試料中に被検物質が存在する場合には、第二の結合物質との結合（例えば、第二抗体との抗原抗体反応）が起こる。被検物質と第二の結合物質との結合と同時または結合後に、更に第一の結合物質で修飾した標識物質を過剰量接触させると、被検試料中に被検物質が存在する場合には、固定化された第二の結合物質と被検物質（抗原）と第一の結合物質で修飾した標識物質とからなる複合体が形成される。
　サンドイッチ法では、固定化された第二の結合物質と被検物質（抗原）、および被検物質と標識物質を修飾した第一の結合物質との反応が終了した後、免疫複合体を形成しなかった標識物質を除去し、続いて、例えば、不溶性担体の標識物質捕捉領域をそのまま観察しその標識物質を検出、または定量し、被検試料中の被検物質の有無判定または量を測定することができる。本発明においては、例えば、還元剤および銀イオン含有化合物を供給することにより、かかる複合体を形成した標識物質からの信号を増幅し検出する。
（１２）増幅液
　本発明で使用する増幅液は、増幅試薬を含有する液である。増幅試薬は、標識物質や被検物質の作用により、触媒的に反応することで、着色した化合物や発光などを生じ、シグナルの増幅を起こすことができる試薬であり、試薬を含有する溶液の状態、即ち増幅液として使用することができる。例えば、金属標識上で、物理現像により金属銀の析出を起こす銀イオン溶液や、ペルオキシダーゼ標識と過酸化水素の作用により色素となる、フェニレンジアミン化合物とナフトール化合物の溶液などが挙げられる。
　詳細には、写真化学の分野での一般書物（例えば、「改訂写真工学の基礎-銀塩写真編-」（日本写真学会編、コロナ社）、「写真の化学」（笹井明、写真工業出版社）、「最新処方ハンドブック」（菊池真一他、アミコ出版社））に記載されているような、いわゆる現像液を、増幅試薬を含有する増幅液として用いることができる。すなわち、液中に銀イオンを含み、液中の銀イオンが現像の核となるような金属コロイド等を中心に還元される、いわゆる物理現像液であれば、特に限定されることなく増幅液として用いることができる。
　本発明では、２種の増幅試薬を用いることができる。標識物質捕捉領域に捕捉された標識物質のシグナルを増幅するために使用する２種の増幅試薬のうち、第１の増幅試薬を第１の増幅液に、第２の増幅試薬を第２の増幅液に含有させておき、第２の増幅液および第１の増幅液を順次、添加することにより増幅を行うことが好ましい。
　増幅液の具体例としては、銀イオンを還元し得る還元剤を含む第２の増幅液、および、銀を含む化合物を含む第１の増幅液の組み合わせを用いることができる。
　以下、第２の増幅液に含まれる銀イオンを還元し得る還元剤と第１の増幅液に含まれる銀を含む化合物等について説明する。
（１２－１）銀を含む化合物
　銀を含む化合物としては、銀イオン含有化合物、例えば、有機銀塩、無機銀塩、もしくは銀錯体を用いることができる。好ましくは、水などの溶媒に対して溶解度の高い銀イオン含有化合物であり、硝酸銀、酢酸銀、乳酸銀、酪酸銀、チオ硫酸銀などが挙げられる。特に好ましくは硝酸銀である。銀錯体としては、水酸基やスルホン基など水溶性基を有する配位子に配位された銀錯体が好ましく、ヒドロキシチオエーテル銀等が挙げられる。
　無機銀塩、もしくは銀錯体は、銀として一般に０．００１モル／ｍ２～０．２モル／ｍ２、好ましくは０．０１モル／ｍ２～０．０５モル／ｍ２含有されることが好ましい。
（１２－２）銀イオンを還元し得る還元剤
　銀イオンを還元し得る還元剤は、銀イオンを銀に還元することができれば、無機・有機のいかなる材料、またはその混合物でも用いることができる。
　無機還元剤としては、Ｆｅ２＋、Ｖ２＋、Ｔｉ３＋、などの金属イオンで原子価の変化し得る還元性金属塩、還元性金属錯塩を好ましく挙げることができる。無機還元剤を用いる際には、酸化されたイオンを錯形成するか還元して、除去するか無害化する必要がある。例えば、Ｆｅ２＋を還元剤として用いる系では、クエン酸やＥＤＴＡを用いて酸化物であるＦｅ３＋の錯体を形成し、無害化することができる。本系ではこのような無機還元剤を用いることが好ましく、より好ましくはＦｅ２＋の金属塩が好ましい。
　なお、湿式のハロゲン化銀写真感光材料に用いられる現像主薬（例えばメチル没食子酸塩、ヒドロキノン、置換ヒドロキノン、３－ピラゾリドン類、ｐ－アミノフェノール類、ｐ－フェニレンジアミン類、ヒンダードフェノール類、アミドキシム類、アジン類、カテコール類、ピロガロール類、アスコルビン酸（またはその誘導体）、およびロイコ色素類）、および本分野の当業者にとって明らかなその他の材料、例えば米国特許第６，０２０，１１７号に記載されている材料も用いることができる。
　還元剤としては、アスコルビン酸還元剤も好ましい。有用なアスコルビン酸還元剤は、アスコルビン酸と類似物、異性体とその誘導体を含み、例えば、Ｄ－またはＬ－アスコルビン酸とその糖誘導体（例えばγ－ラクトアスコルビン酸、グルコアスコルビン酸、フコアスコルビン酸、グルコヘプトアスコルビン酸、マルトアスコルビン酸）、アスコルビン酸のナトリウム塩、アスコルビン酸のカリウム塩、イソアスコルビン酸（またはＬ－エリスロアスコルビン酸）、その塩（例えばアルカリ金属塩、アンモニウム塩または当技術分野において知られている塩）、エンジオールタイプのアスコルビン酸、エナミノールタイプのアスコルビン酸、チオエノ－ルタイプのアスコルビン酸等を好ましいものとして挙げることができ、特にはＤ、ＬまたはＤ，Ｌ－アスコルビン酸（そして、そのアルカリ金属塩）若しくはイソアスコルビン酸（またはそのアルカリ金属塩）が好ましく、ナトリウム塩が好ましい塩である。必要に応じてこれらの還元剤の混合物を用いることができる。
（１３）その他の助剤
　増幅液のその他の助剤としては、緩衝剤、防腐剤（例えば酸化防止剤または有機安定剤）、速度調節剤を含む場合がある。緩衝剤としては、例えば、酢酸、クエン酸、水酸化ナトリウムまたはこれらの何れかの塩、またはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを用いた緩衝剤、その他一般的化学実験に用いられる緩衝剤を用いることができる。これら緩衝剤を適宜用いて、その増幅液に最適なｐＨに調整することができる。また、カブリ防止剤としてアルキルアミンを添加剤として用いることができ、特に好ましくはドデシルアミンである。またこれら添加剤の溶解性向上のため、界面活性剤を用いることができ、特に好ましくはＣ9Ｈ19-Ｃ6Ｈ4-Ｏ-（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）50Ｈである。
　増幅試薬をイムノクロマトグラフ用キットに点着する方法としては、還元剤溶液を送液するためのパッドに、第２の増幅液としての還元剤溶液を点着して標識物質捕捉領域に還元剤溶液を送液し、標識物質捕捉領域を含む領域に、第１の増幅液としての銀イオン溶液を不溶性担体の上部から点着して、銀イオン溶液を不溶性担体の厚み方向に浸潤させる方法が好ましい。
　２種の増幅試薬をイムノクロマトグラフ用キットに内蔵する方法としては、各増幅試薬を含むポット（容器）として、還元剤溶液を含む第２の増幅液貯蔵ポット（第二の容器）、第１の増幅液貯蔵ポット（第一の容器）を、各増幅試薬を点着する部位の上部に配置する方法が挙げられる。還元剤溶液を含む第２の増幅液貯蔵ポット（第二の容器）を、還元剤溶液を送液するためのパッドの上部に置き、銀イオン溶液（第１の増幅液）を含む第１の増幅液貯蔵ポット（第一の容器）を銀イオン溶液充填孔のすぐ上部に設置する態様が挙げられる。より詳細な添加方法に関しては、特許第５２７６５６８号公報の図１に記載のデバイスのように配置することにより、それぞれのポットを押すことで液が流れ、所定の部位に点着することができる。
　増幅試薬をイムノクロマトグラフ用キットに点着するもう一つの方法としては、還元剤溶液を含む第２の増幅液貯蔵ポットを、試料添加パッドに対し、標識物質捕捉領域と反対側となる不溶性担体の端に相当する部分に設置し、不溶性担体に還元剤溶液を供給することで被検試料の展開方向と同じ方向に被検試料に遅れて展開させる。標識物質捕捉領域を還元剤液で満たした後に、標識物質捕捉領域に、第１の増幅液である銀イオン溶液を不溶性担体の上部から点着して不溶性担体の厚み方向に浸潤させる態様が挙げられる。より詳細な添加方法に関しては、特許第６５７０６５２号公報の図１～図８に記載のデバイスのように配置することによりそれぞれの凸状変形部を押すことで液が流れ、所定の位置に点着することができる。
（１４）イムノクロマトグラフ用キット
　本発明の検出方法は、被検物質と結合し得る第一の結合物質で修飾した標識物質と、被検物質と結合し得る第二の結合物質、または被検物質と結合し得る第一の結合物質への結合性を有する物質を含んだ不溶性担体とを具えたイムノクロマトグラフ用キットを用いて実施することができる。その場合、イムノクロマトグラフ用キットは、被検物質と結合し得る第一の結合物質で修飾した標識物質を予め不溶性担体上に具えているものでもよい。あるいは、被検物質と結合し得る第一の結合物質で修飾した標識物質を不溶性担体とは別に具えているものでもよい。この場合、不溶性担体とは別に具えられた標識物質を被検試料と混合した後に不溶性担体上を展開するなどの方法で測定を行うことができる。本発明のイムノクロマトグラフ用キットは、洗浄液、および増幅液を備えるものであり、好ましくは、銀を含む化合物を含む第１の増幅液と、銀イオンを還元し得る還元剤を含む洗浄液としての機能を兼ねた第２の増幅液を具えることができる。イムノクロマトグラフ用キットを構成する各素材の例、好ましい範囲は、イムノクロマトグラフ方法等で記載した例、範囲を好ましく用いることができる。
　以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
　実施例のイムノクロマトグラフキットは、ＮＰ抗原を検出するためのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原検出用イムノクロマトグラフキットである。
実験Ａ
＜１＞抗ＮＰモノクローナル抗体の調製
（１）マウスの免疫およびハイブリドーマ細胞の作製
　精製済みの３００μｇの抗原タンパク質（配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質）をフロイントアジュバントと混合して乳化させ、ＢＡＬＢ／ｃマウスに複数回（１回あたり３００μｇの抗原タンパク質を投与）皮下注射して免疫した。免疫したマウスから１か月後にＢ細胞を回収し、ポリエチレングリコール溶液を用いてミエローマ細胞と融合させた。融合したハイブリドーマ細胞を選択培地と共に９６穴マイクロプレートに播種した。
（２）ハイブリドーマ細胞のスクリーニングとクローニング
　次に、各ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＮＰに対する反応性をＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）法とウエスタンブロット法により調べた。ＥＬＩＳＡ法では、まず、Ｈｉｓ－ｔａｇが付加された組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＮＰタンパク質５μｇをＥＬＩＳＡプレート上に固定化した。プレートをブロッキングした後、プレートにハイブリドーマの培養上清１００μＬを添加して反応させた後、ペルオキシダーゼ標識したヤギ抗マウス免疫イムノグロブリン抗体を添加して反応させた。その後、ペルオキシダーゼ基質溶液を加えて発色させ、その吸光度を測定した。ウエスタンブロット法では、まずＨｉｓ－ｔａｇが付加された組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＮＰタンパク質１μｇを２×ＳＤＳサンプル緩衝液（１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、０．０１％ブロモフェノールブルー、１０％２－メルカプトエタノール）と混合して熱処理し、ポリアクリルアミドゲルに供して電気泳動した。電気泳動後のゲルをＰＶＤＦメンブレンに転写した。メンブレンを２％スキムミルク溶液でブロッキングした後、ハイブリドーマの培養上清５ｍＬを添加して反応させ、ペルオキシダーゼ標識された抗マウス免疫イムノグロブリン抗体と反応させた。その後、ペルオキシダーゼ基質溶液を加えて発光させて検出した。これらのスクリーニングで特定したハイブリドーマをクローニングすることにより、抗原タンパク質に高い反応性を示すモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を得た。 
（３）モノクローナル抗体の調製
　各ハイブリドーマを無血清・無タンパク質培養液で培養し、培養上清を回収した。回収した培養上清から、プロテインＡカラムを用いて各々のハイブリドーマ細胞が産生するモノクローナル抗体を精製した。まず、培養上清１２０ｍＬを平衡化・洗浄緩衝液（１．５ｍｏｌ／Ｌ Ｇｌｙｃｉｎｅ、３ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、ｐＨ８．９）で２倍に希釈して、平衡化・洗浄緩衝液で平衡化したプロテインＡカラム（容積１．０４ｍＬ）に添加して抗体をプロテインＡ担体に捕捉させ、担体に非特異的に吸着された成分を平衡化・洗浄緩衝液１０ｍＬで洗い流した。次にカラムに吸着した抗体を溶出緩衝液（１００ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．０）１０ｍＬで溶出させた。回収した溶離液は、アミコンウルトラ（メルクミリポア社）を用いて濃縮した。得られた精製抗体の濃度は、２８０ｎｍのＵＶ吸収法で定量した。
（４）サブクラスの決定
　ＩＳＯ－ＧＯＬＤ　Ｒａｐｉｄ　Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ　Ｋｉｔを用いて、サブクラスを同定した。精製した抗体をＳａｍｐｌｅ　Ｄｉｌｕｅｎｔ　Ｂｕｆｆｅｒで１００倍希釈した。この溶液１５０μＬをラテラルフローキットに添加し、５分静置した。検出したラインを読み取り、サブクラスを同定した。抗体は複数作製した。
　上記により、ＩｇＧ２ｂ（Ｎｏ１）、ＩｇＧ２ｂ（Ｎｏ２）、ＩｇＧ１（Ｎｏ１）、およびＩｇＧ１（Ｎｏ２）の４種の抗体を得た。
＜２＞イムノクロマトグラフキットの作製
＜実施例１＞
（２－１）被検物質に結合可能な第１の物質が修飾された標識物質としての抗ＮＰ抗体修飾金コロイドの作製
　直径５０ｎｍの金コロイドを含有する溶液（品番：ＥＭ．ＧＣ５０、ＢＢＩ社製）９ｍＬに５０ｍｍｏｌ／ＬのＫＨ２ＰＯ４バッファー（ｐＨ８．０）を１ｍＬ加えてｐＨの調整を行い、その後、２０μｇ／ｍＬの抗ＮＰモノクローナル抗体（サブクラスがＩｇＧ２ｂ（Ｎｏ１）の抗体）含有溶液１ｍＬを加えて１０分間攪拌した。その後、１０分間静置した後に、１質量％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ(ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｇｌｙｃｏｌ)；重量平均分子量（Ｍｗ．）：２００００、品番：１６８－１１２８５、富士フイルム和光純薬株式会社製）含有水溶液を５５０μＬ加えて１０分間攪拌し、続いて１０質量％牛血清アルブミン（ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ　Ａｌｂｕｍｉｎ）；ＦｒａｃｔｉｏｎＶ、品番：Ａ－７９０６、ＳＩＧＭＡ社製）の水溶液を１．１ｍＬ加えて１０分間攪拌した。この溶液を遠心分離装置（ｈｉｍａｃＣＦ１６ＲＸ、日立株式会社製）を用いて、８０００×ｇ、４℃の条件で３０分間遠心分離した。容器の底に１ｍＬを残して上澄み液を取り除き、超音波洗浄機により容器の底に残った１ｍＬ液中に含まれる金コロイドを再分散した。この後、２０ｍＬの金コロイド保存液（２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（トリス塩酸）バッファー（ｐＨ８．２）、０．０５％ＰＥＧ（Ｍｗ．２００００）、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ、１％ＢＳＡ）に分散し、再び同じ遠心分離装置を用いて同様の条件で遠心分離を行い、上澄み液を取り除き、超音波分散後、金コロイド保存液に分散し、抗体修飾金コロイド（５０ｎｍ）溶液を得た。
（２－２）標識保持パッドとしての抗ＮＰ抗体修飾金コロイド保持パッドの作製
　（２－１）で作成した抗ＮＰ抗体修飾金コロイドを、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファー(ｐＨ８．２)の濃度が２０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＰＥＧ（Ｍｗ．２００００）の濃度が０．０５質量％、スクロースの濃度が５質量％、そして光路長１０ｍｍとしたときの金コロイドの５２０ｎｍの光学濃度が０．１となるように水で希釈し、金コロイド塗布液とした。この塗布液を、５ｍｍ×３００ｍｍに切ったグラスファイバーパッド（ＧｌａｓｓＦｉｂｅｒ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｐａｄ、ミリポア社製）１枚あたり１ｍＬずつ均一に塗布し、２４時間減圧乾燥することで抗ＮＰ抗体修飾金コロイド保持パッドを得た。
(２－３）クロマトグラフ担体の作製
　不溶性担体として、６０ｍｍ×３００ｍｍに切断したニトロセルロースメンブレン（プラスチックの裏打ちあり、ＨｉＦｌｏｗ　Ｐｌｕｓ　ＨＦ１３５（キャピラリーフローレート＝１３５秒／ｃｍ)、ミリポア社製）を用い、このメンブレン上に以下のような方法により、捕捉領域として、以下の３つの領域である、検出領域、確認領域および増幅指標領域を形成してクロマトグラフ担体を作製した。
　ニトロセルロースメンブレンの６０ｍｍの短辺のうちの下流側から１５ｍｍの位置に、１．５ｍｇ／ｍＬとなるように調製した抗ＮＰモノクローナル抗体（サブクラスがＩｇＧ２ｂ（Ｎｏ２）の抗体）溶液をライン状に塗布し検査領域とした。さらに６０ｍｍの短辺のうちの下流側から１１ｍｍの位置に、０．５ｍｇ／ｍＬとなるように調製した抗マウスＩｇＧ抗体溶液をライン状に塗布し確認領域とした。さらに６０ｍｍの短辺のうちの下流側から９ｍｍの位置に、３０ｍｍｏｌ／Ｌに調製したブロモクレゾールグリーン(富士フイルム和光純薬株式会社製)をライン状に塗布し増幅指標領域とした。それぞれの塗布の後にニトロセルロースメンブレンを、温風式乾燥機で５０℃、３０分間乾燥した。乾燥が終了した後、ブロッキング液（０．５質量％カゼイン（乳由来、品番０３０－０１５０５、富士フイルム和光純薬株式会社製）を含有する５０ｍｍｏｌ／Ｌのホウ酸バッファー（ｐＨ８．５））５００ｍＬを入れたバットに、上記のように乾燥したニトロースメンブレンを浸漬させてそのまま３０分間静置した。その後ニトロセルロースメンブレンを取り出して、別のバットに準備した洗浄・安定化液（０．５質量％スクロースおよび０．０５質量％コール酸ナトリウムを含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣl（ｐＨ７．５）バッファー）５００ｍＬ中にニトロセルロースメンブレンを浸し、そのまま３０分間静置した。その後、ニトロセルロースメンブレンを液から取り出し、２５℃の環境で２４時間乾燥させた。抗ＮＰ抗体を固定化した部分が、被検物質に結合する第２の物質を含む検査領域、抗マウスＩｇＧ抗体を固定化した部分が、第１の物質に結合可能な物質を含む確認領域、ブロモクレゾールグリーンを固定した部分が、第１の増幅液と反応する物質を含む増幅指標領域にそれぞれ相当する。これら３つ領域を合わせて捕捉領域としている。
(２－４) 検査用ストリップの作製
　バック粘着シート（６０ｍｍ×３００ｍｍ（Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）)に、（２－３）で作製したクロマトグラフ担体を貼り付けた。次に、クロマトグラフ担体の短辺のうちの下流側から２６ｍｍの位置に幅３ｍｍの両面テープ(日東電工)を固定した。その後、両面テープの下流端と８ｍｍ×３００ｍｍに切ったグラスファイバーパッド（ＧｌａｓｓＦｉｂｅｒ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｐａｄ、ミリポア社製）の下流端が重なるようにして金コロイド保持パッドをクロマトグラフ担体に固定した。送液用パッド（２５ｍｍ×３００ｍｍに切ったグラスファイバーパッド（Ｇｌａｓｓ　Ｆｉｂｅｒ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｐａｄ、ミリポア社製））をクロマトグラフ担体の上流側に、送液用パッドとクロマトグラフ担体が７ｍｍ重なるように貼り付けた。こうして作製した部材を、３００ｍｍの長辺と垂直な方向に対して平行に、幅が５ｍｍとなるようにギロチン式カッター（ＣＭ４０００、ニップンテクノクラスタ社製）で切断し、６０本の検査用ストリップ（但し、吸収パッドを含まない。）を作製した。
（２－５）増幅液の作製
（２－５－１）第２のポットに封入する増幅液（還元剤溶液）の作製
　水２９０ｇに、硝酸鉄(III)九水和物（富士フイルム和光純薬株式会社製、０９５－００９９５）を水に溶解して作製した１ｍｏｌ／Ｌの硝酸鉄水溶液２３．６ｍＬ、クエン酸（富士フイルム和光純薬株式会社製、０３８－０６９２５）１３．１ｇを溶解させた。全て溶解したら、スターラーで攪拌しながら硝酸（１０重量％）溶液を３６ｍＬ加え、硫酸アンモニウム鉄（II）六水和物（富士フイルム和光純薬株式会社製、０９１－００８５５）を６０．８ｇ加えた。このように調製した溶液を第２のポットに封入する第２の増幅液である還元剤溶液とした。
（２－５－２）第１のポットに封入する増幅液（銀イオン溶液）の作製
　水６６ｇに、硝酸銀溶液８ｍＬ（１０ｇの硝酸銀を含む）と１ｍｏｌ／Ｌの硝酸鉄水溶液２４ｍＬを加えた。さらに、この溶液と、硝酸（１０重量％）５．９ｍＬ、ドデシルアミン（富士フイルム和光純薬株式会社製、１２３－００２４６）０．１ｇ、界面活性剤Ｃ12Ｈ25-Ｃ6Ｈ4-Ｏ-（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）50Ｈ　０．１ｇをあらかじめ４７．６ｇの水に溶解した溶液を混合し、これを第１のポットに封入する第１の増幅液である銀イオン溶液とした。
（２－６）吸収パッドの作製
　１２ｍｍ×１０ｍｍに切ったグラスファイバーパッド（ガラス濾紙、アドバンテック社製）を６０枚準備し、吸収パッドとした。
（２－７）イムノクロマトグラフキットの部品の作製
　図１および図２に示すようなイムノクロマトグラフキット１００を構成する下部ケース２０、上部ケース１０、中間部材３０、および第１のポット４０、第２のポット４５を、ポリプロピレンを材料として射出成形によりそれぞれ作製した。上部ケースは住友化学株式会社製オレフィン系エラストマーであるタフセレン（登録商標）を５０質量％含有するポリプロピレンを材料として射出成形により作製した。なお、上部ケース１０は、２つの変形可能な部位（第１の凸状変形部と第２の凸状変形部と）を備え、この２つの変形部は上部ケース１０と分離する部分はなく、すべての境界部で上部ケース１０の一部として射出成形で作成した。
　なお、実施例の上部ケースは、図１および図２に示す第１の凸状変形部１２が２本の突起部を有し、第２の凸状変形部１４が１本の突起部を有する構成とした。
（２－８－１）実施例１のイムノクロマトグラフキットの作製
　下部ケース２０、（１－４）で作製した検査用ストリップ１と（１－６）で作製した吸収パッド６を、図１、および図２に示すように固定した。次に、図３に示すように、第１のポット４０、第２のポット４５に、それぞれ、（１－５－２）、（１－５－１）で作製した第１のポット４０に封入する第一の増幅液４１、第２のポット４５に封入する第２の増幅液４６を充填し、シート部材４８としてのアルミ箔でポット４５を、シート部材４３としてのアルミ箔でポット４０をそれぞれ封止し、図１、および図２に示すように、第２のポット４５を、シート部材４８を上にして下部ケース２０に、第１のポット４０を、シート部材４３を下にして中間部材３０に装着した。そして、上部ケース１０と下部ケース２０とを外周同士が接触するように嵌め合わせた状態で、上部ケースと下部ケースとの接触部を超音波溶着により接合させた。このとき、溶着部位は密閉状態で均一にすべての部位で溶着されていることを確認した。このようにしてイムノクロマトグラフキットを作製した。
＜実施例２＞
　実施例１の（２－１）で記載した抗ＮＰ抗体修飾金コロイドの作製において、サブクラスがＩｇＧ２ｂ（Ｎｏ１）の抗体の代わりに、サブクラスがＩｇＧ２ｂ（Ｎｏ２）の抗体を用いたこと、および、実施例１の（２－３）で記載したクロマトグラフ担体の作製において、サブクラスがＩｇＧ２ｂ（Ｎｏ２）の抗体の代わりに、サブクラスがＩｇＧ２ｂ（Ｎｏ１）の抗体を用いたこと、以外は全て実施例１と同様にして、実施例２の金のクロマトグラフキットを作製した。
＜実施例３＞
　実施例１の（２－３）で記載したクロマトグラフ担体の作製において、サブクラスがＩｇＧ２ｂ（Ｎｏ２）の抗体の代わりに、サブクラスがＩｇＧ１（Ｎｏ２）の抗体を用いたこと、以外は全て実施例１と同様にして、実施例３の金のクロマトグラフキットを作製した。
＜比較例１＞
　実施例１の（２－１）で記載した抗ＮＰ抗体修飾金コロイドの作製において、サブクラスがＩｇＧ２ｂ（Ｎｏ１）の抗体の代わりに、サブクラスがＩｇＧ１（Ｎｏ１）の抗体を用いたこと、および、（２－３）で記載したクロマトグラフ担体の作製において、サブクラスがＩｇＧ２ｂ（Ｎｏ２）の抗体の代わりに、サブクラスがＩｇＧ１（Ｎｏ２）の抗体を用いたこと、以外は全て実施例１と同様にして、比較例１の金のクロマトグラフキットを作製した。
＜比較例２＞
　実施例１の（２－１）で記載した抗ＮＰ抗体修飾金コロイドの作製において、サブクラスがＩｇＧ２ｂ（Ｎｏ１）の抗体の代わりに、サブクラスがＩｇＧ１（Ｎｏ２）の抗体を用いたこと、および、（２－３）で記載したクロマトグラフ担体の作製において、サブクラスがＩｇＧ２ｂ（Ｎｏ２）の抗体の代わりに、サブクラスがＩｇＧ１（Ｎｏ１）の抗体を用いたこと、以外は全て実施例１と同様にして、比較例２の金のクロマトグラフキットを作製した。
＜３＞検出感度の評価
（３－１）評価液
　Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０（４ｇ）を超純水３２８０ｍＬに添加し、溶解した。トリスヒドロキシジメチルメタンを１２０ｇとカゼイン４ｇ、ＥＤＴＡ・Ｎａ（エチレンジアミン四酢酸ナトリウム）６０ｇを添加した。ｐＨ７．７になるように調整した後、４Ｌにメスアップした。
（３－２）検体調液
　上記のように調製した評価液中に、上記（１）で調製したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２組換えＮＰを添加し、各濃度の検体を調液した。
（３－３）実施例および比較例のイムノクロマトグラフキットを用いた測定
　上記のように調液した検体２４μＬをキットに点着した。
　検体の点着直後に、第２の凸状変形部１４を押下することで、第２のポット４５に封入した第二の増幅液４６を封止しているシート部材４８のアルミ箔を破り、第２のポット４５の中に送液用パッド４を浸すことにより、毛細管現象を利用して第２の増幅液４６を不溶性担体２に供給した。
　増幅指標領域Ｌ３が緑からオレンジに変色した後、第１の凸状変形部１２を押下して第１のポット４０を中間部材３０の第１のポット収容部３２の破断部３４に向けて移動させることにより、第１のポット４０を封止しているシート部材４３のアルミ箔を破断部３４により押し破り、第１の増幅液４１である銀イオン溶液を中間部材３０の開口部から不溶性担体２に供給して、銀増幅反応を行った。銀増幅反応は数十秒で完了する。
　銀増幅反応終了後、目視にて陽性または陰性を判定した。判定は、捕捉量は、そのＮＰ量に比例して増減する抗ＮＰ抗体塗布ライン黒色の呈色度合いをＬＡＳ４０００（ＧＥ製)で撮影しシグナルを算出した。
　以下の基準により評価した。
　Ａ：シグナル濃度０．１を超え、十分に検体の存在が確認できる。
　Ｂ：シグナル濃度０．０５～０．１で、濃度上昇検出可能で、検体の存在が確認される。
　Ｃ：シグナル濃度０．０３～０．０５で、検体検出がかろうじて検出される。
　Ｄ：シグナル濃度０．０３以下。検体がない、あるいは検出不可である。
　結果を表1に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　イムノクロマトグラフキットの抗ＮＰモノクローナル抗体として、ＩｇＧ２ｂの抗体を少なくとも1種使用した場合の検出感度が高いことが分かった。
　富士レビオ株式会社製のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原検出用試薬「スプラインＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２」の添付文書に記載の最小検出感度が、２５ｐｇ／ｍＬと記載されており、その検出感度に対し、優位に高感度が実現できる可能性があることが分かった。
実験Ｂ
＜１＞抗体の断片化
　リン酸２ナトリウムを純水に溶解し、１ｍｏｌ／Ｌ塩酸を用いて、ｐＨ７．８に調整し、消化液とした。抗体の緩衝液を脱塩カラム(Ｚｅｂａｔｍ Ｓｐｉｎ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎｓ, ７Ｋ ＭＷＣＯ)を用いて、消化液に置換した。Ｅｎｄｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｇｌｕ－Ｃ （Ｖ８ Ｐｒｏｔｅａｓｅ)(シグマアルドリッチ社製または富士フイルム和光純薬社製)を２．０ｍｇ測り取り、消化液を３００μＬ添加し、酵素液を作製した。抗体（ＩｇＧ２ｂ（Ｎｏ１））２ｍｇに対し、酵素液１５０μＬ添加し、３７℃で２０時間反応させた。反応後、アミコンウルトラ（メルク社製）で限外ろ過を行い、Ｍｏｎｏｓｐｉｎ ｐｒｏＡ（ＧＬサイエンス社製）を用いて、Ｗｈｏｌｅ抗体を除去し、断片化抗体の精製を行った。
＜２＞イムノクロマトグラフキットの作製
＜実施例４＞
（２－１）被検物質に結合可能な第１の物質が修飾された標識物質としての抗ＮＰ断片化抗体修飾金コロイドの作製
　直径５０ｎｍの金コロイドを含有する溶液（品番：ＥＭ．ＧＣ５０、ＢＢＩ社製）９ｍＬに５０ｍｍｏｌ／ＬのＫＨ２ＰＯ４バッファー（ｐＨ８．０）を１ｍＬ加えてｐＨの調整を行い、その後、（１）で調製した、２０μｇ／ｍＬの断片化抗ＮＰモノクローナル抗体（含有溶液１ｍＬ）を加えて１０分間攪拌した。その後、１０分間静置した後に、１質量％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ(ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｇｌｙｃｏｌ)；重量平均分子量（Ｍｗ．）：２００００、品番：１６８－１１２８５、富士フイルム和光純薬株式会社製）含有水溶液を５５０μＬ加えて１０分間攪拌し、続いて１０質量％牛血清アルブミン（ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎ）；ＦｒａｃｔｉｏｎＶ、品番：Ａ－７９０６、ＳＩＧＭＡ社製）の水溶液を１．１ｍＬ加えて１０分間攪拌した。この溶液を遠心分離装置（ｈｉｍａｃＣＦ１６ＲＸ、日立株式会社製）を用いて、８０００×ｇ、４℃の条件で３０分間遠心分離した。容器の底に１ｍＬを残して上澄み液を取り除き、超音波洗浄機により容器の底に残った１ｍＬ液中に含まれる金コロイドを再分散した。この後、２０ｍＬの金コロイド保存液（２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（トリス塩酸）バッファー（ｐＨ８．２）、０．０５％ＰＥＧ（Ｍｗ．２００００）、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ、１％ＢＳＡ）に分散し、再び同じ遠心分離装置を用いて同様の条件で遠心分離を行い、上澄み液を取り除き、超音波分散後、金コロイド保存液に分散し、断片化した抗ＮＰ抗体修飾金コロイド（５０ｎｍ）溶液を得た。
（２－２）標識保持パッドとしての抗ＮＰ抗体修飾金コロイド保持パッドの作製
　（２－１）で作成した抗ＮＰ抗体修飾金コロイドを、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファー(ｐＨ８．２)の濃度が２０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＰＥＧ（Ｍｗ．２００００）の濃度が０．０５質量％、スクロースの濃度が５質量％、そして光路長１０ｍｍとしたときの金コロイドの５２０ｎｍの光学濃度が０．１となるように水で希釈し、金コロイド塗布液とした。この塗布液を、５ｍｍ×３００ｍｍに切ったグラスファイバーパッド（ＧｌａｓｓＦｉｂｅｒ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｐａｄ、ミリポア社製）１枚あたり１ｍＬずつ均一に塗布し、２４時間減圧乾燥することで抗ＮＰ抗体修飾金コロイド保持パッドを得た。
(２－３）クロマトグラフ担体の作製
　不溶性担体として、６０ｍｍ×３００ｍｍに切断したニトロセルロースメンブレン（プラスチックの裏打ちあり、ＨｉＦｌｏｗ　Ｐｌｕｓ　Ｈ１３５(キャピラリーフローレート＝１３５秒／ｃｍ)、ミリポア社製）を用い、このメンブレン上に以下のような方法により、検査領域、確認領域および増幅指標領域を形成してクロマトグラフ担体を作製した。
　ニトロセルロースメンブレンの６０ｍｍの短辺のうちの下流側から１５ｍｍの位置に、１．５ｍｇ／ｍＬとなるように調製した抗ＮＰモノクローナル抗体（ＩｇＧ１（Ｎｏ２））溶液をライン状に塗布し検査領域とした。さらに６０ｍｍの短辺のうちの下流側から１１ｍｍの位置に、０．５ｍｇ／ｍＬとなるように調製した抗マウスＩｇＧ抗体溶液をライン状に塗布し確認領域とした。さらに６０ｍｍの短辺のうちの下流側から９ｍｍの位置に、３０ｍｍｏｌ／Ｌに調製したブロモクレゾールグリーン(富士フイルム和光純薬株式会社製)をライン状に塗布し増幅指標領域とした。それぞれの塗布の後にニトロセルロースメンブレンを、温風式乾燥機で５０℃、３０分間乾燥した。乾燥が終了した後、ブロッキング液（０．５質量％カゼイン（乳由来、品番０３０－０１５０５、富士フイルム和光純薬株式会社製）を含有する５０ｍｍｏｌ／Ｌのホウ酸バッファー（ｐＨ８．５））５００ｍＬを入れたバットに、上記のように乾燥したニトロースメンブレンを浸漬させてそのまま３０分間静置した。その後ニトロセルロースメンブレンを取り出して、別のバットに準備した洗浄・安定化液（０．５質量％スクロースおよび０．０５質量％コール酸ナトリウムを含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣl（ｐＨ７．５）バッファー）５００ｍＬ中にニトロセルロースメンブレンを浸し、そのまま３０分間静置した。その後、ニトロセルロースメンブレンを液から取り出し、２５℃の環境で２４時間乾燥させた。抗ＮＰ抗体を固定化した部分が、被検物質に結合する第２の物質を含む検査領域、抗マウスＩｇＧ抗体を固定化した部分が、第１の物質に結合可能な物質を含む確認領域、ブロモクレゾールグリーンを固定した部分が第１の増幅液と反応する物質を含む増幅指標領域にそれぞれ相当する。
(２－４) 検査用ストリップの作製
　バック粘着シート（６０ｍｍ×３００ｍｍ（Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）)に、（２－３）で作製したクロマトグラフ担体を貼り付けた。次に、クロマトグラフ担体の短辺のうちの下流側から２６ｍｍの位置に幅３ｍｍの両面テープ(日東電工)を固定した。その後、両面テープの下流端と８ｍｍ×３００ｍｍに切ったグラスファイバーパッド（ＧｌａｓｓＦｉｂｅｒ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｐａｄ、ミリポア社製）の下流端が重なるようにして（２－２）で作製した金コロイド保持パッドをクロマトグラフ担体に固定した。送液用パッド（２５ｍｍ×３００ｍｍに切ったグラスファイバーパッド（Ｇｌａｓｓ　Ｆｉｂｅｒ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｐａｄ、ミリポア社製））をクロマトグラフ担体の上流側に、送液用パッドとクロマトグラフ担体が７ｍｍ重なるように貼り付けた。こうして作製した部材を、３００ｍｍの長辺と垂直な方向に対して平行に、幅が５ｍｍとなるようにギロチン式カッター（ＣＭ４０００、ニップンテクノクラスタ社製）で切断し、６０本の検査用ストリップ（但し、吸収パッドを含まない。）を作製した。
（２－５）増幅液の作製
（２－５－１）第２のポットに封入する増幅液（還元剤溶液）の作製
　水２９０ｇに、硝酸鉄(III)九水和物（富士フイルム和光純薬株式会社製、０９５－００９９５）を水に溶解して作製した１ｍｏｌ／Ｌの硝酸鉄水溶液２３．６ｍＬ、クエン酸（富士フイルム和光純薬株式会社製、０３８－０６９２５）１３．１ｇを溶解させた。全て溶解したら、スターラーで攪拌しながら硝酸（１０重量％）溶液を３６ｍＬ加え、硫酸アンモニウム鉄（II）六水和物（富士フイルム和光純薬株式会社製、０９１－００８５５）を６０．８ｇ加えた。このように調製した溶液を第２のポットに封入する第２の増幅液である還元剤溶液とした。
（２－５－２）第１のポットに封入する増幅液（銀イオン溶液）の作製
　水６６ｇに、硝酸銀溶液８ｍＬ（１０ｇの硝酸銀を含む）と１ｍｏｌ／Ｌの硝酸鉄水溶液２４ｍＬを加えた。さらに、この溶液と、硝酸（１０重量％）５．９ｍＬ、ドデシルアミン（富士フイルム和光純薬株式会社製、１２３－００２４６）０．１ｇ、界面活性剤Ｃ１２Ｈ２５-Ｃ６Ｈ４-Ｏ-（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）５０Ｈ　０．１ｇをあらかじめ４７．６ｇの水に溶解した溶液を混合し、これを第１のポットに封入する第１の増幅液である銀イオン溶液とした。
（２－６）吸収パッドの作製
　１２ｍｍ×１０ｍｍに切ったグラスファイバーパッド（ガラス濾紙、アドバンテック社製）を６０枚準備し、吸収パッドとした。
（２－７）イムノクロマトグラフキットの部品の作製
　図１および図２に示すようなイムノクロマトグラフキット１００を構成する下部ケース２０、上部ケース１０、中間部材３０、および第１のポット４０、第２のポット４５を、ポリプロピレンを材料として射出成形によりそれぞれ作製した。上部ケースは住友化学株式会社製オレフィン系エラストマーであるタフセレン（登録商標）を５０質量％含有するポリプロピレンを材料として射出成形により作製した。なお、上部ケース１０は、２つの変形可能な部位（第１の凸状変形部と第２の凸状変形部と）を備え、この２つの変形部は上部ケース１０と分離する部分はなく、すべての境界部で上部ケース１０の一部として射出成形で作成した。
　なお、実施例の上部ケースは、図１および図２に示す第１の凸状変形部１２が２本の突起部を有し、第２の凸状変形部１４が１本の突起部を有する構成とした。
（２－８）実施例のイムノクロマトグラフキットの作製
　下部ケース２０、（２－４）で作製した検査用ストリップ１と（２－６）で作製した吸収パッド６を、図１、および図２に示すように固定した。次に、図３に示すように、第１のポット４０、第２のポット４５に、それぞれ、（１－５－２）、（１－５－１）で作製した第１のポット４０に封入する第１の増幅液４１、第２のポット４５に封入する第２の増幅液４６を充填し、シート部材４８としてのアルミ箔で第２のポット４５を、シート部材４３としてのアルミ箔で第１のポット４０をそれぞれ封止し、図１、および図２に示すように、第２のポット４５を、シート部材４８を上にして下部ケース２０に、第１のポット４０を、シート部材４３を下にして中間部材３０に装着した。そして、上部ケース１０と下部ケース２０とを外周同士が接触するように嵌め合わせた状態で、上部ケースと下部ケースとの接触部を超音波溶着により接合させた。このとき、溶着部位は密閉状態で均一にすべての部位で溶着されていることを確認した。このようにしてイムノクロマトグラフキットを作製した。
＜実施例５＞
　実施例４において、下記の表２に記載の抗体に変更した以外は、実施例４と同様に、実施例５のイムノクロマトキットを作製した。
＜３＞検出感度の評価
（３－１）評価液
　Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０（４ｇ）を、超純水３２８０ｍＬに添加し、溶解した。トリスヒドロキシジメチルメタンを１２０ｇとカゼイン４ｇ、ＥＤＴＡ・Ｎａを６０ｇ、添加した。ｐＨ７．７になるように調整した後、４Ｌにメスアップした。
（３－２）検体調液
　評価液中に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２組換えＮＰを添加し、各濃度の検体を調液した。
　上記のように調液した検体２４μＬをキットに点着した。
　検体の点着直後に、第２の凸状変形部１４を押下することで、第２のポット４５に封入した第２の増幅液４６を封止しているシート部材４８であるアルミ箔を破り、第２のポット４５の中に送液用パッド４を浸すことにより、毛細管現象を利用して第２の増幅液４６を不溶性担体２に供給した。
　増幅指標領域Ｌ３が緑からオレンジに変色した後、第１の凸状変形部１２を押下して第１のポット４０を中間部材３０の第１のポット収容部３２の破断部３４に向けて移動させることにより、第１のポット４０を封止しているシート部材４３であるアルミ箔を破断部３４により押し破り、第１の増幅液４１である銀イオン溶液を中間部材３０の開口部から不溶性担体２に供給して、銀増幅反応を行った。銀増幅反応は数十秒で完了する。
　銀増幅反応終了後、目視にて陽性または陰性を判定した。判定は、捕捉量は、そのＮＰ量に比例して増減する抗ＮＰ抗体塗布ライン黒色の呈色度合いをＬＡＳ４０００（ＧＥ製)で撮影しシグナルを算出した。
　以下の基準により評価した。
　Ｅ：シグナル濃度０．０４５以上で、十分に高濃度で検出できる。
　Ｆ：シグナル濃度０．０２５～０．０４５で、濃度上昇検出可能で、検体の存在が確認される。
　Ｇ：シグナル濃度０．０１５～０．０２５で、わずかに濃度が判別される。
　Ｈ：シグナル濃度０．０１０～０．０１５で、かろうじて濃度が判別できる。
　Ｉ：シグナル濃度０．０１０以下。濃度が検出されない。
　結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　金コロイド抗体、膜抗体共に未断片化抗体の実施例５に比べ、金コロイド抗体を断片化した抗体である実施例４の方が、評価液中にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が含まれない試料（ＮＰ濃度０ｐｇ／ｍＬ）のシグナル濃度が低く、偽陽性が発生しにくいことが分かった。加えて、断片化しても、富士レビオ株式会社製のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原検出用試薬「スプラインＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２」の検出感度に対し、優位に高感度が実現できる可能性があることが分かった。
（実施例６）
　実施例１で調製した、サブクラスがＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂの抗ＮＰモノクローナル抗体を用いて、特許第５４３０９９５号公報に記載の実施例１に従ってアッセイデバイスを作製して評価し実施例１と同様の濃度測定を行ったところ、実施例１と同様に本発明の効果が確認された。
１　検査用ストリップ
２　不溶性担体
３　標識保持パッド
４　送液用パッド
６　吸収パッド
７　バック粘着シート
９　ハウジングケース
１０　上部ケース
１２　第１の凸状変形部
１４　第２の凸状変形部
１６　試料液滴下用開孔
１８　観察窓
２０　下部ケース
２１　不溶性担体収容部
２２　吸収パッド収容部
２４　第２のポット収容部
３０　中間部材
３２　第１のポット収容部
３４　破断部
３５　流路形成部
３６　流路形成部３５の裏面
４０　第１のポット
４１　第１の増幅液
４２　ポット容器
４３　シート部材
４５　第２のポット
４６　第２の増幅液
４７　ポット容器
４８　シート部材
１００　イムノクロマトグラフキット
Ｌ１　検査領域
Ｌ２　確認領域
Ｌ３　増幅指標領域

Claims (15)

  1. 　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質と特異的に反応する少なくとも１種の抗体を含む、生体試料に含まれるヌクレオカプシドタンパク質を特異的に検出するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出キットであって、
    　前記抗体が、サブクラスがＩｇＧ２ｂである抗体を少なくとも一種含み、
    　銀を含む化合物を収容する第一の容器と、銀イオンを還元し得る還元剤を収容する第二の容器とを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出キット。
  2. 　前記抗体が、断片化抗体である、請求項１に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出キット。
  3. 　前記断片化抗体が、プロテアーゼ処理により作製された抗体である、請求項２に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出キット。
  4. 　前記抗体が標識物質により標識されており、標識物質による情報を、銀を含む化合物と銀イオンを還元し得る還元剤により増幅して検出する、請求項１から３のいずれか一項に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出キット。
  5. 　前記標識物質が金コロイドである、請求項４に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出キット。
  6. 　前記還元剤が、Ｆｅ２＋の金属塩である、請求項１から５のいずれか一項に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出キット。
  7. 　不溶性担体をさらに含む、請求項１から６のいずれか一項に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出キット。
  8. 　前記不溶性担体が、被検物質を捕捉する捕捉領域と、還元剤を検出する発色領域を有する、請求項７に記載の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出キット。
  9. 　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質と特異的に反応する少なくとも１種の抗体を用いた、生体試料に含まれるヌクレオカプシドタンパク質を特異的に検出するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法であって、
    　前記抗体として、サブクラスがＩｇＧ２ｂである抗体を少なくとも一種使用し、
    　前記検出する方法が、ヌクレオカプシドタンパク質の検出情報を、銀を含む化合物と、銀イオンを還元し得る還元剤により増幅することを含む、
    ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法。
  10. 　前記抗体が、断片化抗体である、請求項９に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法。
  11. 　前記断片化抗体が、プロテアーゼ処理により作製された抗体である、請求項１０に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法。
  12. 　前記抗体が標識物質により標識されており、標識物質による情報を、銀を含む化合物と銀イオンを還元し得る還元剤により増幅して検出する、請求項９から１１のいずれか一項に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法。
  13. 　前記標識物質が金コロイドである、請求項１２に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法。
  14. 　前記還元剤がＦｅ２＋の金属塩である、請求項９から１３のいずれか一項に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法。
  15. 　前記検出方法が、イムノクロマト法である、請求項９から１４のいずれか一項に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法。
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