JPH02130473A - 杭原性物質の免疫測定法および免疫測定試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分寿コ 本発明は、抗原性物質の免疫測定法および免疫測定試薬
に関する。さらに詳しくは、モノクローナル抗体を使用
した免疫測定法により被検試料液中の抗原性物質を測定
する方法および免疫測定試薬に関し、種々の身体的疾患
に伴う、例えば血ｌａもしくは他の体液中の抗原性物質
の検出および／または濃度を測定する方法および測定試
薬に関するものである。

［従来の技術］ 従来、モノクローナル抗体を使用した免疫測定法として
は、不溶性固体に結合したモノクローナル抗体、抗原性
物質、標識モノクローナル抗体を結合させて得た免疫複
合体における標識物質量を測定する方法が知られている
（たとえば、特開昭５７−８８０５１号公報、特開昭５
７−１１８１５９号公報、特開昭５７−７９４５５号公
報）。

［発明が解決しようとする課［ しかしながら、従来のモノクローナル抗体を使用した免
疫測定法は、モノクローナル抗体の親和力が弱い場合、
十分な感度が得られないなどの問題点がある。

［課題を解決するための手段］ 本発明者らは、上記問題点に鑑みて、モノクローナル抗
体の親和力にかかわらず、十分な感度を持つ測定法を得
るべく鋭！！検討した結果、本発明に到達した。

すなわち、本発明は、被測定抗原性物質、不溶性固体上
の被測定抗原性物質を認識するモノクローナル抗体（第
一抗体）、被測定抗原性物質を認識しかつ第一抗体とは
異なるクラスまたはサブクラスのモノクローナル抗体（
第二抗体）、および第二抗体のクラスまたはサブクラス
を認識する標識抗体（第三抗体）を結合させて得た免疫
複合体における標識物質量を測定することにより、該被
測定抗原性物質を測定することを特徴とする抗原性物質
の免疫測定法、並びに、不溶性固体上の被測定抗原性物
質を認識するモノクローナル抗体（第一抗体）、被測定
抗原性物質を認識しかつ第一抗体とは異なるクラスまた
はサブクラスのモノクローナル抗体（第二抗体）、およ
び第二抗体のクラスまたはサブクラスを認識する標識抗
体（第三抗体）を必須構成成分とすることを特徴とする
免疫測定試薬である。

本発明における被測定抗原性物質としては、ホルモン（
インシュリン、ＩＩＣＧ−β、成長ホルモン、ＴＳＨ，
ＬＨｌＦＳＨｌ　　プロラクチン、サイロキシン、トリ
ヨードサイロニン、ガストリン、グルカゴン、ソマトス
タチンなど）、酵素（エラスターゼ、アミラーゼ、プロ
テアーゼ、リパーゼ、リボヌクレアーゼ、エノラーゼ、
アルカリフォスフ１ターゼなど）、血清タンパク質（Ｉ
ｇＧｌｌｇＡ、　　ＩｇＭ、　　ＩｇＥｌｆ　ｇＤｌ　
　β２−マイクログロブリン、ＴＢＧ、　　糖タンパク
質、糖脂質など）、Ｉｌｌ瘍関連抗原（ＣＥＡ、　　α
−フェトプロティン、フェリチン、ＰＯＡ、　　ＣＡ１
９−９、ＣＡ１２５など）、ＤＩＩＡ結合性タンパク質
因子、サイト力イン（インターフェロン、インターロイ
キン１、インターロイキン２など）または種々の細菌、
ウィルス、原虫（真菌、連鎖球菌、肝炎ウィルス、ヘル
ペスウィルス、エイズウィルス、　トキソプラズマ原虫
、マラリア原虫、赤痢アメーバ−など）などがあげられ
る。これらのうち、好ましくは、特に高感度の測定系が
要求されるホルモン、Ｍｉ瘍関連抗原およびウィルスで
ある。

第一抗体としては、被測定抗原性物質を認識するモノク
ローナル抗体を用いることができる。モノクローナル抗
体は、ミエローマ細胞を文献に記載の方法［たとえば、
ジー・ケラ−シー・ミルスタイ７　；＊　イｆ　＋　−
（Ｇ、Ｋｏｈｌｅｒ、Ｃ，ｌｌｌ１ｓｔｅｌｎ；Ｎａｔ
ＩＩ＋−ン　Ｖｏｌ、２５＆、ＰＰ、４９５（１９７５
）コによって融合させた細胞由来の抗体であり、同一ク
ローンの抗体産生細胞から産生きれた抗体であるので、
その抗体は完全に同一であり、被測定抗原性物質に対す
る特異性詔よび抗体のクラス、サブクラスも完全に同一
であると考えられる。

不溶性固体としては、ケイ酸質無機担体［ガラス（ポー
ラス、ツヤ消しガラスなど）、シリカゲル、ベントナイ
トなど］、磁性体、および有機担体（プラスチック、デ
キストラン、口紙など）があげられる。これらのうち、
好ましくは、簡便かつ安定して抗体が結合でき、さらに
、取扱いが容易なガラス（ガラスピーズおよびガラス試
験管）、およびプラスチック（プラスチックチューブお
よびプラスチックトレイ）である。

不溶性固体上に第一抗体を結合させる方法としては、ガ
ラスと抗体を化学的に結合させる（シランカップリング
剤および必要により架橋剤をもちいて）、または物理吸
着させる方法［たとえば、米国特許第４２８０９９２号
明細凹および同第３１１ｉ５２７８１号明細四］、ある
いは、プラスチックに抗体を物理吸着させる方法［たと
えば、イー・エングバール、ジェー・ジョンソン、ビー
・パールマン；パイオキム、パイオフィス、アクタ（Ｅ
、Ｅｎｇｖａｌｌ、Ｊ　、Ｊｏｎｓ−ｓｏｎ　、Ｐ　、
Ｐａｒｌｍａｎｎ　；Ｂｉ　ｏｃｈｌｍ、Ｂｌｏｐｙｓ
　、Ａｃｔａ　）、２５１（１９７１）４２７〜４３４
］　がある。

第二抗体としては、被測定抗原性物質を認識しかつ第一
抗体と異なるクラスまたはサブクラスのモノクローナル
抗体を用いることができる。たとえば、第一抗体がＩｇ
Ｇクラスのモノクローナル抗体なら第二抗体は１ｇＭク
ラスのモノクローナル抗体、第−抗体力ｕｇＡクラスの
モノクローナル抗体なら第二抗体はＩｇＧクラスのモノ
クローナル抗体、第一抗体が　ＩｇＧ２ａサブクラスの
モノクローナル抗体なら第二抗体はＩｇＧ１サブクラス
のモノクローナル抗体を用いることができる。

第三抗体としては、第二抗体のクラスまたはサブクラス
だけを特異的に認識する抗体［たとえば、第一抗体がマ
ウスＩｇＡで第二抗体がマウスＩｇＧならば抗マウスＩ
ｇＧ抗体、あるいは第一抗体がマウスＩｇＧ２ａで第二
抗体がマウスＩｇＧ１なら抗マウスＩＫＧ！抗体などコ
を用いることができる。

第三抗体に標識する標識物質としては、酵素（ペルオキ
シダーゼ、アルカリフォスファターゼ、およびβ−ガラ
クトシダーゼなど）、放射線同位元素（ｓＨ，＋＊ｓＩ
など）、蛍光物質（フルオレセインインチオシアネート
、ローダミンなど）、化学発光物質（イソルミノール誘
導体、Ｎ−メチルアクリジウム誘導体など）などを用い
ることができる。

好ましくは、抗体標識が容易で、かつ高い感度が得られ
るペルオキシダーゼおよびｌ１ｌｓ　ｌである。

免疫複合体は、（Ｉ）不溶性固体上の第一抗体と被測定
抗原性物質を結合させたのち、洗浄し、この被測定抗原
性物質と第二抗体を結合させたのち、再び洗浄し、さら
にこの第二抗体と第三抗体を結合させる方法、（２）不
溶性固体上の第一抗体、被測定抗原性物質、第二抗体を
同時に結合させたのち、洗浄し、さらにこの第二抗体と
第三抗体を結合させる方法、（３）不溶性固体上の第一
抗体、被測定抗原性物質、第二抗体、第三抗体を同時に
結合させる方法、および（４）不溶性固体上の第一抗体
と被測定抗原性物質を結合させたのち、洗浄し、この被
測定抗原性物質と第二抗体、第三抗体を同時に結合させ
る方法によって得ることができる。たとえば、（Ｉ）第
一抗体を結合させた不溶性固体、および被測定抗原性物
質を緩衝液中でインキュページロン（たとえば、５〜５
０℃、５分〜２日）し結合させたのち、不溶性固体を洗
浄する。次に第二抗体を含む緩衝液中に不溶性固体を移
し、インキュベーション（たとえば、５〜５０℃、５分
〜２日）し結合させたのち、再び不溶性固体を洗浄する
。

さらに第三抗体を含む緩衝液中に不溶性固体を移し、イ
ンキュベーション（たとえば、５〜５０℃、５分〜２日
）し結合させることにより免疫複合体を得る。（２）第
一抗体を結合させた不溶性固体、被測定抗原性物質、第
二抗体を緩衝液中でインキュベート（たとえば、５〜５
０℃、５分〜２日）し結合させたのち、不溶性固体を洗
浄する。次に、第三抗体を含む緩衝液中に不溶性固体を
移し、インキュベート（たとえば、５〜５０℃、５分〜
２日）し結合させることにより免疫複合体を得る。

（３）第一抗体を結合させた不溶性固体、被測定抗原性
物質、第二抗体、第三抗体を緩衝溶液中でインキュベー
ト（たとえば、５〜５０℃、５分〜２日）し結合させる
ことにより免疫複合体を得る。または（４）第一抗体を
結合させた不溶性固体、および被測定抗原性物質を緩衝
液中でインキュベーション（たとえば、５〜５０℃、５
分〜２日）し結合させたのち、不溶性固体を洗浄する。

次に、第二抗体、および第三抗体を含むｍ街液中に不溶
性固体を移し、インキュベート（たとえば、５〜５０℃
、５分〜２日）し結合させることにより免疫複合体を得
ることができる。

免疫複合体の標識物質量の測定は、標識物質に応じて酵
素ｍを酵素活性の測定により測定する方法、放射線同位
元素量を放射線測定装置を用いて測定する方法、蛍光物
質量を蛍光光度計により測定する方法、化学発光物質量
を酵素を用いた化学発光により測定する方法などにより
行うことができる。たとえば、標識物質にペルオキシダ
ーゼを用いた場合、オルト−フェニレンジアミンと過酸
化水素溶液、４−アミノアンチピリンと過酸化水素溶液
などの発色基質溶液中で免疫複合体をインキュベート（
たとえば、５〜５０℃、５分〜２日）した後、分光光度
計を用いて発色量を測定することによりペルオキシダー
ゼ活性を測定する方法などをあげることができる。

本発明の免疫測定試薬は必須構成成分以外に、この免疫
測定試薬の使用を便ならしめるために、種々の補助剤を
包含させることができる。たとえば、第二抗体または第
三抗体が固体吠である場合にはそれらを溶解させるため
の溶解剤、免疫複合体を得る工程で不溶化固体を洗浄す
るための洗浄液、標識物質が酵素である場合にその酵素
活性を測定するための基質、および酵素反応を停止する
ための反応停止剤などを任意の組合せで包含させること
ができる。

［実施例コ 以下、実施例および比較例により、本発明を更に説明す
るが、本発明はこれに限定されるものではない。

実施例Ｉ　　Ｃ１１９−９の測定 ａ）　抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体の製造ＣＡ１
９−９に対するモノクローナル抗体は、文献［ヒラリー
・コブロスキー、ゼノン・ステプルスキー　ヶネット・
ミッチェル、ミーンハード・ヘリン；　ツマチック　セ
ルジェネッティックス（Ｈｌｌａ−ｒ７　Ｋｏｐｒｏｖ
ｓｋｌ＋Ｚｅｎｏｎ　Ｓｔｅｐｌｅｗｓｋｌ、Ｋｅｎｎ
ｅｔｈ　Ｍｌｔｃｈ−ｅ！１．関ｅｅｎｈａｒｄ　　Ｈ
ｅ１ｙｎ　　；Ｓｏｍａｔｌｃ　　Ｃｅ１ｌ　　Ｇｅｎ
ｅｔｌｃｓ）Ｖｏｌ、５．ＮｏＢ、１９７９．ｐｐ、９
５７−９７２］に記載の方法に従って製造した。

簡単には、５ＩＦ１１＋［ｉ細胞（大日本製薬社から入
手可能）　１ｘｌＯ”個をＢＡＬＢ／ｃマウスの静脈内
に投与し免疫した。１ケ月後に再び５ＷＩＩＩＢ細胞１
ｘｌＯ＠個を投与し３日後に＃臓を摘出して肺細胞を採
取した。

ＲＰＭ１１６４０培地にて洗浄した後、牌細胞全ｎを２
ｘｌＯ’個のマウスミエローマ細胞（Ｐ３１１ＳＩ／ｌ
−Ａｇ　４．１）と混ぜ、３７℃の４２．５％ポリエチ
レングリコール１５４０および７．５ｘジメチルスルフ
オキシドを含むＲＰＭＩＩ［ｉ４０培地１１中で１分間
融合させた。重分後にその細胞懸濁物をＲＰＭＩＩＢ４
０培地５１で徐々に希釈した。それらの細胞を遠心分離
し、洗浄した後、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノ
プテリン、チミジン、１０％牛脂児血清を含むＲＰＩＩ
　１６４０培地）を２０ｍ１になるように加えて、９６
ウエル　マイクロプレートに０．２１ずつ分注して２週
間培養した後、増殖したウェル中の培養上清の抗体活性
を測定した。

次に、活性の認められたウェルの細胞を限界希釈法を使
用して繰り返してクローン化し、ＩｇＣＩサブクラスと
ＩｇＡクラスの２クローンのモノクローナル抗体を産生
ずる細胞を得た。この２クローンの細胞をマウスの腹腔
内に投与し腹水［ｌ５１１Ｎとして成長させた後、腹水
を採取した。この腹水中モノクローナル抗体をアフィ・
ゲル・プロティンＡ　ＭＡＰＳキット（バイオラッド社
）を用いて精製単離し、以下の検討に用いた。

ｂ）抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体（ＩｇＧｌサブ
クラス）結合ガラスピーズの作製 米国特許第８５２７１３１号明細書の方法に従い、ガラ
スピーズの表面にＩｇＧ１サブクラスの抗ＣＡ１９−９
モノクローナル抗体をコーティングした。

Ｃ）ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＡ抗体の作製抗
マウスＩｇＡ抗体（カッベル社）を文献［ニス・ヨシタ
ケ、エム・イマガワ、イー・イシカワ、エトール；　ジ
ェイ、バイオケム（Ｓ、ＴＯ５ＩＩＩＴムにＥ、１．１
間−ムＧＡＷＡ、Ｅ、ｌ５ＩＩＩにＡｆＡ、ｅｔ、ａｌ
、；Ｊ、ＢＩｏｃｈｅｗ、、Ｙｏｌ、９２　　（１１８
２）　１４１３−１４２４１に記載の方法にてペルオキ
シダーゼと結合し、ペルオキシダーゼ標７Ｍ　抗マウス
１ｇＡ抗体を得た。この試薬は通常！Ｘ牛血清アルブミ
ン含有緩衝液で１０〜５０００倍に希釈して使用した。

ｄ）　　ＣＡ１９−９標準溶液の調整 ５Ｗ−１１１６細胞を１０％牛脂児血清含宵ＲＰＭＩＩ
ｌｉ４０培地で培養し、培養上清液を採取した。培養上
清液中のＣ１１９−９５度をイムノクロンＣＡｌ９−！
ｌ　（富士レビオ社）を用いて測定し、濃度が３０．Ｇ
ｏ、１２０，２４０ｕｎｉｔ／■１なるように１％牛血
清アルブミン含有緩衝液で希釈し標準溶液とした。

ｅ）　　ＣＡｌ９−９測定試薬の製造 抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体（ＩｇＣＩサブクラ
ス）結合ガラスピーズ１００個、抗ＣＡ１９−９モノク
ローナルｔｉ’を体（ＩｇＡり５　Ｘ　）１０℃ｇ／ｍ
ｌ含有０．０２Ｍ　！Ｊ　７酸ｍ街液１２１、ペルオキ
シダーゼ標識抗マウスＩｇＡ抗体含有０．０２１リン酸
緩衝液ＧＯ醜１１１％牛血清アルブミン含有０．０２１
１リン酸緩衝液４０■１１０Ａ１９−９標準溶液３０゜
Ｇｏ、１２０，２４０ｕ＋１ｔ／ｇ＋１を各１−１１　
　生理食塩水１０１００Ｏ、基質溶液（過酸化水素含有
オルト−フェニレンジアミン溶液）　ｌ１ｉＯ＋＊ｌ、
および１．５規定硫酸水溶液３５０１を別々の容器に充
填した後密栓して、ＣＡｌ９−９測定試薬を製造した。

ｆ）　　ＣＡ１９−９標準溶液の測定 ＣＡ１９−９２４０ｕｎｉｔ／ｍｌを含む標準溶液５（
ｌｌ、抗ＣＡｌ３−８モノクローナル抗体（ＩｇＡクラ
ス）１０Ｍｇ／ｍｌ含育Ｑ　、０２Ｍリン酸緩衝液１０
０μｍおよび１％牛血清アルブミン含を０．０２Ｍ　Ｉ
Ｊン酸緩衝液３００μｍを入れた試験管に抗ＣＡ１９−
９モノクローナル抗体（ＩｇＣＩサブクラス）結合ガラ
スピーズを１個入れインキュベージロン（３７℃、１５
分間）したのち、生理食塩水にてビーズを洗浄した。次
に、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＡ抗体含有０．
０２Ｍ　リン酸緩衝液５００μ！中にビーズを移し、イ
ンキュベーション（３７℃、１５分間）した。

再度、生理食塩水にてビーズを洗浄したのち、ビーズを
基質溶液（過酸化水素含有オルト−フェニレンジアミン
溶液）５００μｌ中に移し、インキュベージロン（３７
℃、１５分間）したのち、１．５規定硫酸水溶液３１を
加えて反応を停止した。この液の４９２ｎｍの吸光度を
測定し、ビーズに結合した酵素の酵素活性を測定した。

同様に、ＣＡＩ！１−９標準溶液３０，６０，１２０ｕ
ｎｉｔ／１および０ブランクの測定も行った。

第１図に本測定法によるＣＡｌ９−９標準溶液の測定結
果を示した。

比較例１　サンドウィッチ法ＥＩＡによるＣＡ１９−９
の測定 実施例１と比較するため、抗ＣＡｌ９−９モノクローナ
ル抗体を用いたサンドウィッチ法酵素免疫測定法（ＥＩ
Ａ）によりＣＡｌ９−９の測定を行った。

ａ）抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体の製造実施例１
．ａ）に準じた。

ｂ）抗ＣＡｌ９−９モノクローナル抗体（ＩｇＣＩサブ
クラス）結合ガラスピーズの作製 実施例１．ｂ）に準じた。

Ｃ）ペルオキシダーゼ標識抗ＣＡ１９−９モノクローナ
ル抗体（ＩｇＡクラス）の作製 ＩｇＡクラスの抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体を文
献［ニス拳ヨシタケ、エムーイマガヮ、イー・インカワ
、エトール；　ジェイ、バイオケム（Ｓ、ＹＯ５旧Ｔ−
ＡＫＥ、Ｍ、ＩＭＡＧＡＷ＾、Ｅ、ｌ５ＨＩＫＡＷＡ、
ｅｔ、ａｌ、；Ｊ、ＢＩｏｃｈｅｍ、。

Ｖｏｌ、９２（＋９８２）　１４１３−１４２４コに記
ｆｒ＆　（Ｄ方法ニテヘルオキシダーゼと結合し、ペル
オキシダーゼ標識抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体（
ＩｇＡクラス）を得た。この試薬は通常！Ｘ牛血清アル
ブミン含を緩衝液で１０〜５０００倍に希釈して使用し
た。

ｄ）　　ＣＡｌ９−９標準溶液の調整 実施例１．ｄ）に準じた。

ｅ）　　ＣＡｌ９−９標準溶液（７）　測定ＣＡｌ９−
９２４０ｕｎｌｔ／ｍｌを含む標準溶液５０μ！および
１％牛血清アルブミン含［０，０２Ｍ　ＩＪン酸ｍ街液
４００μｍを入れた試験管に抗ＣＡｌ９−９モノクロー
ナル抗体（ＩｇＧ１サブクラス）結合ガラスピーズを１
個入れインキュベージロン（３７℃、１５分間）したの
ち、生理食塩水ニてビーズを洗浄した。次に、ペルオキ
シダーゼ標識抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体（Ｉｇ
Ａクラス）含有０．０２Ｍリン酸緩衝液５００μｌ中に
ビーズを移し、インキュベーション（３７℃、１５分間
）した。再度、生理食塩水にてビーズを洗浄したのち、
ビーズを基質溶液（過酸化水素台をオルト−フェニレン
ジアミン溶液）５００μｌ中に移し、インキュベージロ
ン　（３ブＣ，１５分間）したのち、１゜５規定硫酸水
溶液３１を加えて反応を停止した。この液の４９２ｎｍ
の吸光度を測定し、ビーズに結合した酵素の酵素活性を
測定した。

同様に、ＣＡ１９−９標準溶液３０．６０．＋２０ｕｎ
ｌｔ／ｍｌおよび０ブランクの測定も行った。

第１図に本測定法によるＣＡ１９Ｌ９標嘔溶液の測定結
果を示した。

実施例２　０ＥＡの測定 ａ）　抗ＣＥＡモノクローナル抗体の製造ＣＥＡに対す
るモノクローナル抗体は文献［ロバート・ニス・アコー
ラ、ステフアン・カーレル、ジャンビニール・マフク；
プロ、ナツル、アカデ、サイ、ニーニスｘ　−（Ｒｏｂ
ｅｒｔｏ　Ｓ、Ａｃｃｏｌｌａ、　５ｔｅｆａｎＣａｒ
ｒｅ１．ａｎｄ　Ｊｅａｎ−Ｐｉｅｒｒｅ　Ｍａｃｈ　
；Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｆ、ＵＳＡ）　Ｙｏｌ、７？、Ｎｏ、ｌ＋ｐｌ’、
５８３−５８８−１９８０１に記載の方法に従って製造
した。

簡単には、大腸癌肝転移果から抽出したＣＥＡ１５μｇ
をフロイントの完全アジュバントとともにＢＡＬＢ／Ｃ
マウスの腹腔内に投与し免疫した。２ケ月後に再びＣＥ
ＡＩ５μｇを静脈内に投与し３日後にｌｌＩ！臓を摘出
して牌細胞を採取した。ＲＰＭ１１８４０培地にて洗浄
した後、肺細胞全量を２ｘｌＧ’個のマウスミエローマ
細胞（Ｐ３−ＮＳＩ／ｌ−Ａｇ　４．１）と混ぜ、３７
℃（７）４２．５％ポリエチレングリコールｌ５４０お
よび７．５ｘジメチルスルフオキシドを含むＲＰＭｌｌ
Ｂ４０培地１１中で１分間融合させた。１分後にその細
胞懸濁物をＲＰＭＩＩ６４０培地５１で徐々に希釈した
。それらの細胞を遠心分離し、洗浄した後、ＨＡＴ培地
（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン、１０％
牛脂児血清を含むＲＰＭＩＩＩｌｉ４０培地）を２０１
になるように加えて、３６ウエル　マイクロプレートに
０．２１ずつ分注して２週間培養した後、増殖したウェ
ル中の培養上清の抗体活性を測定した。

次に、活性の認められたウェルの細胞を限界希釈法を使
用して繰り返してクローン化し、ＩｇＧ１サブクラスと
Ｉｇに２ａサブクラスの２クローンのモノクローナル抗
体を産生ずる細胞を得た。この２クローンの細胞をマウ
スの腹腔内に投与し腹水腫瘍として成長させた後、腹水
を採取した。この腹水中モノクローナル抗体をアフィ・
ゲル・プロティンＡ　ＭＡＰＳキット（バイオラッド社
）を用いて精製単離し、以下の検討に用いた。

ｂ）抗ＣＥＡモノクローナル抗体（Ｉｇｌｌ；２ａサブ
クラス）結合ガラスピーズの作製 米国特許束８５２７８１号明細書の方法に従い、ガラス
ピーズの表面にＩｇＧ２ａサブクラスの抗ＣＥＡモノク
ローナル抗体をコーティングした。

Ｃ）　ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＣＩ抗体の作
製 抗マウスＩｇＣＩ抗体（バインディングサイト社）を文
献［ニス・ヨシタケ、エム・イマガワ、イー・インカワ
、エトール；　ジェイ、バイオケム（Ｓ。

ＴＯＳＲＩＴＡＫＥ、ＩＩ　、　ｌｌｌＡ１１ｉＪ４Ａ
　、Ｅ　、　ｌ５ＩＩ　ＩＫＡｆＡ　、ｅｔ、ａ　ｌ　
、；　Ｊ　、ＢＩｏ−ｃｈｅＷＡ、、　Ｖｏｌ、９２（
１９８２）　１４１３−１４２４コに記載の方法にてペ
ルオキシダーゼと結合し、ペルオキシダーゼ標識抗マウ
スＩＫＧＩ抗体を得た。この試薬は通常１％牛血清アル
ブミン含を緩衝液で１０〜５０ｏＯ倍に希釈して使用し
た。

ｄ）　　ＣＥＡ標準溶液の調整 大腸癌肝転移果から過塩素酸抽出法により得られた高値
ＣＥＡをＷＨＯのＣＥＡインターナショナルリファレン
ス　スタンダード（６３／７０１）を用いて、三洋化成
工業社製ＣＥＡキット「グラオザイムＣＥ＾」により濃
度を検定し、濃度が５．１０，３０．ＩｌｉＯｎｇ／ｍ
ｌとなるように！Ｘ牛血清アルブミン含を緩衝液で希釈
し標準溶液とした。

ｅ）　　ＣＥＡ測定試薬の製造 抗ＣＥＡモノクローナル抗体（ＩｇＧ２ａサブクラス）
結合ガラスピーズ１００個、抗ＣＥＡモノクローナル抗
体（ＩｇＧ１サブクラス）１０Ｍｇ１１含育０．０１Ｎ
りン酸緩衝液Ｉ２■１１　　ペルオキシダーゼ標識抗マ
ウスＩｇＧ１抗体含宵０．０２Ｍ　！Ｊン酸緩衝液ＢＯ
■ｌ、１％牛血清アルブミン含有０．０２Ｍリン酸緩衝
液４０ｍ１．　　ＣＥＡ標準溶液５，１０゜３０、［ｉ
０ｎｇ／ｍｌを各１１、生理食塩水１０００ｍ１１　　
基質溶液（過酸化水素含育オルトーフェニレンジアミン
溶液）Ｂｏｗｌ、および１．５規定硫酸水溶液３５０１
を別々の容器に充填した後密栓して、ＣＥＡ測定試薬を
製造した。

ｆ）　　ＣＥＡ標準溶液の測定 ＣＥＡ　６０ｎｇ／ｍｌを含む標準溶液５０μＩ、抗Ｃ
ＥＡモノクローナル抗体（ＩｇＧ１サブクラス）１０Ｍ
ｇ／ｍｌ含を０．０２詞リン酸緩衝液１００μｌおよび
１％牛血清アルブミン含有０．０２Ｍリン酸緩衝液３０
０μｌを入れた試験管に抗ＣＥＡモノクローナル抗体（
ＩｇＧ２ａサブクラス）結合ガラスピーズを１個入れイ
ンキュベージ１ン（３７℃。

１５分間）したのち、生理食塩水にてビーズを洗浄した
。次に、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ＋抗体含
を０．０２Ｍ　ＩＪン酸緩衝液５００μ！中にビーズを
移し、インキュベーション（３７℃、１５分間）した。

再度、生理食塩水にてビーズを洗浄したのち、ビーズを
基質溶液（過酸化水素台をオルト−フェニレンジアミン
溶液）ＳＯＯμ！中に移し、インキュベーション（３７
℃、ｔＳ分間）したのち、１．５規定硫酸水溶液３１を
加えて反応を停止した。この液の４９２ｎｍの吸光度を
測定し、ビーズに結合した酵素の酵素活性を測定した。

同様に、ＣＥＡ標準溶液５，１０．３０ｎｇ／ｍｌおよ
び０ブランクの測定も行った。

第２図に本測定法によるＣＥＡ標準溶液の測定結果を示
した。

比較例２ 実施例２と比較するため、抗ＣＥＡモノクローナル抗体
を用いたサンドウィッチ法ＥＩＡによりＣＥＡの測定を
行った。

ａ）抗ＣＥＡモノクローナル抗体の製造実施例２．３）
に準じた。

ｂ）抗ＣＥＡモノクローナル抗体（ＩｇＧ２ａサブクラ
ス）結合ガラスピーズの作製 実施例２．ｂ）に準じた。

Ｃ）ペルオキシダーゼ標識抗ＣＥＡモノクローナル抗体
（Ｉｇに１サブクラス）の作製 ＩｇＧ１サブクラスの抗ＣＥＡモノクローナル抗体を文
献〔ニス・ヨシタケ、エム拳イマガワ、イー・イシカワ
、エトール；ジェイ、バイオケム（ｓ、ｙｏｓ■−ＩＴ
ＡＫＥ　、Ｍ　、　ＩＭＡＧＡＷＡ　、Ｅ　、ｌ５ＨＩ
ＫＡＩＡ　、ｅｔ　、ａｌ　、；Ｊ　、ＢＩｏｃｈｃｖ
　。

、　Ｖｏｌ、９２（１９８２）　１４１３−１４２４１
に記載の方法にてペルオキシダーゼと結合し、ペルオキ
シダーゼ標識抗ＣＥＡモノクローナル抗体（ＩｇＧＩサ
ブクラス）を得た。

この試薬は通常１％牛血ｔＲアルブミン含を緩衝液で１
０〜５０００倍に希釈して使用した。

ｄ）　　ＣＥＡ標準溶液の調整 実施例２．ｄ）に準じた。

ｅ）　　ＣＥＡ標準溶液の測定 ＣＥＡ　ＧＯｎｇ／ｍｌを含む標準溶液５０μｍおよび
！に牛血清アルブミン含有０．０２Ｍ　リン酸緩衝液４
００μｍを入れた試験管に抗ＣＥＡモノクローナル抗体
（Ｉｇ（ｉ２ａサブクラス）結合ガラスピーズを１個入
れインキュベージジン（３７℃、１５分間）したのち、
生理食塩水にてビーズを洗浄した。次に、ペルオキシダ
ーゼ標識抗ＣＥＡモノクローナル抗体（ＩｇＧ１サブク
ラス）含有０．０２Ｍリン酸緩衝液５００μｍ中にビー
ズを移し、インキュベーション（３７℃、１５分間）し
た。再度、生理食塩水にてビーズを洗浄したのち、ビー
ズを基質溶液（過酸化水素含有オルト−フェニレンジア
ミン溶液）５００μＸ中に移し、インキュページせン（
３７℃、１５分間）したのち、１、５規定硫酸水溶液３
１を加えて反応を停止した。この液の４９２ｎｍの吸光
度を測定し、ビーズに結合した酵素の酵素活性を測定し
た。

同様に、ＣＥＡ標準溶液５，１０．３０ｒ＋ｇ／＋ｏｌ
および０ブランクの測定も行った。

第２図に本測定法によるＣＥＡ標準溶液の測定結果を示
した。

実施例３ ａ）抗ＣＥＡモノクローナル抗体の製造ＨＢｓに対する
モノクローナル抗体は文献［ケイ・クニトモ、ニス・ヤ
ハラ、エイチ・サジ、ティーφホソイ；ボックス　サン
ジーニス　（Ｋ、Ｋｕｎｌｔｏｍｏ。

Ｓ、Ｙａｈａｒａ、Ｈ，５ａｊｌ、Ｔ、）ｌｏｓｏｌ；
　’１０ｘ　Ｓａｎｇｕｔｎｌｓ）　Ｖｏｌ。

４５、Ｎｏ、２．１９８３．ｐｐ、１０４−１１１コに
記載の方法に従って製造した。

簡単には、ＨＢｓ抗原５００μｇ　（ミドリ十字社製）
をフロイントの完全アジュバントとともにＢＡＬＢ／ｃ
マウスの腹腔内に投与し免疫した。１０日後に再びｌｌ
Ｂ５抗原１００μｇを静脈内に投与し３日後に膵臓を摘
出して肺細胞を採取した。ＲＰＭＩＩ６４０培地にて洗
浄した後、肺細胞全量を２ｘｌＯ’個のマウスミエロー
マ細胞（Ｐ３−ＮＳＩ／ｌ−Ａｇ　４．１）と混ぜ、３
７°Ｃの４２，５％ポリエチレングリコール＋５４０お
よび７．５ｘジメチルスルフオキシド せた。１分後にその細胞懸濁物をＲＰＭＩＩＧ４０培地
５１１１で徐々に希釈した。それらの細胞を遠心分離し
、洗浄した後、ＨＡＴ培地（ヒボキサンチン、アミノプ
テリン、チミジン、１０％牛脂児血清を含むＲＰＭＩＩ
Ｉｌｉ４０培地）を２０１になるように加えて、９６ウ
エル　マイクロプレートに０．２１ずつ分注して２週間
培養した後、増殖したウェル中の培養上清の抗体活性を
測定した。

次に、活性の認められたウェルの細胞を限界希釈法を使
用して繰り返してクローン化し、１ｇＭクラスとＩｇ（
ｉ２ａサブクラスの２クローンのモノクローナル抗体を
産生ずる細胞を得た。この２クローンの細胞をマウスの
腹腔内に投与し腹水腫瘍として成長させた後、腹水を採
取した。この腹水中モノクローナル抗体ヲＤＥＡＥ−セ
ルロースとアフィ拳ゲル・プロティンＡ　ＭＡＰＳキッ
ト（バイオラッド社）を用いて精製単離し、以下の検討
に用いた。

ｂ）　抗ＨＢｓモノクローナル抗体（１ｇＭクラス）結
合ガラスピーズの作製 米国特許第８５２７８１号明細書の方法に従い、ガラス
ピーズの表面に１ｇＭクラスの抗Ｈａｓモノクローナル
抗体をコーティングした。

ｃ）　　＋２Ｊ標識抗マウスＩｇ０２ａ抗体の作製抗マ
ウスＩｇＧ２ａ抗体（バインディングサイト社）ヲ文献
［バーバラ・ビー・ミツシェル、スタンレイ・エム・シ
ギ；セレクテイッド　メンツズインセルラーイムノロジ
−（Ｂａｒｂａｒａ　Ｂ、ＭＩｓｈｅｌｌ　５ｔａ−ｎ
ｌｅｙ　　Ｍ、Ｓｈｌｇｌ；　　　５ＥＬＥＣＴＥＤ　
　ＭＥＴＨＯＤＳ　　ＩＮ　　ＣＥＬＬＵＬＡＲ１％ｍ
ＩｔｌｌｌＯＬＯＧＹ）　ＰＰ、３１Ｓ−３１６，１９
８０コに記載の方法にて１１ｓＩと結合し、Ｉ＊Ｉｌ標
識抗マウスＩｇ０２ａ抗体を得た。

この試薬は通常１％牛血清アルブミン含宵緩衝液で１０
〜５０００倍に希釈して使用した。

ｄ）　　ＨＢｓ標準溶液の調整 ミドリ十字社から入手したＨＢｓ抗原（４０Ｍｇ／バイ
アル）を０．０２１りん酸緩衝液で希釈し、濃度が０．
５゜Ｌ２．５＋ＬＩＯｎｇ／ｍｌとなるようにＩＩＢｓ
ｅ：４準溶液を調製した。

ｅ）　　Ｈａｓ測定試薬の製造 抗ＨＢｓモノクローナル抗体（１ｇＭクラス）結合ガラ
スビーズ１ＧＱ個、抗ｔｌＢｓモノクローナル抗体（Ｉ
ｇＧ２ａサブクラス）１０μｇ／ｍｌ含有０．０２Ｍリ
ン酸緩衝液１２ｍ１、１１１８１Ｆ！識抗マウスＩｇＧ
２ａ抗体含有０．０２Ｍ　リン酸緩衝液Ｂｏｗｌ、１％
牛血漬アルブミン含を０．０２Ｍ　ＩＪン酸緩衝液４０
ｍ１．　　ＨＢｓ標準溶液０．５．Ｉ、２．５，５．Ｉ
Ｏｎｇ／＋ｗｌを各１ｍｌ、および生理食塩水１０１０
０Ｏを別々の容器に充Ｉｎした後密栓して、ＨＢｓ測定
試薬を製造した。

ｆ）　　１８ｇ標準溶液の測定 ＨＢｓ　ＩＯｎｇ／ｍｌを含む標準溶液５０μ＋、抗Ｈ
Ｂｓモノクローナル抗体（ＩｇＧ２ａサブクラス）１０
μｇ／ｍｌ含有０．０２ＭリンＷ！１１１衝液１００μ
ｌおよび１％牛血清アルブミン含宵０．０２１１　！ｊ
ン酸緩街液３００μｌを入れた試験管に抗ＨＢｓモノク
ローナル抗体（１ｇＭクラス）結合ガラスピーズを１個
入れインキュベージジン（３）’Ｃ，１５分間）したの
ち、生理食塩水にてビーズを洗浄した。

次に、１１＠ｌ標識抗マウスＩｇＧ２ａ抗体含有０．０
２Ｍ　！Ｊン酸１１衝液５００μｌ中にビーズを移し、
インキュベージジン（３７℃、１５分間）した。再度、
生理食塩水にてビーズを洗浄したのち、ビーズに結合し
た１２１の皿をγ線カウンターで測定した。

同様に、ＨＢｓ標準溶液０．５，１，２．５，５ｎｇ／
ｍｌおよび０ブランクの測定も行った。

第３図に本測定法によるＢＢｓ標準溶液の測定結果を示
した。

比較例３ 実施例３と比較するため、抗■Ｂｓモノクローナル抗体
を用いたサンドウィッチ法放射線免疫測定法（ＲＩ　Ａ
）によりＨＢｓ抗原の測定を行った。

ａ）抗ｌｌＢｓモノクローナル抗体の製造実施例３．ａ
）に準じた。

ｂ）抗ＨＢｓモノクローナル抗体（１ｇｌクラス）結合
ガラスピーズの作製 実施例３．ｂ）に準じた。

ｃ）　　１１＄１標識抗１１８ｇモノクローナル抗体（
ＩｇＧ２ａサブクラス）の作製 ＩｇＧ２ａサブクラスの抗ＨＢｓモノクローナル抗体を
文献［バーパラ・ビー・ミツシェル、スタンレイ・エム
ーシギ；セレクティッド　メンツズインセルラーイムノ
ロジ−（Ｂａｒｂａｒａ　Ｂ、Ｎｌ５ｈｅｌｌ　　５ｔ
ａｎ−Ｉｅｙ　Ｍ、Ｓｈｌｇｌ；　５ＥＬＥＣＴＥＤ　
ＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ　ＣＥＬＬＬＩＬＡＲｌ−属調Ｕ
ＮＯＬＯＧＴ）　ＰＰ、３１５−３１［ｉ、１９８０１
に記載の方法にて１１８１と結合し、＋＊ｓＩ標識抗ｆ
ｌＢｓモノクローナル抗体（ＩｇＧ２ａサブクラス）を
得た。この試薬は通常Ｉ％牛血清アルブミン含を緩衝液
で１０〜５０００倍に希釈して統用した。

ｄ）　　ＨＢｓ標準溶液の調整 実施例３．ｄ）に準じた。

６）　　１８ｇ標準溶液の測定 １１８ｓｌＯｎｇ／ｍｌを含む標準溶液５０μｍおよび
１％牛血清アルブミン含有０．０２Ｎ　リン酸緩衝液４
００μｌを入れた試験管に抗ＨＢｓモノクローナル抗体
（１ｇＭクラス）結合ガラスピーズを１個入れインキュ
ベージジン（３７℃、１５分間）したのち、生理食塩水
にてビーズを洗浄した。次に、１２町標識抗ＨＢｓモノ
クロ一ナル抗体（１ｇ０２ａサブクラス）含有０．０２
Ｍリン酸緩衝液５００μｍ中にビーズを移し、インキユ
ベーシヨン（３７℃、１５分間）した。再度、生理食塩
水にてビーズを洗浄したのち、ビーズに結合した１１８
１の量をγ線カウンターで測定した。

同様に、ＨＢｓ標準溶液０．５，１，２．５，５．ｌＯ
ｎｇ／ｍｌおよび０ブランクの測定も行った。

第３図に本測定法によるＨＢｓ標準溶液の測定結果を示
した。

実施例４ ａ）　　抗ｕｃｃモノクローナル抗体の製造ヒト絨毛性
性腺刺激ホルモン（ＨＣＧ）に対するモノクローナル抗
体は文献［グプタ・ニス−ケイ、タルバー・ジー・ピー
；インド　ジェイ　イクスプバイオｏ　（Ｇｕｐｔａ＋
Ｓ、に、ｓＴａ１ｗａｒ＋Ｇ、Ｐ、ｉ　Ｉｎｄ、　Ｊ、
　Ｅｘｐ。

Ｂｌｏｔ、）　　Ｖｏｌ、１３１９８０　ｐｐ、１３８
１−１３８５１に記載の方法に従って製造した。

簡単には、　　ＩＩＣＧ抗原５μｇ（バーリンガー　マ
ンハイム社）を７０インドの完全アジュバントとともに
５ＡＬＢ／ｃマウスの皮下に投与し免疫した。３週間後
及びその２週間後にＩ（ＣＧ抗原５μｇをフロイントの
不完全アジュバントとともにマウスの腹腔内に投与した
。６週間後、生理食塩水に溶解したＩ（ＣＧ抗原２００
μｇをマウスの腹腔内に投与し、その後３日連続して毎
日マウスの腹腔と静脈内に生理食塩水に溶解したｎｃｃ
抗原４００μｇを投与し、翌日、膵臓を摘出して肺細胞
を採取した。ＲＰＭｌｌ［ｉ４０培地にて洗浄した後、
肺細胞全量を２ｘ１０７個のマウスミエローマ細胞（Ｐ
３−ＮＳＩ／ｌ−Ａｇ　４．１）と混ぜ、３７℃（７）
　４２．５％ポリエチレングリコール１５４０および７
．５％ジメチルスルフオキシドを含むＲＰＭｌ、ｌ６４
０培地１１中で１分間融合させた。１分後にその細胞懸
濁物をＲＰＭＩＩ８４０培地５鱈で徐々に希釈した。そ
れらの細胞を遠心分離し、洗浄した後、■ＡＴ培地（ヒ
ボキサンチン、アミノプテリン、チミジン、１０％牛脂
児血清を含むＲＰＰＩ３ｉ４０培地）を２０１になるよ
うに加えて、９Ｂウエル　マイクロプレートに０．２１
ずつ分注して２週間培養した後、増殖したウェル中の培
養上清の抗体活性を測定した。

次に、活性の認められたウェルの細胞を限界希釈法を使
用して繰り返してクローン化し、ＩｇＧ２ｂサブクラス
とＩｇＧ１サブクラスの２クローンのモノクローナル抗
体を産生ずる細胞を得た。この２クローンのクローン化
した細胞をマウスの腹腔内に投与し腹水腫瘍として成長
させた後、腹水を採取した。この腹水中モノクローナル
抗体をアフィ・ゲル・プロティンＡ　ＭＡＰＳキット（
バイオラッド社）を用いて精製単離し、以下の検討に用
いた。

ｂ）抗■ＣＧモノクローナル抗体（ＩｇＧ２ｂサブクラ
ス）結合ガラスピーズの作製 米国特許第８５２７６１号明細書の方法に従い、ガラス
ピーズの表面にＩｇＧ２ｂサブクラスの抗ＨＯＧモノク
ローナル抗体をコーティングした。

（Ｈ）　　＋　２１＋　１標識抗マウスＩｇＧ１抗体の
作製抗マウスＩｇＧ１抗体（バインディングサイト社）
ヲ文献［バーバラ・ビー・ミツシェル、スタンレイ・エ
ム・シギ；セレクティッド　メソッズインセルラーイム
ノロジー（Ｂａｒｂａｒａ　Ｂ、１１ｇｈｅｌｌ　５ｔ
ａ−ｎｌｅｙ　Ｍ、Ｓｈｌｇｌ；５ＥＬＥＣＴＥＤ　Ｍ
ＥＴＨＯＤＳ　ＩＩＩ　ＣＥＬＬＵＬＡＲＩ−ＭＭＵＮ
ＯＬＯＧＹ）　ＰＰ、３１５−３１６，１９８０コに記
載の方法にて＋！Ｊと結合し、＋２Ｊ標識抗マウスＩｇ
ＣＩ抗体を得た。

この試薬は通常１％牛血清アルブミン含を緩衝液で１０
〜５０００倍に希釈して使用した。

ｄ）　　ＩＩｃＧ標準溶液の調整 バーリンガー　マンハイム社から入手したＨＣＧ抗原（
１００００１０／ｍｇ）を０．０２Ｍりん酸緩衝液で希
釈し、濃度が５．１０，２５，５０，１００．２０旧Ｕ
／ＩとなるようにＨＣＧ標準溶液を調製した。

ｅ）　　ＨＣＧ測定試薬の製造 抗ＨＣＧモノクローナル抗体（ＩｇＧ２ｂサブクラス）
結合ガラスピーズ１００個、抗）ＩＣＧモノクローナル
抗体（ＩｇＣＩサブクラス）１０Ｍｇ／ｍ　Ｉ含有０．
０２Ｍリン酸緩衝液璽２謹１、Ｉ＊ｓ１標識抗？　ウ７
．　ＩｇＣＩ抗体含＜ＴＯ，０２Ｍ　ＩＪ　７酸緩衝液
Ｈｍｌ、１％牛血清アルブミン含有０．０２Ｍ　ＩＪン
酸緩衝液４ｈｌｓ　■ＣＧ標準溶液　５，１０，２５，
５０，１００゜２００１０／ｌを各１ｍｌ、および生理
食塩水１０００ｉ１を別々の容器に充填した後密栓して
、ＨｃＧ測定試薬を製造した。

ｆ）　　＋ＩＣＧ標準溶液の測定 ＨＣＧ　２００１０／ｌを含む標準溶液５０μｌ、抗１
１ｃＧモノクローナル抗体（ＩｇＧ１サブクラス）ＩＯ
μｇ／ｓｌ含育Ｍ　ＩＪン酸緩衝液１００μｍおよび１
％牛血清アル。

有０．０２Ｍ　ＩＪン酸緩衝液３００μｌを入れた試験
管にＨＣＧモノクローナル抗体（ＩｇＧ２ｂサブクラス
）結合ガラスピーズを１個入れインキュベージロン（３
７℃。

１５分間）したのち、生理食塩水にてビーズを洗浄した
。次に、ｌｌｉ　ｌ標識抗マウスＩｇＣＩ抗体含存０．
０２Ｍリン酸緩衝液５００μｍ中にビーズを移し、イン
キュベージロン（３７°Ｃ，１５分間）した。再度、生
理食塩水にてビーズを洗浄したのちビーズに結合したＩ
ｔｓ　１の蚤をγ線カウンターで測定した。

同様に、ＨＣＧ標準溶液５．ｔｏ、２５．５Ｇ、１ｏｏ
ｌｔｌ／ｌおよび０ブランクの測定も行った。

第４図に本測定法によるＨＣＧ標準溶液の測定結果を示
した。

比較例４ 実施例４と比較するため、抗ＩＩＣＧモノクローナル抗
体を用いたサンドウィッチ法ＲＩＡによりＨＣＧ抗原の
測定を行った。

ａ）　抗１１ＣＧモノクローナル抗体の製造実施例４．
８）に準じた。

ｂ）　抗１１ＣＧモノクローナル抗体（ＩｇＧ２ｂサブ
クラス）結合ガラスピーズの作製 実施例４．ｂ）に準じた。

ｃ）Ｉ２Ｓ１標識抗ＨＯＧモノクロ一ナル抗体（Ｉｇ（
ｉｌサブクラス）の作製 ＩｇＧけブクラスの抗１１ＣＧモノクローナル抗体を文
献［バーバラ・ビー・ミツシェル、スタンレイ・エム拳
シギ；セレクテイツド　メンツズイン　セルラー　イム
ノロジー（Ｂａｒｂａｒａ　Ｂ、ＭＩｓｈｅｌｌ　Ｓｔ
ａｎｌｅｙＭ、Ｓｈｌｇｌ；５ＥＬＥＣＴＥＤ　ＭＥＴ
ＨＯＤＳ　ＩＮ　ＣＥＬＬＵＬＡＲＩＭＭＵＮＯＬＯＧ
Ｙ）　Ｐｆ’、３１Ｓ−３１８，１９８０コに記載の方
法にて１２５１と結合し、＋２１　ｌ標識抗ＨＯＧモノ
クローナル抗体（ＩｇＧ＋サブクラス）を得た。この試
薬は通常１％牛血清アルブミン含有緩衝液でＩＯ〜５ｏ
ｏｏ倍に希釈して使用した。

ｄ）　　ｎｃｃ標準溶液の調整 実施例４．ｄ）に準じた。

ｅ）　　［ＩＣＧ標準溶液の測定 ＨＣＧ　２０Ｇ１（１／ｌを含む標準溶液５０μｍおよ
び１％牛血清アルブミン含有０．０２Ｍ　Ｕン酸ｗｉ街
液４００μｍを入れた試験管に゛抗ＨＣＧモノクローナ
ル抗体（ＩｇＧ２ｂサブクラス）結合ガラスピーズを１
個入れインキユベーション（３７℃、１５分間）したの
ち、生理食塩水にてビーズを洗浄した。次に　＋２Ｊ標
識抗ＨＣＧモノクロ一ナル抗体（ＩｇＣＩサブクラス）
含有０．０２Ｍリン酸緩衝液５００μＩ中にビーズを移
し、インキュベージロン（３７℃、１５分間）した。再
度、生理食塩水にてビーズを洗浄したのち、ビーズに結
合した１１８１の量をγ線カウンターで測定した。

同様に、ＨＣＧ標準溶液５，１０，２５，５０，１００
１０／ｌおよび０ブランクの測定も行った。

第４図に本測定法によるＨＣＧ標準溶液の測定結果を示
した。

［発明の効果］ 本発明の測定方法および免疫測定試薬によれば、従来の
モノクローナル抗体を用いた測定方法に比較して高感度
な測定が可能となる。すなわち、従来のモノクローナル
抗体を用いた測定方法は測定精度は優れているが測定感
度が低いという問題点があったが、本発明の測定方法お
よび免疫測定試薬によれば測定精度を低下させることな
く測定感度を向上させることができる。更に、高感度の
測定方法を検査薬に応用した場合測定感度が向上するた
めに測定時間の大幅な短縮が可能である。

以上の点から、本発明は、特に高感度の測定が要求され
る血清またはその他の体液中に極微量台まれているｐｍ
瘍関連抗原、ホルモン、ウィルスなどの検出に応用でき
、かつ、これらの検出時間を短縮することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１および比較例１のＣＡｌ９−９の測定
検量線、第２図は実施例２および比較例２のＣＥムの測
定検量線、第３図は実施例３および比較例３のＨＢｓ抗
原の測定検ｆｆｉ線、第４図は実施例４および比較例４
のＩＩＣＧの測定検量線である。 特許出願人　　　三洋化成工業株式会社あ 第１ｆ！ｌ ＣＡｌ９−９ｇ１度（ｕｎｌｔ／ｍｌ）口 実施例１ Δ　比較例１ 第３図 Ｈａｓ濃、Ｉｆ（ｎν＋１１） 口 実施例３ Δ 比較例３ 第２図 ０１度（ｎｇ／■１） 口 実施例２ Δ　比較例２ 第４１１！１ １１ｃＩＩ：１１度（ＩＵ／Ｉ） 口　実施例４ Δ 比較例４

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、被測定抗原性物質、不溶性固体上の被測定抗原性物
   質を認識するモノクローナル抗体（第一抗体）、被測定
   抗原性物質を認識しかつ第一抗体とは異なるクラスまた
   はサブクラスのモノクローナル抗体（第二抗体）、およ
   び第二抗体のクラスまたはサブクラスを認識する標識抗
   体（第三抗体）を結合させて得た免疫複合体における標
   識物質量を測定することにより、該被測定抗原性物質を
   測定することを特徴とする抗原性物質の免疫測定法。 ２、不溶性固体上の被測定抗原性物質を認識するモノク
   ローナル抗体（第一抗体）、被測定抗原性物質を認識し
   かつ第一抗体とは異なるクラスまたはサブクラスのモノ
   クローナル抗体（第二抗体）、および第二抗体のクラス
   またはサブクラスを認識する標識抗体（第三抗体）を必
   須構成成分とすることを特徴とする免疫測定試薬。